（材料学专业论文）双光子dna荧光探针的设计、合成及其在生物荧光成像中的应用.pdf

。山东大学硕士学位论文 摘要 ，双光子过程是长波吸收短波发射，其吸收过程有着高度的三维空间选择性和 高穿透性。基于此发展而来的双光子荧光显微镜为生命科学研究提供了重要工具。 双光子吸收是在三维空间内的任一点的吸收，因此双光子显微成像可以不使用传 统的小孔光阑就可以实现样本的三维成像。由于采用近红外的飞秒激光作为激发 光源使得双光子荧光显微成像时不仅可以具有高的穿透深度而且可以有效的避免 生物体系的紫外可见光损伤。但是双光子荧光探针研究的相对滞后限制了双光子 荧光显微成像的发展，因此研究具有大的双光子活性吸收截面、优良的生物相容 性的双光子荧光探针显得极为迫切。 本论文主要是设计合成具有优良的双光子性能、良好双亲性、优异的生物相 容性的双光子d n a 荧光探针，对其进行了一系列的光学表征并将其最终应用于生 物细胞和组织中。本文的主要内容和结果如下： l 、设计合成五个具有良好双亲性、优良的双光子性能的系列咔唑毗啶碘盐。 主要使用w i t t i n g 反应和h e c k 反应合成这些分子，其中对于h e c k 反应既有无水无 氧高压条件下的反应，也有采用新的溶剂和催化剂的反应。所有的最终产物均采 用了核磁共振氢谱，核磁共振碳谱，高分辨质谱，以及元素分析进行了表征，证 明了得到的材料就是要合成的目标产物。在合成过程中利用溶剂挥发法生长得到 了一种重要的有机中间体3 , 6 二甲酰基9 乙基咔唑的晶体，并用b r u k e rp 4x r a y 型四圆衍射仪通过单晶x 射线分析测得其晶体结构。 2 、详细讨论了不同极性溶剂对所合成的材料的紫外光谱、单光子荧光光谱， 双光子荧光光谱以及量子产率和吸收截面的影响，并探讨了光物理性质与分子结 构的关系。经过对比研究发现在咔唑n 上引入乙基和分子两端链的增长有助于提 高荧光量子产率和双光子吸收截面，在咔唑环上不同位置的取代也对探针分子的 光物理性质有较大影响，2 ，7 位取代由于具有更好的共轭性从而使其单光子荧光量 子产率更高，荧光寿命更长，在双光子荧光测试中也发现2 , 7 位的荧光强度比同样 测试条件下3 , 6 位更强。 3 、研究了探针分子与c t d n a 相互作用的紫外吸收光谱，单光子荧光光谱和双 光子荧光光谱，通过筛选重点研究了b m v c ，b e c ，9 e b h v c 的各种光物理 山东大学硕士学位论文 性质并预测了它们与d n a 可能的结合方式。探讨不同激发光波长对探针分子与 c t d n a 结合后的双光子荧光光谱的影响，得到了三个探针分子的最佳双光子激发 光波长，对它们在生物中的后续研究奠定了基础。经过体外实验研究得到b m v c 、 b m v e c 和9 e b h v c 可以用作光开关型荧光探针使用。 4 、把与c t d n a 结合良好的b m v c 、b m v e c 和9 e b h v c 用于固定的动物细 胞、拟南芥植物活细胞和拟南芥植物活组织的染色，并通过d a p i 的复染实验比较 证明它们是可用的双光子d n a 荧光探针。以9 e b h v c 为例与商品化探针d a p i 对比研究了探测深度和荧光强度关系以及发射的荧光与入射光能量的关系。 关键词：合成，晶体结构，d n a ，双光子荧光探针，活细胞和活组织，核成像 山东大学硕士学位论文 a b s t r a c t t h e r ea r ec e r t a i na d v a n t a g e si nt h ep r o c e s s e so ft w o - p h o t o np r o s s e s s ：a b s o r b i n g l o n g e rw a v e l e n g t hb u te m i t t i n gs h o r t e rw a v e l e n g t h ，h i g hs p a t i a ls e l e c t i v i t ya n dh i g h d e p t ho fp e n e t r a t i o n u p o nt h e s ef e a t u r e s ，i tp r o v i d e sap o w e r f u lt o o li nt h es t u d yo f b i o l o g yt h a tw d e n ke ta 1 i n v e n t i e dt h et w o - p h o t o nf l u o r e s c e n c em i c r o s c o p y ( t p m ) i n19 9 0 b e c a u s e t w o - p h o t o na b s o r p t i o n c a l lt a k e p l a c e i n a n yp o i n t o f t h r e e d i m e n s i o n a ls p a c e ，t p mc a nb eu s e df o rb i o l o g