（环境科学与工程专业论文）atcc9027菌以泔水油为单一碳源优化鼠李糖脂的生产.pdf

硕士学位论文 a b s t r a c t b i o l o g i c a ls u r f a c t a n ti sak i n dm a t e r i a l ，w h i c hi sp r o d u c t e db ym i c r o o r g a n i s m s 、 p l a n t sa n di sc o m p o s i t i o no fh y d r o p h i l i ca n dh y d r o p h o b i c i ti su s u a l l yc a u s e db y c u l t i v a t i o no fm i c r o o r g a n i s m su n d e ra e r o b i ca n da n a e r o b i cc o n d i t i o n si nd i f f b r e n t c a r b o ns o u r c em e d i u m ，i nt h e i rm e t a b o l i cp r o c e s sh a ss o m es e c r e t i o nw i t hc e r t a i n s u r f a c ea c t i v em a t e r i a l a c c o r d i n gt ot h es t r u c t u r ec h a r a c t e r i s t i c so ft h eb i o l o g i c a l s u r f a c ea c t i v ea g e n t ，i tc a nb ed i v i d e di n t o5c a t e g o r i e s ：g l y c o l i p i d ，l i p o p e p t i d e sa n d l i p o p r o t e i n s ，p h o s p h o i i p i d sa n df l a t t ya c i d s ，p o l y m e r i cs u r f a c t a n tt y p ea n dp a r t i c l e s u r f a c ea c t i v ea g e n t s d u et ot h eb i o l o g i c a ls u r f a c ea c t i v ea g e n tw i t hs o l u b i l i z a t i o n ， e m u l s i f i c a t i o na n dw e t t a b i l i t ye f f e c t ，i ti sp l a y i n ga ni n c r e a s i n g l yi n l p o r t a n tr o l ei n t h ep e t r o l e u mi n d u s t r y ，t h ee n v i r o n m e n t a l e n g i n e e r i n gf i e l d ， t h ef i e l do ff b o d ， m e d i c i n e ，c o s m e t i cf i e l d s i nt h i sp a p e rs t u d i e s ，r h a m n o l i p i da sac o m m o nt y p eo ft h e b i o l o g i c a l s u r f a c ea c t i v e a g e n t w h i c hc a n g e n e r a l l yb eo b t a i n e dt h r o u g h f e r m e n t a t i o n ，a n dt h e nw a se x t r a c t e da n dp u r i 6 e db yt h ee x t 豫c t i o n ，u l t r a 6 l t r a t i o n ， f o a ms e p a r a t i o n ，c 0 1 u m nc h r o m a t o g r a p h y i nt h i ss t u d y ，r h a m n o l i p i dp r o d u c t i o nb yp s e u d o m o n a sa r u g i n o s aa t c c9 0 2 7 w i t hw a s t ef r y i n go i la ss o l ec a r b o ns o u r c e t h eo r g a n i cs y n t h e s i si nt h ew a s t eo i lc a n w e r ed i r e c t i yu s eb yt h e s em i c r o o r g