（环境工程专业论文）降解高浓度含氰废水菌株的筛选及其性能研究.pdf

昆明理工大学工程硕士学位论文摘要 a b s t r a c t b i o d e g r a d a t i o np l a y s a n i m p o r t a n t r o l ei n c y a n i d e c o n t a i n i n g w a s t e w a t e r t r e a t m e n t t h e s c r e e n i n g o f h i g h l y e f f e c t i v e c y a n i d e d e g r a d a t i o n s t r a i n sw e r e i n v e s t i g a t e d a sf o l l o w s ，( 1 ) t h eb u i l d i n go fae f f i c i e n t ，s i m p l ea n dc o n v e n i e n t s c r e e n i n gm o d e lt oo b t a i na na i m e ds t r a i na n dt h eo p t i m i z a t i o no fc e l lg r o w t ha n d d e g r a d a t i o nc o n d i t i o n ss u c ha ss h a k e rr o t a t i o n ，p hv a l u ea n dt e m p e r a t u r e ，( 2 ) t h e s e l e c t i o no fi m m o b i l i z a t i o nm e t h o d s a n dc o m p a r i s o no fd e g r a d a t i o nc h a r a c t e r i s t i cf o r t h ei m m o b i l i z a t i o n ah i g h l ye f f e c t i v e s c r e e n i n gm o d e lw a sb u i l t ，i n w h i c he n r i c h m e n tw a s c o n d u c t e db ya d d i n gad e f i n i t ea m o u n to fc y a n i d ei n t ot h ei n n u t r i e n tm e d i u m f i f t y k i n d so fc y a n i d e - r e s i s t a n ts t r a i n sw e r es c r e e n e df r o mt w e n t yn i n es a m p l e so fs o i l ， a m o n gw h i c ht w e n t yk i n d so fs t r a i n ss h o w e dt h ec y a n i d e d e g r a d a t i o na b i l i t ya n dt h e b a c t e r i a ls t r a i nn u m b e r e dd 0 2w a st h eb e s t t h ee x a m i n a t i o no fc e l lg r o w t ha n dd e g r a d a t i o nc h a r a c t e r i s t i c so fs t r a i nd 0 2w a s c o n d u c t e di nt h ef u r t h e rs t u d i e s t h es t r a i nh a dah i g hc y a n i d e - r e s i s t a n ta b i l i t yt h a ti t c o u l dg r o wi nt h ep r e s e n to fc y a n i d eu pt o10 0 0m g lc n i tw a sa d v a n t a g e st o c o n d u c tt h ec e l lc u l t u r ew i t h2 0 m lm e d i u mi n2 5 0 m lf l o c ka n dt h eo p t i m u mc u l t u r e a n db i o d e g r a d a t l o nc o n d i t i o n sw e r ed e t e r m i n a t e dt ob e1 2 0 r p m ，p h8 0a n d3 0 a n d t h eb i o d e g r a d a t i o nr a t ef o rt h ew a s t e w a t e ro f5 0 0m gc n lc o u l dr e a c ht o9 9 i n 1 0 h m e t a l e y a n oc o m p l e x sc o u l da l s ob ed e g r