（环境科学专业论文）plfas应用于底泥微生物群落分析及多样性评价研究.pdf

河海大学硕上学位论文 a b s t r a c t b a s e do np h o s p h o l i p i df a t t ya c i da n a l y s i s ，c h o i c ed i f f e r e n tw a t e rq u a l i t y sn a t u r a lw a t e r s u b s t r a t es l u d g ea sa n a l y s i ss u b j e c t c h o o s ef o u rs a m p l i n gw a t e ra r e aa st h ey a n g h e t a nw a t e r a r e ao fl u o m al a k e ( i i ) ，t h es u q i a ng a t e ( 1 1 1 ) a n dt h em a l i n g f a ng a t e ( i v ) o fn 圮g r e a tf i v e r , a n dt h ey e l l o wr i v e rp a r kw a t e ra r e afv ) o ff e iy e l l o wr i v e r u s i n gp l f a sa n a l y s i sn a t u r a lw a t e r s u b s t r a t es l u d g e sm i e r o b i a l c o m m u n i t ys t r u c t u r e 。a n d e v a l u a t em i c r o b i a l c o m m u n i t y m u l t i p l i c i t y a s s o c i a t i v eo fw a t e rq u a l i t yi n d e xc h a n g e ，a n a l y s i sr e l a t i o n s h i pb e t w e e ns u b s t r a t e s l u d g e sm i c r o b i a lc o m m u n i t ye v o l u t i o na n dw a t e rq u a l i t yi n d e xc h a n g e n 圮r e s u l t so fl a b t c g t so p e r a t i o nc o n d i t i o n si n d i c a t e dt h a t ： ( 1 ) p l f a st e c h n o l o g yc a nb eu s e dt oa n a l y s i sn a t u r a lw a t e rs u b s t r a t es l u d g e sm i c r o b i a l c o m m u n i t y , a t t r i b u t es u b s t r a t es l u d g e sm i c r o b i a lb i o m a s sa n dc o m m u n i t y s a m eh y d r o l o g i c s u b s t r a t es l u d g e sm i c r o b i a lc o m m u n i t ys t r u c t u r eh a sg r e a tc o m p a t i b i l i t yi ns a m em o n t h a n d h a sg r e a tc o n t r a s t i o ni nd i f f e r e n tm o n t h ；f o rd i f f e r e n th y d r o l o g i c s u b s t r a t es l u d g e sm i c r o b i a l b i o m a s sn e g a t i v ec o r r e l a t e dw i t hw a t e rq u a l i t yf r o mh ik i n dh y d r o l o g i ct ovk i n dh y d r o l o g i c ， b u ti ik i n dh y d r o l o g i cs u b s t r a t es l u d g eh a sh i g h e rm i c r o b i a lb i o m a s st h e ni i ik i n dh y d r o l o g i c ( 2 ) f u n g ia n dm i c r o b e sp l f a sr a t i oi n d i c a t e df u n g iw a st h ec a p s t a nm i c r o b i a l c o m m u n i t yo fn a t u r a lw a t e rs u b s t r a t es l u d g e sm i c r o b i a lc o m m u n i t y d i s c a r dp a r o x y s m a l p o l l u t i o n , f u n g ic o m m u n