ys p e c i m e nt h r e e d i m e n s i o n a l i m a g i n gw i t hh i g hr e s o l u t i o nb u tw i t h o u tc o n f o c a lp i n h o l e s d u et of e m t o s e c o n dl a s e r w i t hi ro u t p u th a v eb e e nu s e da sp u m p i n gb e a m ，t p mp o s s e s s e sh i g hd e p t ho f p e n e t r a t i o nw i t h o u tu v v i s i b l ep h o t o d a m a g et ot i s s u e h o w e v e r , t h el a c ko ft w o - p h o t o n f l u o r e s c e n tp r o b eh a dl i m i t e dt h ed e v e l o p m e n to ft p m i m a g i n g i naw o r d ，i ti sv e r y i m p o r t a n tt os t u d yt w o - p h o t o nf l u o r e s c e n tp r o b e 、析n 1l a r g et w o - p h o t o na c t i o n a b s o r p t i o nc r o s ss e c t i o n s ( 谚回a n dg o o db i o c o m p a t i b i l i t y i nt h i st h e s i s ，f i v eg o o da n a p h i p h i l i cm o l e c u l e s 砸t 1 1g o o dt w o - p h o t o np r o p e r t i e s a n dw e l lb i o c o m p a t i b i l i t ya r ed e s i g n e da n ds y n t h e s i z e d t h e i rp h o t o p h y s i c a lp r o p e r t i e s a r ei n v e s t i g a t e da n dt h e ya l ea p p l i e di nl i v i n gc e l la n dt i s s u e t h em a i nc o n t e n t sa n d r e s u l t sa r es u m m a r i z e da sf o l l o w s ： 1 f i v ec a r b a z o l ep y r i d i n ei o d a t es e r i e so r g a n i ca m p h i p h i l i cm o l e c u l e s 、i t hl a r g e t w o - p h o t o na c t i o na b s o r p t i o nc r o s ss e c t i o n sa r es y n t h e s i z e du t i l i z i n gw i t t i n ga n dh e c k r e a c t i o n 1 h n m r ，1 3 c n m r , h r m sa n de l e m e n ta n a l y s i s a l eu t i l i z e df o r c h a r a c t e r i z a t i o na l lf i n a lc o m p o u n d s t h es i n g l ec r y s t a lo fa ni m p o r t a n to r g a n i c i n t e r m e d i a t e 9 - e t h y l - 3 ，6 - d i f o r m y l 一9 h c a r b a z o l ew a s o b t a i n e db yu s i n g s o l v e n t e v a p o r a t i o nm e t h o da n dc h a r a c t e r i z e db ym e a n so fs i n g l e c r y s t a lx - r a yd i f f r a c t i o n 2 t h el i n e ra b s o r p t i o ns p e c t r a , o n e t w o - p h o t o ne m i s s i o ns p e c t r a , f l u o r e s c e n t q u a n t u my i e l d ，f l u o r e s c e n tl i f