发酵工程课程设计论文.doc

中北大学2012年发酵工程课程设计说明书1概述1.1苹果酸简介苹果酸（Malic acid），由于分子中有一个不对称碳原子，有两种立体异构体。大自然中，以三种形式存在，即D苹果酸、L苹果酸和其混合物DL苹果酸。苹果酸是一种较强的有机酸，又名羟基丁二酸，是一种白色或荧白色粉状、粒状或结晶状固体。晶体中不含结晶水，DL-型熔点129，L-型熔点100，加热到180可以失水分解成富马酸或马来酸。在通常条件下，苹果酸是稳定的，但其纯晶体稍有吸湿性，在高湿度条件下可能液化。在相对湿度98，25下放置6天，约增重50.4. 苹果酸在催化剂存在下与醇可发生酯化反应。以三氟化硼为催化剂与醇回流可形成单酯。与多元醇、芳香多元羧酸作用，可形成树脂类产品，如醇酸聚酯树脂。 在氧化银存在下，苹果酸酯与卤代烷反应可以产生醚类，如乙氧基琥珀酸。在醇溶液中，苹果酸酯与氨作用，可以生成苹果酸酰胺。苹果酸在日常生活中有着重要的作用。在食品应用行业，被生物界和营养界誉为“最理想的食品酸味剂”，目前在老年及儿童食品中正取代柠檬酸。除此之外，苹果酸可作为保鲜剂、除腥脱臭剂、面试强化剂等。在医药行业，L苹果可以用于治疗肝病、贫血、免疫力低下、尿毒症、高血压、肝衰竭等多种疾病，并能减轻抗癌药物对正常细胞的毒害作用。苹果酸主要用于食品和医药行业。 1.2苹果酸发酵机理L-苹果酸在生物体中普遍存在，它作为三羧酸循环的一员而参与细胞代谢。在一般生物中它只参与循环而不会大量积累，否则会造成代谢流的阻塞。要想积累苹果酸，必须要有补充4碳酸的途径。理论上讲，补充4碳酸的途径有两条：乙醛酸循环和丙酮酸羧化支路。三羧酸循环（tricarboxylicacidcycle acid cycle ，TCA cycle,TCA循环）是一个由一系列酶促反应构成的循环反应系统，在该反应过程中，首先由乙酰辅酶A与草酰乙酸缩合生成含有3个羧基的柠檬酸，经过4次脱氢，2次脱羧，生成四分子还原当量和2分子CO2，重新生成草酰乙酸的这一循环反应过程成为三羧酸循环。乙醛酸循环（glyoxylate cycle）是在异柠檬酸裂解酶的催化下，异柠檬酸被直接分解为乙醛酸，乙醛酸又在乙酰辅酶A参与下，由苹果酸合成酶催化生成苹果酸，苹果酸再氧化脱氢生成草酰乙酸的过程。1 三羧酸循环图 乙醛酸循环图1.3苹果酸发酵工艺L-苹果酸的发酵工艺大体可以分为三类：一步发酵法、两步发酵法和酶法转化。一步发酵又称为直接发酵，它用糖类为原料，用霉菌直接发酵产生苹果酸。两步发酵法也是用糖类为原料，先由根霉发酵成富马酸（或富马酸-苹果酸混合物），再由酵母或细菌转化成苹果酸。酶法转化是用富马酸（盐）或马来酸为原料，用微生物酶（包括全细胞）转化成苹果酸。发酵方法利用了微生物酶的立体异构专一性，生产的都是L-苹果酸，是生物体内所存在和可以利用的构型。2发酵工艺发酵工程是指利用微生物的生长繁殖和代谢活动来大量生产人们所需产品的过程的理论和工程技术体系。发酵工程也称作微生物工程，该工程技术体系主要包括：微生物菌种选育和保藏；培养基和发酵设备的灭菌技术；空气净化除菌技术；菌种的扩大培养；微生物代谢产物的发酵生产和产品分离纯化技术；发酵过程中的补料技术；发酵过程的参数检测、分析与控制技术。2原料空气采样配料压缩材料预处理 培养基入罐冷却菌种选育与保藏灭菌减湿种子扩大培养过滤发酵生产产品分离纯化下游加工发酵工艺（需氧）流程图32.1菌种选育菌种选育包括自然育种和诱变育种。自然育种（natural screening）是利用微生物在一定条件下产生自发突变的原理，通过分离、筛选排除衰退型菌株，从中选出维持或高于原有生产菌种的过程，已达到稳定和提高生产能力的目的。诱变育种（mutation screening）是利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群体，促进其突变率大幅度提高，然后采用简便高效的筛选方法，从中选出少数具有优良性状的菌种。2采样材料的预处理分离所需菌种培养菌种一般菌种分离纯化和筛选的步骤如下：菌种保藏性能鉴定菌种复筛菌种初筛菌落选择优良菌种的选择是发酵法生产苹果酸的技术关键，产品收率及分离纯化都与菌种密切相关。能产生苹果酸的微生物的种类很多，有黄曲霉、米曲霉、寄生曲霉、华根霉、无根根霉、温特曲霉、膜瞨毕赤酵母、短乳杆菌、产氨短杆菌等。