（遗传学专业论文）脂肪中表达的基因stard4stard6rnpc3的研究.pdf

复旦大学博士学位论文 脂肪中表达的基因s t ，d l j 3 4 、s t a d 划d 6 和r n p c 3 的研宄 摘要 为了研究胆固醇合成和代谢的基因及其表达，我们利用抑制消减杂交方法建 立了c 5 7 小鼠在加胆固醇食物的条件下的差减文库。经过筛选和测序，我们在脂 肪文库中得到了几个独立的克隆，其中的两个是s t a r d 4 ( a f 4 8 0 2 9 7 ) 和 s t a r d 6 ( a f 4 8 0 3 0 3 ) ，另一个克隆对应的人类同源基因是r n p c 3 。 以前报道s t a r d 4 只在肝脏中表达，而且在加胆固醇的条件下表达水平下降。 s t a r d 6 只在睾丸中表达。我们首次发现s t a r d 4 和s t a r d 6 在脂肪组织中也有表 达，并且在加胆固醇的条件下表达水平下降。并在脂肪组织中发现了s t a r d 4 的 一种剪切形式造成o r f 的改变；s t a r d 6 至少有两种种剪切形式。其它含s t a r t 地结构域能结合固醇。在脂肪组织中新发现s t a r d 4 和s t a r d 6 所有的剪切体都 破坏了s t a r t 结构域，提示s t a r d 4 ( a f 4 8 0 2 9 7 ) 和s t a r d 6 ( a f 4 8 0 3 0 3 ) 是结合胆固 醇最重要的剪切形式。 s t a r d 4 和s t a r d 6 在3 t 3 l 1 细胞的分化中，没有显著的表达变化。我们首次 成功地构建了表达s t a r d 4 的腺病毒载体a d p s u h t t l e m s t a r d 4 ，用 a d p s u h t t l e m s t a r d 4 感染3 t 3 l l 细胞后发现s t a r d 4 有促进细胞胆固醇合成的 作用。 用软j f 预测了人的s t a r d 4 和人的s t a r d 6 和小鼠的s t a r 0 4 可能的启动子序 列，将它们装到报告基因的质粒上转染a d 2 9 3 细胞，实验结果显示它们的启动子 有一定的活性。 在s s h 的脂肪库中发现了一个小鼠的c o n a 片断，这个c d n a 片断对应小鼠的 一条基因，它的基因号为n m - 0 2 6 0 4 3 。在n c b i 上没有发现这条基因对应的人类 基因，但在我们实验室建立的人类基因文库中有这条基因。这是这个基因的首次 报道。我们将这条基因登陆到n c b i 上，并经过人类研究命名委员会同意命名为 r n p c 3 。r n p c 3 全长为1 8 7 0 b p ，由1 4 个外显子组成，定位在l p 2 1 。从l o l b p 到1 6 5 4 b p 有一个开放阅读框，编码一个5 1 7 氨基酸的蛋白质。r n p c 3 含有两个r r m 结构域、 两个双核定位信号和一个多聚脯氨酸区。r n p c 3 定位在细胞核中，多组织表达谱 分析发现r n p c 3 主要分布在肾脏和胰腺中。 复日大学博士学位论文脂肪中表达的基因s t a r d 4 、s t a r d 6 和r n p c 3 的研究 关键词：抑制差减杂交；脂肪组织：s t a r d 4 ：s t a r d 6 ：r n p c 3 ；腺病毒载体；启动 子：r n a 识别序基 复旦大学博士学位论文 脂肪中表达的基因s t a r d 4 、s t a r d 6 和r n p c 3 的研究 a b s t r a c t s u b t r a c t e dc d n al i b r a r yo fa d i p o s eti s s u eo fc 5 7m o u s e ( 敞 sm 口s c i u s lw a s c o n s t r u c t e du n d e rh i g h c h o l e s t e r o ld i e tu s i n gs u p p r e s s i o ns u b s t r a e t i v e h y b r i d i z a t i o n ( s s h ) m e t h o d i no r d e rt o s t u d y t h e g e n e i n v o l v e di n b i o s y n t h e s i s a n dm e t a b o l i s m o fc h o l e s t e r 0 1 a f t e r s c r e e n i n g a n d s e q u e n c i n gw eg e ts e v e r a lc l o n e sw i t hd i f f e r e n t i a l l ye x p r e s se d n a ，t w o o ft h e ma r es t a r d 4a n ds t a r d 6g e n e sa f t e rb l a s ts e a r c hi nn c b ia g a i n s