e t i m ea n dt w o - p h o t o nc r o s ss e c t i o n sa n da c t i o nc r o s s a c t i o n sh a v e b e e ni n v e s t i g a t e da n d t h es o l v a t o c h r o m i s mh a sb e e ns t u d i e d t h e r e l a t i o n s h i p sb e t w e e ns t r u c t u r ea n dp r o p e r t ya r ed i s c u s s e di nt h i st h e s i s e t h y lg r o u p c o v a l e n t l yl i n k i n gt ot h en a t o mo ft h ec a r b a z o l em o i e t ya n dt h ei n c r e a s i n gl e n g t h so f b o t he n d sr e s u l ti nb i g g e ro x 8a n dh i g h e rq u a n t u my i e l d t h e r ea r ev e r yl a r g e d i f f e r e n c e si n3 , 6 - 2 ，7 - c a r b a z o l ed e r i v a t i v e s ，c o m p e t i t i v e l y2 , 7 - d e r i v a t i v e sc a l lg i v e 山东大学硕士学位论文 h i g h e rq u a n t u my i e l d ，l o n g e rl i f e r t i m ea n db e t t e rt w o - p h o t o np r o p e r t i e s 3 f l u o r e s c e n tt i t r a t i o ne x p e r i m e n t sh a v eb e e nc a r r i e do u ti no r d e rt od e t e r m i n e w h e t h e rf i v em o l e c u l e sc a nb eu s e da st w o p h o t o nf l u o r e s c e n td n a p r o b e s i nt h e p r o c e s so ft i t r a t i o nc t d n aw a su s e da st h em o d e l ，t h el i n e ra b s o r p t i o ns p e c t r aa n d o n e t w o - p h o t o ne m i s s i o n s p e c t r aa r eo b t a i n e db yu s i n gs t a n d e r dm e t h o d 1 1 1 es p e c t r ao f b m v c ，b m v e ca n d9 e - b h v cb i n d i n gc t d n aw a sm a i n l ya n a l y z e dt o f i n dt h e p o s s i b l em o d eo fb i n d i n g e f f e c t so fd i f f e r e n te x c i t a t e dw a v e l e n g t h so nt w o - p h o t o n f l u o r e s c e n ts p e c t r ah a v eb e e ni n v e s t i g a t e da n dt h eo p t i m a le x c i t e dw a v e l e n g t h sw e r e o b t a i n e df o rt p mi m a g i n g b m v c ，b m v e ca n d9 e - b h v cc a l lb eu s e da s 屯t n - o n f l u o r e s c e n tp r o b e sa c c o r d i n gt of l u o r e s c e n tt i t r a t i o ne x p e r i m e n t s 4 a n i m a lf i x e dc e l l ，l i v i n gp l a n tc e l la n dt i s s u ew e r es e l e c t e da ss p e c i m e n st o i n v e s t i g a t et h es p e c i f i c i t yo fb m v c ，b m v e ca n d9 e - b h v c i nl a b