（环境工程专业论文）高效氯氟氰菊酯降解菌的分离及其降解特性.pdf

a b s t r a c t 硕士论文 a b s t r a c t i nt h i sd i s s e r t a t i o n ，t a k i n gl a m b d a - c y h a l o t h r i na sam o d e lp o l l u t a n t ，i t sa n a l y t i c a l m e t h o d ，d e g r a d i n gb a c t e r i ae n r i c h m e n ta n di s o l a t i o n ，c h a r a c t e r i z a t i o no f i t sb i o d e g r a d a t i o n w e r es t u d i e ds y s t e m a t i c a l l y t h em a i ni t e m s 弱f o l l o w i n g ： t h ee x t a c t i o na n da n a l y s i sm e t h o do fl a m b d a - c y h a l o t h r i ni nl i q u i dm e d i aw e r es e tu p ， i n c l u d i n gu v - s p e c t r o p h o t o m e t r i em e t h o da n dg a sc h r o m a t o g r a p h ym e t h o d t h er e s i d u a l l a m b d a e y h a l o t h r i nw a se x t r a c t e dw i t hc h 2 c 1 2a n dc 6 h 1 4i nu vs p e c t r o p h o t o m e t r i c m e t h o da n dg a sc h r o m a t o g r a p h ym e t h o d ，r e s p e c t i v e l y t h er 2o fs t a n d a r dc u r v ew a s 0 9 9 4 3a n d0 9 9 8i nu v - s p e c t r o p h o t o m e t r i cm e t h o da n dg a sc h r o m a t o g r a p h ym e t h o d ， r e s p e c t i v e l y t h e t w om e t h o d sc o u l dm e e tt h er e q u i r e m e n t f o r a n a l y s i s o f l a m b d a c y h a l o t h r i nr e s i d u e t h el a m b d a - c y h a l o t h r i nd e g r a d i n gb a c t e r i aw e r ei s o l a t e db yd i r e c tw a ya n ds e l e c t i v e e n r i c h m e n tf r o mw a s t e w a t e ro fp e s t i c i d e sp r o d u c t i o n 3 2b a c t e r i as t r a i n sw e r ei s o l a t e di na l l ， 12s t r a i n so fw h i c hc o u l dd e g r a d el a m b d a - c y h a l o t h r i ni ne v i d e n c e 3s t r a i n sw e r ep r o v e dt o h a v eh i g h l yd e g r a d a t i o nr a t e st ol a m b d a - c y h a l o t h r i nb yf u r t h e rs c r e e n i n g s s t r a i n sb d e ， b e l a n db e 6h a s4 0 1 ，5 7 3 a n d3 6 8 d e g r a d a t i o nr a t e sr e s p e c t i v e l y t h ed e g r a t i o nc h a r a c t e r i s t i c so fb e - 1s t r a i nw a ss t u d i e d b e - 1d e g r a d i n gc a p a c i t yw a s i n f l u e n tb yp ha n dt e m p e r a t u r e ，a n dt h eo p t i m a lp ha n dt e m p e r a t u r ew a s7 0a n d3 0 c t h ee f f e c t so fi n