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广东省四个矿区a m d 微生物群落多样性 专业：生态学 硕士生：鲁力 指导教师：蓝崇钰教授 摘要 酸性矿山废水( a c i dm i n ed r a i n a g e ，a m d ) 是一种在全球广泛分布的极端酸 性环境。研究a m d 里的微生物群落组成，是探索a m d 形成机理与治理利用的 基础，也对揭示极端环境中生命形成的过程有着重要的意义。目前，虽然国内外 对不同a m d 环境里微生物的多样性已经从传统培养方法和现代分子方法两个方 面均进行了深入的研究，但大多局限于一个矿区几个样点间的比较，或同一种类 的几个矿区之间的比较，对区域范围内数个不同类型矿区之间多个样点间的 a m d 微生物群落结构的研究则较少涉及。 我们于2 0 0 9 年夏季，分别对广东省内三个主要矿区( 大宝山多金属矿、凡 口铅锌矿、云浮硫铁矿) 的四个样点的a m d 进行了采样分析，利用1 6 s 克隆文 库的手段，深入分析了三大矿区四个样点的a m d 里微生物群落组成的差异，并 详尽分析了a m d 的理化性质。结合已报道的广东省其它a m d 样点的理化及微 生物数据，首次从区域尺度上，分析了广东省a m d 的微生物群落组成的特征。 研究发现： ( 1 ) 广东省a m d 里的嗜酸微生物不仅丰度高( 每毫升a m d 里含有有1 0 7 个以上的微生物) ，物种多样性也很高。分析得到的微生物1 6 s 序列一共有7 0 9 条，以9 7 的相似性为限便可以分得o t u 共2 0 4 个。这2 0 4 个o t u 分布很广， 不仅在a m d 里常见的几个门类，譬如变形菌门、硝化螺菌门、厚壁菌门、酸杆 菌门、放线菌门均等有大量分布，同时还有一些o t u 属于很少在a m d 里被检 测到的门类，例如衣原体门和t m 7 门。 ( 2 ) 这些嗜酸微生物在1 4 个样点里的分布相互间的差异很大。用u i n f r a c 对各个a m d 样点里微生物的1 6s 序列进行聚类分析，结果显示广东省1 4 个 a m d 样点并没有按照地理位置、矿区类型或者采样时间的相近而聚类，且大部 分样点彼此间的u i n f r a cs c o r e 均在0 5 左右，而非接近o 或接近1 ，表明这些a m d 样点的微生物群落组成，虽然不存在绝对的组成差异，但彼此间的相似度很低。 ( 3 ) a m d 的理化指标，对样点间的微生物群落组成差异影响不大。因为虽 然这1 4 个a m d 样点隶属4 个不同类型的矿区( 硫铁矿、铅锌矿、多金属矿等) ， 但彼此间理化性质的差异却并不大，对各个样点的理化指标进行p c a 聚类分析 显示，这些a m d 样点间没有明显的分簇，绝大多数样点聚成一群。 ( 4 ) 变形细菌门下的g a m m a p r o t e o b a c t e r i a 纲的细菌( 主要是a t f e r r o o x i d a n s 菌) ，以及n i t r o s p i r a 门下的l e p t o s p i r i l l u m 属类群i i i 的细菌，在广东省1 4 个a m d 样点里均有分布，且在大多数样点里占优势地位。前者是铁硫氧化的重要参与者， 后者可能是a m d 里唯一的固氮类群。这两类微生物可能属于a m d 群落构建的 核心物种。 ( 5 ) 目前受到广泛关注的古细菌，在所研究的这些样点里所占的比例非常 低，古菌所占比例最高的样点中，古菌也不过百分之几的比例，甚至大多数样点 完全没有古细菌被检出。而检测出的古菌，多样性也很低，1 4 个a m d 样点的序 列，全部都能归入3 个o t u 中，而且全部分布在e u r y a r c h a e o t a 下的 t h e r m o p l a s m a t a l e s 目中。这可能是由于技术上的缺陷( 例如引物不能有效扩增古 菌d n a ) 导致的1 6s 克隆文库未能很好的代表a m d 实际含量有古细菌丰度。 ( 6 ) 曾被认为是催化a m d 产生的非常重要的一类细菌，l e p t o s p i r i l l u m 属 的厶f e r r o o x i d a n s ，在大部分的a m 3 样点里均不占优势，甚至在s 1s u m 、l a k e 等样点里，完全没有检出lf e r r o o x i d a n s 菌。这可能是由于l f e r r o o x i d a n s 虽然 对矿物酸化以及a m d 产生有着比较重要的作用，但在一个成熟的a m d 微生物 群落里，可能并非必要的组成部分。 