a n i s m s ，a n dt h e nas p e c i a ll i f e a c t i v i t yo ft h e b i o l o g i c a ls u r f a c ea c t i v ea g e n ti sp r o d u c t e d t h r o u 曲t h i se x p e r i m e n t ，w a s t eo i lw a s t r e a t e d ，m e a n w h i l et h ev a l u a b l eb i o s u r f a c t a n tr h a m n o l i p i dw a sg a i n e d i nt h i ss t u d y ，r h a m n o l i p i dp r o d u c t i o nb yp s e u d o m o n a sa r u g i n o s aa t c c9 0 2 7 w i t hw a s t ef r y i n go i la ss o l ec a r b o ns o u r c ew a ss t u d i e du s i n gr e s p o n s es u r f a c e m e t h o d c u l t u r e sw e r ei n c u b a t e di ns h a k i n gn a s kw i t ht e m p e r a t u r e ，n 0 3 一a n dm 9 2 + a st h ev a r i a b l e s m e a n w h i l e ，f e d b a t c hf e r m e n t a t i o ne x p e r i m e n t sw e r ec o n d u c t e di n 2 - lf e r m e n t a t i o nt a n k r e s u l t ss h o w e dt h a tt h et h r e ev a r i a b l e sw e r ec l o s e l yr e l a t e d t o r h a m n o l i p i dp r o d u c t i o n t h eo p t i m a lc u l t i v a t i o nc o n d i t i o n sw e r eo f6 4 g l n a n 0 3 ，3 1g lm g s 0 4a t3 2 ，w i t ht h em a x i m u mr h a m n o l i p i dp r o d u c t i o no f6 6 g l t h er e s u l t so ff e d - b a t c hf e r m e n t a t i o ne x p e r i m e n t ss h o w e dt h a tf e e d i n gt h eo i l i n t w ob a t c h e sc a ne n h a n c er h a m n o l i p i dp r o d u c t i o n t h eb e s tt i m ei n t e r v a lw a s7 2h w i t hm a x i m u mr h a m n o l i p i dp r o d u c t i o no f8 5g l t h ed a t aw e r ep o t e n t i a l l yu s e f u l f o rm a s sp r o d u c t i o no fr h a m n o l i p i do no i lw a s t ew i t ht h i sb a c t e r i u m k e yw o r d s ：p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a ；r h a m n o l i p i d ； w a s t ef r y i n g o i l ； r e s p o n s e s u r f a c em e t h o d ：b a t c h f e d i i i a t c c 9 0 2 7 菌以泔水油为单一碳源优化鼠李糖脂的生产 附图索引 图1 1 液滴的接触角3 图1 2 泡沫分离法提取生物表面活性剂1 0 图1 3 铜绿假单胞菌产生的四种鼠李糖脂1 4 图1 4 用元素衡算式来间接估计乙醇产生速率，菌体浓度等的方法2 2 图2 1 鼠李糖脂的标准曲线2 7 图2 2 机械发酵罐示意图2 8 图2 3 鼠李糖脂成分的薄层色谱检测结果3 1 图2 4a t c c9 0 2 7 产鼠李糖脂单糖脂混合物h p l c m s 图谱3 3 图2 5a t c c9 0 2 7 产鼠李糖脂单糖脂混合物的衍生物h p l c m s 图谱3 4 图2 6a t c c9 0 2 7 