2.1.1苹果酸菌种选育L-苹果酸的发酵工艺大体可以分为三类：一步发酵法、两步发酵法和酶法转化。以糖蜜为原料的一步发酵法关键在于筛选到高效菌种，而两步法由于涉及到两种微生物，培养条件要求比较严格，发酵周期较长，产酸率相对较低，副产物较多。近年来，一种以苹果酸为底物利用微生物菌体的富马酸合成L-苹果酸的技术，以其产酸水平高、发酵周期短、能耗少、操作程序简单等优势引起国内外研发人员的青睐。4-7试验证明, 用富马酸为原料经微生物发酵生产L-苹果酸的转化率已高达98%以上，因此用富马酸为原料生产L-苹果酸的技术得到广泛采用。国内近期研究以及工业化生产多以富马酸法为主。经研究发现温特曲霉所需培养温度为20-30摄氏度，PH2025-3030种子生产情况滚大球良好滚小球表1表明豆饼粉粒度过大或过细都会引起菌种培养过程中的滚球现象，不利于种子的生长， 因此豆饼粉的粒度必须控制在25-30目。2.8.2培养温度对菌种生长的影响不同培养温度下菌种的生长状况如表2。表2 菌种在不同温度下的生长状况Table 1 Growing state of strain under different temperatures培养温度（）2830323436生长周期（h）25242840生长极慢温特曲霉菌株本身不耐高温，经诱变后耐温性又有所下降。由表2可见，当温度超过36后，种子几乎不生长，适宜的培养温度为30。在此温度下的种了培养周期为1d。2.8.3通气量与搅拌转速保持搅拌轴恒定转速300rmin，考察了不同通气量(VVm)对产酸的影响，结果如图I(富马酸初始浓度115.8gL(下同)；温度30)。由图1可见本菌种以富马酸为底物发酵产L-苹果酸，在整个发酵产酸过程中各阶段对耗氧量需求是不同的。发酵前4 8h，产酸受通气量改变影响很小，但在进入发酵中期随着通气量的提高，产酸速率明显加快，当通气量增加到1：1.3时，在48108h间产酸速率上升很快，产酸峰值在120h。说明发酵前期即048h主要是培菌过程，在此过程中体系内的富马酸、L-苹果酸及pH值的变化均较小；48h以后为产酸阶段，富马酸的浓度速率下降和L苹果酸产酸速率增加很快，即产酸过程中耗氧速率迅速增加，因此必须加大通气量。在这两个阶段控制不同的通气量进行试验，结果见表3。表3表明培菌阶段通气量应控制在1：105，而一进入产酸阶段要将通气量增加至1：1.3。较高的搅拌速度能增加培养基的溶氧量并可以稀释培养基中的大分子9-10。产酸阶段适当降低通气量，而提高搅拌转速，考察350、400rmin转速下的发酵试验，结果如表4发酵液的溶解氧与通气、搅拌以及发酵罐的大小、形式有密切关系。从表4可看出当搅拌转速由300rmin增加到350rmin，同时适当降低通气量可提高转化率和产酸，继续增加转速反而使起不到增加溶解氧的效果11。2.8.4发酵进程中的温度控制摇瓶试验结果表明整个过程以3O恒温控制为好，但在200L罐试验过程中发现，在产酸阶段温度可降至在25左右，即采取变温发酵比恒温发酵的效果更好，见图2。由图2可见进入产酸期后适当降低温度可提高产酸速率，并能使产酸峰值点前移，从而缩短发酵周期。同时说明温特曲霉F891酶产酸最佳温度为2526。因此48h前温度控制在30 ，48h后应降低至2526 。2.8.5发酵进程中pH值变化与初始pH值控制摇瓶试验的结果表明温特曲霉发酵的适宜pH值为7，但在发酵罐试验时发现48h后体系中的pH值上升过快并导致菌体衰老快、发酵成熟早、富马酸转化率及L-苹果酸产酸率低等问题。其原因是首先温特曲霉本身耐酸碱性能较低，其次种子培养阶段菌体生长繁殖所利用的碳源主要是培养基中的蔗糖， 当菌体繁殖到一定程度时蔗糖也基本耗尽，菌体要继续生长繁殖就必须利用发酵液中富马酸钠，富马酸被转化后，钠离子与发酵过程中产生的CO2生成碳酸钠，使体系的pH值上升，菌体生长越快，pH值上升亦越快。当pH7.5后，温特曲霉的酶活性则开始受到抑制，当pH8后，温特曲霉菌体会出现自溶现象，其酶活性也开始丧失。因而必须抑制发酵过程pH的上升速度，使整个发酵过程中体系pH值控制在适宜的范围，有效的方法是适当降低初始pH值。但初始pH值如低于60则发酵培养只长菌丝不产酸，故发酵培养基的初始pH值最低不能小于6.0。当发酵培养基的初始pH值控制在6.06.2时则可以减缓发酵过程中pH的上升速度，发酵进程中pH值变化还受温度和通气量的影响(见图3)。