（分析化学专业论文）电沉积乙酰胆碱酯酶生物传感器的研制及农药残留分析.pdf

摘要 酶生物传感器自发现以来，因具有高度的选择性、结构简单、自动、价廉而备 受研究者的关注。特别是微电子技术、纳米材料制备技术、生物技术的发展为扩展 生物传感器的应用范围、批量生产、集成化、微型化打下了坚实的基础，极大地促 进了酶生物传感器的研究与应用。基于酶的生物传感器已经广泛用于农药的检测， 尤其是以乙酰胆碱酯酶( a c h e ) 的催化活性为基础的抑制型酶电极已大量应用于氨 基甲酸酯和有机磷类农药的检测。 酶的固定技术是制备生物传感器的关键步骤，这将直接影响传感器的稳定性、 灵敏度、检出限、响应时间和酶的活性、存活时间等。酶的固定技术主要包括酶的 固定方法和固定酶的载体材料的选择，当前国内外对生物传感器中酶的固定技术进 行了广泛的研究，并取得了许多重要进展。 电沉积是一种电化学过程，也是一种氧化还原过程。电化学诱导的聚合物沉积 已经用于生物分子的固定。壳聚糖是一种具有良好生物相容性的线型聚合物，分子 中的一n h 。能通过离子吸附的方式有效地应用于固定酶技术，从而作为生物传感器 的材料。 本论文一方面基于电沉积构建了三种生物界面，( 1 ) 壳聚糖( 2 ) 金纳米一壳 聚糖复合膜( 3 ) 金纳米一自组装膜。我们在这些生物兼容膜上固定乙酰胆碱酯酶， 用于农药的检测，检出限可达n g m l 级。另一方面，我f l 、描酰胆碱酯酶催化底物氯 化乙酰硫代胆碱，产生的硫代胆碱的特性进行农药检测。( 1 ) 硫代胆碱具有还原 性，硫代胆碱可以还原溶液中的四氯化金在界面生成金纳米，生成的金纳米可以调 控界面的电子传导，基于铁氰化钾探针电流的变化建立了农药测定的电化学传感 器。( 2 ) 用硫代胆碱在电极表面的化学吸附和脱附过程，构建了乙酰胆碱酯酶生物 传感器，用于高灵敏农药检测。 我们构建的生物传感器，一方面为农药残留速测问题的解决提供了一种新的方 法。另一方面据不同种类农药的生物活性不同以及它们与靶标酶作用的机理和结合 能力不同，可以用于农药和药物的高通量筛选，具有快速、灵敏、简便和不受筛选 试材生长状况影响等优点。 关键词：电沉积；金纳米；壳聚糖；自组装膜；乙酰胆碱酯酶；氨基甲酸酯和有机 磷类农药；生物传感器 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s a b s t r a c t e 】吆y m e sa r em em o s tp o 、e r 如lm o l e c u l a rr e c o g i l i t i o ne l e m e n t si nb i o s e n s i i l g ，s i i l c e t h es e n s i l l gs i g n a lc a nb e 锄p l i f i e dm i l l i o n so ft i m e st 1 1 r o u g he m 万m a t i cr e a c t i o i l s 1 1 1 i s s i g n a l 锄p l i f i c a t i o ne n a b l e st h ed e s i g n i n go fl l i g l l l y s e n s i t i v eb i o s e n s i n gs y s t e m s a m p e r o m e 埘ce n z y m a t i cb i o s e n s o r sh a v eb e e nc o n s i d e r e dt 0b et h em o s ts u i t a b l ef o r b i o c h e m i c a la 1 1 a l y s i sd u et ot 1 1 e i rg o o ds e l e c t i v 时，s e l l s i t i v 时，r a p i dr e s p o n s e ，m “a n 鹏 s i z e ，a n dr e p r o d u c i b l e r e s u l t s ac o m b i n a t i o no fe n z v m a _ t i cr e a c t i o n sw i t h e l e c t r o c h e m i c a lm e t l l o da 1 1 0 w e dt od e v e l o pd i 行e r e n te n z y m eb 2 l s e de l e c t r o c h e m i c a l b i o s e n s o r sf o rs e n s i t i v ea n dr a p i dd e t e m i n a - t i o no fe n v i n ) l l m e n t a la n a l y s i s a m o n gt h e s e ， a m p e r o m e t r i ca c e t y l c h o l i n e s t e r a s e ( a c h e ) b i o s e n s o r sb 2 l s e do nt h ei n l l i b i t i o no fa c h e l l