e l l i n gd n ai nt p m i m a g i n g t h r e ep r o b e sc a l ls l a i nd n a i nc e l la n dl i v i n gt i s s u e ，a n dt h ep o s i t i o n sa n d r e g i o n ss t a i n e db yt h e ma r ew h o l l yc o n s i s t e n t 、析廿1t h a to fd a p ia c c o r d i n gt o d o u b l e - s t a i n i n ge x p e r i m e n t s m o r e o v e r9 e - b h v ca n dd a p ia r es e l e c t e dt os t a i nl i v i n g t i s s u e ，t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nf l l u o r e s c e n ti n t e n s i t ya n dd e t e c t i o nd e p t ha r ea l s o i n v e s t i g a t e di nt h i st h e s i s k e y w o r d s ：s y n t h e s i s ，c r y s t a ls t r u c t u r e ，d n a ，t w o p h o t o nf l u o r c c e n tp r o b e ，l i v i n g c e l la n dt i s s u e ，n u c l e a ri m a g i n g 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明 的法律责任由本人承担。 论文作者签名： 幽垄：! 日 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论 文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 一：址新签讶移日期：趟 山东大学硕士学位论文 第一章序言 1 1 双光子吸收( t p a ) 与双光子荧光( t p e f ) 的基本理论 1 9 3 1 年g 6 p p e r t - m a y o r 1 j 首次提出双光子吸收口p a ，t w o p h o t o na b s o r p f i o n ) 理 论：在强激光激发下，利用近两倍于样品的线性吸收波长的光源激发分子，使分 子通过一个虚中间态i r t s t a 哟直接吸收两个光子跃迁至高能态【2 】，所吸收的两 个光子的能量可以相同 l = 砣) 亦可以不同佃l 蚴。双光子荧光( t p e f , t w o p h o t o ne x c i t e df l u o r e s c e n c e ) 是指分子吸收两个较低频率的光子后，发射出一 个较高频率的光子的过程；即长波激发，短波发射：这是一种上转换c o n v e r s i o n ) 荧光的过程。单、双光子吸收和发射的机理可以用图1 1 表示： lj 1 、， s ，硼 。； ， l 明i 8 一 _ _fp h o t m - v 小 八 1 h o t o n f i u o r e l i t a t i o n 洲”i【 ij 、， l 1 l 、 i 卜v o 图1 1 单、双光子吸收和发射过程的三能级模型示意图。 ( a ) 单光子过程( b ) 双光子过程 单光子吸收是利用紫外或可见光激发荧光分子，只有吸收光子的能量与基态 和激发态之间的能带隙相匹配时才会发生。双光子吸收属于三阶非线性光学效应， 它的吸收选律与单光子吸收选律完全不同1 3 】，也完全不同于借助真实中间态逐步激 发吸收两个光子的过程，它是荧光团与光相互作用的过程【4 】。 山东大学硕士学位论文 1 9 6 1 年k a i s e r 和g a r r e t t 等人首次发现当6 9 4 3n i i l 的红宝石激光通过 c a f 2 ：e u 2 + 晶体时，观察到3 4 7 2n m 的倍频光【5 1 ，这在实验上验证了g 6 p p e r t m a y o r 的双光子吸收理论，有力地推动了三阶非线性光学材料的发展。有机分子系统可 以采用两种方式和光场相互作用：参量过程和耗散过程。双光子吸收属于耗散过 程，其能量以吸收和发射的方式在分子和光场问进行交换。它在单位时问、单位 体积内光和介质能量的交换可由式1 - 1 表示【6 】： 坐d t = 萼，2i m ( 艄 c ( 1 - 1 ) zz ，v i m ( z 3 ) 是三阶非线性极化率z 3 的虚部，n 是折射率，c 是光速。光的能量i = e e * n c 8 7 t 。从这个公式可以看出，双光子吸收过程中能量的吸收与激光强度的平方成j f 比。