（环境工程专业论文）高效氯氰菊酯的手性拆分及其对映体毒性研究.pdf

高效氯氰菊酯的手性拆分及其对映体毒性研究 对增殖率差异最大，达1 5 2 倍。1 尺。c 括谜异构体对s h s y 5 y 细胞的 毒性最大，对映体之间1 尺c 西心异构体 1 s - c i s o r 异构体，1 s - t r a n s 砍 异构体 1 r t r a n s a s 异构体。 关键词t 手性拆分，对映异构体，斑马鱼胚胎，s h s y 5 y 细胞，毒性 浙江工业大学硕士学位论文 高效氯氰菊酯的手性拆分及其对映体毒性研究 s t u d yo nt h es e p a ra t l 0 na n dt o x i c i t yo f e n a n t i o m e r so fb e t a c y p e r m e t h r 玎n a bs t r a c t i nt h i sp a p e r ，z e b r a f i s he m b r y o sa n ds h s y 5 yc e l lw e r eu s e da st e s t m o d e l s ，a n das e r i e so ft o x i c i t yt e s tw e r ee s t a b l i s h e d am e t h o do fc h i r a l s e p a r a t i o no ff o u re n a n t i o m e r so fb e t a - c y p e r m e t h r i nw a sd e v e l o p e db yh i g h p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) t h et h e s i sa i m st oe v a l u a t e t o x i c i t yo fb e t a - c y p e r m e t h r i na n di t sf o u re n a n t i o m e r st oz e b r a f i s he m b r y o s a n ds h s y 5 yc e l l ，a n da l s o p r o v i d e s t h ee v a l u a t i o n s t a n d a r df o r e n v i r o n m e n t a lo r g a n i s m s am e t h o df o rc h i r a l s e p a r a t i o n o ff o u re n a n t i o m e r so f b e t a - c y p e r m e t h r i nw a sd e v e l o p e db yh p l co nt h ec h i r a l c e lo da n d c h i r a l p a ka dc o l u m n s t h ee f f e c t so fd i f f e r e n tp r o p o r t i o no fm o b i l e p h a s e ( o no da n da dc o l u m n s ) a n dc o l u m nt e m p e r a t u r e ( o no dc o l u m n ) w e r e s t u d i e d b e s i d e s ，a s s i g n m e n to fa b s o l u t ec o n f i g u r a t i o n s t ot h e r e s o l v e df o u rp e a k sw a sm a d eb yc o m p a r i n gc h r o m a t o g r a mf r o mp r e v i o u s s t u d y a c c o r d i n gt ot h eo e c ds t a n d a r d ，t h ee f f e c t so fb e t a - c y p e r m e t h r i na n d i t sf o u re n a n t i o m e r st oz e b r a f i s he m b r y o sw e r er e s e a r c h e d a t4 8 - h ，b e t a 一 浙江工业大学硕士学位论文 3 高效氯氰菊酯的手性拆分及其对映体毒性研究 c y p e r m e t h r i na n di t s f o u re n a n t i o m e r sh a dt h eg r e a t e s te f f e c to nt h e h a t c h i n gr a t eo ft h ez e b r a f i s he m b r y o s t h em o s te m b r y o t o x i ci s o m e ri s 1 r c s - a s , n e x ti sr a c e m a t