a l v es h o w ns a t i s f a c t o 珂r e s u l t sf o rp e s t i c i d e sa i l a l y s i s ，i nw i l i c hm ee n z y t n a t i ca c t i v i 竹i s e m p l o y e da sa ni n d i c a t o ro fq u a n t i t a t i v em e a s u r e m e n to fi n _ s e c t i c i d e s as i g l l i f i c 觚tc h a u e n g et od e v e l o p m e n to fs e n s i t i v ea n ds t a b l es e n s o r sc o i n e sf b m e f 王e c t i v e i n 】m o b i l i z a t i o no fe n z v m et os o l i de l e c 仃- o d es u r f a c e e l e c t r o c h e m i c a l d e p o s i t i o nh a sb e e nr e p o i r t e dr e c e n t l ya sa ne 舵c t i v ei i l l i i l o b i l i z a t i o nm e t h o df o re 哪e d u et ot h ef o 珊a t i o no fs o l g e lf i l m s i no u re x p e r i m e n t ，o nt h eo n eh a n d ，t l l r e ed i f r e r e n tk i n d so fi n t e r f a c e sw e r e c o n s t r u c t e db a s e do nt h ee l e c t r o d e p o s i t i o no fc h i t o s a no rg o l dn a n o p a i r t i c l e s t h e s e i n t e r f a c e sd i s p l a y e de x c e l l e n tb i o c o m p a t i b i l i 够a n dg o o ds t a b i l i t yf o ri m m o b i l i z a t i o no f a c l e u n d e rt h eo p t i m a le i e c t r o d e p o s i t i o n ，锄p e r o m e t r i cs e n s o r sf o rm ef a s t d e t e 肌i n “o no fp e s t i c i d e 、v e r ed e v e l o p e d o nt h eo m e rh a n d ，m ei m m o b i l i z e da c l l e m e d i a t e dh y d r o l y s i so fa t c la n dy i e l d e dar e d u c i n ga g e n tt l l i o c h o l i n e as i m p l es t r 砷e g y f o rt h ed e s i g no fa ne l e c t r o c h e m i c a ls e n s o rb a l s e do ne n z y m e i n d u c e d 黟o w t l lo fg o l d n a l l o p a n i c l e s ( a u n p s ) w i t h o u ta d d i n gg o l dn a l l o - s e e d sw a sp r o p o s e d c h e m i s o r p t i o 刚，d e s o r p t i o np r o c e s ss e e m st ob eu s e m lf o rd e t e n l l i n a t i o no ft _ h j o l c o m p o u n d s ( a n dt h i 0 1 一p r o d u c i n gc a t a l y s t s ) 、v i t hh i g hs e n s i t i v i 够w - ea l s o 印p l i e dt h e c h e m i s o 印t i o n d e s o 印t i o np r o c e s so ft l l i o c h o l i n e o nag o l dn a n o p a r t i c l e sm o d i f i e d e l e c t r o d et od e t e m i n ep e s t i c i d e t bs 啪u p ，t h e s ep r o p o s e da c h eb i o s e n s o r sc o u l db er e a d i l ye