通常用双光子吸收截面6 ( t w o p h o t o na b s o r p t i o nc r o s ss e c t i o n ) 来表示分子双 光子吸收的强弱【2 】： 等= 吼胛2 ( 1 - 2 ) 统 二 l 卜z 式中i d r i 厂p 是时间单位，单位体积内吸收的光子数，而石d w = ( 鲁) 办v ，是介质 的分子密度，即单位体积内的分子数，f 是光通量，f = 。所以 吼= 磊16 z 丙3 h vi m ( 棚= i 8 ：r 2 h 百f _ t ) 2i m ( ( 1 3 ) 其中h 是普朗克常数，为入射光的频率，n 为介质内发生双光子跃迁的分子 密度，由上式可以看出双光子吸收截面与三阶非线性光学系数的虚部成j 下比。 双光子吸收截面从微观层面表征材料双光子吸收性能。 双光子效应的大小用双光子吸收截面。表示，这是双光子材料的基本参数， 为了纪念双光子领域的创始人，用g m 作为双光子吸收截面的常用单位，其中： 1g m = 10 - 5 0c m 4 s p h o t o n 一。 双光子材料引起人们关注，原因在于其非线性吸收过程所导致的其区别于单 光子过程的基本特征： 2 山东太学硕士学位论文 1 、双光子吸收具有高度的空间选择性。在忽略微弱的线性吸收的影响下， 双光子吸收的产生几率与入射光强的平方成正比。也就是说只有入射激光的峰值 功率密度( 光强) 达到一定的阈值，才会有取光子吸收现象。因此，在激光束紧 聚焦条件下，双光子吸收效应局限于材料内部的相当于入射波长立方的微小区域 内啷，而在焦点以外的地方，入射光的峰值功率密度可控制在激发阈值以下，则不 会有双光子吸收，如图1 - 2 中理论模型图a 所示。同时，激发光波长红移，穿透 性好，从而实现了双光子吸收效应的高度空闻选择性。图b 是我们在实际试验中 拍到的照片：同一种有机双光子分子在不同激发波长下通过单、双光子吸收所产 生的单、双光子荧光现象。从中可以看出，双光子吸收发射得到的是一个在溶液 内部的微小两点，而单光子在整个聚焦光路中均有吸收。 单光子过程 双光子过程 ( a ) 图1 - 2 单、双光子过程空间选择性的不同。( a ) 理论模型( 实际实验 2 、在材料中的高的穿透深度。单光子荧光过程是短波激发长波发射，吸收和 发射所涉及的基元光物理过程服从s t a r k - e i m t t i n 定律。而双光于荧光是长波激发 短波发射，所用激发光的波长红移近一倍，一般位于6 0 0 1 0 0 0n m 。其光子能量远 远低于单光子过程紫外辐照光( 波长为2 5 0 - 4 0 0n m ) 的光子能量。材料体系对光 能的线性吸收与r a y l e i g h 散射均比较小，入射光的穿透性好，并且光损伤较小。 山东大学硕士学位论文 3 、双光子吸收与单光子吸收的量子选择定则不同。对于中心对称的分子，其 电子态具有明确的宇称，分别标记为g ( g e r u d e ) 或u ( u n g e r u d e ) 。通常单光子吸收 的选择定则为g - u ，而双光子吸收的最大特点在于其选择定则是g - g 或u - u ，分子的 宇称奇偶性保持不变 4 1 。 正是由于双光子过程有着明显区别于单光子过程的特点，使得具有大的双光 子吸收截面的双光子材料在许多方面具有很好的应用，例如：光限幅【7 - 9 1 、激射【1 0 , 1 1 】、 双光子聚合微加- i - t 1 2 , 1 3 】、双光子三维存储1 4 , 1 5 】，光动力学医疗【1 6 ，1 7 1 、可控药物释放 旧等，本论文主要集中在双光子材料在生物荧光探针上的应用。 1 2 双光子荧光显微技术 清晰的细胞和组织三维成像因为在生命科学和医学中具有重要的应用价值而 成为科学家不断努力的目标，荧光显微技术是现代生物中用于无损观察组织和细 胞的一种重要方法。激光扫描共焦显微镜利用小孔光阑共焦技术从一条荧光亮线 或多个荧光亮点中取出一个亮点成像，从而实现样品的三维成像 1 9 , 2 0 】，但是这一 技术有明显的缺点：显微镜光学元件系统繁琐复杂，共焦小孔光阑降低了荧光 收集效率造成强烈的信号损失( 只对未经散射的光子成像) ；激发光源一般为紫 外可见光，光生物损伤大：受激荧光一般在4 0 0n l t l 5 5 0 姗之间，不在生物光学 窗口，因此荧光发射有可能被细胞内的功能基团再吸收，限制了检测深度等。 4 粪委 器 三蘸 地藤 掸品 、 豳 图l - 3 双光子荧光显微镜工作原理示意图 1 9 9 0 年美n l c o m e l l 大学d e n k 2 1 1 等人提出将双光子激发现象应用到激光扫描 山东大学硕士学位论文 共聚焦荧光显微镜中从而使得双光子激光扫描显微镜( t w o - p h o t o nl a s e rs c a n n i n g m i c 口r o s c o p y , 简称t p l s m ) 问世。t p l s m 是基于非线性的双光子激发实现对荧光样 品的三雏扫描成像的显微镜，图1 0 是它的结构示意图，典型的t p l s m 由三_ 个基本 部分组成：激发光源、荧光显微镜和探铡系统。