ea n d1r - t r a n s - a s e m b r y o se x p o s e dt ot h e s e i s o m e r ss h o w e dv a r i o u s d e v e l o p m e n t a la b n o r m a l i t i e s ( y o l ks a ce d e m a ， p e r i c a r d i a le d e m aa n dc r o o k e dt a i l ) ，a n dc r o o k e d t a i lw a st h em o s ts e n s i t i v e e n d p o i n t s o nt h eo t h e rh a n d ，n oe f f e c to nm o r p h o l o g yw a sr e c o r d e df o r b o t h1s - c i s a ri s o m e ra n d1s - t r a n s t t ri s o m e r b o t ho ft h e d e g r e eo f e d e m aa n dc r o o k i n gi n c r e a s e dw i t hi n c r e a s i n gc o n c e n t r a t i o na t7 2 - h t h et e s te v a l u t e st h ec y t o x i c i t yo fb o t hr a c e m a t ea n df o u re n a n t i o m e r s o fb e t a - c y p e r m e t h r i no nn e u r o n a lc e l l l i n e s h s y 5 y a c c o r d i n gt ot h e r e s u l t s ，a l lo ft h ef i v ef o r m so fb e t a - c y p e r m e t h r i ns h o w e dd o s e - d e p e n d e n t e f f e c t c e l l se x p o s e dt or a c e m a t ea n d1 r - c s a si s o m e rs h o w e dt h eg r e a t e s t d i f f e r e n t i a ( 1 5 2t i m e s ) a tt h ec o n c e n t r a t i o no f10 0l x m o l l 1 r - c s a s i s o m e rh a sb e e ns h o w nt ob et h em o s tc y t o t o x i cc o m p o u n d ，a n dt h e t o x i c i t yo r d e ro ft h ee n a n t i o m e r sw a s1r c 括- a s 1s - c i s - o r ，1s - t r a n s - 积 1r t r a n s a s k e yw o r d s ：c h i r a ls e p a r a t i o n ，e n a n t i o m e r ，z e b r a f i s he m b r y o ，s h s y 5 y c e l l ，t o x i c i t y 浙江工业大学硕士学位论文 4 符号说明 h p l c 一高效液相色谱 七，容量因子或保留因子 卜选择因子 咫一分离度 t - 时间，m i n h 一正己烷 卜乙醇 t - 一温度，k r 气体常数，为8 3 1 4jm o l 1k - i 痧相比 埘。焓变，k jm o l 1 丛。熵变，jm o l 。1k q 蜩。一焓变之差，k jm o l 1 蟠。一熵变之差，jm o l 1k 1 一线性相关系数 g 。一相邻两异构体在固定相和 流动相间的自由能之差 巧一临界温度，k e c 5 r 半致畸浓度，p gl 。1 l c 5 r 半致死浓度，p gl 。l n o e c 卜一最低未觉察浓度，g gl y s e - 一卵黄囊水肿 c l 疑结 p e 一心包囊水肿 c b 一身体弯曲 卜眼原基 s 一体节 d 一卵黄囊 c l 卜绒毛膜 g e 脑原基 。一耳芽 c 一索 p - d 包囊 b z 一血细胞 m t t - 一3 - ( 4 ，5 二甲基2 噻唑) 一2 ，5 二苯基溴化四唑 w s t - 8 _ 2 ( 2 一甲氧基- 4 硝基苯基) 3 - ( 4 一硝基苯基) 一5 一( 2 ，4 二磺 酸苯) 2 h 四唑单钠盐 m e a n 平均值 s d 一标准差 浙江工业大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研 究工作所取得的研究成果。除文中已经加以标注引用的内容外，本论文不包 含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得浙江工业 大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。 