产鼠李糖脂二糖脂混合物h p l c m s 图谱3 6 图2 7a t c c9 0 2 7 产鼠李糖脂二糖脂混合物的衍生物h p l c m s 图谱3 7 图2 8 第二部分鼠李糖脂二糖脂混合物h p l c m s 图谱3 8 图2 9 第二部分鼠李糖脂二糖脂混合物的衍生物h p l c m s 图谱3 9 图2 1 0 鼠李糖脂二糖脂混合物经二次柱层析纯化后h p l c m s 图谱4 0 图3 1 温度和硝酸钠浓度对鼠李糖脂产量的影响4 4 图3 2 温度和硫酸镁对鼠李糖脂产量的影响4 6 图3 3 硝酸钠和硫酸镁对鼠李糖脂产量的影响一4 7 图3 4 流加发酵中，菌体的生产情况4 8 图3 5 流加实验中鼠李糖脂变化曲线4 9 v i 硕士学位论文 附表索引 表1 1 生物表面活性剂的种类及其微生物来源1 表1 2 流加培养的例证2 0 表1 3 控制流加培养所需的初级参数一2 1 表2 1 实验编码设计2 5 表2 2 中心复合设计的试验设计及试验结果2 5 表2 3 鼠李糖脂标准曲线的测定数据2 7 表3 1 响应面法的回归模型和方差分析4 3 v l i 硕士学位论文 1 1 生物表面活性剂 第1 章绪论 生物表面活性剂是一类由微生物、植物或生物合成的集亲水和憎水基结构 于一体，通常是由微生物在好氧或厌氧条件下在不同的碳源培养基培养时，其在 代谢过程中分泌产生的一些具有一定表面活性的两性类物质。这些碳源一般是碳 水化合物、烃类、油、脂肪或者它们的混合物，大多数生物表面活性剂是生物的 次级代谢产物，可分为非离子型和阴离子型，阳离子型较为少见。跟其它表面活 性物质类似，生物表面活性剂也是由一个或多个亲水性和憎水性基团组成，亲水 基为脂、羟基、磷酸盐、羧酸盐基团或者是糖基一种或几种，憎水基则由蛋白质 或者是含有憎水性支链的氨酸等。 1 1 1 生物表面活性剂的分类及其生产的微生物种类 根据生物表面活性剂结构的不同，一般可将其分为5 类：糖脂类、脂肽和脂蛋 白类、磷脂和脂肪酸类、聚合表面活性剂类和微粒表面活性剂类，表1 1 列出了 一些常见的生物表面活性剂的种类以及对应生产的微生物种类。 表1 1 生物表面活性剂的种类及其微生物来源口3 1 生物表面活性剂微生物来源举例 糖脂 鼠李糖脂铜绿假单胞菌( p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a ) 纤维二糖脂玉米黑粉菌( u s t i l a g oz e a e ) 脂肽地衣芽饱杆菌( b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s ) 旨 薹荔鬟羞蒌；篙裟淼凼， s u r f a c t i r 枯草芽饱杆菌( b s u b t i l i s ) 粘液菌素荧光假单胞菌( p n u o r e s c e n s ) 枯草菌素枯草芽抱杆菌( b s u b t i l i s ) 腑酸，黼篓襄蒹蒌霁f 篇淼；裟燃鲞 短杆菌肽短芽孢杆菌( b b r e v i s ) 多粘菌素多粘芽孢杆菌( ( b p o i y m y x a ) 多聚表面活性剂热带假丝酵母( c a n a d i d at r o p i c a l i s ) t c c 9 0 2 7 菌以泔水油为单一碳源优化鼠李糖脂的生产 海藻糖脂 乙酸不动杆菌( a c i n e t o b a c t e rc a l c o a c e t i u s ) 红串红球菌( r h o d o c o c c u se r y t h r q p o l i s ) 灰暗诺卡氏菌( n o c a r d i ae r y t h r o p o l i s ) 糖脂类 糖脂是生物表面活性剂中最重要的也是最大的一类，品种最多。糖脂类生物 表面活性剂是由碳水化合物与长链脂肪酸或者羚基脂肪酸结合而成。从生理学观 点看，在不同的生产条件下，微生物可能会产生出不同的糖脂，而与生产阶段和 处于细胞休止条件无关；其分泌物在细胞外壁或者周边介质中。目前，大多数己 知种类的生物表面活性剂都属于糖脂类。在糖脂中，人们最为熟悉的是鼠李糖脂、 海藻糖脂和槐糖脂都已经进入大规模工业化生产阶段。 脂肽和脂蛋白 表面活性素是迄今已报道的效果最好的表面活性剂之一【4 ，5 1 ，在1 9 6 8 年，a r i m a 等首次发现枯草杆菌姆a e i l l u s 、s u b r i l i s ) i f 0 3 0 3 9 产生的脂肽类表面活性剂呈晶状， 并命名为表面活性素( s u r f a c t i n ) ，s u r f a c t i n 常常是肽链和b 羟基十五烷酸通过脂 键和酰胺键连接而成，一般从细菌的胞外代谢产物中可以分离得到。 