i t i a ll a m b d a - c y h a l o t h r i nc o n c e n t r a t i o no nt h es t r a i nb e - 1c o u l dn o tb e i n g o r e d l a m b d a c y h a l o t h r i nw a sa c c e l e r a t ea n dr e s t r a i nt h eg r o w t ho fb e ls t r a i na tl o w c o n c e n t r a t i o na n dh i g l lc o n c e n t r a t i o n ，r e p e e t i v e l y t h ee f f e c t so fi n o c u l u ma n dv o l u m eo f v e n t i l a t i o no nt h e d e g r a d i n g c o u l db e i n g o r e d s t r a i n b e - lc o u l d d e g r a d e l a m b d a - c y h a l o t h r i ni ni t s5 0 m g ll i q u o rm e d i u m ，w i t h5 5 d e g r a d i n gr a t ei n4 8 h ，a n d w i t h6 0 2 d e g r a d i n gr a t ei n12 0 h e f f e c t so ft e m p e r a t u r e ，p ha n di n i t i a lc o n c e n t r a t i o no fl a m b d a c y h a l o t h r i no nt h e b e - 6d e g r a d i n gc h a r a c t e r i s t i cw e r es t u d i e db yo r t h o g o n a le x p e r i m e n t t h er e s u l t si n d i c a t e d t h a tt h eo p t i m a ll e v e lw a st e m p e r a t u r e2 5 ，p h7 0a n dt h ei n i t i a lc o n c e n t r a t i o no f 10 0 m g l k e yw o r d s ：l a m b d a - e y h a l o t h r i n ，d e g r a d i n gb a c t e r i a ，i s o l a t i o n ，c h a r a c t e r i s t i c s i i 声明 本学位论文是我在导师的指导下取得的研究成果，尽我所知，在本学 位论文中，除了加以标注和致谢的部分外，不包含其他人已经发表或公布 过的研究成果，也不包含我为获得任何教育机构的学位或学历而使用过的 材料。与我一同工作的同事对本学位论文做出的贡献均已在论文中作了明 确的说明。 研究生签名：0 2 0 口艿年多月“日 学位论文使用授权声明 南京理工大学有权保存本学位论文的电子和纸质文档，可以借阅或上 网公布本学位论文的部分或全部内容，可以向有关部门或机构送交并授权 其保存、借阅或上网公布本学位论文的部分或全部内容。对于保密论文， 按保密的有关规定和程序处理。 研究生签名： 硕七论文 高效氯氟氰菊酯降解菌的分离及其降解特性 1 绪论 1 1 化学农药的使用 农药自诞生之日就在人类生产、生活中发挥了极其重要的作用。目前，随着耕地 面积的不断减少，世界人口的不断增加，人类对生存环境的保护意识不断增强，使得 人口、粮食、环境成为新世纪最突出的问题。通过提高农业生产技术，加强优质高产 作物的选育，使用杀虫、杀菌、除草农药，世界作物产量有效地提高了3 倍。然而， 当前世界虽然已经使用化学农药，每年仍有3 5 左右的农作物损失。倘若离开化学农 药，损失则高达7 0 。据统计，如不使用化学农药世界粮食产量中稻谷产量损失4 7 1 ，小麦产量损失2 4 4 ，玉米产量损失3 5 7 。采用化学农药是防治病、虫、草三 害的重要措施。人口增长需要更多的粮食，由此可见，化学农药已成为人类生存和发 展不可缺少的物资。 、 目前，世界上生产的化学农药主要有4 2 0 种，其中1 6 0 种杀虫杀螨剂，1 6 种除草 剂，5 0 种杀菌剂，其余是植物生长调节剂和驱避剂。经常大量使用的有1 0 0 多种。大 吨位的品种主要为有机氯，有机磷和氨基甲酸酯类化合物。从各种化学农药的销售情 况看，上世纪5 0 年代以来世界化学农药仍呈上升趋势。全世界的化学农药产量( 以有 效成分计) 1 9 5 0 年为2 0 万吨，1 9 6 0 年为6 0 万吨，1 9 7 0 年为1 5 0 万吨，1 9 7 5 年为1 8 0 万吨。自1 9 8 5 年后维持在2 0 1 0 6 t - 2 5 1 0 6 t 左右。全世界化学农药销售额1 9 6 0 年 为5 8 亿美元，1 9 8 7 年达2 0 0 亿美元，1 9 9 0 年为2 4 6 亿美元。