作者签名：王，j 生1 王 日期：勾口g 年石月三日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查 阅和借阅。本人授权浙江工业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入 有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本 学位论文。 本学位论文属于 l 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密毗 ( 请在以上相应方框内打“4 ) 作者签名：王佳j 生 新签名：；l 卜降 日期：妒g 年月工日 日期：知d g 年5 月二日 高效氯氰菊酯的手性拆分及其对映体毒性研究 1 1 选题背景及意义 第一章前言 手性( c h i r a l i t y ) 是宇宙间的普遍特征，是自然界的本质属性之一。整个生物 界完全是一个“手性的世界，从原子到人都是不对称的：如人的左手和右手不 能重叠，而是互为镜相；自然界存在的糖都是d 型的，氨基酸是l 型的，蛋白质和 d n a 是右旋的；海螺的螺纹和缠绕植物都是右旋的。在手性环境中，在手性化合 物相互作用时，不同的对映体往往表现出不同的性质，特别是医药、农药针对蛋 白质、糖、核酸等手性生物大分子的生化作用，在生物选择性、活性、毒性上有 显著差异 1 - 4 。 历史上最典型的例子是“反应停”( t h a l i d o m i d e ) 。2 0 世纪5 0 年代末，西方 国家开发出一种用于治疗孕妇妊娠反应的镇痛费u t h a l i d o m i d e ，但是后来发现服用 此药导致了大量畸形胎儿的出生。1 9 7 9 年，研究人员对其进行拆分，发现导致胎 儿致畸的是孓型反应停，尺型的反应停则没有此毒副作用。惨痛的教训使人们认识 到，开发药物必须考虑到手性，注意它们不同的构型【4 】。 此外，一些精细化学品中的手性分子也越来越受到人们的关注。第一批1 2 个 p o p s 化合物中的农药是手性的，现在所使用的杀虫剂中大约有2 5 是手性的，对 环境的污染严重( 干扰内分泌、致癌、致畸、致突变) ，并且随着结构更复杂的化 合物投入使用，这个比率呈渐增趋势【3 】。目前一些使用的杀虫剂、杀螨剂、杀菌剂 和除草剂中，一个对映体是高效的，另一个却是低效的甚至无效或有更强的环境 危害。例如：氯氰菊酯对水生生物cd u b i a 存在着对映体选择性毒性，它的8 个对 映体当中有2 个( 1 r - c i s o 氓和1 r t r a n s 积) 对cd u b i a 有较强的毒性【2 】；杀虫剂a s a n a 的4 个对映体中，只有一个是强力杀虫剂，另三个则对植物有毒；杀菌剂 p a c l o b u t r a z o l 的尺型有高杀菌作用，低植物生长控制作用，而孓型有低杀菌作用、 高植物生长控制作用【5 】。 拟除虫菊酯是一类含有苯氧烷基的环丙烷酯，其分子结构中具有1 3 个手性中 心，因而存在多个非对映异构体和对映异构体。自7 0 年代中期以来，因其高效低毒 而得到广泛使用。拟除虫菊酯类虽然对哺乳动物等非靶标动物低毒，但它对鱼类、 水蚤等水生动物的毒性却很高。由于这类杀虫剂被广泛用于室内杀虫，人类长期 浙江工业大学硕士学位论文 高效氯氰菊酯的手性拆分及其对映体毒性研究 暴露的可能性非常大，已经有研究发现它们在慢性或致癌性试验中表现出一定的 副作用【6 】，而且还能刺激乳腺癌m c f 7 细胞增殖和p 阳基因表达，具有较高的拟雌 激素活性 7 - 8 1 。但是目前在对映体层面上的相关研究还基本上处于空白状态。 菊酯类农药的异构体在生物选择性、活性以及毒性等方面存在显著差别。因 此使用高效体或单体手性农药，不仅高效、经济，而且对非靶标生物和环境生态 安全。但是由于受到认识和技术的限制，只有少数菊酯农药实现单体形式商品化， 菊酯农药的手性分离变得日益迫切。此外，现有的毒理学数据也大多是基于外消 旋化合物存在的。从对映体水平上研究手性拟除虫菊酯杀虫剂的靶标生物药效和 环境安全性极其重要。本研究的目的就是通过手性分离，希望在对映体水平上研 究高效氯氰菊酯的靶标生物药效和环境安全性，对现有手性污染物进行对映体层 面上毒理学数据的补充。 1 2 本文的研究内容 ( 1 ) 建立基于高效液相色谱( h p l c ) 的对高效氯氰菊酯的高效、灵敏、快 速的对映体分离及定量分析方法。 利用h p l c ，在不同条件下对高效氯氰菊酯进行拆分，在最优条件下制备获取 少量对映体纯样品，目的是为研究手性农药各对映体提供标样，用于不同对映体的 非靶标生物环境安全性( 胚胎毒性和神经毒性) 试验。建立对映体的定性和定量 分析方法为后续研究服务。 ( 2 ) 斑马鱼胚胎实验 采用美国e p a 水生毒性标准实验的斑马鱼为实验动物，研究其胚胎暴露在高 效氯氰菊酯及其对映体中7 2h 之内，发育形态上发生的一些变化。 ( 3 ) s h s y 5 y 细胞毒性实验 运用w s t 8 法来研究高效氯氰菊酯及其对映体对s h s y 5 y 细胞的毒性影响。 浙江工业大学硕士学位论文 2 葛效氯氰菊酯的手性拆分及其对映体毒性研究 2 1 手性及对映异构体 2 1 1 手性的概念 第二章文献综述 手性是一个几何学的概念。1 8 4 8 年，法国科学家路易斯巴斯德( l o u i sp a s t e u r ) 在显微镜下发现酒石酸盐的晶体( 一种在葡萄酒酿造过程中得到的产物) 有两种 结晶形态，这两种晶体的关系就好象一个物体与它在镜子中的映像一样。巴斯德 还发现它们的水溶液能够使偏振光的偏转方向不一样，一种使偏振光向左偏转， 另一种则使偏振光向右旋转。更为奇妙的是，当把这两种晶体的溶液等量混合以 后，则不会发生偏振光偏转的现象。而它们的其他物理和化学性质则完全相同。 由此，巴斯德断定酒石酸分子具有两种不同的空间构型，第一次将“手性”概念 引入化学领域，为现代有机立体化学奠定了基础【9 】。1 9 0 4 年，l o r dk e l v i n 在他的 著作中将这个概念叫做手性( c h i r a l i t y ) ，并且定义为“任何一个不能与其镜像完全 重叠的几何构型或者点群都可以说其具有手性r i o ( 见图2 1 ) 。 图2 1手性分子的左右手镜面对称 手性化合物使偏振光振动平面旋转的角度叫做“旋光度”。使偏振光振动平 面向右旋转( 顺时针方向) 的叫做右旋，用“+ ”表示，向左旋转( 逆时针方向) 的叫左旋，用“一 表示。 2 1 2 对映异构体的性质 不能重合，互为镜像与实物关系的两个分子互为对映异构体，简称对映体。 一对对映体结构差别很小，具有相同的熔点、沸点、偶极矩、折光率、相对密度、 溶解度和光谱性质。与非手性试剂作用时，其化学性质也一样。很难用一般的物 浙江工业人学硕士学位论文 鬻菱 高效氯氰菊酯的手性拆分及其对映体毒性研究 理或化学方法区分。但它们对平面偏振光的作用不同：一个会使平面偏振光向右 旋，称为右旋体；另一个可使平面偏振光向左旋，称为左旋体。二者旋转角度相 同。因此，对映异构也叫做旋光异构。 2 2 手性拆分方法 手性化合物的研究一直受分析方法的制约。手性分析可分为直接分析和手性 拆分两大类。手性拆分法主要包括直接结晶拆分法、化学拆分法、生物拆分法和 色谱法【1 1 - 1 5 】。 ( 1 ) 直接结晶拆分法 无需对对映体混合物进行任何预处理，而直接利用两种对映体间存在的差异 将其分离。一个改良的方法，“接种晶体析解法 比较有用：在一个外消旋混合物 的热饱和溶液中加入纯对映体之一的晶种，然后冷却，同种的对映体将附在晶体 上析出；滤去晶体后，母液重新加热，并补加外消旋体使之达到饱和，然后加入 另一种对映体的晶种，冷却，使另一对映体析出。交替进行，可方便获得大量纯 对映体结晶。 ( 2 ) 化学拆分法 化学拆分法是形成非对映体分离法。即将对映体与一些手性试剂反应，生成 非对映体，利用非对映体物理性质( 如溶解度、熔点等) 的不同，将非对映体分离 后，再通过柱色谱或重结晶等方法进行分离。最常用一种光学纯的碱去拆分一个 酸，或者用一种光学纯的酸去拆分一个碱，酸碱可以形成盐进行重结晶。近年来 又发展起一种称为动力学拆分的方法，在手性催化剂作用下反应，使起始物中的 某一对映体以比较快的速度反应转化为另一种化合物从而达到分离的目的。 ( 3 ) 生物拆分法 利用微生物体内含有的活性酶的高度立体选择性作催化剂制备手性化合物， 主要有两种途径：酶催化不对称合成；外消旋体的不对称酶拆分。 ( 4 ) 色谱法 接种结晶拆分法与化学拆分法是目前工业上广泛应用的方法，工艺成熟，但 成本较高，操作较繁琐。生物化学拆分法以反应条件温和、成本低、操作方便、 无公害且能够完成一些化学方法难以完成的反应等特点而受到广泛青睐，但因可 以利用的酶制剂品种有限且易被破坏、不易保存与运输、价格昂贵等而受到限制。 浙江工_ 匕大学硕士学位论文4 高效氯氰菊酯的手性拆分及其对映体毒性研究 与上述方法比较，色谱法通过将对映体分离完成对微量样品的分析测定，方法简 单快速，一可靠性好，准确度、精确度高，应用范围广，而且为得到高纯的单一旋 光手性化合物提供了一种简单快速的方法，所以在近2 0 年里得到了迅猛发展，已 在科研、质检等领域得到了广泛的应用。利用色谱法拆分手性化合物有以下几种 方法：纸色谱法( p c ) 、薄层色谱法( t l c ) 、高效液相色谱法( h p l c ) 、气相色 谱法( g c ) 、超临界色谱法( s f c ) 、毛细管电泳法( c e ) 、电色谱法( c e c ) 和高 效膜色谱法( h p m c ) 等。 2 2 1 色谱手性识别机理 近年在手性色谱学领域中，机理的研究是一种趋势，人们试图从理性的角度 将手性色谱导向深入。色谱法中，关于手性识别的一般机理众说纷纭。按手性环 境引入方式的不同，色谱法拆分手性化合物有以下三种策略：非对映异构化衍生 拆分法；手性流动相拆分法；手性固定相拆分法。 ( 1 ) 非对映异构化衍生拆分法 非对映异构化衍生拆分法是一种间接拆分的方法。它将手性环境直接引入到 分子内部，先由对映体与手性光学试剂反应，生成非对映异构体后再进行分离， 因此是对手性衍生物的非手性分离，即利用一般的色谱手段就可将得到的衍生物 分离。