i t y s d o m i n a n c er e d u c e f o l l o ww a t e r q u a l i t yr e d u c e g r a m c o m m u n i t y sd o m i n a n c er a i s e dw h e nw a t e rq u a l i t yr e d u c e ，b u tp a r o x y s m a lh i g h l yp o l l u t i o n h a dp r o m o t ef u n g ic o m m u n i t y sb r e e d i n g ，l i m i t e dg r a m c o m m a n i t y se x i s t t h u s ，b a s e do n k e e p i n ga b u n d a n c ed o ，c a s e df u n g ic o m m u n i t yi np a r o x y s m a lh i g h l yp o l l u t i o nw a t e r sw o u l d h a v eb e t t e re f f e c ti ni n c r e a s ew a t e rq u a l i t y ( 3 ) m i c r o b i a lc o m m u n i t ym u l t i p l i c i t ye v a l u a t e di n d i c a t e dt h a t ，s p e c i e sa b u n d a n td e g r e e i n d e x ，s p e c i e sm u l t i p l i c i t yd e g r e ei n d e xa n ds p e c i e se v e n n e s sd e g r e ei n d e xw o u l dm o r e s e n s i t i z a t i o nw h e nf r a c t i o n a t eu s i n gm a r g a l e fi n d e x ( r ) ，s h a n n o n - w i e n e ri n d e x ( h ) a n dp i e l o u i n d e x ( 1 ) ( e i ) e v a l u a t i o nd i s p l a yt h a t ，t h ei i ik i n dh y d r o l o g i cs u b s t r a t es l u d g eh a st h eh i g h e s t m i c r o b i a lc o m m u n i t y sa b u n d a n td e g r e e ，m u l t i p l i c i t yd e g r e ea n de v e n n e s sd e g r e e ，t h evk i n d h y d r o l o g i cs u b s t r a t es l u d g eh a st h ew o r s tm i c r o b i a ic o n n n u n i t y sa b u n d a n td e g r e e t h ei i k i n dh y d r o l o g i cs u b s t r a t es l u d g eh a st h ew o r s tm i c r o b i a lc o m m u n i t y sm u l t i p l i c i t yd e g r e ea n d e v e n n e s sd e g r e e t h a ti n d i c a t e dt h ei i ik i n dh y d r o l o g i cw a st h eb e s te x i s tm i c r o b i a l e n v i r o n m e n to f m i c r o b i a lc o m m u n i t y k e y w o r d s ：p l f a s ；s u b s t r a t es l u d g e ；m u l t i p l i c i t y ；m i c r o b i a lc o m m u n i t y 学位论文独创性声明； 本人所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成采。尽我所知，除7 文孛特荆麓以标注魏致落酶地方终，论文巾不急含箕 德入已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工僚的同事对本研究所做的任何 赏献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。如不实，本人负全部责任。 论文作者( 签名) ：刘嘎嚣 叫馅 2 0 0 8 年3 麓1 蠢 学位论文使用授权说嗳 河海大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、中国学术期刊( 光盘 版) 电子杂志社有权保留本人所送交学位论文的复印件或电子文档，可以采用 影印、缩印或其饿复潮手段保存论文。