由于世界耕地面积的减 少和高产优质品种的开发，进入9 0 年代以来，化学农药产量、销售额增长趋缓，全球 化学农药销售额基本稳定在3 0 0 亿美元左右。 各种类型的农药中，有机磷农药使用量大，应用面广，在环境保护和食品安全方 面受到了普遍关注f l 】。尤其是一些剧毒、高毒的农药品种由于其造成的急性毒性和残 留毒性问题，已被禁止在蔬菜和水果上使用。新的替代型农药如拟除虫菊酯类农药使 用规模日益加大。 1 2 高效氯氟氰菊酯 拟除虫菊酯是国内代替有机氯、有机磷和其他剧毒高残留杀虫剂的主要农药类型 之一，其广泛应用于防治茶树、蔬菜、果树、棉花、花卉害虫【2 】，在我国其施用面积 已占杀虫剂总施用面积的三分之一以上【3 】。拟除虫菊酯杀虫剂对某些非目标生物如蜜 蜂、家蚕等毒性大，对鱼、虾、贝等水生生物毒性也很大，这类农药的大量残留会严 重破坏生态环境【4 1 。而且，这类农药普遍具有对环境稳定、降解速率慢、降解率低的 特点。联合国粮农组织和世界卫生组织已对它们在农产品中的残留限量作出了严格的 1 绪论 硕士论文 规定【5 1 。 高效氟氯氰菊酯是拟除虫菊酯类杀虫剂中重要的一种，具有很广的杀虫谱，可以 杀灭双翅目、鳞翅目、半翅目和鞘翅目等昆虫，对昆虫主要是触杀，其次还有胃毒和 驱避作用f 6 l 。高效氟氯氰菊酯在我国使用量日益增大。高效氟氯氰菊酯在环境中的半 衰期较长，很难在自然条件下快速降解；加之长期的使用，很多害虫出现了抗药性， 于是农民加大了用药量，这势必造成蔬菜和土壤中此类农药的大量残创1 1 。中华人民 共和国农药管理条例规定了高效氯氟氰菊酯在农产品中的残留量应o 2 m g k g ，所 以，无公害农产品生产过程中必须严格控制高效氯氟氰菊酯的残留量。 1 2 1 高效氯氟氰菊酯理化性质 高效氯氟氰菊酯，通用名称为l a m b d a - e y h a l o t h r i n ，化学名称为q 氰基3 苯氧基 苄基- 3 - ( 2 一氯一3 ，3 ，3 一三氟一1 - 丙烯基) - 2 ，2 - o 。文： 理化性质：白色粉末状固体( 质量分数9 2 工业品) ；沸点1 8 7 - 1 9 0 c 0 2 m m h g ： 蒸气压约o 0 0 1 m p a ( 2 0 。c ) ；相对密度1 2 5 ( 2 5 c ) ；溶解度水中0 0 0 4 x1 0 。1 2 9 ( 2 0 ) ：溶 于丙酮、二氯甲烷、甲醇、乙醚、乙酸乙酯、正己烷、甲苯，溶解度均 5 0 0 9 l ( 2 0 。c ) ； 5 0 黑暗处存放2 年不分解，光下稳定；2 7 5 分解。 毒性：中等毒【8 】，但对鱼、虾的毒性均属剧毒级，其中对河虾的毒性比对斑马鱼 更大t 9 1 。有的学者通过动物试验证明，侵入机体后其所含c n 除了影响细胞色素c 和 电子传递系统外，主要引起神经传导阻滞，减缓神经细胞膜的钠离子通道“m 闸门 的关闭，使钠离子通道保持开放，以致动作电位的去极化期延长，周围神经出现重复 电位，进而使中枢和周围神经兴奋性增强，出现一系列相应临床表现。 1 2 2 主要成分及杂质解析 包素萍【l o 】采用气相色谱一质谱( g c m s ) 联用在一定分析条件下分析高效氯氟氰菊 酯，总离子流色谱图如下图： 2 巧 o 1 0约 弼 高效氯氟氰菊酯原药的g c m s 分析结论为：组分1 ，三氟氯菊酸，保留时间 硕上论文 高效氯氟氰菊酯降解菌的分离及其降解特性 7 7 5 8 r a i n ，分子量异构体( e 体或t r a n s 体) ，保留时间7 9 5 4 m i n ，分子量2 4 2 ，含量0 1 0 ； 组分2 ，苯醚醛，保留时间1 1 4 2 5 m i n ，分子量1 9 8 ，含量o 1 l ；组分3 ，高效氯氟 氰菊酯低效异构体( e 一体或t r a n s 体) ，保留时间1 6 5 6 7 m i n ，分子量4 4 9 ，含量2 6 4 ； 组分4 ，高效氯氟氰菊酯高效异构体，保留时间1 6 8 0 8 m i n ，分子量4 4 9 ，含量9 5 8 4 ； 组分5 ，高效氯氟氰菊酯低效异构体( e 体或t r a n s 一体) ，保留时间1 7 9 5 4 m i n ，分子量 4 4 9 ，含量0 1 7 。 1 2 3 降解菌株及降解机理 微生物降解农药的研究一直是国内外的研究热点，至今已取得了很大进展，表现 在降解农药的微生物种类不断被发现，降解机理日趋深入，降解效果稳定提高等方面 u 。拟除虫菊酯类降解菌主要有假单胞菌( p s e u d o m o n a ss p p ) 、芽孢杆菌( b a c i l l u ss p p ) 和产碱菌属( a l c a l i g e n e ss p p ) 等【1 2 q6 1 。 m a l o n e y 等【1 7 j 筛选出三株菌分别为尾杆菌、假单胞菌和无色杆菌，可以对几种拟 除虫菊酯类农药( 氯菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯等) 生物转化，并发现其中一种重要转 化产物3 氧基苯甲酸能够进一步转化成4 羟基3 苯氧基苯甲酸；研究还表明，初始浓 度为5 0 m g l 时，氯菊酯的生物转化速度最快( 半衰期5 - 1 0 天) ；氰戊菊酯次之( 半衰 期7 1 4 天) ；溴氰菊酯最慢( 半衰期2 1 - 2 8 天) 。