脂肪酸、磷脂和中性脂 有些不动杆菌( a c i n e t o b a c t e rs p ) 可产生磷脂酞乙醇胺，具有有乳化作用； 曲霉( a s p e r g i l l u ss p p ) 的一些种和硫氧化硫杆菌亦可大量产生磷脂；节杆菌菌株 a k 1 9 和绿脓假单胞菌( p a e r u g i n o s a ) 4 4 t i 在十六烷和橄榄油上生长时，也能大量 积累磷脂( 4 0 ，8 0 w t w t ) 吲：由在正烷烃中生长红串红球菌产生的磷脂酰乙醇 胺能把两相界面张力降到1 i n n m 以下【7 j 。 高分子生物表面活性剂 高分子量生物聚合物往往能够表现出很多有用的特性，如高粘性、张力和抗 剪性等。因此聚合体生物表面活性剂的得到了广泛应用。目前研究比较多的此类 生物表面活性剂包括甘露蛋白、多聚糖蛋白等。 微粒生物表面活性剂 不动杆菌生产中有许多囊泡，直径在2 0 5 0 n m 之间，浮力密度为1 1 5 8 9 c m 3 ， 成分包含了蛋白质、磷脂和脂多糖。是相同生物体的外面的膜5 倍的磷脂和大约 3 5 0 倍的多糖。这些胞外膜囊泡这种特殊的成分构成是其具有分隔烃类的微乳化 作用，大大促进了微生物细胞对烷烃类物质吸收。 1 1 2 生物表面活性剂的性能 ( 1 ) 增溶作用 硕士学位论文 向水中加入少量生物表面活性剂，能使不溶或微溶于水的有机物的溶解度相 对于在纯水中显著提高，这种现象称作增溶现象。当表面活性剂的浓度较低时， 表面活性剂的亲水基嵌入水中，而疏水基则暴露在外，形成片层状结构。而当表 面活性剂累积达到一定浓度后，活性剂分子形成球状，它们的亲油基团彼此互相 聚集，而亲水基团则外向伸入水相，这样的聚集体叫做胶束。能够形成胶束的最 低表面活性剂浓度叫做临界胶束浓度( c r i t i c a lm i c e l l a rc o n c e n t r a t i o n ，c m c ) 。一 般认为，增溶作用只有当表面活性剂的浓度高于c m c 时，其中不溶物质才会被 胶束所包围而溶解于水中，增溶作用因此才会显著。在c m c 以上，表面活性剂 浓度越高，生成的胶团数越多，能加溶于胶团的微溶或不溶物质的量也越多，即 增溶作用就越强。c m c 越低，说明这种活性剂的表面活性越高，使用较低浓度 时就能发挥其增溶作用。 ( 2 ) 乳化作用 由于表面活性剂的作用，使本来不能混合到一起的两种液体能够混入到一起 的现象称为乳化现象，这个作用就称为乳化作用。加入表面活性剂后，由于表面 活性剂的两亲性质，其在油水界面上吸附并富集，改变了临界面状态，从而使本 来不能混合在一起的“油”和“水”两种液体能够混合到一起，其中一相液体离 散成许多微粒分散于另一相液体中，成为乳液。这其中有一种液体或几种液体以 液珠的形式均匀地分散于另一种或几种与其不相混的液体中。 乳状液中的液珠大小并不是均匀等大的，而是各种大小都有一定的分布。一 般随着时间的增加，分布曲线的最大值逐渐向质点变大的方向移动，而且质点分 布更为分散，乳状液的稳定性变差。加入表面活性剂至一定值时，乳状液的表面 膜形成排列较紧密的定向吸附分子，膜的强度较高，乳状液凝结时受到的阻力较 大，从而增加了乳状液的稳定性。 ( 3 ) 润湿作用 润湿是指固体表面上的一种气体被一种液体所取代的过程，通常涉及气、液、 固三相。将液体滴于固体表面，平衡时液体或铺展覆盖于固体表面，或形成一个 液滴停留于固体表面。在固、液、气三相的交界处，自固液界面始，经过液体 内部到气液界面的夹角叫接触角，如下图所示： g s 图1 1 液滴的接触角 a 1 c 9 0 2 7 菌以泔水油为单一碳源优化鼠李糖脂的生产 以接触角表示润湿性时，通常将0 = 9 0 。定为润湿与否的标准。0 9 0 。，叫 做不润湿，0 簪旦芷 硕士学位论文 b o 9 1 0 0 8 1 4 1 ，s 8 柏4 止 9 3 7 91 3 c i 9 8 1 4 1 9 3 6 d 8 4 0 1 6 38 4j | l 。? 6 191 0 1 0 m z d e 图2 8 第二部分鼠李糖脂二糖脂混合物的衍生物h p l c 一- s 图谱 a ) h p l c 色谱图；b ) 1 3 - 1 3 5 m i n ；c ) 1 4 - 1 4 5 m i n ；d ) 1 4 5 1 5 m i n ；e ) 1 5 1 5 5 m i n 3 5 8c-口c，口9口!口叱 rrjrtjj11r|j_丁_1rrt一j_j_tt-：一11jj二jjjjjjjj爿jj了djjdj斗 ：； = 8 ；2 加 ：3 ：； 帖 加 纷 ； 挎 持 住 仳 i 旷 喜星，qv口叠旦。叱 a t c c 9 0 2 7 菌以泔水油为单一碳源优化鼠李糖脂的生产 b 7 0 3 o l ，o 5 7 6 9 j 8 ；i e 1 - h _ lu l 。【l 。 c 6 4 7 1 6 4 8 1 7 0 ”7 2 9 o j l ，3 0 ， 6 1 5 1ir 徽 d 6 5 0 0 6 5 1 o 7 1 1 0 7 7 e 8 7 7 o 6 9 7 07 6 0 1 f 6 7 8 o 6 _ o7 6 7 _ 4 o o7 8 7 m z 图2 9 鼠李糖脂二糖脂混合物经二次柱层析纯化后h p l c 一_ s 图谱 a 1h p l c 图谱；b ) 7 o 8 o m i n ；c ) 9 5 1 0 0 m i n ；d ) 1 0 5 1 1 o m i n ；e ) 1 2 0 1 2 5 m i n ； f ) 1 3 0 - 1 3 5 m i n 图2 9 为鼠李糖脂二次柱层析纯化h p l c m s 图谱。