激发光源通常是采用能提供足够 高的光于流密度的具有波段调谐( 7 0 0n l u - 1 0 0 0n m l 功能的皮秒或者飞秒钛宝石激 光罂；荧光显微镜与通常的激光扫描共聚焦显微镜( l a s e rs c 如n i n gc o n f o c b l m i 饿噼o p y ，简称l s m ) 的最大区别在于检测光路中不用小孔光阑( 图1 4 ) 而是荧光 信号直接进入检钡l 系统。 图1 4 激光扫描共聚焦显微镜与取光予荧光显徽境成像示意图比较 由于双光子激发所产生的荧光强度与激发光的光强平方成正比，这就使双光 子激发具有很高的空问局域特点，因此基于非线性的双光于激发过程的t p l s m 与 传统的l s m 相比具有以下优点1 1 站：o 使用激发光源波长为7 0 0 衄1 0 0 0 n m ，在生 物光学窗n ( 6 0 0 m - 9 0 0 n m ) 范围内，避开了生命体系所不能承受的紫外一可见光损 伤，降低了光漂白和光损伤； 长波长激光具有相对较深的传播距离，且组织对 这一波段( 7 0 0 a m - 9 0 0 n m ) 的线性吸收和r a y l e i g h 散射均比较小，使得取光子荧光 显微镜可肘浑浊的样品以下较深处( 2 0 0 进行成像观察】； 成像系统简单， 不必采用小孔光阑，避免了信号损失，从而提高了分辨率。 为了形象的解释上述问题给出一个模拟细胞图( 图1 5 ) 。其中空心圆代表被荧 光探针标记的物质，实心圆代表被标记的物质在激发光的作用下发射出荧光。如 山东大学硕士掌位论文 图中所示，在来自激光扫描共焦显徽镜的紫外可见光的涮发下( 左侧光路) ，细胞 内在辐照光路上的被荧光标记的物质都能够发出荧光( 图中示意了四个亮点) 。因 此，c c d 检测器接受的是四个荧光亮点的整体荧光效果，却无法区分一个指定的 荧光点在与激发光轴同向的纵深z 方向上的确切位置。为此，c c d 检测器前装置了 起屏蔽作用的小孔光时。但来自小孔光阑共焦成像点的上方、下方或上下两方的 荧光点的荧光千扰仍然难以消除。利用双光子荧光显微镜观测时( 右侧光路) ，尽 管在辐照光路中也有多个荧光标记物，但只有处在聚焦光焦点处的标记物才能发 出荧光，不比使用小孔光阑，其分辨率可以达到亚微米尺度。 z 方向 回回 单光干寝托子 圈l 单、双光子荧光成像时在z 方向上的不同效果左侧光路示意激光扫描共焦显徽镜 的单光子戚像进程，右侧为双光子成像过程。 1 3 传统的单光子d n a 探针 脱氧核糖核酸p v o x y r i b o n u c l e i ca c i d , d n a ) ，是重要的生命遗传物质阻2 0 。有 关d n a 的研究是揭示生物遗传奥秘的基础同时d n a 也关系到正常生命过程以及 病理过程。d n a 的研究经历了一个漫长而又复杂的过程，其中就包括利用一些荧 光探针对d l 姐定性和定量进行研究。通过使用荧光探针可以分析药物分子与d n a 作用的位点、类型，跟踪d n a 的去向等许多预防和治疗的药物都是以d n a 为作 用靶点来设计的，而d n a 的定量测定则是研究它们的基础。研究证实体外与d n a 作用的药物在一定程度上在体内也能与d n a 作用e i - 与d n a 作用在体内与体外具 山东大学顸士学位论文 有一致性f ”t 。因此在体外首先进行探针d n a 结合实验在理论和实践上都很有意义。 通过对d n a 上太沟、小沟等小分子识别位点的研究发现：探针分子与d n a 的相互作用模式主要有非共价结合、共价结合和剪切作用。非共价结合主要包括( 见 图1 6 ) 静电结合( e l e c t r o s t a t i cb i n d i n g ) ! 沟槽结合( g r o o v eb i n d i n g ) 和嵌插结合 0 m t e r c a l a t i v eb i n d i n g ) 田1 ，很多因素都能影响小分子与d n a 相互作用，小分子的结 构、形状、大小、柔性都有可能导致小分子与d n a 结合的方式不同。很多小分子 与d n a 的作用方式是非单一的，有时是几种作用方式协同作用的结果1 a 9 3 1 l 静电结合沟增结合嵌插结合 削1 - 6d n a 与担尊 分子的菲菇价结合 d n a 荧光探针可根据能否穿膜透入活细胞内分为膜通透性和非通透性d n a 探针两大类。膜通透性d n a 荧光探针有吖啶橙( a o ) ，一种阳离子荧光探针，通过 嵌入或静电吸引而与d n a r n a 相结合i 与d n a 沟槽式结合的h o e c h s t 系列荧光 探针：与双链d n a 的小沟结合的d a p i 荧光探针等。非细胞通透性d n a 荧光探 针有溴化乙锭f e b ) 和碘化丙锭( p i ) 探针，主要是嵌入d n a 的碱基对之间，基于从 d n a 到有机分子菇振能量转移而使荧光增强。另外还有p o p o 、b o b o 和y o y o 、 t o t o 荧光探针等。常见的染料分子的结构如图1 6 所示。