免疫学检测技术 PPT课件.ppt

,免疫学检测技术,一、免疫学检验原理,抗原-抗体反应：指抗原与相应抗体在体内、外发生高度特异性结合反应。由于实验所用的抗体存在于血清中，故又称血清学反应（serologicalreaction)应用：用已知抗原检测未知抗体；用已知抗体检测未知抗原：定性或定量检测体内各种分子；用已知抗体检测半抗原物质。,1.特异性和交叉反应特异性：一种抗原通常仅能与由它刺激所产生的抗体结合。分子基础：抗原表位与抗体分子高变区之间空间构型的互补性。,（一）抗原-抗体反应的特点,交叉反应（crossreaction）性：若两种抗原分子有一个或数个相同（或相似）的决定基，则针对一种抗原的抗血清可与另一种抗原发生反应。,结合价：天然抗原分子表面一般含多种抗原决定基，可与多个抗体分子结合，为多价。单体形式的抗体分子有两个Fab段，能结合两个相同的抗原决定基，为两价。,2.比例性,比例合适：若抗原、抗体的数量比例合适，抗体分子的两个Fab段分别与两个抗原决定基结合，相互交叉连接成网格状复合体，则反应体系中基本不存在游离的抗原或抗体，此时形成肉眼可见的反应物（沉淀物或凝集物）。因此，确定反应体系中抗原、抗体的最适比例十分重要。前带现象（prozone）和后带现象(postzone)Ab过剩和Ag过剩,抗原和抗体结合是否呈现可见的反应现象，与两者的浓度和比例密切相关,前带现象（prozone）和后带现象(postzone)Ab过剩和Ag过剩,网格学说（latticetheory）,抗体过剩,抗原过剩,抗体抗体比例合适,抗原,抗体,抗原-抗体反应为分子表面的非共价结合，结合虽稳定但可逆。在一定条件下（如低pH、高浓度盐、冻融等），抗原-抗体复合物可被解离。解离后的抗原和抗体仍保持原有理化特性和生物学活性。根据此特点，可借助亲和层析法纯化抗原或抗体。,3.可逆性,4.阶段性,抗原抗体反应可分为两个阶段特异性结合阶段：反应快，不可见。可见的反应阶段：反应慢，出现凝集、沉淀和细胞溶解等现象。,1.电解质抗原和抗体有对应的极性基团，能相互吸附并由亲水性变为疏水性。电解质的存在使抗原-抗体复合物失去电荷而凝聚，出现可见反应，故免疫学试验中多用生理盐水稀释抗原或抗体。,（二）、抗原-抗体反应的影响因素,2.酸碱度抗原抗体反应的最适pH是6-8。3.温度最适温度为37。有些例外，如冷凝集素在4左右与红细胞结合最好，20以上反而解离。,4.抗原和抗体的性质抗体的特异性和亲和力是决定抗原-抗体反应的关键因素。此外，抗原理化性质、抗原决定基多寡和种类等均可影响抗原-抗体反应。,抗体分子上一个抗原结合点与对应的抗原决定基之间的结合能力,亲和力(affinity),根据抗原的性质、结合反应的现象、参与反应的成分等因素分类：1.凝集反应2.沉淀反应3.补体参加的反应4.免疫标记技术,（三）、免疫学检验方法,颗粒性抗原（细菌或细胞等）与相应抗体结合，在一定条件下，出现肉眼可见的凝集物，称为凝集反应(agglutination)。用于凝集反应中的抗原称凝集原(agglutinogen)。用于凝集反应中的抗体称凝集素（agglutinin)。,凝集反应（AgglutinationTests）,1直接凝集（directagglutination)：细菌或红细胞与相应抗体直接反应，可出现细菌或红细胞凝集现象。2间接凝集（indirectorpassiveagglutination)：检测针对可溶性Ag的Ab3间接凝集抑制试验(directagglutinationinhibitiontest)4.协同凝集试验（co-agglutinationtest）载体为金葡菌，其细胞壁蛋白A与IgG的Fc结合，用于细菌、病毒的快速检测。,妊娠免疫诊断试验,孕妇尿中，绒毛膜促性腺激素（HCG）含量明显增高。（HCG是可溶性抗原）反之，非孕妇尿中HCG含量甚微，不足以消耗掉抗HCG抗体。,HCG检测为间接凝集试验的应用,Definition:可溶性抗原（血清蛋白、外毒素、细菌滤液等）与相应抗体结合，在一定条件下，形成出现肉眼可见的沉淀物的现象称为沉淀反应。,沉淀反应（PrecipitationTests）,用于沉淀反应中的抗原称沉淀原(precipitonogen)。用于沉淀反应中的抗体称沉淀素（precipitin)。,大多沉淀反应多用半固体琼脂凝胶作为介质进行琼脂扩散或免疫扩散，即可溶性抗原与抗体在凝胶中扩散，在比例合适处相遇即形成可见的白色沉淀。