图中最强负离子a p c i 质谱信号分别为m z6 4 9 o 、6 7 5 0 和6 7 7 0 ，对应的峰出现的保留时间10 6 9m i n 、 1 2 2 4m i n 和1 3 3 5m i n 。分别对应于r h a 2 c l o c l o 、r h a 2 c l o c l 2 h 2 和r h a 2 c l o c l 2 。 图中没有出现r h a c l o c l o 特征峰，可见已经被完全分离去除。保留时间7 0 7 7m i n 特征峰其m z 为6 4 7 1 、9 5 1 0 0m i n 特征峰m z 为6 2 1 1 ，与图2 3 中1 0 0 1 0 5 m i n 3 6 8c导c3qv岳墨星 ，qqql勺勺q1勺q勺1qlqlq暑拍 8cic：qv皇翠墨e 硕士学位论文 特征峰m z 值和图2 6 中6 5 7 2 m i n 分别对应，其分别为r h a 2 c l o c l o h 2 r h a 2 c l o c 8 ，与以上关于两种成分的推断相符。这两种成分的含量相对很低。 2 8 本章小结 本章通过实验的设计了响应面的具体实施方案，确定了发酵温度，硝酸钠浓 度和硫酸镁浓度的三因素三水平实验。制作了鼠李糖脂标准曲线，以及获知了鼠 李糖脂与苯酚硫酸法的换算比例，进行摇瓶实验和发酵实验的具体操作，确定了 流加实验的方法，对鼠李糖脂进行了分离和提纯。然后再此基础上对鼠李糖脂表 征进行了分析。 3 7 a t c c 9 0 2 7 菌以泔水油为单一碳源优化鼠李糖脂的生产 第3 章结果与讨论 鼠李糖脂作为生物表面活性剂中最常用的一种，其不管在工业、民用方面， 更在环境保护方面都有着不可比拟的优越性，但是由于成本的制约，却迟迟难以 在大规模的工业化生产中运用。众多研究者将目光投向了主要依靠生产过程和原 材料的成本的降低来降低工业化生产成本，其中这两个因素占到整个鼠李糖脂生 产成本的一到三成。更多以废料为碳源研究见诸报端。 另一方面，每天在家庭和工业生产过程中均产生大量的餐饮废油，给环境及 社会带来了巨大压力，而我国对餐饮废油的处理水平还远远不能满足餐饮废油的 增长，造成了各种问题如：影响市容市貌、污染水源并影响到水中及岸边动植物 环境、其腐化产生的臭味污染空气，和被回收制造地沟油进行非法牟利等。虽然 一些城市己出台规定，规范餐饮废油回收利用的途径，例如用来生产油酸或者肥 皂，但其仍存在巨大的经济效益差、难以治理二次污染等问题。 本论文通过对以泔水油为单一碳源，用铜绿假单胞菌a t c c 9 0 2 7 ( 美国典型 微生物保藏中心) 进行了响应面法和流加培养优化，并在发酵罐中进行发酵生产， 目标是为了在去除城市中大量的餐饮废油。培养的铜绿假单胞菌以利用“泔水油” 发酵生产鼠李糖脂，其碳源十分廉价，又减少了对环境的污染，同时合成的具有 特殊生命活性的鼠李糖脂，用于环境污染补救中来。具有相当大的发展前景和无 比巨大的优越性。 3 1 响应面法回归方程 这些实验的结果符合于一个二阶多项式方程。回归系数的价值进行了计算， 并拟合方程( 以编码的计算) 来预测鼠李糖脂的产量( x ) ，下面给出其系数方程： y = 1 6 6 + 0 9 9 6 a + o 9 4 6 b + 2 3 2 c + 0 0 0 5 2 1 a b + o 0 4 1 7 a c 0 0 3 4 7 b c o 0 1 8 1 a 2 o 0 7 8 7 8 2 0 5 6 c 2 从这个方程，a 选定为温度；b 为n a n 0 3 的浓度和c 为m g s 0 4 的浓度。通过 f 测试检验统计意义的回归模型和方差分析的二次响应面模型( 见表3 1 ) 。其概 率值f 分布【( p f ) = 0 0 0 0 3 7 l 】，其模式非常显著。通过测定系数( r 2 ) 可以看出实 验与方程符合情况良好。在这种情况下，r 2 = 9 6 表明该响应模型能够解释9 6 的 实验变化趋势。一般说来，一个回归模型价值r 2 超过0 9 被认为具有很高的相关 性【6 1 1 。调整的价值判定系数( r 2 a d j = 8 7 ) 也足够高，足以表明这模型的意义。 硕士学位论文 r e g r e s s i o ns t a t i s t i c s 表3 1 响应面法的回归模型和方差分析 3 2 响应面法二位模型的建立及最佳条件的推导 通过二次模式的数据，获取了鼠李糖脂产量最大的生产条件：a = 3 2 b = 6 4g l ，和c = 3 1g l 。最优条件下的鼠李糖脂产量预测为6 6 9 l 。为了证明这 些预测的实验结果是否符合，额外做了几组用最佳条件来生产鼠李糖脂，其平均 产量为6 7 1g l 。