a d e db yd 0 2w i t ht h ec o n v e r s i o no f 9 6 i n12 hf o rt h ew a s t e w a t e ro f5 0 0 m gc n l t h ee x p e r i m e n t so ft h ei m m o b i l i z a t i o nc e l l so ns o d i u ma l g i n a t ea n dz e o l i t e c a r r i e rs h o w e dt h a tt w ok i n d so fi m m o b i l i z a t i o nc e l l sd i s p l a yt h en e a r l ys a m e d e g r a d a t i o na c t i v i t ya n dc u r v ea st h ef r e e c e l l r e s p e c t i v e l y t h e i m m o b i l i z a t i o n p r o c e s sw i t hz e o l i t ea st h ec a r r i e rw a sm o r es i m p l et h a no n ew i t hs o d i u ma t g i n a t e t h eo p t i m u mr e a c t i o nc o n d i t i o n sf o ri m m o b i l i z e dc e l l sw e r e3 0 a t a dp h8 0 i nt h e i m m o b i l i z a t i o np r o c e s s ，g r o w t ho fc e l l so nt h ez e o l i t ea n ds u s p e n d e dc e l l sw e r e s y n c h r o n o u sa n db i o m a s sa d s o r b e db yz e o l i t ew a sc a l c u l a t e d t ob e o 2 2 8 9d r y w e i g h t g t h ei m m o b i l i z e dc e l l sc o u l db er e u s e da tl e a s t5t i m e s c y a n i d ed e g r a d i n g w a sa l s oc o n d u c t e di nt h eo p e ns y s t e ma n di th a sb e e nf o u n dt h a tt h es t a b i l i t yo f 昆明理工大学工程硕士学位论文摘要 b i o l o g i c a ls y s t e m c o u l db em a i n t a i n e di nt h e p r e s e n t o f c y a n i d e a n dt h e b i o d e g r a d a t i o nr a t ef o rt h ew a s t e w a t e ro fc n o f5 0 0 m g lr e a c ht o9 9 i n6 h k e yw o r d s ：b i o d e g r a d a t i o n ；c y a n i d e c o n t a i n i n gw a s t e w a t e r ，s t r a i n ；s c r e e n c h a r a c t e r i s t i c i i i 昆明理工大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下( 或 我个人) 进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内 容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成 果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。苯声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：p 孵舒 日期：硎5 年6 月g 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解昆明理工大学有关保留、使用学位论文的规定，即： 学校有权保留、送交论文的复印件，允许论文被查阅，学校可以公布 论文的全部或部分内容，可以采用影印或其他复割手段保存论文。 ( 保密论文在解密后应遵守) 趟 日 期：型兰生鱼旦苎旦 注：此页放在封面后，目录前。 昆明理工大学工程硕士学位论文 第一章文献综述 第一章文献综述 生物净化法是利用微生物的代谢作用，使废水中的污染物转化成稳定、无害 的物质。由于微生物本身的可分解性和可再生性，这种通过微生物降解废物的技 术为人类提供了一种安全有效而且成本较低的方法。