g r a n t 和b e t t s 1 跳。增分离出2 株能降 解氯氰菊酯的菌株，分别为假单胞菌e c i r c l e 和沙雷氏菌s w h i t e 。将这两种菌应用于 处理洗羊废水，结果表明，对于氯氰菊酯初始浓度为2 5 0 m g l 的废水，降解率为：e c i r c l e 2 d a y o 、4 9 d a y 5 、5 4 d a y l 4 ；s w h i t e2 d a y 0 、4 0 d a y 5 、6 0 d a y l 4 。辛伟等【2 i 】分 离到一株能在茶树体内内生定殖并对氯氰菊酯降解效能高的菌株t r 2 ，其对氯氰菊酯 降解作用的最优化条件为底物浓度2 5 m g l 、培养温度3 6 、p h 7 8 、装液量 2 5 m l 2 5 0 m l 和培养时间9 6 h ，3 苯甲基苯甲醛是菌株t r 2 降解氯氰菊酯的主要中间 代谢产物。杨娜等【2 2 j 分离出了高效降解氯氰菊酯菌株3 7 ，经鉴定，该菌为革兰氏阴 性球菌，在通气、2 8 、p h 7 5 条件下培养7 d ，对2 5 0 m g l 氯氰菊酯的降解率为7 8 1 。 丁海涛等【2 3 】人筛选到一株可降解拟除虫菊酯的芽孢杆菌q w 5 ：培养5 天，该菌株对氰 戊菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯的降解率分别为5 3 8 ，4 1 2 和6 1 7 。洪源范等【2 4 j 从农药厂废水处理池的活性污泥中分离到l 株能以甲氰菊酯为唯一碳源生长的菌株 j q l 4 5 能在2 4 h 内对2 0 m g l 的甲氰菊酯的降解率达到9 9 8 ；降解甲氰菊酯的最适 温度为3 0 。c ，p h 为7 0 ，降解速率与初始接种量呈正相关。王兆守【2 5 】等分离出一株能 以拟除虫菊酯类杀虫剂为唯一碳源和能源的降解菌w l o j 5 ，经鉴定为阴沟肠杆菌，该 菌对1 0 0 m g l 联苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯的降解率分别为5 2 4 ，5 0 7 和5 6 8 9 。 近来，许育新【2 6 1 等分离得到一株放线菌c d t 3 ，其通过共代谢方式对氯氰菊酯农药进 行降解作用，在摇瓶中对1 0 0 m g l 氯氰菊酯农药7 2 h 降解率达到8 4 2 4 。小区试验中 3 l 绪论 硕上论文 对茶叶上的氯氰菊酯农药降解率为6 8 9 4 。但是对于浓度达到2 0 0 m g l 或2 0 0 m g l 以上的氯氰菊酯降解明显下降甚至不降解。 目前对高效氯氟氰菊酯研究主要侧重于研究其环境行为和消解动态【27 1 ，而有关微 生物降解的研究较少。林淦等f 2 8 】发现阴沟肠杆菌w 1 产生的粗酶液可以较好地降解高 效氯氟氰菊酯。其酶促降解的作用机理如下： 其酶促降解作用产物可以采用g c m s 气质联用仪测定推出。结果l m o l 的高效氯 氟氰菊酯物质大体生成l m o l 的a 氰基3 苯氧基苄醇和l m o l 的2 ，2 二甲基- 3 ( 2 氯3 ， 3 ，3 三氟1 丙烯基) 环丙烷羧酸( 反应式如下) 。从而可以推断，从w 1 中提取出来的 粗酶液具有对高效氯氟氰菊酯农药的水解功能。 ，f 型a 1 一9 i f v + 旧“，f 测定结果表明，高效氯氟氰菊酯水解的最适p h 值为7 5 ，最适温度为3 5 ，米氏 常数1 0 n - l1 6 7 8 0 n m o l m l ，最大反应速率v 腿x = 1 6 3 9 3 n m o l ( m l m i n ) 。在最适条件 下，该酶在1 h 内对2 0 m g l 高效氯氟氰菊酯的降解率达到8 3 。 1 2 4 仪器检测方法 1 2 4 1 采用气相色谱法分析高效氯氟氰菊酯的含量【2 0 1 。中华人民共和国农业行业标 准n y t 7 6 1 2 2 0 0 4 规定了用气相色谱法检测蔬菜、瓜果内高效氯氟氰菊酯含量的方 法。 1 2 4 2 采用高效液相色谱法分析高效氯氟氰菊酯的含量。 高效液相色谱( h p l c ) 是以液体作流动相的一种色谱法。它可以分离检测极性强、 分子量大及离子型农药，尤其对不易气化或受热易分解的农药检测更能显示出它的优 点。近年来，采用高效固定相、高压泵和高灵敏度的检测器，柱前或柱后衍生化技术 以及计算机联用等，大大提高了液相色谱的检测效率、灵敏度、速度和操作自动化程 度，现已成为农药残留检测不可缺少的重要方法【3 1 句2 1 。 1 2 4 3 联用技术 多种分析技术联用是现代农药残留分析的发展特点。联用技术可以扬长避短，一 般兼分离、定量和定性于一体，因而特别适用于确证性分析，常用的联用技术有气相 色谱质谱( g c - m s ) 、高效液相色谱一质谱( h p l c m s ) 等。其中g c m s 已相当成熟，应 用相当广泛。 