,1单向免疫扩散(singleimmunodiffusion)2双向免疫扩散(doubleimmunodiffusion),沉淀反应,单向免疫扩散(SingleImmunodiffusion),是将一定量已知抗体混于琼脂凝胶中制琼脂板，在适当位置打孔后将抗原加入孔中扩散。抗原在扩散过程中与凝胶中的抗体相遇，形成以抗原孔为中心的沉淀环，环的直径与抗原含量成正比相关。本法常用于测定血清IgG、IgM、IgA和C3等的含量。,含抗体的凝胶,沉淀环,双向免疫扩散（DoubleImmunodiffusion),是将抗原与抗体分别加入琼脂凝胶的小孔中，二者自由向周围扩散并相遇，在比例合适处形成沉淀线。如果反应体系中含两种以上的抗原抗体系统，则小孔间可出现两条以上的沉淀线。本法常用于抗原或抗体的定性、组成和两种抗原相关性分析的检测。,补体结合试验（ComplementFixationtest,CFT),敏感性和特异性均较高，但该试验影响因素较多，现在已有被其它新方法取代的趋势。,补体结合试验(complementfixationtest，CFT)将免疫溶血作为指示系统，用以检测另一反应系统中抗原或抗体的传统方法。,试验原理,作用原理：利用补体的溶细胞作用进行各种物理状态的抗原抗体测定,5种成分，3个系统反应系统（溶菌系统）：已知抗原（或抗体）与待测抗体（或抗原）补体系统：指示系统（溶血系统）：SRBC与相应溶血素。试验时常将其预先结合，成为致敏绵羊红细胞（sensitizedsheepredbloodcell,SRBCS）。,溶菌系统,反应分两步进行第一步:反应系统与补体的作用第二步:指示系统利用剩余补体的反应,不溶血为补体结合试验阳性，而溶血为试验阴性,已知抗原加入血清（检测抗体）,加入标准量补体,加入包被抗体的红细胞,检测红细胞溶解情况,Ag,Ag,用荧光素、酶、放射性核素或化学发光物质等标记抗体或抗原，进行抗原-抗体反应的检测，是目前应用最为广泛的免疫学检测技术。标记物与抗体或抗原连接后并不改变抗原抗体的免疫特性，具有灵敏度高、快速、可定性、定量、定位等优点。,免疫标记技术（Immunolabellingtechnique）,用荧光素与抗体连接成荧光抗体，再与待检标本中抗原反应，置荧光显微镜下观察，抗原-抗体复合物散发荧光，借此对抗原进行定性或定位。,1免疫荧光法(immunofluorescence,IF),（1）直接荧光法：荧光素直接标记抗体，对标本进行检测。该法优点是特异性高，缺点是检查任一抗原均须制备相应荧光抗体。（2）间接荧光法：用一抗与标本中抗原结合，再用荧光素标记的二抗进行检测。该法优点是敏感度比直接法高，制备一种荧光素标记的二抗即可用于多种抗原的检测,但非特异性反应亦增强。,免疫荧光法分类,免疫荧光法图示,此法将抗原-抗体反应的特异性与酶催化作用的高效性相结合，借助酶作用于底物的显色反应判定结果。应用酶标测定仪测定光密度（OD）值可反映抗原含量，灵敏度达ng/ml甚至pg/ml水平。常见的标记物为：辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）,酶免疫测定(enzymeimmunoassay,EIA),常用的方法如下：（1）酶联免疫吸附试验(enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA),1）ELISA是酶免疫测定中应用最广的技术，用于测定可溶性抗原或抗体。优点：灵敏度高、操作简便、稳定性强，可自动化检测，从而被广泛用于检测多种病原体抗原或抗体、血液及其他体液中微量蛋白成分、细胞因子等。,分类：（1）放射免疫分析法(radioimmunoassay,RIA)（2）免疫放射分析法（immunoradiometricassay,IRMA）,3放射免疫技术,乃用放射性核素标记抗原或抗体进行免疫学检测。该法兼有放射性核素的高灵敏度和抗原-抗体反应的特异性，检测灵敏度达pg水平。常用于标记的放射性核素为125I和131I，分为液相和固相两种方法。该法常用于测定微量物质，如胰岛素、生长激素、甲状腺素、孕酮等激素，吗啡、地高辛、IgE等。,放射免疫分析法(radioimmunoassay,RIA),属于非竞争性放射性配体结合分析技术。他与RIA为代表的竞争性放射性配体分析技术的区别主要有两点：一，放射性核素标记的是抗体而不是抗原，其二是采用过量抗体而不是限量抗体。