但是当生物法应用于有毒或 非天然难降解物质时，常常遇到诸如有毒物质对微生物的抑制作用、降解效率低 等问题，因此如何治理含氰化物的废水已成为近年来生物法处理废水一个重要的 研究方向。本章主要介绍了尉毒物氰化物的分类及来源、毒性机理、各种氰处理 方法和国内外生物法处理的研究进展，其中包括微生物细胞固定化技术等方面的 研究进展。 1 ，1 氰化物的分类、来源及毒性机理 1 1 ，1 氰化物的分类及来源 氰化物是指化合物分子中含有氰基( c n ) 的物质。根据与氰基连接的元素或基 团是有机物还是无机物把氰化物分成两大类，即有机氰化物和无机氰化物。无机 氰化物的应用与来源广泛，品种较多，按其性质与组成又把它分为简单氰化物和 络合氰化物。氰根具有与卤族元素相似的化学性质，可与碱金属、碱土金属、重 金属阳离子进行反应，产生一系列的氰化物、氰酸盐和硫氰酸盐【i 】。 环境中的氰化物既有自然来源，例如木薯、苜蓿和杏仁中含有一定量的氰化 物，其含量可高达3 9 氰化物k g 作物，也有人为来源( 见表1 1 ) ，氰基作为强 络合剂，在工业上的应用非常广泛，黄金生产、冶炼、胶片工业、有机合成等行 业现有的生产工艺都离不开氰化物的使用。如黄金冶炼，虽然人们己对开采方法 进行了不少改进，先后发展了很多新工艺，但是不管何种方法，仍然需要氰化物 作为黄金浸取剂，由此产生了大量浓度很高含氰废水。另一方面，在很多化工生 产中，氰化物是副产品之一，丙烯腈、腈纶、合成氨以及氰类物质为原料的生产 工艺中都有大量氰化物产生。由于工业性质的不同，排出的含氰废水的性质、成 分也不相同。即使同种行业产生的废水，废水含氰浓度相差也很大，表1 2 列出 了几种行业含氰废水处理情况。 昆明理工大学工程硕士学位论文 第一章文献综述 表1 1 氰化物的来源 t a b l el 一1s o u r c e so fc y a n i d e c h r o m o b a c t e r i u mv i o l a c e u m 、p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a 、 产氰细菌2 1 p s e u d o m o n a sc h l o r a p h i s 、p s e u d o m o n a sf l u o r e s c e n s 等。 n a c y s t i sn i d u l a n s 、c h l o r e l l av u l g a r i s 、n o s t o cm u s c o r u m 、 l三 自然 产氰海藻3 1 p l e c t o n e m ab o r y a n u m 等。 曩 来源 产氰的病原霉菌g l o e o c e r c o s d 0 r as o r g h i l l 、m a r a s m i u so r e a d e s 、s n o w 4 1m o u l d s 、s t e m p h y l l i u ml o t i 等。 产氰作物【5 木薯、苣蓿、苹果树、枇杷、青豆、杏树等。 非自 产气、产氰作物生产、电解、废金属回收、台成纤维、煤气化、煤焦化、 然来 塑料、涂料、冶金、医药工业和洗矿等工业【6 ，8 】。 源 表1 2 几种行业含氰废水处理情况1 9 t a b l e1 2c y a n i d et r e a t m e n ts t a t u so fs o m ei n d u s t r i e s 行业 氰化提金 电镀无机化工钢铁i 业 c n 。 原矿：1 5 0 3 0 0电镀液： 5 0 0 0 0合成氨：1 0 1 6 0焦碳：2 0 4 0 i ( m g l ) 精矿：3 0 0 1 0 0 0废水：2 0 。1 5 0 0黄磷：3 6 8高炉煤气：1 5 0 1 1 2 毒性机理 氰化物的慢性中毒症状为头晕、头痛、呕吐等。c n l 进入人体后便生成氰化 氢，氰化氢能迅速地被血浆吸收和输送，它能与铁、铜、硫以及某些化合物( 在生 存过程起重要作用中) 的关键成分相结合，抑制细胞色素氧化酶，使之不能吸收血 液中的溶液氧，当这些酶不起作用时，就会导致细胞窒息和死亡【i 。h c n 的作用 极为迅速，在含h c n 0 1 m g l 的空气中，人会立即死亡，一般只要误服0 1 9 左右 n a c n 就会导致死亡，当水中c n 含量为o 3 m g l 时便可使鱼致死。根据国标 g b 8 9 7 8 一1 9 9 6 ，工业废水一级排放标准中氰化物最高允许浓度是o 5 m g l 。 1 2 含氰废水处理技术 一般来说，c n 含量大于4 0 0m g l ，视为高浓度含氰废水，低于此浓度，则 昆明理工大学工程硕士学位论文第一章立= 献综述 为低浓度含氰废水。对前者需进行氰化物的回收以降低生产成本，但同时回收工 艺所排出的废液仍需进行处理才能安全排放；低浓度含氰废水直接采用破坏氰的 方法处理。回收氰化物方法包括酸化法、酸化沉淀一再中和法、活性炭吸附法、 离子交换法、电解回收法和膜法( 气态膜法、液膜法) 等；破坏氰化物类方法包 括活性氯氧化法、s 0 2 a i r 法、双氧水氧化法、臭氧氧化法、活性炭法、电解氧 化法、高温水解法和化学沉淀法等1 ，1 2 】，表1 3 列出主要几种含氰废水的处理方 法。