关键词：酸性矿山废水、微生物多样性、广东省、1 6 s 克隆文库 m i c r o b i a lc o m m u n i t ys t r u c t u r ea n dd i v e r s i t yi na c i dm i n e d r a i n a g ee n v i r o n m e n ti n4m i n i n ga r e a so tg u a n g o o n g ln l p r o v i n c e m a j o r ：e c o l o g y n a m e ：l ul i s u p e r v i s o r ：p r o f l a nc h o n g - y u a bs t i 认c t a c i dm i n ed r a i n a g e ( a m d ) i sa l le x t r e m e l ya c i d i ce n v i r o n m e n t ( p h 3 0 ) a r o u n d t h ew o l r d d u et om o m e n t o u st h e o r e t i c a l s i g n i f i c a n c e i nt h ea s p e c to fg l o b e g e o c h e m i s t r ye v o l u t i o na n dt h ea p p l i c a t i o np o t e n t i a lo nb i o l e a c h i n g ，t h e r ea r e a b u n d a n ts t u d i e so fm i c r o b i a lc o m m u n i t yc o m p o s i t i o na n dd i v e r s i t yi na m d n u m e r o u sr e s e a r c h e su s i n gb o t hc u l t i v a t i o n - d e p e n d e n ta n dm o l e c u l a r - b a s e dm e t h o d s h a v er e v e a l l e dt h ed i v e r s i t yi na m da t s p e c i f i c s i t ee x t e n s i v e l y , h o w e v e r , f e w r e s e a r c h e sh a v ef o c u s e do nt h er e g i o np a t t e r no fd i v e r s i t yi na m d i nt h i ss t u d y , 4a m ds a m p l e sw e r ec o l l e c t e df r o m3m i n i n gs i t e so fg u a n g d o n g p r o v i n c e t h em i c r o b i a lc o m m u n i t yc o m p o s i t i o na n dd i v e r s i t yw e r es t u d i e db y16s r r n ac l o n el i b r a r i e s ，a n dt h e i rp h y s i c o c h e m i c a lp a r a m e t e r sa l s oh a db e e nm e a s u r e d b yc o m p i l i n gt h ep u b l i s h e d16sr r n ad a t a s e t so fg u a n g d o n gp r o v i n c e ，i tm i g h tb e t h ef i r s ts t u d yw h i c hr e s e a r c h e dt h em i c r o b i a lc o m m u n i t yc o m p o s i t i o na n dd i v e r s i t y o f a m da tar e g i o n a ls c a l e t h em a i nr e s u l t sf r o mt h i ss t u d ya r ep r e s e n t e da sf o l l o w s ： ( 1 ) n o to n l yt h ea b u n d a n c e ，b u ta l s ot h ev a r i e t yo fm i c r o b e si nt h ea m d o f g u a n g d o n gp r o v i n c ei sv e r yh i g h t h e7 0 916ss e q u e n c e sh a db e e ni d e n t i f i e d ，w h i c h s o r t e di n2 0 4o t u sa ta3 d i f f e r e n c e t h e s eo t u sw e r ed i s t r i b u t e dn o to n l yi nt h e c o m m o np h y l u m sf r o mt h ea m de n v i r o n m e n t s ，s u c ha sp r o t e o b a c t e r i aa n dn i t r o s p i r a , b u ta l s oi ns o m er