RIMA与RIA相比较，提高了检测的灵敏度并使检测范围增宽，特异性和精确度进一步提高。,免疫放射分析法（immunoradiometricassay,IRMA）,免疫放射分析法有以下特点：,1.以标记抗体作为示踪剂2.反应动力学：因标记抗体是过量的，且反应是非竞争性的，抗原抗体是全量反应，故反应速度比RIA快。3.灵敏度明显高于放射免疫分析，约为放射免疫分析的10100倍。4.标准曲线工作范围宽。5.特异性高。6.稳定性好。,金标记免疫技术,胶体金标记技术(Immunogoldlabelingtechnique)是以胶体金作为示踪标记物，应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。,免疫胶乳试验应用,胶乳凝集试验,原理：胶乳凝集试验是一种间接凝集试验，它是以聚苯乙烯胶乳微粒作为惰性载体。胶乳为人工合成的载体，因此其性能比生物来源的红细胞稳定，均一性好。但胶乳与蛋白质的结合能力以及凝集性能不如红细胞，因此作为间接凝集试验，胶乳试验的敏感度不及血凝试验。,胶乳凝集试验,方法：传统的胶乳凝集试验分试管法与玻片法。试管法先将受检标本在试管中以缓冲液作倍比稀释，然后加入致敏的胶乳试剂，反应后观察胶乳凝集结果。玻片法操作简便，1滴受检标本和1滴致敏的胶乳试剂在玻片上混匀后，连续摇动23min即可观察结果。出现大颗粒凝集的为阳性反应，保持均匀乳液状为阴性反应。,抗链球菌溶血素“O”（ASO）,原理：胶乳凝集试验原理相同，在受检者血清中，加入溶血素“O”,出现凝集颗粒，即为阳性。参考值：ASO250U/L,临床意义：1.ASO测定对于诊断A族链球菌感染很有价值，其存在及含量可反映感染的严重程度。2.风湿热、急性肾小球肾炎、结节性红斑、猩红热、急性扁桃体炎等ASO明显升高。3.少数肝炎、结缔组织病、结核病及多发性骨髓瘤病人亦可使ASO增高。4.当效价250U/L时，才被认为有诊断价值。,抗链球菌溶血素“O”（ASO）,类风湿因子（rheumatoidfactor,RF）,类风湿性关节炎（RA）是由自身抗体免疫复合物引起的自身免疫性疾病。类风湿因子是由于感染因子（细菌、病毒等）引起体内产生的以变性IgG为抗原的一种抗体，故又称抗抗体。,原理：将变性IgG包被于聚苯乙烯胶乳颗粒上，这种致敏胶乳在与待测血清中的RF相遇时，即发生肉眼可见的凝集。参考值：正常人1：20稀释血清为阴性。,类风湿因子（rheumatoidfactor,RF）,临床意义：1.约90%类风湿性关节炎（RA）患者的RF呈阳性。2.某些自身免疫病，如冷球蛋白血症、进行性全身性硬化症、干燥综合征、SLE等。3.一些其他疾病如血管炎、肝病、慢性感染也可出现RF。,类风湿因子（rheumatoidfactor,RF）,酶联免疫吸附试验（ELISA）,原理：使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关。,ELISA主要有以下几种类型：,1.双抗体夹心法测抗原（常用）2.双抗原夹心法测抗体3.间接法测抗体（常用）4.竞争法测抗原5.竞争法测抗体6.捕获包被法测抗体7.亲和素-生物素ELISA法,包被特异性抗体,加入待测样品,加酶标特异性抗体,底物显色,洗涤,孵育,洗涤,孵育,双抗体夹心法测抗原,待测抗原须有两个可以与抗体结合的部位，其一端与包被于固相载体上的抗体结合，另一端与酶标记的特异性抗体结合。此法适用于检验各种二价或二价以上的大分子抗原，如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。不能用于分子量小于5000的半抗原或小分子单价抗原的测定。,双抗原夹心法测抗体,反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定。乙肝标志物中HBsAb的检测常采用本法。关键在于根据抗原结构的不同制备酶标抗原。,间接法测抗体,间接法是检测抗体最常用的方法。原理：利用酶标记的抗体检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。,操作步骤：（1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原，洗涤。