对于氰化物的治理，目前工业上应用较多、工艺成熟的方法有活性氯氧化法、 电解氧化法、离子交换法等。这些方法都存在一定的不足，如活性氯氧化法虽然 有效易操作，但是所产生及残余氯化物是另一种离污染物，形成严重的二次污染； 电解法的运行成本较高，耗电量大；离子交换法投资大，操作复杂，交换效果易 受其他因索干扰，而且总的说来这些以化学反应为基础的处理方法对于金属氰络 合物、硫氰酸盐、铁氰酸盐等氰形式不能彻底清除。因此这些方法难以适应当今 世界环境保护的趋势，寻找投资少、操作简便、能有效除氰化物的新工艺是十分 必要的。 1 3 微生物法 生物法是目前受到日益重视的处理氰化物的方法之一。它利用微生物自身的 代谢作用，使废水中的氰化物转化为稳定、无害的物质。与传统方法相比，生物 法工艺简单、处理水量大、运行费用低，去氰率一般在9 0 以上并且无= 次污 染，操作危险性降低。同时采用生物法治理废水，可以通过不同菌株的配伍及混 合培养，实现氰和其他有机污染物在同一微生物体系下的共同净化。另外，也可 以将生物法和其他处理工艺相结合，提高污水中氰化物的处理效率，如用于处理 聚丙烯车间含氰废水的湿式空气氧化法后接活性污泥工艺和双氧水氧化后接天然 细菌降解工艺等。 活性污泥法是一种传统的废水生物处理形式，它主要应用于城市污水的处理， 当用于有毒工业废水时，往往引起污泥中毒。以c n 为例，一般的活性污泥分解 作用十分缓慢，效果并不理想且当c n 浓度提高到2 0 m g l 以上时，污泥中毒 加速，废水生化处理效果明显下降。近年来人们提出采用生物强化技术来解决有 毒物质的生物处理，生物强化主要是指通过引入能够降解目的污染物的微生物柬 改善原有微生物处理系统中的去除效能。因此筛选培育具有特异降解净化功能的 优势菌株，是实现强化生物技术在各种有毒工业废水净化中应用的基础之一。 昆明理工大学工程硕士学位论文 第一章文献综述 表1 3主要几种舍氰废水处理方法 t a b l el - 3m a i nt r e a t m e n to fc y a n i d e c o n t a i n i n gw a s t e w a t e r 方法原理优缺点 在酸性条件下，生成挥发性h c n ，用碱液吸可处理浓度较高的含氰废水，但是 收。 设备和操作较复杂，投资较高：有 酸化法 n a c n + h 2 s 0 4 - - 2 h c n + n a 2 s 0 4 - h c n + n a o h时需要进行二次处理，这就使流程 n a c n + h 2 0 太长。 在p h 为1 0 - 1 1 条件下，通过使用液态氯或次 处理方法成熟，处理效果好，能达 碱氯化氯酸钙产生次氯酸盐离子，破坏氰化物。 标排放，但是操作较复杂，成本较 法 c n + c 1 2 + 2 0 h 。一h o c l + h c l ， 高，同时易产生余氯。 2 h o c i + 2 h c i + 2 c a ( o h ) z - - c a c l 2 + c a ( o c l ) 2 不但能使氰化物除去，还能降低水 利用s 0 2 0 2 混台气体作为氧化剂，在可溶解 s o2 - a i r中的重金属浓度，但是1 ：艺控制严 铜存在下分解氰化物。c n 。+ s 0 2 十0 2 + h 2 0 法格，而且s c n 不能迅速氧化，原料 c n o + h 2 s 0 4 ，c n o 。+ 2 h 2 0 o h + n h 3 + c 0 2 来源困难。 使用双氧水破坏氰化物。可降低氰化物浓度达05 mg l 以 双氧水 c n + h 2 0 2 一c n o 一+ h 2 0 ，c n s + h 2 0 下，操作简单，但是氰酸盐和硫代氰 法 s + c n 0 一+ h 2 0 酸盐不被氧化，药剂费刚高。 利用空气或氧气在高压高频电荷通过电晕放 降解铁、锌、镍和铜的氰化物效率 臭氧氧电产生的臭氧氧化氰化物。n a c n + 0 3 一 高，但是对钴氰化物降解效率低， 化法 n a c n o + 0 2 ，n a c n o + 0 3 - - n a h c 0 2 + n 2 ， 耗能大，臭氧生产和过科控制设备 s c n 。+ h 2 0 + 0 3 一c n + h 2 5 0 4 成本高。 适合于高浓度吉氰废水处理，操作 电解前将调整p h 7 ，c n 。在阳极产生c n o 、 电解氧 简单，同时能除去金属离子，但是能 c 0 2 、n 2 和c 1 2 ，c 1 2 进入溶液生成c n o ，阴极 化法耗大、成本高，处理后还需二次处 析出金属。 理。 化学沉 该法是向废水中加入f e s o 。或f e s o 。+ n a ：s o t ，使操作简单，处理费用低，但是处理效 淀法 氰化物生成铁氰化物沉淀。 率差，淤渣多，出水未达标a 可以有效地脱除氰化物，操作简便， 微生物利用微生物的生物化学性质对氰化物进行分 但是有关技术工艺仍需进一步研 仕 解，使之转化为n h 3 、c o ”硫酸盐等。 究。 4 昆明理工大学工程硕士学位论文 第一章文献综述 氰化物微生物降解已有一些工业实现的例子。h o m e s t a k e 公司在9 0 年代初采 用生物法处理了金矿含氰废水。