a r ep h y l u m s ( c h l a m y d i a ea n d t m 7 ) ( 2 ) t h em i c r o b i a lc o m m u n i t yc o m p o s i t i o na n dd i v e r s i t yw e r ev e r yd i f f e r e n t i i i a m o n gt h e 14s a m p l e s c l u s t e r a n a l y s i sb a s e db y16ss e q u e n c e sw h i c hw a s p e r f o r m e db yt h eu n i f r a cr e v e a l e dt h a tt h em i c r o b i a lc o m m u n i t yo f14 a m d s a m p l e s w e r en o tc l u s t e r e da sg e o g r a p h i c a ll o c a t i o no rm i n i n ga r e a , a n dt h e yw e r ed i s t i n c t i v e t oe a c ho t h e rb e c a u s em o s to ft h eu n i f r a cs c o r eb e t w e e nt h es a m p l e sw e r ec e n t r a l i z e d n e a r b yt h em e d i a ns c o r eo f0 5 ( 3 ) t h ed i f f e r e n c e so f m i c r o b i a lc o m m u n i t yb e t w e e nt h es a m p l e sw e r en o td u et o t h ed i f f e r e n c e so fp h y s i c o c h e m i c a lp a r a m e t e r s a l t h o u g ht h e14s a m p l e ss p r e a di n v a r i o u sk i n d so fm i n i n ga r e a si n g u a n g d o n gp r o v i n c e ，t h ep h y s i c o c h e m i c a l p a r a m e t e r sw e r es i m i l a r t h ep r i n c i p a lc o m p o n e n t sa n a l y s i sw a sp e r f o r m e di ns p s s o nt h eb a s i so ft h ep h y s i c o c h e m i c a lp a r a m e t e r s ，a n dm o s to ft h es a m p l e sc e n t r a l i z e d ， e x c e p tt h es a m p l ef kw i t hh i g hc o n c e n t r a t i o no fd i s s o l v e do r g a n i cc a r b o n ( 4 ) s o m em i c r o b e s ，s u c ha sa t f e r r o o x i d a n sa n dt h eg r o u pi i io fl e p t o s p i r i l l u m w e r ed o m i n a n tc o m p o n e n t so f m o s ts a m p l e s t h e ym i g h tp l a ya v e r yi m p o r t a n tr o l ei n t h em i c r o b i a lc o m m u n i t yo f a m d ( 5 ) t h ep e r c e n t a g eo fa r c h a e ai nt h et o t a lo t u sw a sv e r yl o w , a l t h o u g ht h e y w e r et h o u g h tt ob ee s s e n t i a li na m d t h e r ew e r eo n l y3a r c h a e ao t u s ，a n dt h e y w e r ea l lf r o mt h ep h y l u me u r y a r c h a e o t a i tm i g h tb ed u et ot h ed e f e c t so fp c r a m p l i f i c a t i o nf o rt h ea r c h a e a16sr r n a l f e r r o o x i d a n s ，w h i c ht h o u g h tt ob ea i m p o r t a n tr