良好的预测值与实验值符合证实了该模型的有效性和存在有最 佳条件。发酵条件的和产量之间关系的3 d 响应面法图可以看出发酵条件对鼠李 糖脂产量有着显著的影响( 图3 1 ，3 2 ，3 3 ) 。铜绿假单胞菌生产鼠李糖脂有几种 不同生产途径，由一个复杂的多层基因调节。此外，其合成是个高度依赖环境条 件，特别是温度、氮源和矿物质。通过分析图3 1 、3 2 ，连续培养的温度范围为2 0 到4 0 ，最优的鼠李糖脂生产温度为3 2 。过高或者过低的温度都会导致鼠 李糖脂产量的急剧下降。在其测试的所有温度中，实验内的泔水油几乎被全部消 耗掉。此外，在生物发酵生产鼠李糖脂过程中，脂质代替糖的过程中，限氮可以 促进脂质的积累1 6 2 6 引。s y l d a t ka n dl a n g ( 1 9 8 5 ) 【“】发现了发酵液中限氮可以引起 鼠李糖脂的高产。s a n t aa n n a ( 2 0 0 2 ) a n dr a s h e d i ( 2 0 0 5 ) 【6 5 ，6 6 】的报告中表明，硝酸 钠盐比硫酸铵和尿素作为鼠李糖脂生产的氮源更为高效。这也是为什么在我们的 实验里硝酸钠被选为了氮源。 3 9 f e m p e r a l u r e ( o c ) 图3 1 温度和硝酸钠浓度对鼠李糖脂产量的影响 通过分析图3 1 、3 3 ，极端的氮盐浓度严重的抑制了鼠李糖脂的生产。氮浓 一_1、功一一ozz芍co；micoucoo 度结果与上述文献相符，最佳生产的硝酸钠浓度为6 4 9 l 。 4 l (16)pl呈oce芑c。焉宅oocoos d 9 o a 苫 b c q 墨 芒 8 c 8 m 暑 t e m p e 怕t u 侍( o c ) 图3 2 温度和硫酸镁对鼠李糖脂产量的影响 镁的存在也有着强烈的影响鼠李糖脂的合成，l u i s ( 1 9 8 6 ) 【6 7 1 发现当镁离子浓 度下降到最低，可以通过铜绿假单胞菌发酵获得更多的鼠李糖脂产量。然而通过 图3 2 、3 3 ，以泔水油作为碳源发酵，镁离子的缺乏将严重影响鼠李糖脂的产出。 而适当镁离子浓度能大大提高鼠李糖脂的产量，最佳的产鼠李糖脂的硫酸镁浓度 为3 1 9 l 。其在最优的条件下，可获得6 6 9 l 的鼠李糖脂产量。 4 2 t h ec o n c e n t r a t i o no fn a n 0 3 ( g ，l ) 图3 3 硝酸钠和硫酸镁对鼠李糖脂产量的影响 4 3 16)pl dliocel4j芍c 0 l 苟暑c o 。c o o 5 一j、a一oo乏ko co；与coucoo o c _ a t c c 9 0 2 7 菌以泔水油为单一碳源优化鼠李糖脂的生产 3 3 流加发酵试验结果的分析 图3 4 展示了流加培养铜绿假单胞菌a t c c 9 0 2 7 菌体数的增长。开始对四组 细菌快速生长没有停滞，在0 2 4 小时，菌种生长情况类似。表明细菌的生长是 一个与总底物无关的质量转化率限制的过程。2 4 小时后在四组细胞生长慢下来 并且进入平稳期，但是有更高的初始底物浓度培养基获得了更多的细胞生长。经 过一段时间的，由于碳源损耗导致细胞自溶，o d 6 0 0 值开始下降。在过12 小时， 重新添加有碳源的发酵罐中，细菌出现了轻微的再次生长。在9 6 h 时添加碳源d 组的细菌生长率最高，但是b 、c 、d 组最大菌种增长没有达到在最开始一次性 添加所有碳源的对照组的最大水平。 图3 4 流加发酵中，菌体的生产情况 图3 5 反应流加发酵鼠李糖脂的生长情况，鼠李糖脂在菌种生长初期开始产 生，但大量鼠李糖脂生产发生在菌种稳定期，这和以前的研究是一致的【6 8 ，6 9 1 。 在4 8 h 和7 2 h 加入泔水油后，发酵液里面的鼠李糖脂浓度急剧增长。同时在9 6 h 添加泔水油的那组，发酵液中的鼠李糖脂产量却增加的不明显。这些结果表明， 鼠李糖脂的生产和细菌生长活动有着密切的关系。作为次生代谢产物，鼠李糖脂 通常是营养缺乏的条件下合成1 7o i 。在对数期时，营养物质没被限制，细胞生长 十分活跃，却极少产生鼠李糖脂。在稳定期的前中期，即4 8 h 和7 2 h ，细菌具有 较高的转化鼠李糖脂的活跃度。在9 6 h 时，细菌生长进入衰亡期。因为细菌活性 太低，增加碳源在这个时间点主要是用来回复细胞的活性和细胞繁殖，而不是产生 鼠李糖脂。当碳源在7 2 h 补充时，鼠李糖脂达到最高产量8 5 9 l 。 硕士学位论文 3 4 本章小结 图3 5 流加实验中鼠李糖脂变化曲线 本章通过对响应面法数据的回归方程的计算得到最优的优化条件，通过流加 补料实验中o d 6 0 0 和鼠李糖脂产量分析，得出在最优温度3 2 、硝酸钠6 3 9 、硫 酸镁3 2 9 下的发酵罐生产，通过定时补料碳源，可以大大延长了铜绿假单胞菌的 稳定期，即促进了鼠李糖脂产量生产的时间被大大延长，最终得到鼠李糖脂产量 最高可以达到8 5 9 l a t c c 9 0 2 7 菌以泔水油为单一碳源优化鼠李糖脂的生产 结论 本文是使用响应面法来优化环境方面的应用，通过构造了一个能明确表达的 具有隐式功能的多项式，通过二次拟合，得出其系数方程： y = 1 6 6 + 0 9 9 6 a + o 9 4 6 b + 2 - 3 2 c + 0 0 0 5 2 1 a b + 0 0 4 1 7 a c 0 0 3 4 7 b c 一0 0 1 8 1 a 。