与双氧水处理法相比，生物法投资是双氧水法的 6 0 ，操作费用是它的2 9 t 2 6 】。印第安石化公司采用生物处理法处理聚丙烯车间 的含氰废水，利用天然细菌a c e t o b a c t e r 、a c i n e t o b a c t e r 建立了物理一化学法后接活 性污泥的联合工艺，虽然处理了含氰废水流量可达到3 0 0 m 3 i d 。由于旋转生物接 触器( r b c l 是敞开的，易逸出少量有毒气体。 在环境修复领域，氰降解微生物也有一定的用途，如用双氧水法和细菌生物 降解联合修复被氰化物污染的土壤和水体【2 8 1 。 氰降解微生物也可用于采矿工业，如用a c i n e t o b a c t e rr f b1 从矿石洗提液中 把金从其他金属氰络合物中提取出来；通过采用经富集技术分离得到的 p a e r u g i n o s a 菌株来选择性去除一系列的腈，从而提高了页岩油的品质【2 9 i 。 许多微生物具有降解氰化物的特殊的酶系统和途径“。一些种类的霉菌和细 菌能够吸收氰化物用作氮源和2 碳源。一种常见的霉菌一一雪霉用其氰化物水合 酶降解氰化物。这一途径中氰化物不可逆的转化为甲酰胺，然后最终转化为c o ： 和n h 3 。表1 4 列出微生物代谢氰化物的途径。 表1 4 氰化物生化处理及相关的一些微生物 t a b l e l - 4 m i c r o o r g a n i s m so fc y a n i d eb i o d e g r a d a t i o n 酶微生物 代谢途径文献 h e n + 0 2 + h + + n a d p h 一一h o c n + 一氧化酶 p s e u d o m o n a ss p 【1 4 】、 i5 】 n a d p4 + h2 0 f l u o r e s c e n s 、b a c i l l u s h c n + 0 2 + 2 h + + n a d p h n h 3 二氧化酶 【1 6 1 p u m i l l u s 、p c e r e u s+ n a d p + + c 0 2 e s c h e r i c h i ac o l l 、 1 5j 、 1 6 、 解合酶 h o c n + h 2 0 一n h 3 十c 0 2 p s e u d o m o n a sf l u o r g s c e n 1 7 】 水合酶s n o wm o u l d h o c n 。h 2 0 h c o n h2【18 】 a l c a l i g e n e sx y l o s o o x i d a n s 水解酶 h c n + 2 h 2 0 h c o o h + n h3【6 、【1 9 】 d e n i tr i n c a n s 固氮酶k o x y t o c a 氰化物一一c h 4 + n h 3 【2 0 1 k l e b s i e l l ao z a e n a e 、n o c a r d i a 硝化酶 s p 、 溴腈一一3 ，5 - 2 5 溴，4 羟基苯甲酸【2 1 】 p a e r u g i n o s a 昆明理工大学工程硕士学位 台文第一章文献综述 续表1 4 酶微生物代谢途径文献 t h i o b a c i l l u s d e n i t r i f i c a n s 、 硫氰酸酶 b s t r e a r m o p h il u s 、 氰化物一一s c n + s 0 3 2 2 2 1 、 2 3 】 t r i c h o d e r m as p p b s u b t i l i s 、 氰化丙胺 b m e g a t e r i u m 氰化物一一口- 氰化丙胺酸【2 4 】 酸合成酶 国内在近几年也开展了氰( 腈) 降解微生物的筛选工作。国内在近几年也丌 展了氰( 腈) 降解微生物的筛选工作。如王翠红等从生化站活性污泥中分离、筛 选出降氰菌株，8 1 a 内可使浓度在3 0 m g l 的含氰废水降至o 5 m g l 以下 3 3 1 。王恩 德在金矿生产含氰污水中筛选出的节细菌、白曲霉菌和拟青霉菌在氰化物低于 1 0 0 0 m g l 能够生长，9 6 h 内能把污水中的1 0 0 m g l 的c n 降解为零1 3 4 1 。 1 4 固定化细胞技术的应用 采用生物强化技术处理有毒或难降解物质，另一个须解决的问题是如何保持 高效菌株在投加系统内数量和活力的优势。一般认为，与游离细胞相比，固定化 细胞稳定性增强，具有细胞密度高、微生物流失少及产物分离容易等优点，可以 克服游离细胞在反应中对环境敏感、性质不稳定、易失活的缺点，被认为是解决 生物强化技术中保持高效菌株活性的手段之一。 7 0 年代后期，由于水污染日趋严重，迫切要求开发高效废水处理新技术。利 用固定化细胞技术，可将选择性筛选的优势菌种加以固定，构成一种高效的废水 处理系统。目前固定化技术正日臻完善和成熟，其应用正得到进一步发展，前景 良好【3 5 3 9 1 。 1 4 1 固定化细胞的制备方法 固定化细胞的制备方式是多种多样的，任何一种限制细胞自由流动的技术都 可以用于制备固定化细胞。