从图3可看出当发酵培养48h时pH达到64左右，此后进入产酸期，为使产酸期pH值控制在最佳范围，此时将温度由30降低至2526，同时通风量增至1：1.26，则可充分发挥酶的活性使产酸直线上升，产酸高峰出现在l08h。通过上述试验，得出采用经60Co诱变选育得到的温特曲霉F-891菌株，以富马酸为底物深层发酵生产L-苹果酸的优化工艺条件为：富马酸初始浓度115.8gL；接种量10；048h发酵培养温度30，通风量1：1.05VVm，pH值6.O6.2 ，48h后发酵温度2526，通风量1：1.26VV/m，pH值7.8；发酵周期102-108h。2.9生产工艺流程图3下游加工当L-苹果酸的含量达到108.72g/L时即可放罐。3.1L-苹果酸提取工艺操作要点（1）发酵液过滤浓缩：发酵液经泵加压后进入板框过滤机，L-苹果酸随清液流出，而菌丝体、蛋白质和固体悬浮颗粒等杂质被截留，将他们热交换器冷却后，送回罐进一步浓缩，直至超滤浓缩液呈浆糊状，再用少量的水清洗，使滤液渣中残余的L-苹果酸充分洗涤出来。洗涤出的苹果酸溶液的浓度为12%。（2）中和抽滤：将得到的清液转入中和桶，就加入碳酸钙中和，变为苹果酸钙从液相中析出，从而与发酵液中其他可溶性杂质分离。温度在4550，pH6.97.2。加入碳酸钙时，加入速度以泡沫不溢出桶外为好。放入虹吸排液真空抽滤机抽滤。用40热水洗涤。（3）酸解脱色过滤：将苹果酸钙加入其重量34倍的水，调浆，加热到5055，缓慢滴加硫酸至pH为1.52.0，继续搅拌10min，加粉末活性炭（10g/L30g/L）脱色，硫酸一般为碳酸钙的用量的92%95%，过滤，除硫酸钙，活性炭，用热水洗涤，收集到的滤液中苹果酸的浓度为16%。（4）将苹果酸液通过离子交换树脂除去各种杂质离子，浓度达到18%，真空浓缩至80%左右，放入结晶罐结晶，用冷水降温至35，结晶罐转速为10r/min15r/min，缓慢降温结晶约15h，离心分离出L-苹果酸晶体，立即干燥，得到苹果酸晶体。3.2废水处理苹果酸生产废物主要来自发酵和提取工序中产生的废中和液、浓糖水、洗糖水、洗罐水。其中浓糖水和洗糖水浓度高，排放量大。洗罐水虽然浓度高，但排水量很少，有机物负荷小。其它各点排放的废水浓度较低，水量也不大。废水中主要含有淀粉质、蛋白质、各种有机酸、生产菌体所分泌的酶、发酵残留物、葡萄糖、氨氮和脂肪等有机物。利用活性污泥法处理产生的污水，可以得到良好的效果，达到国家污水排放指标。3.3废气处理发酵的过程中产生的废气，可能含有对环境不利的因素，所以不能直接排入大气中，所以应考虑到废气的处理.废气处理严格执行中华人民共和国锅炉大气污染排放标准GB1327-91指标/期限最大允许烟尘浓度(毫克/标立米)最大允许林格曼黑度级2002年12月31日起立项新安装或更换的锅炉2501致 谢在我进行发酵课程设计的两周时间里，得到了许许多多人的极大帮助和支持。在此我深深地表示感谢!此次课程设计感谢贾万利老师对我们提供的材料，感谢老师对我们精心的指导。在此次课程设计中，通过上网百度、图书馆查阅资料和请教学长学姐，我学到了很多。深刻体会到理论与实践的差别，感受到理论与实践完美结合的不易。这些让我对以后的社会生活有了一定的了解。为后续的实习工作打好了坚实的基础。真心感谢所有帮助过我的人，感谢化工与环境学院能够给予我们这次学习的机会。最后，向所有帮助过我完成此次课程设计的老师、同学致以最崇高的敬意！参考文献1王镜岩，朱圣康，徐长法.生物化学，北京：高等教育出版社，20022何建勇，夏焕章，倪孟祥.发酵工艺学，北京：中国医药科技出版社， 20093 俞俊棠，唐孝宣，邬行彦新编生物工艺学（上册），北京：化学工业出版社，20054 施巧琴，吴松刚，郑腾等L-苹果酸产牛菌F-871变株合成富马酸酶的研究【J】菌物系统，2003，22(2)：2832885 Peleg Y，RokemJs，Goldberg IAsimple plateassay for the screening of LmaJJc acid producing microorganismsJFEMs Microbiology Letter，1990，67233-2366 Battat E，Peleg Y，Bercovitz A，et a1Optimization of L-malic acid production by Aspergiulls