一0 0 7 8 7 8 2 o 5 6 c 2 从这个方程，a 选定为温度；b 为n a n 0 3 的浓度和c 为m g s 0 4 的浓度，其拟合 度为r 2 = 9 6 ，表明该响应模型能够解释9 6 的实验变化趋势。具有很高的相关 性。在响应面法被用来优化鼠李糖脂的生产，通过独立变量之间的相互作用与反 应研究。通过回归方程计算可以得出最佳发酵条件为温度3 2 0 c 和6 4 9 ln a n 0 3 和3 1g lm g s 0 4 ，此时我们可以得到最高的鼠李糖脂生产量。鼠李糖脂产量为 6 6 9 l 。 在得出响应面法最优发酵条件后，通过计算将流加实验分成4 组，选择在补 料时间后每4 h 连续测试1 2 h ，其余时间每1 2 h 从发酵罐中提取部分发酵液测试其 o d 6 0 0 值和用苯酚硫酸法来反应发酵液中鼠李糖脂的浓度。我们可以得出鼠李糖 脂的生产主要出现在菌种稳定期，适时的补料可以促进鼠李糖脂产量的增加。最 佳时间的补料，通过极大的延长了菌种稳定期，从而获得最优的鼠李糖脂产量。 当初始加入1 5 毫升泔水油，在7 2 h 时补充添加2 0 m l 泔水油，其在本实验中使用 a t c c9 0 2 7 铜绿假单胞菌作为发酵菌生产的鼠李糖脂的浓度达到最高的8 5 9 l 。 硕士学位论文 参考文献 【l 】d e s a ijd ，b a n a tim m i c r o b i a lp r o d u c t i o no fs u r f a c t a n t sa n dt h e i rc o m m e r c i a l p o t e n t i a l m i c r o b i o lm o lb i o lr e v ， 19 9 7 ， 6l ：4 7 - 6 4 2 】j i t e n d r ad d e s a i ，i b r a h i mm b a n a t m i e r o b i a lp r o d u c t i o no fs u r f a c t a n t sa n dt h e i r c o m m e r e i a lp o t e n t i a l m i c r o b i o lm o lb i o lr e v i e w s 1 9 9 7 ，6 l ( 1 ) ：4 7 - 6 4 【3 】k a p p e l i o ，p 、再，a l t h e r ，m m u e l l e re ta 1 s t r u c t u r eo fc e l ls u f a c eo ft h ey e a s ta n d i t sr e l a t i t o nt oh y d r o c a r b o nt r a n s p o r t a r c h m i c r o b i a l 1 9 8 4 ，1 3 8 ：2 7 9 1 1 0 【4 】p e y p o u x f ， b o n m a t i n j m ，、j i 厂a l l a c h j r e c e n tt r e n d si nt h eb i o c h e m i s t r yo f s u f a c t i n a p p lm i c r o b i o lb i o t e c h n o l ， 19 9 9 ，51 ：5 5 3 5 6 3 【5 】a r i m a k ， k a k i n u m aa ，t a m u r ag s u r f a c t a i na c r y s t a l l i n ep e p t i d el i p i d s u d f a c t a n tp r o d u c e db yb a c i l l u ss u b t i l i si s o l a t i o n ， c h a r a c t e r i z a t i o na n di t s i n h i b i t i o no ff l b r i nc l o ta c t i o n b i o c h e mb i o p h y sr e sc o m m u n 1 9 6 8 ， 31 ：4 8 8 4 9 4 6 r o b e r t m ，m e m e r c a d e ，m p b o s c h ，j l p a r r a ，m j e s p u n y ，m a m a n r e s a a n dj g u i n e a e f | e c to ft h ec a r b o ns o u r c eo nb i o s u r f a c t a n tp r o d