t n o nr e d u n d a n tg e n e b a n kd a t a b a s e p r e v i o u sr e p o r tr e v e a l e ds t a r d 4w a se x p r e s s e do n l yi n1i v e ra n dd e c r e a s e d i nm i c ef e dah i g h c h o l e s t e r o ld i e ta n ds t a r d 6w a se x p r e s s e do n l yi nt e s t i s w ef i r s tf i n db o t hs t a r d 4a n ds t a r d 6e x p r e s s e di na d i p o s et i s s u ea n dt h e y d e c r e a s e di na d i p o s et i s s u eo fm i c ef e dah i g h c h o l e s t e r o ld i e t s t a r d 4 h a so n en e ws p l i c ev a r i a n ta n ds t a r d 6h a v et w on e ws p l i c ev a r i a n t si n a d i p o s et i s s u e a 1 1o ft h e md e s t r o ys t a r td o m a i n sw h i c hc a nb i n ds t e r 0 1 s t a r d 4a n ds t a r d 6e x p r e s s e di n3 t 3 l 1p r e a d i p o s ec e l l ，h o w e v e r ，t h e r ea r e n oe v i d e n t e x p r e s s i o n a l t e r a t i o no fs t a r d 4a n ds t a r d 6w h e n3 t 3 l i p r e - a d i p o s ec e l ld i f f e r e n t i a t e s r e c o m h i n a n ta d e n o v i r u se n c o d i n gm o u s e s t a r d 4g e n ew a ss u c c e s s f u l l ye s t a b l i s h e da n dc o n f i r m e db yp c ra n dw e s t e r n b l o t t h e3 t 3 l ip r e a d i p o s ec e l li n f e c t e db yr e c o m b i n a n t , , d e n o v i r u s e n c o d i n gm o u s es t a r d 4g e n eh a v ep r o d u c em u c hc h o l e s t e r 0 1 w ep r e d i c t e dt h ep u t a t i r eh u m a ns t a r d 4 ，h u m a ns t a r d 6a n dm o u s es t a r d 4 p r o m o t e r sb yo n l i n ep r o m o t e rp r e d i c t i o nb i o s o f t w a r ea n dc l o n e d t h e m t h e s ed n af r a g m e n t sw e r ei n s e r t e di np l a s m i dp g l b a s i cl u c i f e r a s er e p o r t e r v e c t o rw h i c hp r o v i d eab a s i sf o rt h ea n a l y s i so fp r o m o t e rp o t e n t i a l l y r e g u l a t eg e n ee x p r e s s i o n t h er e s u l tr e v e a l e dt h a ts o m eo f t h e mh a v e p r o m o t e rp r o p e r t y i nm o u s ea d i p o s et i s s u el i b r a r yc o n s t r u c t e du n d e rc h o l e s t e r o l f e e d i n g u s i n gs u p p r e s s i o ns u b t r a c t i v eh y b “d i z a t i o n ( s s h ) m e t h o dw ef o u n dac d n a f r a g m e n t t h i sc d n af r a g m e n tc o r r e s p o n d st oam o u s eg e n ew h o s ea c c e s s i o n n u m b e ri s n m 一0 2 6 0 4 3 i n6 e n e b a n ka n dt h e s ec l o n e si nt h eg e n e 1 i b r a r y 墨里查堂竖主堂垡笙皇 ! ! 