气相色谱质谱联用技术( g c m s ) 将气相色谱与质谱仪串联起来，成为一个整体使 用的技术。它既具有气相色谱高分离效能，又具备质谱准确鉴定化合物结构的特点， 4 硕士论文 高效氯氟氰菊酯降解菌的分离及其降解特性 可达到同时定性、定量的检测目的。用于农药残留量检测工作，特别是应用于农药代 谢物、降解物的检测和多残留检测等，具有突出的优点。毛细管色谱仪与质谱和电子 计算机联用，使气质联用技术达到了高效、高速、自动化程度。在农药生物修复的研 究中，气质联用方法对明确农药生物修复过程中的中间产物，阐明降解途径和机理具 有不可替代的作用。 1 3 微生物与农药降解 生物修复( b i o r c m c d i a t i o n ) 是近十年来发展起来的用于治理环境污染的一门新技 术，主要是通过微生物的作用，将环境中的有机污染物转化为c 0 2 和h 2 0 等无毒无害 或毒性较小的物质。采用微生物降解农药能克服物理、化学处理修复难度大、成本高， 并且还会有二次污染的缺陷；从生物技术的角度，利用微生物种类繁多，代谢类型极 为丰富的生物多样性原理与特点，通过筛选高效农药残留降解菌株，并经现代化工业 大规模发酵制成菌剂，或利用微生物所产生的酶类应用于农药残留的原位生物修复技 术，达到清除土壤、水体、农产品中农药残留的目的。 随着农药工业的发展，大规模使用化学农药所带来的环境问题日益严重，因此， 应用微生物进行农药降解这一研究领域日益引起人们的关注。已相继对除草剂、杀虫 剂、杀菌剂、杀线虫剂的微生物降解进行了深入细致的研究，通过近几十年的研究， 已经肯定了微生物在土壤和水环境农药降解中的主要作用，分离到一批能降解或转化 农药的微生物类群，初步弄清了微生物降解农药的主要作用方式及降解机制，以及各 类化学农药微生物降解的途径。 1 3 1 可降解农药的微生物种类 a 细菌f 3 3 】 ( 1 ) 假单胞菌( p s e u d o m o n a s ) ：降解农药类型有d d t 、马拉硫磷、甲拌磷、二嗪农、 d d v 、甲基对硫磷、对硫磷、西维因、茅草枯等。王保军等f 3 4 】系统地研究了门多萨假 单胞( p s e u d o m o n a sm e n d o c i n ad r 2 8 ) 菌株对单甲脒的降解代谢。门多萨假单胞d r 8 菌株及与其它细菌菌株组成的混合菌可利用单甲脒作为生长的唯一氮源，同时降解该 农药。d r 8 菌株的单甲脒降解酶是一种组成酶，主要分布于细胞壁和细胞膜组分。该 酶作用于农药单甲脒的k m 值为5 1 4 m m o l l 。经检测，单甲脒降解产物为2 ，4 一二甲 基苯胺以及n h 3 。鉴于d r 8 菌株不能以单甲脒作为生长的碳源和能源，只能在添加 其它有机营养基质做为生长碳源的条件下降解单甲脒，且降解产物未完全矿化，是一 种不完全降解作用，因此提出，该菌对于单甲脒农药的降解属于共代谢作用类型。 ( 2 ) 芽孢杆菌属( b a c i l l u s ) ：降解农药类型有d d t 、甲基对硫磷、对硫磷、杀螟松、 毒杀芬、茅草枯、苯硫磷、艾氏剂、狄氏剂、利谷隆、灭草隆、毒莠定等。程国锋等 5 1 绪论硕士论文 【3 5 1 从污泥中富集培养筛选出一株能降解甲胺磷和乐果的芽孢杆菌( b a c i l l u s 印) ，8 d 后对 甲胺磷的降解率达4 2 5 ，对乐果的降解率达5 0 2 。周军英等【3 6 】对高效降解菌l y - 4 进行了一系列实验室土壤模拟研究，探明杀虫单降解菌l y - 4 进入土壤后的生存状况及 对杀虫单农药的降解动态。 ( 3 ) 黄杆菌属( f l a v o b a c t e r i u m ) 降解农药类型有马拉硫磷、甲基对硫磷、对硫磷、 二嗪农、毒死蜱、毒莠定等。王银善等f 3 7 】从棉田中分离出一株降解对硫磷能力较强的 黄杆菌( f l a v o b a c t e r i u ms p ) p 3 2 ，该菌还可降解甲基对硫磷，水胺硫磷等。 ( 4 ) 产碱菌属( a l c a l i g e n e s ) 降解农药类型有茅草枯、抑芽丹、三氯醋酸等。虞云 龙等【3 8 】从农药厂的废水中分离出一株广谱的农药降解菌1 师1 1 ，被鉴定为产碱菌属 ( a l c a l i g e n e s ) 的一个未知种，可降解氰戊菊酯、溴氰菊酯、氯氰菊酯、甲基对硫磷、对 硫磷、杀螟松等多种农药。在能降解的杀虫剂中，分离株y f l l 对对硫磷、甲基对硫 磷、杀螟松的降解速率比氰戊菊酯、溴氰菊酯、三氟氯氰菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯、 氯菊酯的降解速率要快得多，这种速率上的差异主要是由各种杀虫剂的疏水性差异引 起的。 另外，对农药具有降解作用的细菌还有固氮极毛杆菌属、短杆菌属、枝动杆菌属、 链球菌属、极瘤细菌属、八叠球菌属、硫杆菌属等。 