o l e i nt h e g e n e r a t i o n o fa m d ，w a sa l s or a r ei nt h e14s a m p l e so f g u a n g d o n gp r o v i n c e k e y w o r d s ：a m d ；m i c r o b i a ld i v e r s i t y ；e n v i r o n m e n t a ld i s t r i b u t i o n ；g u a n g d o n g p r o v i n c e ；16 sr r n ag e n e i v 论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论 文不包含任何其它个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文 的研究作出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本 人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名 日期：a df 护年多月箩日 学位论文使用授权声明 本人完全了解中山大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆、院系资料室被查阅，有权将学位论文的内容编入 有关数据库进行检索，可以采用复印、缩印或其它方法保存学位论文。 学位论文作者签 日期：励胗年6 月厂日疡日鹰月勃年 第1 章前言 1 1 酸性矿山废水( a m d ) 的产生及其环境影响 极端环境中的微生物群落结构及多样性是一个广受关注的热点问题。极端环 境在地球形成早期广泛分布，这些极端环境中的微生物在地球早期的地化起源中 扮演过重要的角色。而现存极端生境中的生物种类可以一定程度上反映了地球形 成早期极端环境中微生物的生命形式。而以高酸度为主要特征的极端酸性环境便 是极端环境的很典型的一种( j o h n s o n , 1 9 9 8 ) 。 酸性矿山废水( a c i dm i l l ed r a i n a g e ，a m d ) 主要来源于矿业开采产生的地表 渗透水、岩石空隙水、矿坑水、选矿厂、洗煤厂污水、井下生产防尘、灌浆、填 充产生的污水，以及矿业活动所产生的废矿堆及尾矿( j o h n s o n , 1 9 9 5 a ) 。a m d 是极端酸性环境( p h 3 的环境) 中最为典型和危害最严重的类型。因为a m d 的p h 值极低，且含有大量重金属离子( f e 、m n 、c u 、z n 、p b 、c d 、a s 、a l 等) 及s 0 4 2 ，会对环境造成巨大的污染和破坏( b a n k se la 1 ，1 9 9 7 ；n o r d s t r o m & a l p e r s ，19 9 9 ；l e b l a n ce ta 1 ，2 0 0 0 ；w h i t e h e a d & p r i o r , 2 0 0 4 ；h a l l b e r g & j o h n s o n , 2 0 0 5 ；s a n c h e z r o d a se ta 1 ，2 0 0 5 ) 。a m d 的产生和排放，不仅会造成矿山资源的 流失，而且会对受其影响的陆地和水生生态系统造成毁灭性的破坏，导致生物多 样性和生物量的剧烈减少( l a c k e y , 1 9 3 9 ) ，并最终直接威胁人类的健康，甚至生 存。据统计，早在1 9 8 9 年时，全世界就有约1 93 0 0 k m 河流以及7 20 0 0 h m 2 的湖 泊、水库受到a m d 的严重污染( j o h n s o n & h a l l b e r gk b ，2 0 0 5 ) 。而我国也不例 外，随着工业和采矿业的蓬勃发展，a m d 污染也越来越严重了。广东省大宝山 矿区a m d 的污染就是一个比较典型的例子。受该矿区a m d 的排放所污染的河 流长达3 0k m ，导致了周边6 0 0h m 2 农田重金属元素严重超标。部分污染严重的 河段已经鱼虾绝迹，而受灾最严重上坝村，近年死亡的二百五十人中，因癌症死 亡的就有二百一十人( 广州日报，2 0 0 0 ) 。 1 2a m d 微生物研究的理论与现实意义 a m d 是一个非常特殊的极端环境，它酸度极高( p h 通常在1 4 之间，有的 甚至更低，可以达到o 以下) ，并且寡营养化，可溶解性有机碳含量非常低( 大 部分a m d 的d o c 6 0o c ) ，大部分能氧化s 和r i s c s 。嗜泉古细菌界的其它类群如 m e t a l l i c u s ( h u b e r & s t e t t e r , 19 91 ) 、a c i d i a n u sb r i e r l e y i ( f u c h se ta 1 ，19 9 6 ) 和 m e t a l l o s p h a e r as p p ( h u b e re ta 1 ，19 8 9 ；f u c h se ta 1 ，19 9 6 ) 也具有f e 2 + 和s 的氧 化能力。