堕主塞姿塑茎里坠婴! ：翌型! 塑曼翌! 望塑塑塞 e s t a b l i s h e di no u rl a b b u tt h e r ei sn oh u m a nh o m o l o gg e n er e p o r t e d w e f o u n dt h i sc d n ac o r r e s p o n d st oah u m a n g e n en u m b e r e d11 4 7 b 0 9i nh u m a ng e n e l i b r a r ye s t a b l i s h e di no u rl a b ，t h u sw ef i r s tr e p o r t e dt h i sg e n ea n d s u b m i t t e di tt og e n e b a n k ( a c c e s s i o nn u m b e ra y 0 9 9 3 2 9 ) w en a m e di tr n p c 3 ( r i b o n u c l e o p r o t e i nc o n t a i n i n g3 ) i na g r e e m e n tw i t hh u g og e n en o m e n c l a t u r e c o m m i t t e e t h i sn o v e lh u m a nr n p c 3g e n ei s1 8 7 0b pi nl e n g t ha n de n c o d e s ap r o t e i nw i t h5 1 7a m i n oa c i d sc o n t a i n i n gt w or n ar e c o g n i t i o nm o t i f s i t a l s oc o n t a i n st w o b i p a r t i t en u c l e a rt a r g e t i n gs e q u e n c e s ，w h i c hr a e i m p o r t a n tf o rn u c l e a rt a r g e t i n gf o rp r o t e i n s ，e s p e c i a l l yt h o s ef u n c t i o n i nt h ee e l ln u c l e u s g f pl o c a t i o no fr n p c 3g e n ep r o d u c ts h o w st h i sp r o t e i n l o c a t e di nt h ec e l ln u c l e u s r t p c rr e v e a l e dt h a ti ti s u b i q u i t o u s l v e x p r e s s e da n da b u n d a n t l yi nk i d n e ya n dp a n c r e a s k e yw o r d s ：s u p p r e s s i o ns u b t r a c t i v eh y b r i d i z a t i o n ( s s h ) ：a d i p o s et i s s u e s t a r d 4 ；s t a r d 6 ；r n p c 3 ；a d e n o v i r u sv e c t o r ；p r o m o t e r ：r n a r e c o g n i t i o n m o t i f ( r r m ) 复旦大学博士学位论文脂肪中表选的基因s t a r d 4 、s t a r d 6 和r n p c 3 的研究 引言 胆固醇代谢研究进展 f l a s m a , l d l 圉绷融获取胆圈醇的进柽置苒谓节 李怕良等丝塑王撵遣曼静! ! ! ：! ! ：! 生 心脑血管疾病是威胁2 1 世纪人类生命健康的最严重、最常见的疾病，其患 病率和死亡率均占各类疾病之首，被誉为”2 1 世纪生命的第一杀手”。在所有心 血管疾病所致死亡的病人中7 9 ，约44o 万人，死亡归因于胆固醇水平控制 不理想。因此研究胆固醇的合成和代谢调节有着重要的医学价值。 胆固醇是人和动物生命代谢不可缺少的成分，胆固醇是性激素的主要成分之 一，它还参与类固醇激素、胆酸、维生素d 3 肝磷酸的合成与代谢。胆固醇也具 有重要的生理生化作用。胆固醇和它的类似物大部分分布在细胞膜上，影响生物 膜的结构、通透性和流动性，它参与细胞营养和废物的运输、药物效果的产生、 信息的传递以及与生物膜有关的免疫系统活动。