b 降解农药的真菌 包括曲霉属( a s p e r g i l l u s ) 、青霉属( p i n i c i e l i u m ) 、根霉属( r h i z o p u s ) 、木霉属 ( t r i c h o d e r m a ) 、镰刀菌属( f u s a r i u m ) 、交链菌属( a l t e r n a r i a ) 、头孢菌属 ( c e p h a l o s p p o r i u m ) 、毛霉属( m u c o r ) 、胶霉属( g l i o c l a d i u m ) 、链孢霉属( n e u r o s p o r a ) 、根 霉菌属( p h i z o b i u m ) 等等。刘玉焕等【3 9 】从长期受甲胺磷污染的土壤中分离到一株华丽曲 霉( a s p e r g i l l u s o r a n t u s ) ，对甲胺磷具有较高的降解活性，降解率最高可达8 3 。 c 放线菌 降解农药的有诺卡氏菌属、链霉菌属、放线菌属、小单胞菌属、高温放线菌属等。 由以上可以看出，农药降解微生物在自然界中广泛存在，说明降解农药的菌并非 特殊的微生物，而是在自然界中广泛存在的。 1 3 2 降解机理、影响因子及降解性能 1 3 2 1 降解机理【4 0 】 农药生物降解过程一般包括初级降解、环境容许的生物降解和最终降解3 个阶段， 初级降解是农药在微生物的作用下母体化学结构发生变化，从而失去原污染物分子结 构的完整性，并进一步降解，使农药的毒性丧失达到环境容许的生物降解过程，最终 被完全降解为c 0 2 和h 2 0 及其它无机物，并被微生物同化。基本过程可表示为： 农药+ 微生物( 酶) 一微生物( 酶) + 降解产物( c 0 2 ，h 2 0 和其他无机物) 6 硕士论文 高效氯氟氰菊酯降解菌的分离及其降解特性 细菌降解农药的机理农药的代谢方式主要有酶促反应与非酶促反应两种，大多数 微生物的降解作用是通过其分泌的酶来完成，其本质为酶促反应。在许多情况下，农 药生物降解是在多种酶的协同作用下完成的。根据酶对农药的代谢特点，可将酶分为 3 类：( 1 ) 偶发代谢的酶：微生物虽然能代谢农药，但不可利用农药作为能源；( 2 ) 分解 代谢的酶：微生物可利用农药作为能源或农药诱导酶利用农药作为能源；( 3 ) 解毒代谢 的酶：微生物降解农药不是出于利用它们作为能源，而是出于抵抗这些农药的毒性。 第二种酶无疑是农药微生物降解中最理想的酶。 a 酶促作用 ( 1 ) 微生物以农药或其分子中某部分作为能源和碳源。部分微生物能以某种农药 为唯一碳源和能源。有些农药能被微生物立即利用，有的则不能立即利用，需先经产 生特殊酶后再使农药降解。 ( 2 ) 微生物通过共代谢作用使农药降解。许多研究表明，由于某些化学农药的结 构复杂，单一的微生物不能使其降解，需靠二种或二种以上的微生物共同代谢降解。 ( 3 ) 去毒代谢作用。微生物不是从农药中获取营养或能源，而是发展了为保护自 身生存的解毒作用。 b 非酶促作用 微生物活动使环境p h 变化而引起农药降解，或产生某些辅助因子或化学物质参 与农药的转化。包括以下几个方面： ( 1 ) 脱卤作用。此作用常见于农药的降解，它是某些脂肪酸生物降解的起始反应。 若干烃类杀虫剂有此作用。 ( 2 ) 脱烃作用。此作用发生在某些有烃基连接在n 、o 或s 原子上的农药( 如三氮 苯类和甲苯胺类) ，烃基连在c 原子上的农药一般不易为微生物所作用。 ( 3 ) 胺及酯的水解。很多农药是无机酸类的酯，如磷酸酯类杀虫剂，酰胺类如苯 胺类除草剂等等。有些微生物可水解这些化合物中的酰胺和酯键。 ( 4 ) 还原作用。由微生物引起的还原作用主要有硝基( n 0 2 ) 还原成为氨基( - n i - 1 9 。 此外，通过微生物的硫醇类化合物将醌类还原成酚类。 ( 5 ) 环裂解。芳香环可被许多土壤细菌和真菌降解。最初，环被单氧酶羟基化生 成邻苯二酚类，然后被双氧酶裂解成粘康酸或粘康半醛类。 ( 6 ) 氧化作用。很多微生物可合成加氧酶，使分子氧进入到有机分子，特别是带 有芳香环的有机分子中去。农药以这种方式被氧化是常见的。 ( 7 ) 缩合或共轭形成。缩合包括将有毒分子或其一部分，与另一有机化合物结合， 从而使农药或其衍生物失去活性。 但在自然条件下，农药的细菌降解通常并不只是以一种单一方式进行，它也可在 多种不同酶作用下以不同的方式进行。农药细菌降解途径的阐明对于深入了解其机理 7 l 绪论 硕士论文 具有重要意义。 1 3 2 2 农药降解的影响因子【4 1 】 ( 1 ) 细菌 农药发生降解的必要条件，一是细菌或其酶系必须与农药接触；二是农药及其代 谢产物必须能转运进入到细菌细胞体内。研究表明，有一些细菌对底物表现出强烈的 趋药性反应( c h e m o t a c t i cr e s p o n s e ) ，而另一些细菌对潜在底物却表现出线性生长。 ( 2 ) 化合物的结构特征 理论上只要环境生长条件适宜，所有生物源分子均可被微生物降解。然而，人工 合成的化合物如农药常带有官能团如氯取代基及自然界很少存在的新颖排列，从而增 加了其难降解性，使之在环境中存在更加持久。农药因其分子结构和理化性质不同而 对微生物降解的敏感性程度表现出极大差异。苯环上氯原子数目和位置影响生物降解， 苯环上取代氯原子数越多，降解越困难，其中以苯环上间位取代最难降解。例如，2 ， 4 ，5 涕的生物降解较2 ，4 一滴慢。此外，芳香环的羟基化和开环均受取代基的影响。 