（2）加稀释的受检样本，其中的特异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物，孵育洗涤。（3）加酶标抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶，孵育洗涤。（4）加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量。,间接法的特点,本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗体检测相应抗体。间接法成功的关键在于抗原的纯度。特别应注意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质。若抗原中含有无关蛋白，也会因竟争吸附而影响包被效果。,竞争法测抗原,操作步骤：,（1）将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体洗涤。（2）待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反应，孵育洗涤。（3）加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深。待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。,竞争法测抗体,当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应。,捕获包被法测抗体,样品中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定IgM抗本多用捕获法。先将所有样品IgM（包括特异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再测定特异性IgM。,操作步骤：,（1）将抗IgM抗体连接在固相载体上，形成固相抗IgM，洗涤。（2）加入稀释的待测标本：孵育后样品中的IgM抗体被、固相抗体捕获，洗涤。（3）加入特异性抗原试剂：其仅与固相上的特异性IgM结合，洗涤。（4）加入针对抗原的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合，洗涤。（5）加底物显色：如有颜色显示，则表示标本中存在、特异性IgM抗体，是为阳性反应。,亲和素-生物素-ELISA法,亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。生物素（biotin）又称维生素H，存在于蛋黄中。可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化的产物。亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，形成一种极为稳定的复合体。把亲和素和生物素与ELISA偶联起来，就可大大提高ELISA的敏感度。,乙型肝炎血清学检验临床意义,乙型病毒性肝炎是由乙肝病毒（HBV）引起的、以肝脏炎性病变为主，并可引起多器官损害的一种疾病。乙肝广泛流行于世界各国，主要侵犯儿童及青壮年，少数患者可转化为肝硬化或肝癌。传播途径：血液传播、性接触传播和母婴传播,HBV的抗原有3种：表面抗原（HBsAg）、核心抗原（HBcAg）和e抗原（HBeAg）。表面抗原大量存在于感染者血液中，是HBV感染以及检测的主要标志。核心抗原是乙肝病毒核心颗粒的唯一结构蛋白。由于它存在于Dane颗粒核心结构表面，被表面抗原覆盖，故不易在血循环中检出。可刺激机体产生抗-HBc。e抗原为可溶性蛋白质，在病理上认为是HBV复制以具有强感染性的一个指标。抗-HBe的出现，是预后良好的征象。,艾滋病实验室检验,艾滋病是一种危害性极大的传染病，由感染艾滋病病毒（HIV病毒）引起。HIV是一种能攻击人体免疫系统的病毒。它把人体免疫系统中最重要的T淋巴细胞作为主要攻击目标，大量破坏该细胞，使人体丧失免疫功能，HIV在人体内的潜伏期平均为89年。