一般来说固定化细胞技术大致分为吸怖法、共价结合 法、交联法和包埋法 ”】。般认为，理想的固定化细胞的制备方法应具有如下几 点：( 1 ) 能控制固定化细胞颗粒的大小和孔隙度；( 2 ) 固定化所用原料廉价、 来源广，固定化成本尽量低：( 3 ) 固定化方法简单易行，固定化过程应尽可能少 6 昆明理工大学工程硕士学位论文第章文献综述 损伤细胞：( 4 ) 固定化细胞具有良好的机械稳定性和化学稳定性：( 5 ) 用于制 备固定化细胞的载体对细胞应该是惰性的，不损伤细胞；( 6 ) 固定化细胞应能使 底物、产物及其他代谢产物自由扩散，消除抑制作用；( 7 ) 为了更好地起到生物 降解作用，固定化细胞应该单位体积细胞数量尽可能多。以上几点对大规模的工 业化生产尤为重要。 1 4 2 固定化细胞载体 固定化细胞的制备方式中吸附法和包埋法因其制备程序简单、条件温和、对 细胞损害小等原因而应用最为广泛。( 1 ) 吸附法是依据带电微生物细胞和载体之间 的静电作用，使微生物细胞固定的方法。属于吸附法的有表面吸附法、细胞聚集 法和共价结合法。从本质上看，吸附法是微生物的自我固定，它在废水处理中已 经得到广泛地应用，如生物塔滤法、生物接触氧化法、厌氧滤器、厌氧流化床等 生物膜，以及上流式污泥床都是依靠微生物吸附于载体表面聚集而成。吸附法的 优点是操作简单，吸附对微生物细胞活动影响小。其缺点是吸附的微生物量有限， 反应稳定性和反复使用性差。( 2 ) 包埋法是将微生物细胞用物理的方法包埋于各 种载体之中，此法的优点是操作简单，不会影明显影响生物活性，是比较理想的方 法，目前应用最多。但这种方法其包埋材料( 即载体) 往往会一定程度地阻碍底物和 氧的扩散，影响水处理效果。作为包埋固定化载体，通常采用聚乙烯醇( p v a ) 、聚 丙烯酰胺凝胶，聚乙烯二醇( p e g ) ，琼脂、海藻酸钙等。 在固定化中，固定化材料的选择非常关键，常用的固定化载体材料有无机载 体、有机高分子载体和复合载体三类1 34 1 。无机载体大多具有多孔结构，如陶珠、 多孔玻璃、活性炭、高岭士、沙粒、沸石等，利用吸附和电荷效应把微生物固定， 具有机械强度大、对微生物无毒性、不易生物分解、耐酸碱、成本低等特性且制 作简单易行，只需把载体放入含有微生物一定浓度的溶液中浸泡一段时间即可。 有机高分子载体又可分为天然高分子载体和合成有机高分子凝胶载体。天然 高分子凝胶载体一般对生物无毒性、传质性能好、但强度低，厌氧下易被微生物 分解，寿命短，如琼脂、海藻酸钠、角叉莱胶等。合成高分子凝胶载体一般而言 强度较大，但传质性能较差，进行细胞固定化时对细胞活性有影响，如聚丙烯酰 胺、聚乙烯醇、光硬化树脂等。 复合载体是有机载体材料和无机载体材料结合而成，使两类材料在许多性能 上能互补。如阂航 35 1 等使用以聚乙烯醇为主要包埋材料的混合载体，其成分为聚 乙烯酵、0 15 的海藻酸钠、2 的铁粉、3 的碳酸钙、4 二氧化硅粉术。研究结 昆明理工大学工程硕士学位论文第一章文献综述 果表明，复合载体具有成球较易、不易破碎、活性损失小等优点3 6 1 。 1 4 3 固定化细胞反应特性 微生物固定化后，许多特性发生了变化，如微生物活性、微生物稳定性及氧 和底物传递速率的变化，这些变化决定了固定化微生物与游离细胞在处理废水工 程及处理工艺上的差异1 3 ”。 一般经过固定化后，细胞稳定性提高。这是因为此时细胞的官能团与载体之 间发生了共价键或范德华力等形式的作用，主链结构得以加固，不易流失和破坏。 另一方面，由于官能团稳定性的增加，其生物活性有所减弱，但由于微生物细胞 在一定区域空间内具有高密度，单个细胞活性降低的缺陷可以得到弥补。 另外细胞固定化后的传质问题也应考虑。由于载体的存在，固定化细胞的体 系中氧和底物传质速率发生变化，尤其是采用多孔载体时，反应系统中主体与微生 物所处区域的底物及氧浓度有所差异，固定化后氧传递受到了限制。如果是好氧 微生物，氧传递受到限制，微生物活性将降低。在厌氧条件下，不受氧传递限制， 微生物仍保持较高的活性。 1 4 4 固定化细胞技术在废水处理中的应用研究 自7 0 年代中期，固定化技术应用于处理废水后，国内外在固定化技术处理菠 水方面展开了大量的研究 3 9 , 4 1 1 ，下面主要介绍固定化细胞在处理有毒或难降解有 机物方面的研究情况。 活性污泥是一种广泛使用的生物处理工艺，但是其不足之处在于反应器内生 物浓度低，耐水质、水量冲击负荷能力差，污泥产量大等不足。日本的角野立夫 m 2 】等利用聚丙烯酰胺包埋固性污泥进行人工合成废水( b o d 为3 0 0 m g ll ) 的处理， 发现在升流式反应器内，采用纯氧曝气，容积负荷可达到2 1 0 k g b o d ( c m 3 d ) ，连续 处理运行1 0 0 0 天，出水水质稳定( b o d 2 0 m g l ) ，固定化后微生物中的酶稳定， 对温度、p h 值的耐受性增强，活性污泥基本无泄漏。与普通的活性污泥法相比，负 荷增大约4 倍。反应器体积可减少3 4 4 5 ，剩余污泥量减少2 3 4 5 。 在处理有毒或难降解有机物方面固定化细胞也表现出优于游离细胞的特性， 如生长稳定、降解能力强等。利用固定化混合菌降解芳香烃废水，细胞利用这些 物质进行生长并使之完全降解，例如酚和萘均能被彻底降解。