对映体与手性试剂的反应如图2 2 所示 1 6 1 。 ( r ) s a ( r ) 一s e 一( r ) - s a ( r ) - s e + ( s ) s a 斗( r ) s e ( s ) 一s a 图2 2 对映体与手性试剂的反应示意图 常见的用于手性衍生的试剂很多，如【l7 】：异硫氰酸酯和异氰酸酯类，萘衍生 物类，酰氯和磺酰氯类，氨基酸类等，一般要求它们必须是手性高纯度试剂，分 子上有易于反应的基团，反应条件温和，操作方便。 ( 2 ) 手性流动相( c h i r a lm o b i l ep h a s e ，c m p ) 法 手性流动相法是将手性选择剂添加到流动相中，利用手性选择剂与药物消旋 体中各对映体结合的稳定常数不同，以及药物与结合物在固定相上分配的差异， 实现对药物对映体的分离。此法的优点在于不需对样品进行衍生化处理，可采用普 通色谱柱，手性添加剂可流出、也可更换，添加物的可变范围较宽；不足之处是易 引起高柱压和高吸收本底。目前常用的手性流动相添加剂有：环糊精( c d ) 及其 浙江工业大学硕士学位论文5 高效氯氰菊酯的手性拆分及其对映体毒性研究 衍生物，配位基手性选择剂，手性离子对添加剂，蛋白质，大分子抗生素等【1 8 】。 ( 3 ) 手性固定相( c h i r a ls t a t i o n a r yp h a s e ，c s p ) 法 手性固定相法是目前对映体拆分中发展最快的一种方法。该法是将手性环境 直接引入到色谱柱的固定相上，当对映体分子流经色谱柱时，不同的构型使得它 们与固定相之间的作用力不同，从而保留时间产生差异，两对映体得到拆分。手 性固定相法的应用范围及其广泛，几乎在所有的色谱拆分手段中都可用到。早在 1 9 5 2 年，d a l g l i e s h l l 9 采用纸层析研究氨基酸对映体的分离时就提出了色谱直接拆 分“三点作用 分离理论。后来，l o c h m f i l e r 和d o b a s h i 提出“两点作用模型； l o c h m i i l e r 和w a i n e r 提出“单点作用”机理，l o c h r n f i l e r 进一步提出某些系统存在 “环境手性”而没有专一的作用点。近些年来，p i r k l e 等【2 0 在深入研究手性固定 相以及手性色谱立体识别机理的过程中，发展了d a l g l i e s h 观点，再一次阐述了“三 点作用 分离理论( 图2 3 ) ：手性识别要求手性固定相和对映异构体( 至少一个 对映体) 之间至少有三个同时存在的作用力，并且这些作用力中至少有一个是和 立体化学相关的。也就是说，用其中的另一个对映异构体来替代后，至少有一个 作用力不复存在或明显改变其性质。用如图2 3 所示的手性识别模型表达：在手性 固定相上有三个作用点a 、b 、c ，与之作用的对映异构体也同样有三个作用点a 、 b 、c 。对映体i 与c s p 形成a - a 、b b 、c c 三个作用力，对映体则不存在 c c 作用力。如果c c 作用是吸引作用力，使形成的非对映分子络合物稳定化， 则在色谱分离系统中对映体i 比保留时间长，后洗脱；反之，对映体i 由于c c 的排斥作用先流出色谱柱。如果c c 作用力很小，则对映体i 、与手性固定相之 c s p 图2 3 手性识别的“三点作用”模型 浙江工业大学硕士学位论文 6 高效氯氰菊酯的手性拆分及其对映体毒性研究 间的相互作用不存在明显差异，从而不能被色谱拆分。以此合成了一系列的手性 固定相，为手性固定相的发展开拓了一个全新的领域。 1 9 9 2 年，t a y l o r 等【2 l 】对“三点作用原理”进行了较为详尽的解释：对映体分子 与手性固定相分子的三个作用力中，至少有一个作用力具有立体选择性，即依赖 于对映异构体和固定相的立体化学，而另外两个作用力必须是两种不同类型的作 用力，如氢键作用、偶极堆叠作用、兀一7 r 电子相互作用等，否则如果存在两个相 同的作用力，可能产生不利于对映体手性拆分的作用，使得手性固定相对该物质 对映体的手性识别能力降低或消失。 色谱手性识别是个复杂的过程，模型的提出是将复杂过程简单明晰化。但是 分子形状和分子间相互作用的共同贡献，是所有作用综合影响的结果，某些作用 因素些许的变化就能导致手性识别方式的明显改变。有时手性识别是几个不同的 识别机理相互竞争的过程，而有些时候是不能完全用“三点作用原理”来解释的。 在有些分离体系中，即使流动相组成的轻微改变也可能导致前后手性识别过程的 迥然不同。因此，手性识别模型不可能解释所有的实验现象，对映体拆分的手性 识别机理还有待于更深入的研究。 2 2 2 两种常用的色谱分析方法 ( 1 ) 液相色谱法 从2 0 世纪8 0 年代开始，高效液相色谱( h p l c ) 以其公认的直接、快速、高 效、简便和适用范围广等优点得到迅速发展，逐渐成为对映体拆分的一种重要手 段。h p l c 拆分方法包括直接法和间接法两种，直接法又可分为手性流动相添加剂 法和手性固定相法。目前认为手性固定相法是非常简单而有效的方法。