进入环境中的有机物分子发生降解后，其情况会变得更复杂。 ( 3 ) 生物利用度( b i o a v a i l a b i l i t y ) 化学物质的低利用度限制着农药在土壤中的生物降解。许多因子均影响生物利用 度，但主要是溶解度和土壤吸附。某种农药的化学结构、分子大小和官能团决定了其 水溶性和溶解度。表面活性剂增加了疏水性有机污染物在水相中的溶解度进而增加了 污染物的传递速率，对提高土壤修复效率、降低修复费用等具有重要意义【4 2 1 。 ( 4 ) 营养有效性 基本营养物质如碳、氮、磷和氧等的有效性( n u t r i e n ta v a i l a b i l i t y ) 也限制着细菌对 农药的降解速率。农药浓度既不能过高，否则对微生物致毒；也不能过低，浓度太低 就不能诱导产生适宜的降解酶和吸收机制，不能诱导产生足够的酶活或提供细胞生长 所需要的足够能量，因而就难以进行生物降解。 ， 1 3 2 3 降解性能 降解性能的研究包括各种农药的微生物降解效果影响因素的研究。实验室液体摇 瓶培养条件下，微生物降解农药的影响因素包括温度、p h 、通气条件、微生物浓度、 受试农药浓度、离子条件、营养条件等。实验室得出的各影响因素的最佳条件一般为： 温度2 8 - - - 3 5 ，p h 范围在6 8 7 5 ，通气条件为培养液体积与摇瓶容积之比1 3 - 1 5 ，1 5 0 r r a i n 摇床振荡，微生物浓度1 0 5c f i i ，1 0 8 c h 胁l ，而受试农药浓度与 微生物特性及农药本身性质相关，从每升几十毫克到每升上千毫克，均超过自然环境 中农药实际存在浓度，所采用的无机盐培养基中大多含有磷酸盐缓冲液、硫酸镁、铁 离子、钙离子、钠离子等，不能以农药为唯一碳源、能源需另外添加一定的葡萄糖或 蔗糖，有的培养液中还需要添加少量酵母膏或蛋白胨作为氮源以提高微生物降解农药 8 硕士论文 高效氯氟氰菊酯降解菌的分离及其降解特性 的能力。降解性能影响因子评估可以通过正交试验得出。 另外，刘爱国、花日茂在其论文农药降解的非线性动力学模型研究中论述了 农药及其它有机化合物的降解动力学建模，对于预测农药降解动态具有一定的理论价 值和应用前景【4 3 1 。 1 3 3 微生物降解农药的研究基本方法 微生物降解农药的研究方法包括以下几个方面： ( 1 ) 以适当浓度范围的被测试农药作为微生物生长代谢所需的唯一或主要碳源和 能源； ( 2 ) 筛选出能分解农药的微生物； ( 3 ) 创造适合微生物生长的环境和条件，包括好氧微生物降解试验中提供足够的 氧量和厌氧微生物降解试验中保证隔绝氧； ( 4 ) 选择适宜的温度条件； ( 5 ) 微生物所需要的氮、硫、磷源和无机盐介质； ( 6 ) 选择合适的农药测定方法等。 1 4 目前新技术 1 4 1 酶学进展 共生或单一微生物对农药的降解作用都是在酶的参与下完成的，降解酶往往比产 生这类酶的微生物菌体更能忍受异常环境。此外，降解酶的降解效果远胜于微生物本 身，特别是对低浓度的农药，因为在这种情况下，降解菌可以利用其他碳源而不能有 效地利用农药为碳源。因此，设想利用降解酶作为消除农药污染的有效手段，目前己 分离得到能降解多种农药的降解酬州5 1 。 由于每一类农药都有类似的结构，只是取代基不同，所以一种农药降解酶往往可 以降解多种此类农药。酶在农药生物降解中的研究主要集中在酶对外部环境要求、酶 的降解谱、酶的降解效能、酶促降解机理、酶的固定技术和酶在农药生物降解中的具 体应用等。此外，农药降解酶基因的克隆与表达正成为近期农药生物降解领域的研究 热点。 1 4 2 降解酶基因的克隆、表达调控及基因工程菌的构建 人们寄希望通过基因工程技术将农药降解酶基因或降解质粒克隆引入合适的宿主 菌株并使其高效表达，构建降解谱广、降解彻底的工程菌，为生物降解农药开辟新途 径。这一领域已成为当今环境生物技术的研究热点之一，目前有很大进展。闫艳春将 抗性库蚊酯酶基因，引入原核表达载体p r l 4 3 9 ，转化大肠杆菌h b l 0 1 细胞，获得表 9 i 绪论硕士论文 达得到高酶活的工程菌，将工程菌固定后对两类难降解农药( 有机氯、菊酯类) 进行 降解，结果表明，固定化细胞在1 h 内对上两种农药可降解9 0 以上。虞云龙等【4 6 】也 报道了有关此方面的内容。 1 4 3 微生物表面展示技术 微生物表面展示技术是通过基因工程手段，将短的外源肽或蛋白质表达在微生物 细胞表面，该技术可以应用于开发活的细菌疫苗、筛选抗体库、生产生物细胞吸附剂 以及制备整细胞生物催化剂。利用生物表面展示技术制备整细胞催化剂，用于有毒有 机污染物的处理，可以极大地加快生物降解速率【4 7 】。 已有实验证明从土壤微生物中分离出的有机磷水解酶( o p h ) 可有效降解有机磷 类杀虫剂，利用整细胞进行污染脱毒更加有效，运用o p h 表面表达可以克服细胞膜地 转移限制，加速降解速率，并且具有良好的稳定性。s h i m a z u 等【4 8 】研发了一种表达的 新方法，成功将o p h 锚定在p n p 降解菌m o r a x e l l as p 表面，大大提高了降解速率。 