u c t i o nb y p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a4 4 t 1 b i o t e e h n 0 1 l e t t ， 19 8 9 ，11 ：8 71 8 7 4 7 】k r e t s c h m e r a ，b o c k ha n dw a g n e r f c h e m i c a la n dp h y s i c a lc h a r a e t e r i z a t i o n o fi n t e r f a c i a l - a c t i v el i p i d sf t o mr h o d o c o c c u se r y t h r o p o l i sg r o w no nn - a l k a n e a p p l e n v i r o n m i e r o b i o l ， 1 9 8 2 ，4 4 ：8 6 4 8 7 0 【8 】t s o m i d e shj ，h u g h e sjb ，t h o m a sm j ，e ta 1 e f f e c to fs u r f a c t a n ta d d i t i o no n p h e n a n t h f e n eb i o d e g r a d a t i o n i ns e d i m e n t s e n v i r o n i o x i c oc h e m ， l9 9 5 ， 1 4 ：9 3 5 9 5 9 9 】0 l i v e r anl ，c o m m e n d a t o r emg ，e s t e v e sjl ，e ta 1 b i o s u r f a c t a n t - e n h a n c e d d e g r a d a t i o no fr e s i d u a lh y d r o c a r b o n sf r o ms h i pb i l g ew a s t e s ji n dm i c r o b i o l b i o t ，2 0 0 0 ，2 5 ：7 0 - 7 3 10 】p o r e m b ak ，g u n k e lw ，l a n gs ，e ta 1 m a r i n eb i o s u r f a c t a n t s i i it o x i c i t yt e s t i n g w i t hm a r i n em i c r o o r g a n i s m sa n dc o m p a r i s o nw i t hs y n t h e t i cs u r f a c t a n t s z e i t n a t u r f o r s c h ，1 9 9 l ，4 6 c ：2 1 0 2 1 6 11 】k a n g ash ，b o n n e rjs ，p a g eca ，e ta l - s o l u b i l i z a t i o no fn a p h t h a l e n ea n d m e t h y l s u b s t i t u t e dn a p h t h a l e n e sf r o mc r u d eo i lu s i n gb i o s u r f a c t a n t s e n v i r o n s c it e c h n o l ，1 9 9 7 ，3l ：5 5 6 - 5 6 1 【1 2 】m o r g a np ，h t k i n s o nrj h y d r o c a r b o nd e g r a d a t i o ni ns o i l sa n dm e t h o d sf o r s o i lb i o t r e a t m e n t c r i tr e vb i o t e c h n o l ，19 8 9 ，8 ：3 0 5 3 3 3 4 7 a t c c 9 0 2 7 菌以泔水油为单一碳源优化鼠李糖脂的生产 【13 】m a k k a rrs ， c a m e o t r ass a nu p t a k eo ft h eu s eo fu n v o n v e n t i o n a ls u b s t r a t e s f o rb i o s u r f a c t a n t p r o d u c t i o n a n dt h e i rn e wa p p l i c a t i o n s a p p l m i c r o b i o l b i o t e c h n o l ，2 0 0 2 ， 5 8 ：4 2 8 4 3 4 1 4 】张翠竹，梁凤来，张心平等一种脂肽类生物表面活性剂的理化性质及其对 原油的作用油田化学，2 0 0 0 ，1 7 ( 2 ) ：1 7 2 1 7 6 【1 5 梅建风