其优势在 于：可用于多种外消旋体的拆分；可以同时高收率地得到两种高旋光纯度的对映 体；可以拆分一些特殊的外消旋体( 如不能衍生化或易消旋的化合物，具有特殊 手性结构如螺旋或螺旋桨构象的化合物) ；可实现大量制备，可用于制备性分离。 特别适用于极性强、热稳定性差的手性药物的分析 2 2 - 2 3 。 手性固定相是实现对映体拆分的基础，有多种类型。根据其化学类型可分为 以下几种【2 4 】： “刷型”手性固定相( b r u s ht y p ec s p ) 手性聚合物固定相( p o l y m e rc s p ) 浙江工业大学硕士学位论文 高效氯氰菊酯的手性拆分及其对映体毒性研究 环糊精类手性固定相( c y c l o d e x t r i n sc s p ) 大环抗生素手性固定相( m a c r o c y c l i ca n t i b i o t i c sc s p ) 蛋白质手性固定相( p r o t e i nc s p ) 配体交换手性固定相 冠醚手性固定相( g r o w ne t h e rc s p ) ( 2 ) 气相色谱法 用于对映体混合物分析的受青睐的方法之一是手性气相色谱，它是最早用于 手性分离的方法。这种灵敏的方法不受痕量杂质影响，快捷而又便于操作。它的 原理是基于分子缔合可能导致充分的手性识别，因而产生对映体拆分。它使用含 有高纯对映体拆分辅助剂的手性固定相，要分析的对映体与固定相发生快速和可 逆的相互作用，其分离度取决于分析样品与固定相的相互作用强弱。 气相色谱中用于分离对映体的手性固定相主要有以下几类【2 5 】： ( 1 ) 以手性氨基酸衍生物为选择体的二酰胺( 含手性聚合物固定相) 、二肽 酯、二酰脲等，它们可分离许多手性化合物 2 6 - 2 8 1 。异氰酸酯类和光气已成为多种 化合物手性分离的万能试剂。 ( 2 ) 光学活性金属配合物。s c h u r i g 提出了“络合气相色谱法的概念，把手 性分离气相色谱推广到不足以生成氢键基团的化合物上。这一方法对分离信息素 特别有用，但受到热稳定性的限制。 ( 3 ) 环糊精衍生物。环糊精衍生物的出现为手性分离开辟了一个新的途径， 是最有前途的一种手性固定相。 ( 4 ) 冠醚。 与其它研究立体化学的方法相比，手性分离g c 有以下优点：可以确定复杂混 合物中少量组分的绝对构型；绝对灵敏度高，而且与官能团无关；对手性杂质的 检测限较低( 低于1 ) ；可以使用线性范围宽的通用检测器；c s p s 可以分离所有 挥发性化合物；g c 柱寿命长，可达数年之长。当然，这种手性选择g c 也有其不 足之处，不宜分离低挥发性、强极性或分子量大的化合物。虽然，c d 衍生物本身 具有较高的热稳定性，但在高温下( 2 4 0o c ) 会失去手性分离的功能【1 4 。 浙江工业大学硕士学位论文 8 高效氯氰菊酯的手性拆分及其对映体毒性研究 2 3 斑马鱼及其胚胎在毒理学中的应用 2 3 1 斑马鱼的基本生物学特征 斑马鱼是属于辐鳍亚纲( a c t i n o p t e r y g i i ) 鲤科( c y p r i n i d a e ) 短担尼鱼属( d a n i o ) 的一种硬骨鱼。原产于印度东部、巴基斯坦、缅甸以及孟加拉国的小溪、稻田及 恒河中游地区，因其体侧具有像斑马一样纵向的暗蓝与银色相间的条纹而得名 2 9 】。 斑马鱼成鱼体长3 - 4 c m ，孵出后约3 , 4 个月可达性成熟，其产卵并不局限于某段 时期，任何时间都可以。一条雌鱼每天最多能产卵4 0 0 个，受精率通常超过 7 0 书0 。此外斑马鱼对水质要求不高，在2 5 3 1 0 c 之间发育正常，其生长的最 适温度为2 8 5 0 c 。 2 3 2 斑马鱼的优点 虽然通过实验室啮齿动物研究可以推断有毒物质对人类的影响，但存在花费 昂贵，实验周期长，且受到法律限制等诸多问题。目前已经有一些替代的模式生 物来研究基因、受体和分子过程。其中无脊椎动物有果蝇和线虫，脊椎动物有青 鲻、斑马鱼、青蛙和老鼠。而斑马鱼凭借其独特的优点，有望取代果蝇、青蛙、 老鼠等作为试验材料，发展前景十分广阔。从近来发表的有关斑马鱼的渐增的文 献就可以得知：2 0 世纪9 0 年代初每年发表的有关斑马鱼的文献少于10 0 篇，世纪 之交时增加到大约1 0 0 0 篇，而现在每年平均有3 5 0 0 篇【3 0 】。斑马鱼体型小，易于 管理，早期形态便于观察，极大的减少了饲养空间和管理成本。此外还减少了实 验所需的试剂量( 化学物质、药品、污染物) 和产生的废液量。斑马鱼胚胎实验 可在单个细胞培养板或一系列的细菌培养皿中进行，一次可提供多个实验平行， 方便进行毒理测试的高通量筛选、小分子筛选和药物发现。从受精卵开始，斑马 鱼胚胎能够在2 4 孔板中存活好几天，其通过卵黄囊吸收营养，并可清楚的看到致 畸等现象。利用荧光转基因技术可以快速筛选出有毒性或治疗价值的分子库。如 果在斑马鱼上能够建立某种人类疾病模型，这些筛选有望改进疾病表型【3 1 】。斑马 鱼胚胎具有光学透明性，可清楚的看到各个发育阶段，突变筛选时可鉴别表型特 征，毒理测试时可方便评价毒理学终点。应用到原位杂交技术( i s h ) 和免疫化学 技术( i h c ) 中时价值更大1 3 0 】。