x t e n d e dt o 砌t l l e i l e t e n n i n a t i o no fp e s t i c i d ea n dt l l ei n v e s t i g a t i o no fm e d i c h l eo rp e s t i c i d es e n s i t i v i t ) r k e yw o r d s ：e 1 e c n o d e p o s i t i o n ；c l l i t o s a n ；g o l dn a i l o p a r t i c l e s ；s e l f a s s e m b l e dm o n o l a y e r ； c a r b 锄a t e p e s t i c i d e s ；o 略a n o p h o s p h a 钯p e s t i c i d e s ；b i o s e n s o r 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 华中师范大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究工作 所取得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在 文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。 作者签名：了唣 日期：0 。乜莎年岁月( 8 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权华中师范大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。同时授权 中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通 过网络向社会公众提供信息服务。 作者签名：丁孝垃 日期：j 乜。待厂月舯 导师签名：槲 日期：蜥厂月加日 本人已经认真阅读“c a l i s 高校学位论文全文数据库发布章程”，同意将本人的 学位论文提交“c a l 工s 高校学位论文全文数据库”中全文发布，并可按“章程”中的 规定享受相关权益。回童途塞握銮后溢蜃i 旦坐生；旦二生；旦三生筮查! 作者签名：j 芬陟 日期：乒供泸夕月【莎日 导师签名：谰 日期：矽略年r 月矽日 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 第一章绪论 1 1 农药的作用及危害 农药是重要的农业生产资料，在农产品生产中对病、虫、草、鼠危害的防治起 到非常重要的作用，为人类创造了巨大的经济效益。农药是快速、高效、经济地防 治有害生物的重要武器，它在保证农业丰产丰收，满足人们对农副产品的需求等方 面发挥着突出的作用 1 ，2 】。但是，农药污染及其产生的危害后果是严重的，农药对 环境污染造成的损失是多方面的，包括对水环境的污染，对土壤的污染，对大气的 污染，对环境生物的影响以及对人体健康的危害等。目前由于使用者普遍缺乏科学 使用农药知识，片面追求产量，造成目前市场上流通的农业产品都不同程度地存在 农药残留问题，其危害也日益引起公众的关注【3 8 】。 在农业生产中应用的农药主要可分为四大类【1 ，9 ，1 0 】。第一类是以滴滴涕、六六 六为代表的有机氯杀虫剂。这类杀虫剂由于致畸、致癌、致突变、高残留等缺点， 已经停止生产和使用；第二类是目前品种最多，应用范围最广，用量最多的有机磷 ( o p s ) 杀虫剂；第三类是氨基甲酸酯杀虫剂，其中有一些品种属于高毒农药，如呋喃 丹等；第四类是拟除虫菊酯杀虫剂，多数为中等毒性或较低毒性的农药。除上述四 类以外，还有少量其他种类的杀虫剂。在所有的农药中，有机磷和氨基甲酸酯类农 药由于具有药效高、品种多、防治对象多、应用范围广、作用方式多、残毒少、药 害轻、在环境中降解快等优点在世界范围内使用量最大。我国生产和使用的杀虫剂 绝大多数品种为有机磷和氨基甲酸酯类农药( 约占7 0 ) ，其中高毒性的有机磷和 氨基甲酸酯类杀虫剂又占有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的7 0 左右，因此最容易引 起食物农药残留中毒 1 1 】。可见，加强对农产品中农药残留的检测对保护生态环境， 尤其是保障人类健康有着十分深远的意义，而农药残留检测的重点应该放在有机磷 和氨基甲酸酯类杀虫剂。 1 2 农药检测方法的应用进展 目前农药残留分析的主要方法是气相色谱法( g c ) 、高效液相色谱法( h p l c ) 等， 这些方法虽然分析精度高，定量准确，但其样品的前处理复杂、检测耗时长、成本 高、需要技术熟练的操作人员【1 2 1 4 】。目前国内外文献中报道的方法主要有光谱法、 色谱法、免疫法、酶抑制法、活体生物测定、分子印迹技术、生物芯片技术等。 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 1 2 1 光谱法 光谱法是根据有机磷农药中的某些官能团水解、还原产物与特殊的显色剂在特 定的环境下发生氧化、磺酸化、酯化、络合等化学反应，产生特定波长的颜色反应 来进行定性或定量( 限量) 测定。