另一类古细菌来源于广义古菌界( e u r y a r c h a e o t a ) 。这些古菌系统发育上 全都属于t h e r m o p l a s m a l e s 目中三个科：t h e r m o p l a s m a c e a e 、p i c r o p h i l a c e a e 和 f e r r o p l a s m a c e a e 中的成员。t h e r m o p l a s m as p p 和p i c r o p h i l u ss p p ( s c h l e p e re ta 1 ， 1 9 9 5 ) 是前两个科的代表微生物，其中t h e r m o p l a s m aa c i d o p h i l u m 普遍存在于 a m d 中，最早在一个煤废堆中被分离到( d a r l a n de ta 1 ，19 7 0 ) ；而p i c r o p h i l u ss p p 的发现则相对较晚。它们都属于专性异养菌，不能氧化f e 2 + 和r i s c s 。至于 f e r r o p l a s m a c e a e 科，现在总共发现两个种，一个是f e r r o p l a s m aa c i d i p h i l u m ，另 一个是f p a c i d a r m a n u s 。前者在生物反应器的沥滤液中分离到，属于嗜温、嗜酸 的铁氧化专性自养古细菌( g o l y s h i n ae ta 1 ，2 0 0 0 ) 。后者则在i r o nm o u n t a i na m d 中分离得到( e d w a r d se ta 1 ，2 0 0 0 ) 。分离到的这个菌株为f e r l ，在系统发育上与 甩a c i d i p h i l u m 极为相似，但鉴于两者在生理特性方面的不同，这个纯培养最后 被定为一个该属内的一个新种印a c i d a r m a n u s 。 7 1 3 3 已分离的嗜酸微生物 表1 - 1 已分离的嗜酸原核微生物( j o h n s o n & h a l l b e r g ，2 0 0 3 ) t a b l e 1 - 1 a c i d o p h i l i cp r o k a r y o t i cm i c r o o r g a n i s m s ( j o h n s o n & h a l l b e r g 2 0 0 3 ) - _ _ _ - - _ - _ - _ _ _ _ - - l - _ - _ i _ i _ _ - _ _ _ l - _ 一一- l l 嗜酸原核微生物 温度分类 系统发育分类 - - - - _ 一一 1 ai r o n - o x i d i z e r s 三f e ，r i p h d u m 工t h e r m o f e r r o o x i d a n s t h i o b a c i l l u s f e r r o o x i d a n s m - 1 “f p a c i d a r m a n u s ”。 1 bs u l f u r - o x i d i z e r s 嗜温菌 嗜温菌 中度嗜热菌 嗜温菌 嗜温菌 嗜温菌 嗜温菌 嗜温菌 n i t r o s p i r a n i t r o s p i r a n i t r o s p i r a b e t a p r o t e o b a c t e r i a a c t i n o b a c t e f i a t h e r r a o p l a s m a l e s t h e r m o p l a s m a l e s n i t l 哪p i r a 嗜温菌 g a m m a p r o t e o b a c t e r i a a t c a l d u s 中度嗜热菌 g a m m a p r o t e o b a c t e r i a t h i o m o n a sc u p r i n a 嗜温菌 b e t a p r o t e o b a c t e r i a 中度嗜热菌 a q u i f a c a l e s m e t a l l o s p h a e r as p p 极度嗜热茵 s u l f o l o b a l e s 1 ci r o n - a n ds u l f u r - o x i d i z e r s a t f e r r o o x i d a n s a c i d i a n u ss p p 嗜温菌 g a m m a p r o t e o b a c t e r i a 极度嗜热菌 s u l f o l o b a l e s s u t f o l o b u sm e t a l l i c u s极度嗜热菌 s u l f o l o b a l e s 1 di r o n - r e d u c e r s a c i d i p h i l u ms p p 嗜温菌 a