胆固醇广泛分布在全身的各个组 复旦大学博上学位论文 脂肪中表达的基因s t a r d 4 、s t a r d 6 和r n p c 3 的研究 织中，其中约1 4 分布在脑和神经组织中，占脑组织总重量的2 左右。肝脏、 肾脏及肠等内脏以及皮肤、脂肪组织中也含有较多的胆固醇，每1 0 0 9 组织中含 有2 0 0 - - 5 0 0 m g ，以肝脏最多( s i m o n s e t a 1 ，2 0 0 0 ) 。但是哺乳动物体内胆固醇 含量过高和过低都会影响正常的生命过程。细胞中过量的胆固醇、低密度脂蛋白 ( l d l ) 年 i 动脉粥样硬化( a t h e r o s c l e s i s a s ) 和冠心病有密切关系。 正常人每天的饮食中含约3 0 0 - - 5 0 0 m g ，主要来自动物的内脏、蛋黄、奶油和 肉类。植物性食品不含胆固醇，但含有植物固醇，如谷固醇、麦角固醇。它们彳i 易为人体吸收，摄入过多还会抑制胆固醇的吸收。人体内的胆固醇l 3 来自食物 供给，2 3 来自于体内的合成。哺乳动物在除脑之外的其它组织中都能生成胆固 醇，9 5 胆固醇来自肝脏、大肠和皮肤的生物合成，合成速度为1 1 5 9 2 4 h 。 胆固醇的吸收、合成、运输、清除等过程涉及各种生物大分子的协同作用， 从而使体内的胆固醇代谢受到多因素、多途径的严格调控并处于一种相对平衡的 状态。体内的胆固醇代谢平衡调节点主要有三个：1 细胞内的胆固醇的合成；2 受体介导的胆固醇吸收；3 游离胆固醇及胆固醇脂的形成过程( 李伯良，段治军， 1 9 9 6 1 。细胞通过前两个过程吸收胆固醇，通过第三个过程将吸收的胆固醇储存 起来。而胆固醇作为产物对参与其吸收的一些运输分子和合成酶，如低密度脂蛋 白受体( l d l r ) 、3 - 羟甲基戊二酰辅酶a 合成酶( h m g c o a s ) 和3 一羟甲基戊二酰 辅酶a 还原酶( h m g c o a r ) 有负反馈作用，而对参与其运输和储存过程的酰基 辅酶a ：胆固醇酰基转移酶( a c a t ) 具有底物激活作用。下面介绍几个和胆固醇合 成、吸收、运输、储存及清除过程相关的酶、运载蛋白和调节因子。 1 3 羟甲基戊二酰辅酶a 合成酶( h m g - c o a s ) 和3 羟甲基戊二酰辅酶a 还 原酶( h m g c o a - r ) 乙酰辅酶a 是胆固醇合成的直接原料，从乙酰辅酶a 到胆固醇的过程比较 复杂，约有3 0 步反应，需要大约3 0 种酶的参与。所有参与胆固醇合成的酶都受 到中间代谢产物和最终产物胆固醇以及一些细胞因子的影响。h m g c o a s 和 h m g c o a r 被认为是整个合成过程的限速步骤( g i l g e ta 1 ，1 9 8 6 ) 。这两个酶 将底物生成重要的中间产物甲羟戊酸。这两种酶都是在种胆固醇代谢调节缺陷 的c h o 细胞株的突变株u t - i 中克隆到的。哺乳动物的h m g c o a s 有两种， 一种存在于肝细胞的线粒体中，参与肝线粒体脂肪酸氧化，它催化h m g - c o a 氧 化成黄体酮，另一种存在于胞浆中，广泛分布于各种细胞中，参与胆固醇的合成。 复旦大学博士学位论文 脂肪中表达的基因s i a r d 4 、s t a r d 6 和r n p c 3 的研究 h m g c o a r 催化h m g - c o a 还原成甲羟戊酸，它整合于细胞的内质网上，c 端 5 4 8 个氨基酸伸入细胞浆中，这是酶的催化结构域，n 端包含8 个穿膜的结构域， 将酶整合在内质网膜上( c h e n g de ta 1 ，1 9 9 5 ：r e n o l d sg ae ta 1 ，t 9 8 4 ) 。 2 低密度脂蛋白受体( l d l r ) 人的低密度脂蛋白受体是由8 3 6 个氨基酸残基组成的3 6 面体蛋白。它由5 种不同的区域构成，每个区域有自己的功能。l d l r 经过受体介导的内吞作用将 细胞外的胆固醇吞入细胞内( ) b r o w nm s e t a 1 ，1 9 8 1 ，1 9 8 2 ：g o l d s t e i nj e t a 1 1 9 8 2 ) 血浆中的胆固醇主要存在于l d l 中，6 5 7 0 的l d l 是依赖于肝细胞中 的l d l r 清除的，肝中l d l r 还影响l d l 的合成速度以及v l d l 代谢。l d l r 主要功能是通过摄取胆固醇进入细胞内，用于细胞的增长、固醇类激素以及胆汁 酸盐的合成。 3 酰基辅酶a ：胆固醇酰基转移酶( a c a t ) 胆固醇在生物体内的运输和细胞对外源胆固醇的吸收都是以胆固醇脂的形 式进行的，细胞内的胆固醇也是以脂的形式储存的。a c a t 是动物体内催化胆固 醇和长链脂肪酸连接形成胆固醇脂的酶( s c h m i t zg ，e ta l ，1 9 9 6 ) 。因此，a c a t 被认为是参与生物体吸收，运输和储存胆固醇的一个很重要的酶。a c a t 是内质 网上的的整合蛋白，实验证明胆固醇及其氧化物不仅是a c a t 的底物，而且还 能在蛋日水平增加a c a t 的活性。 