检出限在微克级，见表1 1 1 5 】。表1 一l 反映的是 微量化学试验法，主要用于商品农药的鉴别试验，灵敏度不高，试验干扰因素多， 含不同基团的有机磷的反应也不一样，易出现假阴性。为提高灵敏度，用分光光度 计等来测定有机磷的方法( 即波谱法) 逐渐代替了微量化学试验。 t a b l e1 11 卯eo fd i f r e r e n tc o l o rr e a c t i o na i l ds e n s i t i v i 够 经典的比色法是e l l m a n 发展起来的，其基于乙酰胆碱酯酶对底物催化，于显色 剂作用显示黄色，进行测定。以碘代硫化乙酰胆碱作为底物，5 ，5 二硫代双( 2 一硝 基苯甲酸) ( d t n b ) 为显色剂【1 6 ，1 7 。碘代硫化乙酰胆碱在乙酰胆碱酯酶的作用下水 解成碘代硫化胆碱，与d n m 作用显黄色，在4 1 0 m n 处测定溶液的吸光度变化， 可以进行农药的检测和筛选。 1 2 1 1 化学发光技术 化学发光法( c l ) 利用发光物质鲁米诺、光泽精、洛粉碱、没食子酸和过氧草酸 等与有机磷进行特殊的化学反应，在反应中吸收了释放出的化学能，而处于电子激 发态的反应中间体或反应产物由激发态回到基态时产生光辐射，检测限达到了n g l 级水平【18 2 0 。 1 2 2 色谱法 色谱法是一类分离分析方法，它是根据分析物质在固定相和流动相之间的分配 2 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 系数的不同达到分离目的，并将分析物质的浓度转换成易被测量的电信号( 电压、 电流等) ，然后送到记录仪记录下来的方法。目前应用于检测农药残留的色谱法主 要有薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法和毛细管电泳法。 1 2 2 1 薄层色谱法( t l c ) 薄层色谱法是一种较成熟的、应用也较广的微量快速检测方法。先用适宜的溶 剂提取农药，经纯化浓缩后，在薄层硅胶板上分离展开，显色后与标准农药比较来 进行定性测定，用薄层扫描仪进行定量测定，检出限达o 1 o 0 l 嵋。由于样品中农 残成份复杂，农药含量较低，为此，国内外针对该方法的不同实验步骤，如提取方 法、纯化方法、浓缩方法、薄层板的吸附剂种类、展开剂的配制、展开方式( 如单 向和双向展开) 以及显色方法都作了深入的研究和改进【2 l 】。 1 2 2 2 气相色谱法( g c ) 气相色谱法是检测有机磷农药的国家标准方法，该方法是利用经提取、纯化、 浓缩后的农药注入气相色谱柱，程序升温气化后，不同的农药在固定相中分离，经 不同的检测器检测扫描绘出气相色谱图，通过保留时间来定性，通过峰或峰面积与 标准曲线对照来定量。该方法具有即定性又定量、准确、灵敏度高，并且一次可以 测定多种成分的优点 2 2 ，2 3 】。 1 2 2 3 高效液相色谱法( i i p l c ) 高效液相色谱法是在液相柱层析的基础上，引入气相色谱理论并加以改进而发 展起来的色谱分析方法。与g c 相比，不仅分离效能好，灵敏度高，检测速度快， 而且应用面广。对气相色谱不能测定的如沸点太高不能气化以及对热不稳定，易裂 解变质的农药都可以用唧l c 来检测。实际应用中还常与质谱仪器等联用或前处理 技术相结合【2 4 2 6 】。 1 2 2 4 毛细管电泳法 毛细管电泳( c a p i l l a 巧e l e c t r o p h o r e s i s ，c e ) ，是近年来发展起来的一类以毛细管为 分离通道，以高压直流电场为驱动力的新型液相分离分析方法，是现代分析化学研 究的前沿领域之一。毛细管电泳在分析检测杀虫剂、杀菌剂以及除草剂残留方面取 得了不断进展，尤以各种除草剂的分离、单种农药制剂及复配农药的有效成分含量 测定为多。随着愈来愈多的开拓性工作的不断推进，毛细管电泳在将来的农药分析中 会得到更广泛的应用 2 7 2 9 】。 3 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 1 2 3 免疫法 免疫就是机体接触“抗原性异物 或“异己分子”所发生的特异性生理反应。 抗原是引起机体发生免疫应答的最基本物质。但是有机磷属小分子化合物，只能作 为半抗原。如果让机体产生抗有机磷作用的抗体，就必须将有机磷分子与大分子蛋 白质结合后制备成具有抗原性的物质，再免疫动物，让动物机体产生具有特异性的 抗体。抗体对相应的抗原具有识别和结合的双重功能，可与抗原选择性地结合，选 择性强，灵敏度高，所以免疫学方法是一种简便、快速、灵敏、特异的生物检测方 法。 酶联免疫吸附测定技术( e n z y m el i l l l ( e dm l i i l u n o s o r b e n t a s s a y 简称e l i s a ) 是 将免疫技术与现代测试手段相结合而建立的一种超微量的测定技术，其原理是通过 在合适的载体上，酶标限定量抗原与未知抗原竞争固相抗体结合位点或固相抗原与 未知抗原竞争限定量的标记抗体结合位点，形成抗体复合物。在一定底物参与下， 复合物上的酶催化底物，使其水解、氧化或还原成另一种带色物质。