除了这些有机小分子 d n a 荧光探针外，近年来还发展出一些金属离子或金属络合物d n a 荧光探针等。 上述各种荧光探针虽各有优点，但有的价格较贵，有的有毒，有的灵敏度不高， 有的线性范围不够宽，有的溶解度不好，因此人们一直在寻找新的性能优良的d n a 荧光探针和更为先进的检测工具。 山东大学硕士学位论文 h 2 n 溴化乙锭toto r p h 一掣 e l l 3 1 4 双光子荧光探针 d a p i h o e c h s t 3 3 2 5 8 图1 7 常见核酸荧光探针举例 o h 双光子荧光显微镜相比较与传统的激光扫描共聚焦显微镜具有很多独特的优 点，因此自从1 9 9 0 年d e n k 等人发展双光子荧光三维成像技术以来，虽然没有专用 的双光子探针分子，人们仍然利用已有单光子荧光探针分子或内源性的生物大分 子荧光发色团的双光子荧光活性开展了大量的活体细胞和组织的双光子荧光成像 研究工作。t b a s c h e 等人利用蛋白质的色氨酸残基作为双光子荧光成像的内源性 探针，研究了单个血蓝蛋白氧释放和结合的生理学机理【配】；t y o h h l c h a n s k y y 等人 研究了核酸与c y a n 4 0 染料的结合对其双光子荧光的影响，实现了在活体细胞中的 8 阜 q y 玲霉弋 山东大学硕士学位论文 暑。i i 一i , i 一一i j 。鼍皇詈巴詈詈詈詈皇曼皇詈基! 皇詈寡 核酸检测，并证实了c y a n 4 0 对细胞发育没有影响【3 3 】；v i c t o rj h r u b y 等人采用特 异性蛋白识别基团标记的罗丹明探针分子，实现了h e k 2 9 3 细胞内靶蛋白与药物 相互作用过程的双光子荧光成像检测【3 4 】；v o h a l l o r a n 等人发展了一类用于荧光比 率成像的苯并呋哺基锌探针分子，基于识别诱导荧光强度和波长响应，实现了纳 摩尔量级的单细胞内锌离子分布双光子荧光成像的灵敏检测【3 5 】；s j l i p p a r d 等人 设计了高灵敏度的具有细胞穿透能力的神经细胞锌离子探针，并探索了其在大脑 海马体切片的锌离子分布的双光子成像中的应用【3 们。但是传统的单光子荧光探针 双光子吸收截面( 融回较小，染料吸收的激发光的光能很大一部分没有转化为荧光 光能，而是以热的形式释放出来。因此为使染料产生足以检测的荧光强度而增大 的激发光的能量同时造成了生物样品的局部过热，造成了对生物样品的热损伤。 这在很大程度上制约了双光子荧光技术的发展。因此探索新的具有大的双光子活 性吸收截面的探针显得极为重要。近年来科学家们对开展了对双光子荧光探针的 研究探索：k i m 等发展了c a 2 + ，m g + ，z n 2 + 以及p h 探针【3 7 - 4 1 1 ；c o g n 6 l a a g e 等【4 2 】合 成了中等敏感的双光子荧光探针并且详细的研究了它们的光物理性质；a b b o t t o 等 人【4 3 】合成了能够与d n a 结合的双光子探针。 双光子显微成像技术在生命科学领域具有很好的应用前景，但是当前纯粹的 用于双光子荧光荧光成像的探针相当缺乏，因此研究具有大的双光子活性吸收截 面、具有良好的双亲性以及优良的生物相容性的双光子荧光探针显得极为迫切。 1 5 论文的研究意义、主要内容以及创新点 有机双光子吸收材料因其独特的双光子吸收特点得到了广泛的关注并在一系 列研究领域中得到了广泛的应用。双光子吸收材料应用于生命科学领域具有无可 比拟的优越性，不但避开了生命体系所不能承受的紫外可见光损伤，而且可以在 深度三维空间的任意位点上引发特定的光物理过程和光化学反应。特别是自从双 光子荧光显微镜问世以来，双光子吸收材料作为荧光探针在癌症诊断、光动力学 医疗等方面有重要作用。因此研究具有大的双光子活性吸收截面、具有良好的双 亲性以及优良的生物相容性的有机双光子探针显得极为迫切而且具有重要意义。 1 、设计、合成以咔唑为母体，具有良好的双亲性、高量子产率、具有大的双 9 山东大学硕士学位论文 光子活性吸收截面以及良好的特异识别性五个双光子探针分子。 2 、对合成的五个探针分子进行了一系列的化学表征( 核磁共振氢谱、核磁共 振碳谱、高分辨质谱、紫外光谱、元素分析等) 并对其光物理性质进行了探讨。 3 、对合成的分子进行体外与c t d n a 结合试验，并根据结合后体系的紫外光谱 和单、双光子荧光光谱进行筛选，确定哪些分子可以进行细胞内和活组织染色。 4 、对筛选后的分子进行活细胞和活组织染色并用双光子荧光显微镜进行观 察，证实其可以作为双光子d n a 荧光探针使用。 