4 卵磷脂胆固醇酰基转移酶( l c a t ) l c a t 能催化卵磷脂和胆固醇生成溶血卵磷脂和胆固醇脂。细胞表面上的游 离胆固醇经l c a t 酯化作用生成胆固醇脂，并转运到高密度脂蛋i 兰i ( h d l ) a z ( y a n g c ye t a 1 1 9 8 7 ) i 塞是胆固醇清除的重要环节l c a t 基因缺陷的患者血浆中的游 离胆固醇含量上升，胆固醇的酯化作用下降，导致眼角膜混浊、动脉硬化、视觉 损伤等病症。 5 a t p 结合盒l ( a b c l ) 血浆中的h d l 的重要功能是将外周胆固醇和胆固醇脂运送到肝脏，从而防止 复旦大学博士学位论文脂肪中表达的基因s t a r d 4 、s t a r d 6 和r n p c 3 的研究 胆固醇在动脉血管壁沉积引起动脉粥样硬化( a s ) 。a p o a i 是h d l 的主要成分，它 能从外周细胞摄取胆固醇，在血浆中经l c a t 脂化后，游离的胆固醇变成胆固醇 脂并向h 跣的内核转移，最终变成成熟的球形h d l ，将胆固醇运送到肝脏，这就 是胆固醇逆向转运的主要过程。细胞内的胆固醇能向细胞外转运，将有利于防止 泡沫细胞的形成，而泡沫细胞是动脉粥样硬化发病的重要环节。t a n g i e r 病人由 于a b c l 基因突变，将细胞内的胆固醇和磷脂转运到细胞间质的a p o a i 的能力明 显下降，因而导致胆固醇在外周细胞特别是巨噬细胞、网状内皮系统细胞的大量 积聚( b e r g e rk ee ta 1 ，2 0 0 0 ) 。 6 固醇调节元件结合蛋白( s r e b p s ) 薹) l h n bs l f # r 口t r s k e b p 如m 曲， n 蝴| “e 壤r 蝌钢托| 瓣嚣抖n # 畦翱：辅! * a 静4 ，： 上图为三种s r e b p 的剪切体的结构简图。 s r e b p 是一种b a s i c h e l i x l o o p h e l i x 1 e u c i n ez i p p e r 蛋白，它能激活胆固醇合 成、低密度脂蛋白内吞、饱和和不饱和脂肪酸的合成以及糖类代谢( h u ax e t a 1 ，1 9 9 3 ) 。它把胆固醇代谢和糖类代谢联系起来。s r e b p s 有三种转录本，它 们分别是s r e b p l a 、s r e b p l c 和s r e b p 一2 。体内实验研究如转基因小鼠和 k n o c ko u t 小鼠的实验显示s r e b p l c 主要调节与脂肪酸合成的基因的活性； s r e b p 2 更特异的调节胆固醇代谢相关基因：而s r e b p l a 则两种活性都具备 ( s h i m a n oe ta 1 1 9 9 7 ；s h i m a n oe ta l1 9 9 9 ；w a n ge ta l ，1 9 9 4 ) 。肝中过表达s r e b p l a 和2 ，都会诱导显著的胆固醇合成，参与胆固醇合成的酶，如3 一羟甲基戊二酰辅 酶a 合成酶( h m g c o a s ) 和3 羟甲基戊二酰辅酶a 还原酶( h m g - c o a - r ) ，法呢 焦磷酸合成酶，鲨烯合成酶以及其它合成所需的酶的m r n a 水平都增加 r s a k a k u r ae ta l 2 0 0 1 ) ，这就可以解释胆固醇合成增加的原因( s h i m a n o e t a 1 1 9 9 6 ；h o r t o n 1 9 9 8 ) 。s r e b p 是由位于内质网上的1 2 5 k d 的前体蛋白生成的。 它的分子伴侣是s r e b p c l e a v a g ea c t i v a t i n gp r o t e i n ( s c a p ) 。s r e b p 和s c a p 在粗面型内质网中形成复合体转移到高尔基体上( s a k a ij ，e t a l1 9 9 7 ) ，s c a p 4 复旦大学博士学位论文 脂肪中表达的基因s t a r d 4 、s t a r d 6 和r n p c 3 的研究 是多次跨膜的蛋白，它含有个固醇敏感的结构域。在高尔基体上经两个蛋自酶 切割后，释放一个成熟的、有转录活性的6 8 k d 氨基端的结构域。切割s r e b p 从而调节胆固醇的分子机制已经被g o l d s t e i n 和b r o w n 所阐明( b r o w na n d g o l d s t e i n 1 9 9 7 ；b r o w n ，g o l d s t e i n 1 9 9 8 ；b r o w ne ta 1 1 9 9 9 ；b r o w ne ta i2 0 0 0 1 。在胆 固醇缺乏的时候，s r e b p s c a p 复合物进入高尔基体，在那里s r e b p 被两个酶 酶切，结合的s r e b p 前体蛋白经过一个顺序的两步酶切反应，释放它的氨基端 ( w a n g ，e ta l1 9 9 4 ；s a k a i ，e ta l ，1 9 9 6 ) b h l h - z i pc o n t a i n i n gd o m a i n ( n u c l e a rs r e b p ) 进入细胞核中，结合特异的d n a 序列，称之为固醇调节元件( s r e ) 年n 具有回文 结构的e b o x 、从而激活与胆固醇和脂肪酸合成相关的靶基因。