l p h a p r o t e o b a c t e r i a 1 ei r o n - o x i d i z e r s r e d u c e r s a c i d i m i c r o b i u m f e r r o o x i d a n s 嗜温菌a c t i n o b a c t e r i a - _ _ l _ l _ _ _ _ - l - _ _ _ - _ - - - - _ - _ _ _ - - _ - _ - _ 一i i i i i i i _ _ - _ _ l - _ - _ - - l _ - _ - _ _ - _ _ _ _ - - _ - _ l - _ _ _ i - 一 8 1 fi r o n - o x i d i z e r s r e d u c e r sa n d s u l f u r o o x i d i z e r s s u l f o b a c i l l u ss p p 2 h e t e r o t r o p h i ca c i d o p h i l e s a c i d o c e l l as p p a c i d i s p h a e r ar u b r i f a c l 台凇 a c i d o b a c t e r i u mc a p s u l a t u m a c i d o m o n a sm e t h a n o l i c a a l i c y c l o b a c i l l u ss p p p i c r o p h i l u ss p p t h e r m o p l a s m as p p 3 o b l i g a t ea n a e r o b e s s t y g i o l o b u sa z o r i c u s a c i d i l o b u sa c e t t c l 上s 嗜温和中度嗜热菌 f i r m i c u t e s 嗜温菌 嗜温菌 嗜温菌 嗜温菌 嗜温菌 中度嗜热菌 中度嗜热 极度嗜热菌 极度嗜热菌 a l p h a p r o t e o b a c t e r i a a l p h a p r o t e o b a c t e r i a a c i d o b a c t e d u m a l p h a p r o t e o b a c t e r i a f i r i i l i c u r e s t h e r m o p l a s m a l e s t h e r m o p l a s m a l e s s u l f o l o b a l e s s u l f o l o b a l e s 注：嗜温菌，最适生长温度 6 0 0 c n o t e ：m e s o p h i l e s ( t o p p i n g 6 0 。c ) 1 4 微生物多样性的研究方法 1 4 1 传统微生物学方法 基于培养的传统方法，在嗜酸微生物的早期研究中占据着重要的地位。凭借 这种方法，人们从a m d 等酸性环境中分离和鉴定了大量铁、硫氧化的自养细菌 及嗜酸异养菌。最早用于分离嗜酸微生物的培养基是l e a t h e n ( l e a t h e ne ta 1 ， 1 9 5 1 ) 和9 k 培养基( s i l v e r m a n & l u n d g r e n , 1 9 5 9 ) ，随后，针对不同嗜酸细菌对 营养需求的不同，t & k ( t u o v i n e n & k e l l y , 1 9 7 3 ) 、i s p ( m a n n i n g ，1 9 7 5 ) 、m s f e p ( h a r r i s o n , 1 9 8 4 ) 等培养基相继被发明了出来。直到1 9 9 5 年，英国w a l e s 大学 的j o h n s o n 教授又发明了一种更加优秀的培养基1 v e r 埘双层培养基( j o h n s o n , 9 1 9 9 5 c ) 。其策略是在下层培养基中接种一种嗜酸异养菌，用来吸收自养菌代谢出 来的有机物，这样可以避免有机物对自养菌的毒害，从而确保菌落容易形成。例 如如a c i d i p h i l i u ms j i - i ( b r i d g e & j o h n s o n , 2 0 0 0 ) ，或者a c i d o c e l l aw j b - 3 ( j o h n s o n 甜a 1 ，2 0 0 1 ) ，均可添加在下层培养基中使用。然后，通过改变上层培养基的具体 组成，例如无机底物的种类、p h 值等，可以选择性地培养不同生理类群的嗜酸 细菌( 如铁氧化细菌、硫氧化细菌、中等嗜酸铁氧化细菌和嗜酸异养菌) ，甚至 可以用于培养古细菌。利用此培养基，目前已成功地培养了绝大多数的嗜温或中 度嗜热的铁、硫氧化嗜酸菌( j o h n s o n , 1 9 9 5 b ) ，基本上解决了在培养嗜酸菌过程 中所面临的效率低或平板无菌落生成的问题。