参考文献 1 】m g 6 p p e r t - m a y e r o b e re l e m e n t a m k t em i tz w e iq u a n t e n s p r t i n g e n a n n p h y s ( l e i p z i g ) 9 ，1 9 3 1 ，2 7 3 2 9 4 【2 】j d b h a w a l k a r , g s h ea n dp n p r a s a d n o n l i n e a rm u l t i p h o t o np r o c e s s e si n o r g a n i ca n dp o l y m e r i cm a t e r i a l s r e p p r o g p h y s ，1 9 9 6 ，5 9 ：1 0 4 1 - 1 0 7 0 【3 】3 i v og g u t ，y a r o n h e f e t z ，i r e n ee k o c h e v a ra n df r a n z h i l l e n k a m p t w o p h o t o n a b s o r p t i o n c r o s ss e c t i o n so fg u a n o s i n e 5 - m o n o p h o s p h a t e a n du r i d i n e 5 - m o n o p h o s p h a t e a t5 3 2n l n ，zp h y s c h e m ，1 9 9 3 ，9 7 ：5171 - 517 6 【4 】p e t e rt c s o ，c h e r tyd o n g ，b s t r yr m a s t e r s ，a n dk e i t hm b e r l a n da n n u r e v b i o m e d e n g ，2 0 0 0 0 2 ：3 9 9 4 2 9 【5 】5w k a i s e ，c gb g a r r e t ，t w o - p h o t o ne x c i t a t i o ni nc r f 2 ：e 矿p h y s r e v l e t t ， 1 9 6 1 ，7 ：2 2 9 2 3 1 6 】l w t u t ta n dt eb o g g e s s ，ar e v i e wo fo p t i c a ll i m i t i n gm e c h a n i s ma n d d e v i c e s u s i n go r g a n i c s ，f u l l e r e n e s ，s e m i c o n d u c t o r s ，a n do t h e rm a t e r i a l s p r o g q u a n t e l e c 纪，1 9 9 3 ，17 ：2 9 9 3 3 8 【7 】gs h e ，gc x u , p n p r a s a d ，t w o p h o t o na b s o r p t i o na n do p t i c a l - l i m i t i n g p r o p e r t i e so f n o v e lo r g a n i cc o m p o u n d s o p t l e t t ，1 9 9 5 ，2 0 ：4 3 5 - 4 3 7 8 】j e e h r l i c h , x l w u , i - y s l e e ，z y h u ，h r 6 c k e l ，s r m a r d e r , a n dj w p e r r y ，t w o - p h o t o na b s o r p t i o na n db r o a d b a n do p t i c a ll i m i t i n gw i t l lb i s d o n o r s t i b e n e s ，o p t l e t t ，1 9 9 72 2 ：18 4 3 18 4 5 【9 】j e e h r l i c h , x l w u , i s l e e e la 1 t w o p h o t o na b s o r b i n go r g a n i c c h r o m o p h o r e sf o ro p t i c a ll i m i t i n g ，m a t e r r e s s o c s y m p p r o c ，1 9 9 7 ，4 7 9 ：9 - 15 【10 m 1 lt o p pa n dp m r e n t z e p i s ，p i c o s e c o n ds t i m u l a t e de m i s s i o ni n af l u o r e s c e n t 1 0 山东大学硕士学位论文 皇暑皇皇詈鼍詈鼍毫。 m i l i 1 i 毫詈拿皇曼皇曼曼皇詈詈詈鼍皇曼! 詈鼍量皇暑詈詈! 曼! 詈皇鼍皇 s o l u t i o nf o l l o w i n gt w o - p h o t o na b s o r p t i o n ，p h y s r e v a ，1 9 7 1 ，3 ：3 5 8 3 6 4 【1 1 y r e n ，q f a n g ，w t y u ，h l e i ，y p t i a n ，m h j i a n g ，q c y a n ga n d tc w m a k ，s y