当胆固醇丰富的 时候，r e b p s c a p 复合物滞留在粗面型内质网上，不发生酶切反应。 r o u g h 嚣霆 s r e b | - s c a p “甜龇h l 递3 | 罐淑fo lf e g u t a t i o n _ “s h t m a n a h 城r 始，轴i j p 黼藏漆e “r 曲j 秘f2 黼i ， 3 嵇5 2 上图为s r e b p 调节细胞胆固醇合成的过程 基里查堂笪士学位论文脂肪中表达的基因s t a r d 4 、s t a r d 6 和r n p c 3 的研究 、 应用抑制消减杂交方法( s s h ) 筛选小鼠肝脏和脂肪细胞中受胆 固醇诱导的基因 刖青 肝脏和脂肪组织是脂肪酸和胆固醇合成、运输、储存及代谢调节的重要场所， 9 5 的胆固醇是由肝脏合成的，而且肝脏又是胆固醇清除和再吸收的重要器官。 以前认为脂肪组织只是脂类储存的器官，但是陆续从脂肪组织中克隆出重要的代 谢调节因子，显示脂肪也是脂类代谢重要的调节场所。 用于克隆和寻找差异表达基因的方法有很多，如差异显示、代表性差异分析、 酶降解差减杂交、接头捕获差减杂交和抑制差减杂交( s s h l 等。s s h 具有操作简 单，所需起始的m r n a 量少，实验周期短等优点。而且s s h 过程中能将m r n a 的丰度进行均一化，某些含量少的基因可以富集5 0 0 0 倍，从而可以克隆到表达 含量很低的新基因。d i a t c g e n k o 等( 1 9 9 6 ) 首先将抑制p c r 与消减相结合建立了 s s h 方法，这种方法已经得到广泛的应用。本研究采用s s h 方法来寻找和克隆 小鼠肝脏和脂肪细胞中受胆固醇诱导上调和下调的基因，并成功地克隆到一些受 胆固醇诱导表达变化的e d n a 片断。 真核细胞的基因组上有大约l o 万个基因，但在某一个发育阶段、某个类型 的细胞中，只有约占总数的1 5 基因表达( 吴乃虎1 9 9 8 ) 。基因表达的顺序性和时 空性决定了生命的过程，例如，发育和分化、细胞的生长和凋亡、应激反应等， 在细胞出现病理性反应、甚至不同的饮食和环境中，也都会有相关的基因表达发 生变化。因此，比较两种不同类型的细胞或经过不同处理的细胞的基因表达差异， 就可能找到造成差异的遗传原因，从而探索生命过程的基本信息。 检测基因表达差异的方法有消减杂交( s u b t r a c t i v eh y b r i d i z a t i o n ) ( k a n gd c e t a 1 ，1 9 9 8 ) 、m r n a 差别显示法( d i f l e r e n t i a ld i s p l a yd d ) 和代表性序列差异分析 ( r e p r e s e m a t i o n a ld i f f e r e n c ea n a l y s i s ，r d a ) ( h u b a n k a n dd gs c h a t z1 9 9 4 ) ，现将 这几种方法介绍如下。 6 复旦大学博士学位论文 脂肪中衰达的基困s t a r d 4 、s t a r _ d 6 和r n p c 3 的研究 1 消减杂交 1 9 8 4 年l a m a r 等报道了用消减杂交克隆了y 染色体特异性探针。k u n k e l 等 将这种方法用于杜兴氏肌营养不良( d m d ) 基因的定位克隆。它们将x p 2 l 上有微 小缺失的d m d 病人的基因组d n a 用超声波处理成平头末端的片断，同时将 k x x x y 个体的d n a 用m o b i 切割，产生带有粘性末端的双链d n a 。将这两种 d n a 在数量上按2 0 0 ：1 的比例混合，变性后复性杂交，用病人d n a 作为d r i v e r d n a ，以大量的x x x x y 个体的d n a 作为t e s t e rd n a ，t e s t e rd n a 中含有目标序 列。杂交后，x x x x y 个体的d n a 几乎全部与大大过量的病人d n a 复性，只 剩下d m d 独有的d n a 片断，这种d n a 只能自我复性形成一条双链的带m b o i 位点，而这种片断可以连到克隆载体上去，这种方法最终得到了d m d 病人位于 2 l 号染色体上所缺失的些基因的克隆。 2 差别显示法( m r n a d i f f e r e n t i a ld i s p l a yr e v e r s et r a n s c r i p t i o np c r ) 这种方法最先是有l i a n g 和p a r d e e 在1 9 9 2 年提出来的，这个方法使用反转录 和p c r 扩增方法将两个样品的m r n a 反转录成e d n a ，3 端引物根据其末端的 序列分成1 2 种，5 端引物为随机引物，扩增的时候掺入同位素将产物在d n a 测序胶上电泳，放射自显影。