1 5 本课题研究的目的、内容、拟采用的手段 高效氯氟氰菊酯杀虫剂对某些非目标生物如蜜蜂、家蚕等毒性大，对鱼、虾、贝 等水生生物毒性也很大，这类农药的大量残留会严重破坏生态环境；而且，这类农药 普遍具有对环境稳定、降解速率慢、降解率低的特点。随着高效氯氟氰菊酯的大量使 用，迫切需要采用微生物降解的方法对大量残留进行处理，以修复受污染的土壤和果 蔬。然而，目前对高效氯氟氰菊酯研究主要侧重于研究其环境行为和消解动态，有关 微生物降解的研究较少。 本论文拟进行以下研究： ( 1 ) 研究介质中高效氯氟氰菊酯的提取、分析测定方法，为正确评价微生物的降 解能力提供可靠依据； 。 ( 2 ) 富集、分离筛选高效氯氟氰菊酯降解菌，并进行初步鉴定； ( 3 ) 研究高效氯氟氰菊酯降解菌的降解特性，如考察p h 、温度、底物浓度、通气 量等条件对降解率的影响；优化降解条件。 1 0 硕上论文 高效氯氟氰菊酯降解菌的分离及其降解特性 2 高效氯氟氰菊酯的分析方法 高效氯氟氰菊酯的分析方法有紫外分光光度法、气相色谱法、高效液相色谱法以 及联用技术等。本文根据不同实验要求分别选择了紫外分光光度法、气相色谱法来检 测高效氯氟氰菊酯。从自然界中成千上万的微生物中获取目的菌株的过程工作量非常 大，为了能在有限时间内对尽可能多的菌株进行广泛的筛选，必须建立一种廉价、简 便、迅速的检测方法。紫外分光光度法由于操作简便、快捷，能在短时间内检测大量 样品，因此可用于菌株初筛过程 4 9 - 5 0 】。气相色谱法则用于定量检测高效氯氟氰菊酯的 残留量。 2 1 实验材料及设备 2 1 1 实验试剂及配制 实验试剂见表2 1 1 。 表2 1 1 实验试剂 t a b l e2 。1 。1e x p e r i m e n t a lr e a g e n t s 高效氯氟氰菊酯原药( 质量分数为9 2 ) 高效氯氟氰菊酯乳化液的配制： t w e e n - 8 0 作为乳化剂：由于高效氯氟氰菊酯不溶于水，本实验采用t w e e n 8 0 为 乳化剂制成乳化液用于配制液体培养基及固体培养基【5 l 】。配制方法为：按照t w e e n 8 0 与高效氯氟氰菊酯质量比为1 5 ：1 溶解，然后加去离子水定容至1 l ，使浓度达到 2 高效氯氟氰菊酯的分析方法 硕士论文 2 0 0 m g l ，备用。 2 1 2 基础盐液体培养基的配制 基础盐液体培养基( g l ) ： n a c l1 0 ，n h 4 n 0 31 0 ，k h 2 p 0 41 5 ，k 2 h p 0 40 5 ，m g s 0 4 7 h 2 0o 1 ，加入适量以 t w e e n 8 0 乳化的高效氯氟氰菊酯乳化液，加去离子水定容，用l m o l ln a o h 调节p h 值至7 0 。 2 1 3 实验设备及型号 实验设备及型号见表2 1 3 。 表2 1 3 实验设备 t a b l e2 1 3i n s t r u m e n t sa n de q u i p m e n t s 2 2 紫外分光光度法 2 2 1 基本原理 分光光度计的基本原理是溶液中的物质在光的照射激发下，产生了对光的吸收效 应，物质对光的吸收是具有选择性的。各种不同的物质都具有各自的吸收光谱，因此 当某种单色光通过溶液时，其能量就会被吸收而减弱，光能量减弱的程度和物质的浓 度有一定的比例关系，即符合比色原理一朗伯比耳定律。 f = i i o ，log i o i = k c l a 爿( c l 其中：仁透射比i 一射光强度 瑚射光强度a 一吸光度 k 一吸收系数l 广一溶液的光径长度 c 一溶液浓度 1 2 硕上论文 高效氯氟氰菊酯降解菌的分离及其降解特性 从以上公式可以看出，当入射光、吸收系数和溶液的光径长度不变时，透射光是 根据溶液的浓度而变化的。高效氯氟氰菊酯的结构表明这种物质对紫外光有吸收，根 据这一特性，可以采用紫外分光光度法检测其浓度。 2 2 2 紫外吸收波长的确定 采用c a r y l 0 0 c o n c 型紫外可见分光光度计对高效氯氟氰菊酯二氯甲烷溶液进行 光谱扫描。 扫描参数：扫描波长 扫描速度 吸光度范围 1 9 0n m - - - 3 5 0 n m 中速 o l 2 2 3 紫外分光光度法标准曲线的制作 紫外分光光度法标准曲线的制作步骤如下： 按照实际反应过程配制培养液，即在基础盐培养液中加入一定量高效氯氟氰菊酯， 使高效氯氟氰菊酯浓度分别达到5 0 m g l 、4 0 m g l 、3 0 m g l 、2 0 m g l 、1 0 m g l ，加入 t w e e n 8 0 作为乳化剂；分别取样l m l 加入4 m l 二氯甲烷充分振荡混合提取2 m i n ，静 置分层，弃去上层水相，用二氯甲烷稀释至1 0 m l ，加入适量无水硫酸钠脱水后利用 紫外分光光度计，在最大波长下，测定溶液吸光度，以二氯甲烷为参比；每个样品重 复3 次。以溶液浓度为横坐标，吸光度a 为纵坐标，取平均值绘制标准曲线，并求得 回归方程。 。 2 2 4 紫外分光光度法的重复性实验 紫外分光光度法方法重复性实验方法如下： 分别在不同时间按照实际反应过程配制6 个样品，分别在基础盐培养液中加入一 定量高效氯氟氰菊酯，使高效氯氟氰菊酯浓度达到5 0 m g l ，加入t