由于酶的降解 底物浓度与显色程度成正比，通过眼观或分光光度计测定，从而确定是否存在未知 抗原及其含量。 8 0 年代以来，已有大量文献报道了杀菌剂、杀虫剂和一些植物生长调节剂的 e l i s a 检测技术方法的建立，其检测水平可达到纳克，甚至皮克。有些发达国家如 美国、德国已开发出商品检测试剂盒应用于食品、蔬菜和环境中的农药残留分析 【3 0 一3 2 】。 1 2 4 酶抑制法( e l 帕 酶抑制法是利用有机磷的毒理特性建立的一种快速检测方法。在一定条件下， 有机磷农药对某些酯酶催化水解的j 下常功能有抑制作用，其抑制率与农药的浓度呈 正相关。这些酯酶包括：各种动物来源的乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶以及从某些 植物中提取的植物酯酶。使这些酶与样本进行反应，如果试样中没有农药残留或者 残留量极少，酶的活性就不被抑制；反之，如果农药残留量比较高，酶的活性就会 被农药所抑制，再利用一些特定的颜色或p h 值等的变化，从而达到检测有机磷农 药的目的【1 5 ，3 3 】 1 2 5 活体生物测定 活体生物测定方法主要用发光细菌、敏感家蝇以及大型水蚤等作为测试对象。 目前发光细菌己能用于有机磷农药的测定，敏感家蝇可用于几乎所有有毒物的检 测，大型水蚤除测定食品中添加剂、增效剂，还用于痕量农药残留的测定【3 4 】。 4 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 1 2 6 分子印迹技术 分子印迹技术的原理：模板分子与功能单体在合适分散介质中依靠相互作用 力，如共价键、氢键、离子键、范德华力、疏水作用以及空间位阻效应等，形成可 逆结合的复合物；再加入交联剂在光、热、电场等作用以及引发剂和致孑l 剂辅助下 形成既具有一定刚性又具有一定柔性的多孔三维立体功能材料，并且将模板分子有 规律的包在其中；合成后用一定方法把模板分子去除，从而获得与模板分子互补有 特异识别功能的三维孔穴，以便用于与模板分子再结合。 近年来有关印迹传感器技术在农药检测方面的研究不断深入，所涉及的农药品 种趋于多样化。已报道的印迹传感器可用于检测莠去津、敌草净、草甘膦、对硫磷、 氯霉素等十几种农药。对绝大部分农药的检测限可达岬l o 儿级，其中对草甘膦等有 机磷农药的检测限可达n g l 级 3 5 3 8 】。 1 2 7 生物芯片技术 生物芯片的概念源于计算机芯片，生物芯片技术是在一小片固相载体上储存大 量的生物信息( 多至几十万个) ，并与生物化学处理等技术相结合而发展起来的一 种新兴技术。将抗有机磷抗体固定于生物芯片上，通过被标记过的抗原( 有机磷与 其他大分子物质的结合物) 与抗体的特异性结合反应达到对农药的检测。在有机磷 农药中，最常用的显色技术是酶标技术、荧光素标记技术与发光免疫标记技术。 比较上几类检测方法，光谱法和色谱法是监测、检验部门分析有机磷主要方法， 而酶抑制法则更适合于基层单位的快速检测。免疫法和生物芯片技术代表未来的发 展方向，目前尚待完善 3 9 】。 随着人们生活水平与环保意识的提高，对环境与食品卫生的安全呼声也越来越 高，除了严格地控制农药的生产、运输、施放等环节外，必须要不断研究新的检测 方法来满足快速检测与精确检测的要求。实现农药的快速、简便检测无疑是一个发 展趋势。生物传感器能够满足农药残留快速检测技术发展的需要。其中由于酶抑制 法操作简便，速度快，不需昂贵的仪器，特别适合现场检测以及大批样品的筛选检 测，易于推广普及，因此酶生物传感受到越来越多的研究。 1 3 生物传感器 生物传感器是用固定化的生物体成分( 酶、抗原、抗体、激素等) 或者生物体 本身( 细胞、微生物、组织等) 为敏感元件，再与适当的能量转换器结合而成的器 件，它能测定许多化学和生物成分的含量。敏感元件产生基于待测化学量和生物量 5 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s ( 或浓度) 相关的化学或物理信号( 原始信号) ，然后由能量转换器转换成易于测 量的电信号( 次级信号) 。 生物传感器的分类方法很多，若按生物敏感材料的不同来划分，它可分为酶传 感器、免疫传感器、细胞传感器和组织传感器；按换能器来划分，它可分为电化学 生物传感器、热学生物传感器、光学生物传感器、半导体生物传感器、声学生物传 感器、压电生物传感器和表面等离子体共振生物传感器 4 0 ，4 l 】。 1 3 1 酶生物传感器 酶生物传感器是生物传感器领域中研究最多的一种类型。它是利用酶在生化反 应中的特殊催化作用，当酶浸入被测溶液，待测底物进入酶层的内部并参与反应， 大部分酶反应都会产生或消耗一种被电极测定的物质，当反应达到稳态时，电活性 物质的浓度可以通过电位或电流的模式进行测定。酶生物传感器的发展经历了三个 阶段。 1 3 1 1 第一代生物传感器 第一代生物传感器是利用氧作为媒介体，这种方法的响应信号与氧的分压或溶 解氧关系很大，而且通常是利用生成的在电极上的电氧化的输出信号来指示底物浓 度，较高的工作电位会使其它电活性物质氧化而造成干扰信号。 1 3 1 2 第二代生物传感器 第二代生物传感器是利用人为加入电子媒介体来解决电子传递的问题。