采用海藻酸钙凝胶 包埋固定化p i n e l o b a c t e r 细胞进行吡啶的降解研究1 4 ”，发现与游离细胞相比，固 昆明理工丈学工程硕士学位论文第一章文献综述 定化细胞的比降解速率和吡啶毒性的承受能力并没有提高，但由于固定化细胞具 有较高的生物浓度，所以其体积降解速率较高，而且可以重复利用。s h r e v e l 4 4 1 等 利用固定化假单细胞菌降解甲苯，研究了固定化细胞生长和底物降解过程动力学， 并与游离细胞进行了比较，结果表明：固定化细胞体系的半饱和常数增加了3 0 倍，细胞的最大比生长速率降低了2 倍。 直链烷基苯磺酸钠( l a s ) 是合成洗涤剂工业排放废水的主要成分，近年来 的研究表明其对环境危害非常大，对其治理目益引起重视。纪树兰 4 5 1 等报道以生 物降解法处理l a s 废水。采用海藻酸钠固定t p 1 号菌株，并与游离细胞对l a s 的降解效果傲了对比试验，绐果表明：固定化细胞对l a s 的降解速率明显增加。 黄霞【46 等采用聚乙烯醇凝胶固定化处理洗农粉废水，废水中的l a s 的浓度为 4 0 m g l 时，3 h 内l a s 可降解9 0 以上。李彤p 等用硼酸化法包埋降解l a s 的 细菌苗系得到的固定化细胞，去除率可达9 0 以上。 在处理含氰废水方面，固定化技术也发挥了它的特长。y e u n g j e a ns u b l 4 8 1 等 曾利用p f l u o r e s e n sn c i b1 1 7 6 4 菌株固定在9 0 的直径小于1 0 um 的沸石上， 细菌能在氰浓度高达2 6 0 m g l 的溶液中生长。并且将含有固定化沸石的理想化的 活性污泥反应器应用于降解人工合成的含氰废水，反应两天后，氰化物浓度低于 0 1 m g l ，效果比较明显。 9 昆明理工大学工程硕士学位论文 第一章试验研究的意义干u 方案的选择 第二章试验研究的意义和方案的选择 2 i 试验研究的意义 如前面已述，氰污染对人类健康和生态保护具有极大危害，对其有效治珲势 在必行。生物法处理氰化物是目前受到日益重视的方法之一。虽然国内外已有一 些氰降解菌株的筛选及特性研究的报道p t ，但是对高浓度含氰废永能达到很高 降解特性，并能在1 0 0 0 m g l 以上含氰废水中生妖繁殖的降氰菌株的筛选和特性 研究还未见有相关报道。因而筛选出能够在高浓度氰化物工业废水中利用氰化物 作为碳源和氮源生长并具有高效降解能力的降氰菌株极有必要。另外从以上文献 报道甲获知，固定化细胞技术对于处理高浓度难降解物质和有毒物质十分有利。 主要原因在( 1 ) 可以提高酶、细胞、或微生物的理论停留时间，减少引起酶或微 生物的冲出现象，容积负荷可以任意控制；( 2 ) 纯化和保持了高效菌种，显著增 加了参与降解反应的微生物的量，污泥产量少，避免了污泥嘭胀问题，固液相分 离更为容易，并且节省了常规沉淀池使得处理系统小型化；( 3 ) 固定化微生物特 别是混合菌相当于一个多酶生物反应器，对成分复杂的废水适应能力强；( 4 ) 使 微生物的稳定性增强。因此通过固定化细胞技术将选择性筛选的优势菌种加以固 定，构成一种高效的废水处理系统，不仅可以人为控制并保持高效菌株，且细胞 对有毒物质的承受能力和降解能力都能得到明显提高。 综上所述，筛选高活性降氰菌株井进行固定化处理含氰废水，可以成为一项 高效而实用的处理技术，也成为当今研究的热点。 2 2 方案的选择 采用生物强化技术一即引入高效降解菌株并加以固定化可以解决物生物法 治理氰化物中常出现的污泥中毒、降解效率低等问题。本论文以高效菌株的筛选 及其固定化为研究主线，主要内容包括( 1 ) 建立高效、快速、简便的筛选模型， 确定筛选方案和筛选流程，从土壤中获得高教降氰菌株，考察著优化培养及降解 条件，如装液量、摇床转速、p h 、温度等：( 2 ) 选择合适的载体固定化细胞， 比较吸附法和包埋法固定化细胞的降解特性。 比较吸附法和包埋法固定化细胞的降解特性。 0 昆明理工大学工程硬士学位论文 第二章试验研究的意义和方案的选择 2 3 氰化物分析方法的选择 氰化物的测定方法有容量滴定法、分光光度法、离子选择性电极法【5 0 】和色谱 法等。根据实验条件和体系，本试验采用硝酸银容量滴定法、异烟酸吡哗啉酮 光度法 5 1 , 5 3 1 和离子选择性电极法 5 4 , 5 5 j 等三种分析方法来分析氰化物的浓度。硝酸 银容量法检出下限为1 m g l 以上氰化物，一般用来标定氰化物的浓度。异烟酸一 吡唑啉酮光度法最低测定c n 一浓度为0 0 0 4 m g l ，测定上限为0 2 5 m g l ，用来测 定低浓度氰化物。氰离子选择性电极法设备简单、灵敏度高、操作方便，既可测 定高浓度又可以测定低浓度的氰化物。本试验中将根据实际情况和反应体系来选 择不同的测定方法。 2 4 实验材料与设备 2 4 1 实验试剂 亚铁氰化钾、氰化钾、硝酸银、硝酸锌、甲基橙指示剂、氢氧化钠、酒石酸、 氯胺t 、异烟酸、1 一苯基3 甲基5 毗唑啉酮、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、乙醇、 试银灵、沸石( 2 0 2 0 0 目) 、海藻酸钠、蛋白胨、酵母浸膏、葡萄糖、硫酸铵、 氯化钠、磷酸氢二钾等，除了亚铁氰化钾、氰化钾、海藻酸钠、蛋白胨、酵母浸 膏为化学纯外。