回收有差异的条带。克隆鉴定。 3 抑制差减杂交( s g h ) 为1 9 9 6 年d 1 a t a c h e n k o l 等首先提出来的，s s h 技术的主要原理是以抑制p e r 为基础的e d n a 消减杂交。抑制p c r 就是利用非目标序列片断两端的反向重复序 列在退火的时候产生“发夹”结构，由于形成这种链内的“发夹”结构比模板链 和引物的结合在动力学上更容易，因此在p c r 的过程中选择性地抑制非目标序列 的扩增。抑制差减杂交的基本过程是首先将对照和处理样本的两种细胞或组织的 m r n a 逆转录成e d n a ，用四个识别位点的酶，如r s a i 或h a e i i i 切割成小片断 ( 4 4 ：2 5 6 ) 。以其中的一份e d n a 作为t e s t e re d n a ，并将e d n a 分成两份，连上不同 的接头( a d o p t o rl 和a d o p t e r2 ) ，分别和过量的( 3 0 倍) d r i v e re d n a 进行不充 分的杂交后，浓度高的单链e d n a 分子迅速复性，浓度低的单链e d n a 分子仍然以 单链的彤式存在，这样就在杂交的过程中将目的基因的丰度均一化，富集了表达 复日大学博士学位论文脂肪中表达的基ns t a r d 4 、s t a r i ) 6 和r n p c 3 的研究 有差异的基因。第一次杂交共得到4 种产物( 如第9 页图所示) 。然后混合两份杂 交产物，再加过量的新的变性的d r i v e re d n a 进行第二次杂交，这次杂交富集了 表达差异的e d n a ，并且形成了一种新的杂交双链，这种双链的两个5 端分别接 了不同的接头。将它的接头处的单链补平，然后进行两轮p c r ，第一轮p c r 是以 抑制p c r 为基础的e d n a 消减杂交，只有在第二次杂交时产生的两个5 端分别 接了不同的接头新的杂交双链才能以指数扩增。第二轮p c r 实际上是巢式p c r ， 进一步提高了目的片断的丰度( 赵寿元，1 9 9 8 ) 。以上述的实验称为“正交”，如 果将t e s t e re d n a 和d r i v e t e d n a 对调再进行实验，这种称为“反交”。正交和 反交可以得到处理的细胞或组织的上调和下调的基因。 与上述的几种方法相比，s s h 具有以下的优点。首先，它降低了假阳性率， s s h 采用装接头的方法，两步消减杂交，两次p c r 反应，保证了该方法的特异 性。例如，s t e i n 等在比较两种胰腺肿瘤细胞的实验中，证明s s h 的阳性率高达 9 4 。其次，s s h 具有高度敏感的优点，s s h 通过消减杂交的富集作用，可以将 目的基因均一化，这样既可以得到表达丰度低的基因，还使一些高表达的基因被 挑到的几率下降，有利于节省成本。再次，s s h 在一次实验中发现的差异基因多， 它一次可以得到上百个克隆。但是对一些较珍贵的样本来说，s s h 也有一些不足 之处，由于需要的初始样本相对较高不能应用，而且s s h 筛到的克隆都是经过 酶切的c d n a 的片断，这样，还要用r a c e 等方法去获得基因的全长。 本研究将s s h 引入到小鼠与胆固醇合成和代谢相关基因的表达的研究，并成 功地克隆到一些与胆固醇代谢相关的e d n a ，出克隆到一些新的e s t 片断。 复旦大学博士学位论文 脂肪中表达的基因s t a d l d 4 、s t a r d 6 和r n p c 3 的研究 h 鼢d 蚺僦耐呷h 1 i l l l l l r - 1 m - _ _ _ _ b 1 懈d 女a 谰t i i 口d a 口_ 群2 黝跫= = = 轫 。c o _ _ - _ - b i i = = = = h 。l e d - - 。- ，- 。- 。, - 。- 。- , - - 三三 a b 一“+ 。i j = = = = 毛囫 卜酢赫 b a 三三 a d d w m h a r 嘲妇畸虻r dn 。热d 嘏c 口l ；。“ b 妒n oa r d i $ c 酬” e；i r 嘲口m p n r ( a t 口n 。删i 1 ；da r 婶i 瓠豳 9 三 霉星型搏上学位论文脂肪中表达的基因s t a r d 4 、s t a r d 6 和r n p c 3 的研宄 1 1 材料和方法 11 ，1 材料 1 1 i 1 组织来源 3 周龄雄性c 5 7 b “6 小鼠购买于中国科学院实验动物中心，平均体重为2 0 克，饲养在清洁级动物房，每天光照1 2 小时，用加0 5 的胆固醇鼠料和不加胆 固醇的鼠料喂小鼠，四周后停止喂食，禁食后6 小时后将小鼠断颈处死。心脏取 血。迅速取小鼠的各个组织，标记后放入液氮中，所有样本处理完，将所有样品 放入_ 8 0 冰箱中备用。 含胆固醇小鼠饲料由苏州双狮实验动物饲料厂生产，胆固醇购买于上海生_ t 生物公司，饲料经钴一6 0 照射灭菌。 