最初是 将电子媒介体加入到底物溶液中，降低了工作电位，减少干扰；但是不能循环使用， 且不适于特殊环境下( 活体检测) 操作。随着化学修饰电极( c ) 的问世，目前多 是将电子媒介体修饰于电极上。 1 3 1 3 第三代生传感器 第三代生物传感器为所谓的无介体传感器，利用酶与电极的直接电子转移，而无 需加入其他试剂，减少操作步骤，这种传感器可称为真正意义上的“无试剂”传感 器，是理想的生物传感器，人们也一直在致力于这方面的研究。这种传感器与氧或 其他电子受体无关，无需媒介体 4 2 】。 1 3 2 有机磷水解酶生物传感器 有机磷水解酶是一种生物催化剂，能催化水解有机磷农药( p o 和p s 键水解) 和神经气体( p f 和p c n 键断裂) ，对农药如对氧磷、对硫磷和化学战剂都有较强 6 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 的水解作用 4 3 ，4 4 】。有机磷农药作为有机磷水解酶的底物，并不对酶产生抑制行为， 利用有机磷水解酶的独特优越性，可以制备各种类型的生物传感器用于有机磷农药 的检测。 它包括电流型和电位型生物传感器。电流型生物传感器，常以碳电极为基底电 极，反应中生成的硝基苯酚可在碳电极表面氧化，因此可以通过测定产物硝基苯酚 来达到检测有机磷农药的目的，反应式如下： xx r 一莘一z + h 2 0 蛆r 一半一o h + z h r p z + h 2 0 3 坚旦r p o h + z h r 。 r 。 而有机磷水解酶催化水解一分子的有机磷农药得到酚与酸，它们电离后形成的 质子量与有机磷农药浓度成相关性，构成了制备电位型酶电极的基础【4 5 ，4 6 】。 1 3 3 乙酰胆碱酯酶生物传感器 乙酰胆碱酯酶测定农药残留的工作原理是：酶催化底物乙酰胆碱或是氯化乙酰 硫代胆碱，在乙酰胆碱酯酶的催化作用下分解形成胆碱和有机酸或是硫代胆碱，利 用产物的特性进行检测。 乙酰胆碱酯酶生物传感器常用单酶体系( a c h e ) 或a c h e 和胆碱氧化酶( c h o d ) 共同修饰制备电极，双酶体系检测机理如下 4 7 】：可以通过测定溶液中的氧或h 2 0 2 来检测有机磷或氨基甲酸酯农药。 a c e t ) r l c h o l i i l e + h 2 0 丝竺专c h o l i n e + a c e t a t e ( 1 ) c h o l i n e + 0 2 兰竺生专b e t a i l l ea l d e h y d e + h 2 0 2( 2 ) 单酶体系的检测机理如下 4 8 】：通过硫代胆碱的氧化电流可以达到检测农药的 目的。 a c e 够l t h i o c h o l i i l e + h 2 0 丝鸟t h i o c h o l i n e + a c e t a t ea c i d ( 3 ) 2 t h j o c h o l i l l e ( r e d ) 专t l l i o c h o l i n e ( o x ) ( d i m e r i c ) + 2 h 十+ 2 e - ( 4 ) 1 3 3 1 电势型生物传感器 反应( 1 ) 产生的酸电离使得缓冲溶液的p h 值发生改变，p h 值的改变可以通过离 子选择电极( 玻璃电极、金属和金属氧化物电极) 和i s f e t 进行测定。p h 值的变 化量与农药对酶的抑制率即农药浓度成比例，从而可以间接测定农药残留 4 9 】。 1 3 3 2 电流型生物传感器 反应( 3 ) 中生成的硫代胆碱可被氧化而产生电流，以此可设计成电流型生物传感 7 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 器。如果同时使用胆碱酯酶和胆碱氧化酶，则胆碱氧化酶氧化反应所消耗的氧或生 成的过氧化氢也可被检测，以间接测定有机磷农药残留浓度。 1 3 3 3 乙酰胆碱酯酶生物传感器的应用 酶筛法在国外大农药公司常被用于农药的高通量筛选，它作为农药筛选方法之 一，除了具有高通量的优点外，还具有快速、灵敏、简便和不受筛选试材生长状况 影响等优点。在我国，由于农药研究一直是仿制，化合物的合成量有限，所以始终 没有开展高通量的酶筛选方法的研究。9 0 年代，为适应现代知识经济的新形势以及 我国是一个农业大国的特殊需求，我国农药研究工作走上了以创新为主创仿结合的 发展道路。在这种形势下，开展酶筛选方法及酶抑制方面的研究，一方面可为将来 高通量筛选做准备；另一方面可引进新思路，对于促进生测工作适应这种转变，使 化学合成有所依据从而指导化学合成是非常必要的。乙酰胆碱酯酶生物传感器的构 建可以一个方面满足快速检测农药的需要，另一方面可以研究农药与乙酰胆碱酯酶 的作用机理，进行农药的快速筛选【5 0 】。 阿尔茨海默病( a l z l l e i i i l e rd i s e a s e ，a d ) 即老年性痴呆症，是以进行性痴呆为特征 的大脑退行性变性疾病，是最常见的与年龄有关的神经衰退症，严重影响患者的认 知功能、记忆功能、视空间功能、社会生活能力、个人生活能力和情感人格等，随 着世界老年人口的急速增长，a d 发病人数也逐年增多。目前，世界上较为接受的 a d 病理为“胆碱能缺失学说”。学说认为老年性痴呆症患者大脑内神经递质一乙酰 胆碱的缺失是导致a d 疾病的关键原因。