其他都均为分析纯试剂。 2 4 2 实验所用试剂配制与标定 ( 1 ) 磷酸盐缓冲液：称取3 4 9 磷酸二氢钾溶于5 0 0 m l 水中，另称取9 0 7 9 n a 2 h p 0 41 2 h 2 0 溶于5 0 0 m 水中，然后将两者混合，p h 为7 2 。 ( 2 ) l 氯胺t 水溶液( 现用现配) ( 3 ) 异烟酸一吡唑啉酮显色剂：称取o 2 5 9 卜苯基- 3 - 甲基一5 - 吡唑啉酮溶于 2 0 m l 无水乙醇中，待用。称取1 5 9 异烟酸溶于等当量氢氧化钠中( 约2 4 毫升2 氢 氧化钠溶液1 ，溶解后用水稀释至1 0 0 毫升。临用前，将上述两种溶液按1 ：5 混合后， 贮于棕色瓶中于1 0 c 下保存，三周内有效。 ( 4 ) k c n 标准液的制备与标定：见附录 ( 5 ) a g n 0 3 标准液的制备与标定：见附录 ( 6 ) k c n 标准中间液( c n 。l o 0 0 m g l ) 制备：见附录 ( 7 ) k c n 标准中间液( c n 1 0 0 m g l ) 制各：见附录 昆明理工大学工程硕士学位论文第二章试验研究的意义和方案的选择 2 4 3 培养基配方 筛选培养基：琼脂2 0 9 l ，c n 。1 0 m g l ，( n h 4 ) 2 8 0 4o 4 9 l ，n a c l0 1 9 l k 2 h p 0 40 4 9 l ，葡萄糖1 9 l ，酵母膏1 9 l ，p h8 0 。 增殖培养基：( n h 4 ) 2 s 0 42 9 l ，n a c lo 5 9 l ，k 2 h p 0 42 9 l ，蛋白胨 萄糖1 0 9 l ，酵母膏5 9 l ，p h 8 0 。 固体培养基：由增殖培养基加入2 0 0g l 琼脂。 2 4 3 实验设备及型号 超声波破碎机j y i i 型宁波新芝生物科技股份有限公司 恒温柜式摇床h q 3 0 0 型 中国科学院武汉科学仪器厂 恒温生化培养箱s p x 1 5 0 b 型上海跃进医疗器械长 分光光度计v i s 7 2 2 0 型北京瑞利仪器厂 高速离心机t d l 5 型上海安亭仪器厂 精密恒温水浴槽h s 4 型成都仪器厂 精密p h 计p h s 3 c 型 上海安亭雷磁仪器厂 氰电极3 13 型江苏电分析仪器厂 双液接饱和甘汞电极8 0 l 型江苏电分析仪器厂 手提式压力蒸汽消毒器y x q $ 6 4 b - 2 8 0 型上海医用核子仪器厂 鼓风电热干燥箱1 0 1 2 。b 5 型上海跃进医疗器械厂 超净工作台 s w c j 型 苏州安泰空气技术有限公司 恒温磁力搅拌器j b 一2 型上海雷磁新泾仪器仪器有限公司 f m g 一5 l 生物反应器上海华东理工大学 昆明理工大学工程硕士学位论文 第= 章降氰菌株的筛选 第三章降氰菌株的筛选 由于土壤具备了各种微生物生长所需要豹营养、水分、空气、酸碱度、渗透 压和温度等条件，所以成了微生物生活的良好环境。可以说，土壤是微生物的“天 然培养基”，是它们的“大本营”，也是最丰富的菌种资源库。而从这些成千上 万的微生物中获得所需要的目的菌株，必须选择一个合适的分离方法和筛选模型， 才能高效、快速、简便地完成筛选任务。 3 1 实验方法 3 1 1 筛选方案的确定 在微生物筛选过程中，筛选模型的选择直接影响到能否快速高效地获取所需 的目标菌株。筛选模型的要素包括土样的采集、培养条件、分离方法等步骤。良 好的筛选模型应该具备以下几个特点：1 ) 快速：能在较短时间处理大量的样品； 2 ) 高效：微生物长出后，要注意选取特征明显的菌，尽可能除去不具备我们所需 活性的菌，并能最大限度地避免重复筛选同样的一种菌；3 ) 经济：筛选过程中尽 可能不使用昂贵的试剂，分析方法要简单、快速并且准确。 根据以上三点准则并结合本实验的实际情况，我们选择以含氰液为培养基溶 剂，使没有耐氰或降氰能力的微生物不能生长，从而达到快速、高效的目的，也 减少了工作量。本实验筛选流程主要包括以下几步： ( 1 ) 土样采集 一方面土样的来源越广越易获得新的菌种，另一方面可从已经适应苛刻的环 境压力中的微生物类群中寻找目的菌株，由于氰的剧毒性，因此尽可能地从氰污 染地区采集土样 3 0 - 3 2 1 。本次试验土样取自广西南宁冶炼厂污染土壤。 ( 2 ) 富集 富集的主要目的是通过一定条件的限制，使不具备耐氰或者降氰活性的微生 物以较慢速度生长甚至不生长，同时帮助目标菌以相对较，陕的速度生长，使其生 长占绝对优势。以底物作为唯一碳源或氮源进行富集是一种常见的策略，也可以 供给特殊的基质或加入某种抑制剂为目的菌株生长提供环境。其它的富集策略还 有：在组成较完全的培养基中加入一定量的底物进行富集。直接用底物富集是一 种相当高效的富集方法，所筛得的微生物对底物有较强地耐受性甚至基本不受抑 昆明理工大学工程硕士学位论文第三章降氰菌株的筛选 制，但这一方法在底物对微生物的生长有抑制甚至有毒时不适用。因此本文采用 在相对贫乏的培养基中加入一定量的氰化物这种方法进行富集。虽然连续富集易 筛选到适用