目前，此培养基已被成功用于评估 环境和商业矿物淋溶样品中嗜酸微生物的生物多样性，成为从环境样品中分离未 知嗜酸菌的基础手段之一( j o h n s o n , 2 0 0 1 ) 。 1 4 2 传统分子方法 1 4 2 1 克隆文库分析 虽然传统的培养方法已经非常的成熟了，但在整个微生物群落中，绝大部分 的微生物在实验室条件下是仍然是无法培养的，可培养的微生物在整个微生物中 所占比例不到1 ( a m a n ne ta 1 ，1 9 9 5 ；p a c e ，1 9 9 7 ；h u g e n h o l t z , 2 0 0 2 ) 。而基于 r r n a 基因扩增的分子方法的引入，为人类研究环境中微生物的多样性提供了新 的、强有力的手段。早在上个世纪8 0 年代，就有人首次通过对5 sr r n a 基因的序 列分析来研究微生物的进化和多样性( s t a h le ta 1 ，1 9 8 5 ) 。但是，由于5 sr r n a 基因片段很短( 只有大约1 2 0 个核苷酸) ，携带信息非常少，因而在揭示微生物 群落多样性的能力上十分有限。相比之下，原核生物1 6 sr r n a ( 大约有15 0 0 个核 苷酸) 、2 3 sr r n a ( 大约30 0 0 个核苷酸) 和真核生物1 8 sr r n a 基因序列，因为片段 较长，所以可为微生物多样性研究提供更多信息，目前，这些r r n a 基因已经成 为了用于物种鉴别的常用的分子标记目的片段。1 6 sr r n a 为核糖体r n a 中的一 种，它之所以能作为分子标记，不仅由于其片段长，包含信息量大，更是因为其 存在于所有的原核生物中，并且在结构与功能上具有高度的保守性，在进化上具 有良好的时钟性质，因此，它能体现不同生物个体之间的系统发育差异。r r n a 方法自1 9 9 0 年开始应用- a - t - s a r g a s s o 海域浮游细菌多样性研究以来( g i o v a n n o n ie t 1 0 a ，1 9 9 0 ) ，其应用越来越普遍和广泛，至今一直是人们研究微生物组成及系统发 育多样性最为经典和最常用的方法。该方法大致过程如下：首先是提取环境样品 的总d n a ，然后通过对1 6 s ( 或1 8 s ) r d n a 的p c r 扩增、克隆、测序，以及序列 的比较分析，从而最终构建出微生物的1 6s ( 或1 8s ) 系统发育树。其中，序列 相似性大于9 7 ( b a n f i e l de ta 1 ，2 0 0 5 ) 或大于9 8 ( b o n de ta 1 ，2 0 0 0 b ) 的克隆 子，归为同一个序列型( o t u ) ，即认为是同_ 物种。这种克隆文库分子方法克 服了传统培养方法的缺陷，可以发现许多新的r d n a 序列( 即新物种) ，更加真实 地反映出了环境中微生物的多样性，并且还可以统计不同种群的相对丰度( h e a d 甜a ，19 9 8 ；r a v e n s c h l a ge ta 1 ，19 9 9 ；h u a n ge ta 1 ，2 0 0 4 ；r e a r d o ne ta 1 ，2 0 0 4 ； p o l y m e n a k o ue ta 1 ，2 0 0 5 ；b r u n e e le ta 1 ，2 0 0 6 ) 。 但是，这种依赖于p c r 的分子方法也未必尽善尽美，依然存在着不少缺陷， 譬如基因组d n a 提取效率、p c 赋择性扩增等问题，都可能最终会导致对某些微 生物类群的过高或过低的评估( m u y z e r & r a m s i n g ，1 9 9 5 ；v o nw i n t z i n g e r o d ee ta 1 ， 1 9 9 7 ) 。 1 4 2 2d n a 指纹分析 尽管通过上述r i g a 基因克隆文库方法，所获得的序列信息能提供环境样品 比较如实、详细的微生物群落结构信息，但是这种方法花费较高，并且非常费时 ( s a i k a l ye ta 1 ，2 0 0 5 ) 。当分析的样品较多时，需要花费大量的时间和资金来进 行序列的测定、分析。为了解决r r n a 基因克隆文库方法在这方面的缺陷，各种 d n a 指纹分析技术便逐步发展起来：例如变性梯度凝胶电泳( d e n a t u r i n gg r a d i e n t g e le l e c t r o p h o r e s i s ，d g g e ) ( m u y z e r e ta 1 ，1 9 9 3 ) 、温度梯度凝胶电泳( t e m p e r a t u r e g r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i s ，t g g e ) ( m u y z e r ，1 9 9 9 ) 、扩增性r d n a 限制性酶切片 段多态性分析( a m p l i f i e dr i b o s o m a ld n ar e s t r i c t i o na n a l y s i s ，a r d r a ) ( v a n e e c h o u t t ee ta 1 ，19 9 2 ) 、单链构象多态分析( s i n g l e s t r a n dc o n f o r m a t i o n p o l y m o r p h i s m , s s c p ) ( s i m o ne ta 1 。