目前对老年痴呆的药物治疗主要是通过抑 制c h e 来提高患者体内的乙酰胆碱水平。医学治疗上多采用胆碱酯酶抑制剂( a c h e i ) 抑制a c l l e 活性，延缓a c h 水解的速度，提高突触问隙a c h 的水平，从而发挥对 a d 的治疗作用。乙酰胆碱酯酶生物传感器的构建可以进行乙酰胆碱酯酶抑制剂的 快速筛选 5 1 ，5 2 】。 1 3 3 4 乙酰胆碱酯酶生物传感器的发展 乙酰胆碱酯酶( a c h e ) 活性受有机磷农药的特异性抑制，故而成为监控有机磷农 药的重要的靶标物质。为适应分析检测的需求，研究人员试图不断改进乙酰胆碱酯 酶生物传感器的构建 5 3 ，5 4 】。 第一种方法是：探索各种有效酶源成为研究的热点。乙酰胆碱酯酶广泛存在于 动物的组织和血液、昆虫组织及植物中，1 9 5 3 年s t e d m a l l 等首先从马血清中分离出 乙酰胆碱酯酶，此后不同来源的乙酰胆碱酯酶相继得到纯化和研究。据文献报道， 目前已就以下来源的乙酰胆碱酯酶进行了分离纯化的研究，动物来源主要集中在动 8 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 物肝脏和血液，如猪肝、鸡血等，鸡血中提取的乙酰胆碱酯酶活性保持较好，而猪 肝中提取的酶对农药的参比数据较大，所以也比较好。另外，蚯蚓、电鳐中乙酰胆 碱酯酶含量也较为丰富。也有报道海洋鱼类如黄鱼、甲壳类动物的神经组织、血液、 肝脏中也广泛存在乙酰胆碱酯酶，其中脑组织中含量最为丰富。植物来源的乙酰胆 碱酯酶研究尚未深入，只是表明粮食作物中含量较其它的高。目前研究比较集中在 从昆虫体内提取乙酰胆碱酯酶，而且国内外也进行了大量的研究，根据湖北大学彭 宇等人的总结整理，现在已就下列昆虫体内的乙酰胆碱酯酶进行了分离纯化：家蝇、 麦二叉蚜、黄猩猩果蝇、烟草天蛾、光叶库蚊、黄粉甲、美洲淤夜蛾、豆荚草盲蝽、 马铃薯叶甲、骚扰角蝇、棉铃虫等 5 5 ，5 6 】。刘晓宇等研究了鲫鱼脑乙酰胆碱酯酶 ( a c l l e ) 的活性，以及对农药检测的应用 5 7 】。s o t i r o p o u l o u 等报道了基于d m a c h e 检测敌敌畏的生物传感器，检测限可以达到1 0 以7 m ，而基于e 饴c f 唧而甜“sp 彪c 护站螂 a c h e 构建的传感器检测限仅1 0 。2 m 。利用蛋白质工程等技术设计提取更适于传感器 构建的乙酰胆碱酯酶亦是中外研究的热点。有文献报道通过蛋白质工程设计提取来 自n i p p o s t r o n g y l u sb r a s i l i e n s i s 的a c l l eb 用于构建生物传感器，该酶固定在电极表面 在室温下保持1 7 个月后，依然有很好的催化活性。可见蛋白质工程对生物传感器的 研发无疑更加重要，它可能是研制满足检测要求的a c h e s 生物传感器最有前景的技 术途径【5 8 ，5 9 】。 第二种方法是通过各种技术改进传感器构建。酶的固定化技术是生物传感器制 作的核心部分。目前，应用较为广泛的固定化技术主要有吸附法、交联法、共价键 合法，电聚合法、溶胶凝胶法等 6 0 】。同时媒介体如钴酞箐、普鲁士蓝以及 t c n q ( t e t r a c y a n o q u i n o d i m e t h a l l e ) 等亦用于电极的修饰，这样可以降低氧化过电位， 提高检测的灵敏度 6 1 6 6 】。 纳米技术和纳米材料，特别是金属纳米材料自诞生1 0 余年以来所取得的巨大 成就和对科学及社会各个领域的影响和渗透一直引人注目。金属纳米材料由于既具 有纳米微粒的特性( 如量子尺寸效应、小尺寸效应、表面效应和宏观量子隧道效应 等特点) ，又存在由纳米结构组合引起的新的效应，如量子耦合效应和协同效应等， 从而表现出独特的电子学、光学和催化性质，使它们成为表面纳米工程和构建功能 化纳米结构的理想材料。金纳米粒子作为金属纳米粒子家族中的成员，由于它具备 高催化活性和能通过自组装形成纳米结构的特性，在高级材料的制造上具有很大的 应用前景，因而吸引大量人力投入其研究与发展，至今已在传感器、微电子元件、 生化工程( 如基因测序) 、化学反应的催化剂等方面的研究应用有了很大的进展。 纳米材料在电化学传感技术领域的应用引起了研究工作者广泛的兴趣。金纳米 9 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 颗粒( g n p ) 具有比表面积大、生物亲和性高等优点，并能起导电通道作用加快蛋白 质与电极间的直接电子转移，目前被广泛用于构建无需电子媒介试剂的电化学生物 传感器。带负电荷的金胶纳米离子表面能为蛋白质分子提供一个特殊的、具有生物 兼容的微环境，这将导致蛋白质与其处的天然状态一样，能与底物分子特殊的具有 选择性的相互作用。表面经过功能化修饰或固定的金纳米颗粒，在传感、检测等方 面都具有较好的应用 6 7 6 9 】。 碳纳米管的修饰目前已成为制备可溶性碳纳米管、功能性碳纳米管的有效方 法。对碳纳米管的功能化研究可使其在力学、电学、热学、光学等领域得到更为充 分的应用。碳纳米管通过混酸氧化表面形成羧基，可以用来连接电极表面与酶、抗 体等其他的一些生物分子。