,艾滋病从感染到发病的一般过程,艾滋病检测的方法,HIV抗体筛查试验,明胶颗粒凝集试验的操作和结果判断,酶联免疫分析ELISA（双抗原夹心、两步法）,HIV抗体检测结果处理规范,HIV抗体确证试验,WesternBlot免疫印迹法针对各种病毒蛋白的特异抗体区分ELISA真阳性与假阳性检测HIV-1和HIV-2,全自动免疫印迹仪,肿瘤标志物检测的临床应用,肿瘤标志物的定义肿瘤标志物（tumormarker，TM）是指在肿瘤的发生和增殖过程中，由肿瘤细胞本身所产生的或者是由机体对肿瘤细胞反应而产生的，反映肿瘤存在和生长的一类物质，包括蛋白质、激素、酶（同工酶）、多胺等。可在肿瘤患者血液或体液中检测到肿瘤标志物。,肿瘤标志物的分类,癌胚抗原类标志物糖类抗原标记物酶类标志物激素类标志物蛋白类标志物,胚胎抗原类标志物,1、甲胎蛋白AFP胎儿发育早期，由肝脏和卵黄囊合成的一种血清糖蛋白，电泳时位于白蛋白和1球蛋白之间，胎儿出生后不久即逐渐消失。成人血清中含量甚微。参考值：AFP300ng/mL，但也有18%的病人AFP并不升高。（2）良性肝病，如病毒性肝炎、肝硬化患者AFP浓度有不同程度的升高，但其水平通常低于100ng/mL。其升高原因主要是由于受损伤的肝细胞再生而形成幼稚化细胞，幼稚化的肝细胞具有产生AFP的能力。但随着受损肝细胞的修复，AFP逐渐恢复正常。（3）生殖腺胚胎性肿瘤患者血清中AFP浓度可见升高。（4）妇女妊娠3个月后，血清AFP浓度开始升高，78个月时达到高峰，一般在400g/L以下，分娩后3周恢复正常。若孕妇血清中AFP异常升高，应考虑胎儿神经管缺损畸形的可能性。,2、癌胚抗原CEA是一种可溶性糖蛋白，胚胎期主要存在于胎儿的胃肠管、胰腺和肝脏。胃肠道恶性肿瘤时可见血清CEA升高，在乳腺癌、肺癌及其他恶性肿瘤中也可出现表达，并分泌于体液中。参考值：CEA5ug/L（ELISA）,（1）血清CEA升高主要见于结肠癌、直肠癌、胰腺癌、胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌，其他恶性肿瘤也有不同程度的阳性率。（2）随着临床应用的发展，CEA变得越来越广谱。主要用于连续的随访检测，可用于恶性肿瘤手术后的疗效观察及预后判断，也可用于对化疗病人的疗效观察。（3）某些良性疾病，如直肠息肉、结肠炎、肝硬化、肝炎和肺部疾病也有不同程度的升高，但阳性率较低。（4）98%的非吸烟者CEA5ng/mL,临床意义,糖类抗原肿瘤标志物,1、糖类抗原12-5（CA12-5）是卵巢癌和子宫内膜癌的肿瘤标志物分子量为20万的糖蛋白可被单克隆抗体OC125所识别在卵巢肿瘤上皮和Mullerian副肾管来源的病理和正常组织中表达，其生物学功能不明。参考值：CA12-53.5万U/L（ELISA）,（1）卵巢癌病人血清中CA125水平明显升高。手术和化疗后期水平很快下降。当复发时，在临床确诊前几个月便可呈现CA125增高，尤其卵巢癌转移患者的血清CA125更明显高于正常参考值。（2）其他非卵巢恶性肿瘤也有一定阳性率，如乳腺癌40%，胰腺癌50%，胃癌47%，肺癌41.4%，结肠直肠癌34.2%，其他妇科肿瘤43%。（3）非恶性肿瘤，如子宫内膜异位症、盆腔炎、卵巢囊肿、胰腺炎、肝炎、肝硬化等疾病也有不同程度升高，但阳性率较低，诊断时应注意鉴别。（4）在许多良性和恶性胸腹水中发现有CA125升高，羊水中也能检出较高浓度的CA125。（5）早期妊娠的头3个月内，也有CA125升高的可能。,临床意义,2、糖类抗原15-3（CA15-3）CA15-3是乳腺癌的最重要的特异性标志物。30%-50%的乳腺癌患者的CA15-3明显升高，是乳腺癌患者诊断和监测术后复发、观察疗效的最佳指标。参考值：CA12-52.5万U/L（ELISA）,（1）乳腺癌患者常有CA15-3升高，但在乳腺癌的初期敏感性较低，约为60%，转移性乳腺癌阳性率可达80%。CA15-3可以作为原发性乳腺癌的辅助诊断指标，也可以作为手术后随访，监测肿瘤复发、转移的指标。（2）其他恶性肿瘤，如肺癌、肾癌、结肠癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、原发性肝癌等也有不同程度的阳性率。（3）肝脏、胃肠道、肺、乳腺、卵巢等非恶性肿瘤疾病，阳性率一般低于10%。,临床意义,3、糖类抗原19-9（CA19-9）CA19-9是胰腺、胃、胆囊和肠癌的标记物。参考值：CA19-980%。（4）女性乳腺癌部分患者也会PSA阳性。,临床意义,激素类肿瘤标志物,人绒毛膜促性腺激素（HCG）糖蛋白类激素，由蛋白核心与位于羧基端的以唾液酸为终止的侧链组成由合胞体滋养层细胞产生被证实是一种原始物质(可作为一