1 9 9 3 ) 和末端限制性片段长度多态分析 ( t e r m i n a lr e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m , t - r f l p ) ( l i ue ta 1 ，19 9 7 ) ， 利用这种这种方法，可以无需构建克隆文库就能对不同环境样品微生物群落结构 进行比较分析，达到对微生物群落进行时、空动态监测的目的，但其所提供的信 息量却比r r n a 基因克隆文库方法要少很多。 1 4 3 新兴分子方法 1 4 3 1 荧光原位杂交 荧光原位杂交( f l u o r e s c e n c ei ns i t uh y b r i d i z a t i o n ，f i s h ) 是一种不需要依靠 p c r 扩增反应的分子技术，是一种由原位杂交技术( i ns i t uh y b r i d i z a t i o n ，i s h ) 发 展来的，细胞学方法与分子杂交技术相结合的产物。目前，该方法使用的探针一 般为非放射性物质( 例如荧光素，f l u o r e s c e i n ) 标记的寡核苷酸，为了保证杂交 反应较高的专一性，探针长度一般为1 5 3 0 个碱基。这种荧光标记的寡核苷酸探 针可以特异地与细胞内的互补核酸序列结合。用相应波长的光波照射，便可激发 荧光基团发光从而检测到目标细胞。且由于荧光探针可以用发射不同波长的染料 标记，所以在一个检测步骤中可同时检测多条目标序列。此技术最大优点在于可 以对所要研究的样品进行原位杂交，从而可获得特定微生物的大量信息，如微生 物的形态特征、样品上的空间分布以及在整个群落中的相对丰度和季节变化动态 ( s a y l o r & l a y t o n , 1 9 9 0 ) 。由于是对环境样品直接进行检测，所以获得的结果 理论上可以更真实的反映自然环境下微生物的多样性特征。目前，这个技术已经 成为微生物分子生态学研究中强有力的分析工具( a m a n ne ta 1 ，19 9 0 ) 。此技术 在a m d 环境微生物分子生态研究上也有应用。譬如s c h r e n ke ta 1 ( 1 9 9 8 ) 便曾 利用f i s h 技术对i r o nm o u n t a i na m d 中a t f e r r o o x i d a n s 和l f e r r o o x i d a n s 的数量 和分布进行了详细的研究，发现在这个a m d 环境中l f e r r o o x i d a n s 的数量远远 超过a t f e r r o o x i d a n s ，最后得出三f e r r o o x i d a n s 是导致m o u n t a i na m d 产生的关 键微生物类群的重大结论。又例如g o n z a l e z - t o r i le la 1 ( 2 0 0 3 ) 在t i n t or i v e r 的 采用此研究方法研究古细菌和细菌的分布，结果发现该酸性河流中近8 0 的原 核微生物是细菌，相反，古细菌的比例极低( 仅占3 ) 。 而近年来，f i s h 技术与流式细胞仪的联用，则进一步优化了f i s h 技术，用 流式细胞仪的自动检测统计功能，代替了f i s h 技术中原本需要在荧光显微镜下 人工计数的环节。 1 2 1 4 3 2q p c r q p c r ( r e a l t i m eq u a n t i t a t i v ep c r ) 技术可以在p c r 指数扩增期间通过连 续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的 初始量，从而实现对核酸的精确定量。q p c r 技术与其它的分子生物学技术的联 合应用( j i z h e n gh ee la 1 ，2 0 0 7 ) ，使我们不仅可以定性，而且可以定量研究微 生物群落结构组成及数量变化，从而深入探索微生物群落与环境因子之间的相互 作用及其动态变化过程。加上q p c r 技术的高灵敏性、高特异性、高精确度、 实时性、污染少等优点，该技术已经在微生物生态学中逐渐得到广泛的应用 ( f i e r e re ta 1 ，2 0 0 5 ) 。 1 4 3 3 宏基因组技术 宏基因组技术是一种新兴的微生物研究方法，它以环境样品中的微生 物群体基因组为研究对象，以和测序分析和基因筛选为研究手段，从而来 深入研究环境中微生物的多样性、种群结构、进化关系、功能基因等问题。 虽然宏基因组的概念早在1 9 9 8 年就出现了，但由于测序瓶颈的存在， 宏基因组技术发展缓慢。直到近几年，高通量测序技术高速发展，随着一 大批成熟的高通量测序平台，如罗氏公司( r o c h e ) 的4 5 4 测序仪( r o c hg s f l xs e q u e n c e r ) ，i l l u m i n 公司的