除了具有高化学稳定性、大的比表面积以外，其独特的 电子传导特性以及相当高的机械强度越来越受到科学家的关注，利用这些性质制备 了一系列高性能的传感器【7 0 】。通过采用功能化纳米材料提高生物活性物质的固定 化功效，已成为改善生物传感性能的有效途径之一，并代表着当前生物分子固定化 技术的发展方向。文献中报道利用纳米材料如金纳米、碳纳米管等材料构建复合膜 固定了乙酰胆碱酯酶构建了生物传感器，能够大大改善生物传感器的性能【7 1 7 7 】。 g u o 等用碳纳米管和乙酰胆碱酯酶层层组装构建了乙酰胆碱酯酶生物传感器 4 8 】。 j u 等利用壳聚糖和碳纳米管的复合膜，共价键合乙酰胆碱酯酶，结合流动注射构建 了乙酰胆碱酯酶生物传感器 7 8 】。 同时有文献报道通过改变固定基体电极的特性，从而改变传感器的特性。有文 献报道利用纳米多孔碳固定乙酰胆碱酯酶，从而降低传感器的检出限 7 9 】。基于有 机磷农药对乙酰胆碱酯酶产生抑制作用的原理，开发丝网印刷电极检测水环境中有 机磷农药的酶传感器，实现水环境中有机磷农药的快速检测【8 0 】。阵列型生物传感 器亦用于乙酰胆碱酯酶生物传感器的构建【8 1 】。 酶的固定化技术是生物传感器制作的核心部分。近年来，有不少关于电沉积纳 米粒子用于制备生物传感器的报道，如j i a n y il i n 实验小组报道了电化学还原p d c l 2 沉积纳米钯制得葡萄糖酶生物传感器 8 2 】，jmp i n g r r 6 n 实验小组报道了电化学还原 h a u c l 4 沉积纳米金制得了酪氨酸酶生物传感器和葡萄糖酶生物传感器 8 3 】。 1 4 电沉积 电沉积是一种电化学过程，也是一种氧化还原过程。近年来，应用电沉积的方 法成功制备了金属化合物半导体薄膜、高温超导氧化物薄膜、电致变色氧化物薄膜 及纳米金属多层膜，使这种技术引起了人们的关注。电沉积按照沉积中所用溶液种 l o 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 类可以分为水溶液电沉积、非水溶液电沉积和熔盐电沉积。电化学沉积 ( e l e c 仃o c h e i i l i c a ld e p o s i t i o n ) 是电解液中的金属离子在外电压的作用下被还原并沉积 在阴极上的电化学过程。它不仅仅是一种表面工程技术，而且还是一种开发新型材 料的途径。采用电化学沉积技术不仅可以制得单层和总厚度、成分、界面密度可调 的多层膜，而且还可以把两种不同的材料在接近原子水平上进行堆垛，从而获得具 有独特性能的新材料【8 4 】。 1 4 1 电化学诱导的聚合物沉积 基于溶液的阳极喷漆或阴极喷漆在汽车工业中被广泛用于防腐蚀，此方法也被 用于传感器的构建。其原理是 8 5 】： 阳极沉积：h 2 0 氧化2 h 2 0 _ 4 r + 0 2 + 4 e 。 聚合物沉积：p 0 1 y m e r - c o o 。+ 矿叶p 0 1 ) ，1 1 1 e r c o o m 阴极沉积：h 2 0 还原2 h 2 0 + 2 e 。_ h 2 + 2 0 h 聚合物沉积：p o l y m e r - n r 2 一+ o h 。一p o l y m e 帆卜h 2 0 1 4 2 壳聚糖沉积 壳聚糖( c l l i t o s a l l ) 是甲壳素( c 胁i n ) 的脱乙酰基产物，是自然界唯一的碱性多糖，其 重复单元上含有羟基、氨基。由于壳聚糖独特的理化性质，使其对许多金属离子( 特 别是过渡金属离子) 、有机物、生物分子等具有离子交换、螯合、吸附等作用，因 而广泛应用于化学、生物和医学等领域。壳聚糖是一种具有良好生物相容性的线型 聚合物，分子中的n h 2 能通过离子吸附的方式有效地应用于固定酶技术，从而作为 生物传感器的材料【8 6 8 8 】。其特性及其应用如图1 2 所示： r u n c l 如锄丑i i z 盘l i t ，| | 图1 2 壳聚糖的特性及其应用示意图 电化学沉积法也可以制备碳纳米壳聚糖复合材料，复合材料的微观结构可控， 硕士学位论文 m a s t e r st h e s is 从而制备出性能独特的复合材料【8 9 】。如l u o 等【9 0 一9 3 】用一步电化学沉积的方法制得 碳纳米管壳聚糖复合薄膜。他们用一对金电极连接直流电源，浸入到碳纳米管壳 聚糖溶液0 h = 5 o ) 中。溶液中的氢离子在阴极被还原成氢气，同时阴极表面的p h 值 逐渐增加，因为壳聚糖的溶解性与p h 值有关，当p h 值达到6 3 时，壳聚糖变得不溶， 在阴极的表面沉积。可以看到直径为4 0 8 0 1 1 1 i l 的线状物质均匀地分布在膜内，他们 认为这是被链状壳聚糖包裹的碳纳米管。因此电化学沉积法是一种制备壳聚糖包裹 碳纳米管复合材料的很好的方法。 1 5 本文立意 随着近代电子技术和生物工程的快速发展，生物传感器越来越受到学者们的关 注。生物传感器由于其具有生物反应的快速、高特异性、高灵敏度的特点，为农药 残留速测问题的解决提供了一种新的方法。酶筛法在国外大农药公司常被用于农药 的高通量筛选，它作为农药筛选方法之一，除了具有高通量的优点外，还具有快速、 灵敏、简便和不受筛选试材生长状况影响等优点。纳米生物分析是分析化学近年来 研究的热点，由