因为操作方便，实验室中普遍使用d i g o x i g e n i n 一标 记的r n a 原位杂交探针来筛选化学物质诱导的畸形( 以特定基因形式表达) 。在 浙江工业大学硕士学位论文 9 高效氯氰菊酯的手性拆分及其对映体毒性研究 胚胎特定组织和细胞上着色可以评估形态上的异常或有毒物质激活的某一信号通 路。比如，对暴露在卤化芳香烃和多环芳烃中的斑马鱼进行c y p l a 表达的免疫组 织化学研究，发现心血管系统的内皮细胞是起作用的细胞位点 3 2 - 3 4 】。因为斑马鱼 的光学透明性，光学显微镜可穿透其组织，看到基因表达。这种方法应用到斑马 鱼心血管系统中，可展现不同芳香烃受体( a h r ) 和芳香烃受体核易位子( 川附t ) m r n a s 的共定位【3 2 】。另外，荧光标记外加共聚焦显微镜可以增强表达成像功能， 使得可以观察较老、较厚的幼鱼【3 5 】。 2 3 3 斑马鱼及其胚胎在毒理学中的应用 ( 1 ) 急性毒性 自2 0 世纪7 0 年代末期，国外开始运用斑马鱼进行化合物的急性毒性研究， 研究的化合物包括锌、镉、硒、汞等重金属以及苯酚、苯胺、环己胺等有机物【3 6 】。 9 0 年代初开始被用于混合化合物的急、慢性毒性检n t 3 7 1 。目前，斑马鱼已经被经 济合作发展组织( o e c d ) 的指导手册列为实验标准鱼类，被用于乙酸甘油酯和氯 化钾危害评价，q 二氯甲苯和1 1 氨基十一烷酸等急性毒性检测。国内对斑马鱼的 研究也逐渐增多，除了各种农药、污染物等对斑马鱼的急性毒性之外，还将斑马 鱼应用到水质检测中【3 8 】。 鱼类急性毒性实验能够很好的分析化合物的毒性，但是近年来引起了极大的 道德关注。因为实验所用幼鱼或成鱼在实验过程中会感到疼痛和折磨，这和当前 的动物权利保护立法相抵触。而且l c 5 0 值的环境毒理价值不高，这就需要寻求新 的替代方法。斑马鱼胚胎试验和鱼细胞毒素试验就是两种较好的方法。已经证实： 斑马鱼胚胎比成年斑马鱼和r t g 2 细胞敏感，是一种最适的研究模型【3 9 】。 b r a u n b e c k 和l a m m e r 对o e c d 标准进行了扩展，详细描述了胚胎的整个发育 情况及测试要求【删。通常，斑马鱼胚胎实验只需4 8 h ，但是根据实验需要，可延长 至9 6 h 或1 2 0 h ，以得到更多的亚致死指标，比如连续孵化率和幼鱼畸形。在倒置 显微镜下可以观察到各项毒理学指标，见表2 1 ，为发育生物学和分子遗传学研究 提供了便利。 表2 1在不同发育时间段可以观察的毒理学指标 染毒时间( h )毒理学终点 4 卵凝结，囊胚发育 浙江工业大学硕士学位论文 1 0 高效氯氰菊酯的手性拆分及其对映体毒性研究 ( 2 ) 内分泌干扰 很多化学物质除了传统毒理学测试终点，如死亡率和各种畸形效应外，还会 在亚致死浓度下影响生殖( 比如干扰内分泌系统) ，而不产生畸形。内分泌干扰物 ( e d c s ) 对性分化和生殖能力的影响已经引起了极大关注【4 l 埘】。近年来，有关鱼 体内分泌干扰的报道越来越多，包括雌雄同体、性比失衡、雄鱼出现卵黄蛋白原 ( v t g ) 等。 已知e d c s 结构多样性，并且新的e d c s 不断出现。这表明单从分子结构上已经 很难预测内分泌干扰能力，需要借助新的技术。研究表明斑马鱼可以成为评价e d c s 的一个模型【4 5 】。将斑马鱼暴露在相对较低浓度的模型物质中，就可以发现性腺发 育中出现了性干扰和反转现象。比如将斑马鱼暴露在1 7 a 乙炔雌二醇( e e 2 ) 中， 浓度低于1 n 酣时己出现了性别比例的变化【4 5 】，也有报道e e 2 浓度达到4 5 n g a 才检测 出这种变化【吲。 最有影响力的内分泌干扰物是天然或合成的雌激素，比如1 7 1 3 雌二醇( e 2 ) 和 e e 2 。这些化合物会使斑马鱼性别比例失衡，偏向雌鱼；使睾丸坏死，还能在雌鱼、 雄鱼中诱发产生雌激素调控蛋白质一g 【7 4 8 】。因为天然雌激素较少，雄鱼和 幼鱼体内的v t g 血浆水平很低，当其体内的v t g 浓度增高时，表示存在着外源性 雌激素。v t g 是含钙的大磷糖蛋白，已经被用来间接量化鱼血浆中的蛋白质。为 实现充分低的检出限，有必要使用灵敏度更高的技术，即免疫化学方法，比如r i a ， e l i s a 或免疫组织化学。因为无法从斑马鱼体内提取足够的血液或血浆来进行分 析，早期研究都使用整体匀浆。丹麦的南丹麦大学、o d e n s e 大学较早研究出用e l i s a ( 整体匀浆) 定量斑马鱼中v t g 的技术。该技术使用雌性斑马鱼卵巢中的卵黄磷 蛋白作为抗原a 实际检出限为4 0n gv t g g 鱼【4 9 】。武汉水生所采用斑马鱼血浆进行 e l i s a 试验，取得了更高的灵敏度【5 0 】。另外一个方法是用全身免疫组织化学检测 v t g 一利用图象分析来量化。这个方法很有效，但是在使用之前需要仔细的校 浙江工业大学硕士学位论文 l1 高效氯氰菊酯的手性拆分及其对映体毒性研究 准和确认。对斑马鱼来说，除了钡i j v t g 之外，通过r t - p c r 技术放大检测v t gm r n a 也是一个有效的方法。 