1 1 ，1 2 菌株、酶类和实验k i t 大肠杆菌d h 5 a 菌株：基因型s u p e 4 4 a ，f a c u l 6 9 ，( 夺8 0 1 a c z m 1 5 ) ，h s d r 1 7 ， r e c a l ，e n d a l ，g y r a 9 6 ，t h i 一1 ，r e l a l ，本实验室保存 s s hk i t 美国c l o n t e c h 公司 t r i z o lg i b c o 公司 各种限制性内切酶，n e we n g l a n db i o l a b s 公司产品 t a q 酶，日本t a k a r a 公司产品 tv e c t o r 日本t a k a r a 公司产品 同位素【a 一3 2 p jd c t p ，北京亚辉生物医学工程公司 i 1 1 3 常用试剂的配制 2 0 s s c ：在8 0 0m l 水中溶解1 7 5 ，3g 氯化钠和8 8 2g 柠檬酸三钠，加入 约1 0 0 m i5 m o l l l n a o h 调节至p h 7 0 ，加水定容至1l 后高压灭菌 2 0 s d s ：在9 0 m l 水中溶解2 0g s d s ，加热至6 8 。c 助溶，加水定容至 1 0 0 m i 后高压灭菌 0 7 5m o l l 柠檬酸钠( p h7 0 ) ：在干烤过的试剂瓶中秤取4 4 1 3 9 柠檬酸三 钠加m i l l i q 水1 6 0m l 溶解后，加n a o h 调节至p h7 0 ，在干烤过的量筒 l o 复旦大学博士学位论文脂肪中表达的基因s t a r d 4 、s t a r d 6 和r n p c 3 的研究 中定容至2 0 0m l 后高压灭菌。 1 0 0 xd e n h a r d t 。s 溶液：称取1 0g 聚乙烯吡咯烷酮，1 0g 水溶性聚蔗糖， 1 0g 小牛血清白蛋白，加水溶解定容至5 0 0m l ，过滤除菌，分装于离心管2 0 备用 预杂交液：2 0 s s c3m l ；1 0 0 d e n h a r d t s0 5m l ；2 0 s d s0 2 5m l ； o1m l1 0m g m l 经变性并打断的鲑精d n a ：1m o l l t r i s h c i ( p h7 5 ) ：1m l o l i g o ( d t ) 1 0p g m l ：水5 0 5m i 杂交洗脱液1 ：2 s s c ，0 0 5 s d s 杂交洗脱液2 ：o 1 s s c ，0 1 s o s r o b b i n ss c i e n t i f i cm o d e l1 0 0 0 杂交炉，美国r o b b i n s 公司产品 c y c l o n es t o r a g ep h o s p h o rs y s t e m ，美国p a c k a r d 公司产品 m o n i t o r9 0 0 型放射性检测仪，英国m i n i i n s t r u m e n tl t d 产品 1 1 2 方法 1 1 2 1 总r n a 抽提 用t r iz o lr e a g e n t ( g i b c o ) 试剂 1 ) 研钵和仵以及其它器皿在2 5 0 。c 烘烤2 小时备用。 2 ) 先研钵和仵在一8 0 。c 冰箱预冷，然后加入液氮，将组织加到研钵中将组织样品 充分研碎。 3 ) 将研碎的组织样品转移到加了t r i z o l 的e p p e n d o r f 管中，每o 5 9 样品加l m l t r i z o l 。 4 1 在冰上放置2 0 分钟，离心( 常温，1 3 0 0 0 r p m ) 1 0 分钟。 5 1 弃上层的油和下层沉淀，将上清转移到新的e p p e n d o r f 管中，加2 0 0 f 1 氯仿， 激烈振荡1 5 秒后，室温放置5 分钟。 6 ) 离心( 4 ，1 3 0 0 0 r p m ) 1 0 分钟，小心取上清，将上清加入到新的e p p e n d o r f 管内，加5 0 0 “1 异丙醇，室温放置l o 分钟或一2 0 。c 过夜。 7 ) 离心( 4 ，1 4 0 0 0 r p m ) 3 0 分钟，弃上清，将r n a 沉淀用7 5 乙醇洗，1 0 0 0 0r p m 离心5 分钟，在超净工作台吹5 分钟，用d e p c 水或m i l l i q 水溶解。 8 1 用紫外分光光度计测定a 2 6 0 a 2 8 0 并走电泳，确定r n a 的浓度和质量。 i i 2 2 抑制差减杂交方法 m r n a 纯化 复旦大学博士学位论文脂肪中表达的基因s t a r d 4 、s t a r d 6 和r n p c 3 的研究 注：采用q i a g e n 公司的o l i g o t e xm r n ak i t s 来分离。 1 准备： 1 ) 放置o l i g o t e xs u s p e n s i o n3 7 水浴中加热后充分振匀，放置室温。 2 ) 加热水浴锅至7 0 后，将b u f f e r0 e b 放入预保温。 3 ) 将b u f f e ro b b 放3 7 加热，混匀后放室温。 4 ) 所有操作应在室温( 2 0 3 0 。c ) 下执行。 5 ) 离心转速保持1 4 0 0 0 - 1