很多学者都对斑马鱼的内分泌干扰进行了研究。p e t e r s e n 等人将暴露在e e 2 中 3 0 天的成年雄性斑马鱼制成匀浆，利用酶联免疫法( e l i s a ) 测出不同浓度的 v t g s i l 。此外，o l s s o n 等人、k i m e 和n a s h i 4 7 - 4 s 将成年雌鱼暴露后，发现其产下的 胚胎发育受到抑制。将斑马鱼暴露在雌激素类化合物比如一些p c b s 及其代谢 物、邻苯二甲酸二一2 一乙基己基酯( d e h p ) 中，也发现了类似的影响 4 7 ，5 2 - 5 3 1 。很多 有机氯化合物，比如2 ，3 ，7 ，8 四氯二苯基对二恶英( t c d d ) 和毒杀芬通过 与a h 受体结合，而不是干扰雌激素受体，产生抗雌激素作用，影响生殖【5 4 j 。成年 雌鱼喂食这些化合物后，每次产卵，数量都会减少，并且其后代出现致命畸形【5 5 5 6 】。 通常，p c b s 通过a h 受体发挥作用【5 7 】，但是b i l l s s o n 等人发现p c b1 0 4 通过诱导 e rm r n a ，能够模拟e 2 的行为【5 8 】。因此，内分泌干扰物的机制是十分复杂的，有 待进一步研究 ( 3 ) 发育毒性 斑马鱼已经成为发育生物学领域和人类疾病研究最主要的脊椎动物模型之 一。根据其生理生殖特点，可方便的用来生成基因抑制( k n o c k d o w n ) 鱼和转基因 ( t r a n s g e n i c ) 鱼。目前，利用斑马鱼充当模型在该领域的应用已经取得了一些成 果【5 9 】。比如用g f p 来标记基因功能或m o ，生成基因抑制斑马鱼。m a t t i n g l y 等人用 g f p 来标记斑马鱼的芳烃基受体( a h r ) 功能。先制备出转基因斑马鱼来表达受 a h r 调控的g f p l 6 0 。a h r 是一个配体激活的转录因子。与环境污染物( l l 女i t c d d ) 结合后，可引发中毒症状。由于细胞色素p 4 5 0 1 a 1 ( c y p l a l ) 的出现是a h r 激活的 一个初期生物标志，人类c y p l a l 启动子增加子区域的基础区域被熔合到水母的 c d n a 序列编码g f p 中。这些转基因鱼暴露在t c d d 中，其眼、鼻及胚胎中的椎骨 都出现了g f p 。与此相应，暴露在t c d d 中的野生斑马鱼在颅面和脊椎发育中都出 现了异常形态。 m o 靶基因抑制技术已经用来制备一些基因抑制斑马鱼，比如抑制n e u r o p i l i n 1 ( n r p l ) 的斑马鱼胚胎【6 l 】。由m o 介导的抑制技术中，通过注射特殊的m o 氨基 磷酸盐寡核苷酸到初期胚胎中，抑制蛋白质翻译。这些结果从生理学上第一次证 实n r p l 是通过一个由血管内皮生长因子( v e g f ) 决定的通路调控血管生成。基 因抑制技术的出现，为估计体外模型受化合物药理学作用可能产生的畸形提供了 浙江工业大学硕士学位论文1 2 高效氯氰菊酯的手性拆分及其对映体毒性研究 方便。和哺乳动物胚胎研究相比，斑马鱼致畸研究可提供更高的通量。 ( 4 ) 神经毒性 当生物体暴露在有毒物质( 比如化学疗法，放射治疗、器官移植所用的药物， 食品添加剂和环境毒物) 中，引起神经系统的正常行为( 包括神经传导、神经连 接和神经存活) 改变时，即产生了神经毒性。因为传统的神经毒性测试费力又耗 时，近年来，斑马鱼被广泛应用于神经研究中。斑马鱼发育初期的神经元称为原 代神经元( p r i m a r yn e u r o n s ) ，是简单神经系统的一部分。斑马鱼胚胎受精2 4 h 之后， 这些原代神经元开始分化，并建立了一些自己的投影( p r o j e c t i o n s ) 。此时，利用 n o r m a r s k io p t t c s “n r , 够鉴别出透明斑马鱼体内相对较大的神经元细胞体【6 2 】。受精4 8 h 之后，斑马鱼脑室形成1 6 3 - 6 4 ，体长增加，无头骨。将其进行整体着色后，可以检 查完整的神经系统，在视觉上评定脑部和神经系统。已经有研究表明：化合物诱 导的斑马鱼的神经细胞损害类似于在哺乳动物上观察到的结果【6 5 】。 很多研究人员运用斑马鱼来研究许多有毒物质以及酒精等引起的神经行为毒 性，并进行了毒理学评估 6 6 - 6 8 。用神经毒素来制备斑马鱼模型，可以得到神经生 化、病理组织学特征、运动行为方面的信息。这些神经毒素包括：( 1 ) 多巴胺 ( d o p a m i n e r g i c ) 神经毒素，比如m p t p ( 1 甲基4 苯基1 ，2 ，3 ，6 四氢吡啶) ， 6 羟多巴胺( 6 o h d a ) ，鱼藤酮( r o t e n o n e ) 和百草枯( p a r ；i q u a t ) ；( 2 ) 非m v i d a 类型的谷氨酸受体( a m p a ) 兴奋剂或拮抗剂，比如软骨藻酸( d a ) ，6 氰基7 硝基喹喔啉2 ，3 - - - 酮、a l p h a 1 a t r o t o x i n 和