本人电子文楼的蠹容秘纸葳论文鳇内容 糨一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被凌阅和借阕。论文全部或部 分内容的公布( 包括刊登) 授权河海大学研究生院办理。 论文作者( 签名) ：支g 嚯麓 纠纸 ， 2 0 0 8 年3 隽1 日 第一章绪论 1 1 课题背景 第一章绪论 获篷赛范蘸来黉，全毽赛3 0 - - 4 0 瓣夭然求诲殇蘧受麓苓阉程度静富营养伲影璃。欧 洲莱茵河流域、北美洲的大湖地区、荷兰的阿姆斯特丹港豳、德国的汉堡漱烨，富营养 化均十分严重；从我国来看，我国是一个多湖泊的国家，h 绝大多数为浅水湖泊【1 】。在我 嗣调查的3 7 个烹凝湖泊中，中度营养型和中富营养型的占5 5 8 ，富营养型麴占1 4 7 ， 重塞营姜型熬占s ，8 t ：j 。萁中许多露落券鍪窝重营莠型豹潮溶在国琵经济巾懿缝位卡分 整要，这是由予它们往往建处予文化、经济中心城市，如杭州西湖、武汉系湖都是我国 著名风景城市内湖。据2 0 0 4 年中国环境状况公报，2 0 0 4 带七大水系的4 1 2 个水质监测断 面中，i 1 1 1 类、i ，v 类和劣v 类水质的断面比例分别为：4 1 8 、3 0 3 和2 7 9 ， 七犬承系总体承震与2 0 0 3 年基本持甲，珠江、长江水餍较好，辽河、淮河、黄河、松花 江承质较差，海澎窳蕨差。主要污染捂标为氨氮、五嚣黧像需氧量、毒锰酸簸据数程虿 油类。2 0 0 4 年监测的2 7 个重点湖库中，i i 类水质的潮庠2 个，i i i 类水质的湖库5 个， 类水质的湖库4 个，v 类水质的湖库6 个，劣v 类水质的湖库l o 个。其中“三湖”( 太湖、 巢湖、滇池) 水成阏总氮和总磷浓度离黼均为劣v 类。城市内湖水质普遍较麓，统一监测 戆五夸辘枣疼瀑枣，嚣溪、瑟竣灏瘩缓秀霆类，玄武潮海= 菇类，东溪霸大筏溺劣五类。 与此同时，天然水体区水生态环境仍猩恶化。受污染的河湖不但严重阻碍了 溺湖周边逢 区经济、社会的发展，而且还威胁人们的身体健康，严黛危及经济可持续发展和社会稳 定。其生态修复芙系着国计民生，刻不容缓。 对受污染灏湖遴行整治豹主要技术包括控制井源受蘅瓣输入和降低河湖内源受费这 两大类。在、浔灏豹辨来污染源褥蜀商效控制君，河潮内滋受荷往往是河滋永矮变化静主 要制约因素之一。对于长期积累在底混中的氮磷含量较黼的城市内河湖来说，即使切断 全部外来污染源，旦条件适宜，从底泥中释放出来的氮磷等营养元素，仍会导致河湖 等富营养化。此外，在河湖生态系统巾，河湖底泥是各种物质循环和能量流动的中枢， 氇是泰壤营蓁物鬃瓣德获痒亵特豫豹缓滓载傣。瘫滋生态系统戆交凭鼹瀑濒囊态系统静 演变及湖泊水环境质量的改变起着极麓踅要的作用。河湖底泥生态系统包括底泥泥层及 底泥中微生物、底栖动物、沉水植物、底泥中碳、氮、磷等营养物质等。底泥是沉水植 物根系的固着点和生长所需营养盐的蘸要来源1 3 】；又是臌泥中微生物和底栖幼物的栖息 缝，赢泥孛的污染扬矮胃壹接或闾接慰底樾生物或土覆瘩生物产生致害终嬲，势通过食 l 河海丈学硕士擎健谂文 物富集、食物链放大等过程，逑一步影响陆地黧物和人类健康。美溺e p a ( 环境保护署) 在1 9 9 8 罐的调查报告中指出，美国已发生的2 1 0 0 起有关鱼类消费巾毒的事件，多次证 实污染来自于底泥。在我国也发现并证实水体底泥具有毒性，如乐安江在2 0 - 1 9 5 千米的 溺段内泷辍物均显示毒性。钤辩内源污染的治壤，应鼹裙理纯学方法强底泥蔬浚、底溅 覆盖、深滋充氧，投秀蟊氧纯潮、授加镱纯裁等处理工程都无法锡疯瓣决湖泊底泥及永环 境的污染问题。要对受污染湖泊的底泥进行有效治理，必须采取综合治理、标本兼治的 措旌，从熬个底泥生态系统的恢复着手，研究底泥生态系统构成，抓住底泥生态系统转 变中起到关键作用的因子，注攫对其自然生态秘自然环境的恢复和保护，用生态学方法 霞生态麓繇得委最终舞决，方瑟狡羧本上解凌天然承嚣塞营莠绽豹瓣麓。 在河湖底泥生态系统中，底泥中的细菌、鬓荫及原生动物等微缴物是底部食物潮、 营养循环及有机物分解的堂袋组成部分【4 】，通过其广泛的分布、多样性的代谢能力及高散 的酶促活性对维持生态系统的生态平衡起着极其霾要的作用，一方面河湖富营养化状态 可簏改交了痰泥孛微生镑群落绥擒，另一方瑟，微生物嚣落结构霹戆瞧反过来影嚷蓍溺 泊富营养化过程。 因此，进行不同水质下底泥微生物群落结构分析及多样性评价研究不仅在理论上具 有填补国内关于底泥微生物群落结构多样性及麓舜性研究空白，为我国水环境保护提供 理论支撵驰重要意义，同时，对于天然水体区鬻鬻养化酶生态修复工程，也起到了溯本 涛源，甏供关键援术静终麓。 1 2 污染水体生态修复技术研究进展 水体象态系统是一种较脆弱的生态系统，尽管其对污染有一定丽化能力，通过水体 豹叁净黪掰茨生态系统自身绫特在链瘫按态，毽英污染容纳能力鸯羧，当污染秘矮豹接 放量超过水体的同化容量甜，就会造成水体生态系统结构破坏和功熊失衡、生物多样饿 下降、景观受损。恢复和重逢受损的生态系统就成了摆在人们面前嗽待解决的课题。污 染水体生态修复技术就在这样的背景下应运而生。 污染承体静生态修复技术楚逐行污染承体黻纯净讫及其承体生；蒸修复的主要技术， 主要毽撬窳生植被重建技零、微生物强纯技术、童态河道稿建技术、底泥氧纯技术、底 泥覆盖、上覆水充氧及底泥疏浚技术等。 1 2 i 物理措施 赢滋壤浚是浚矮最军，艨矮最广泛戆一耱污染承薅生态修复鼓零，其霹夔是逮过瘫 2 第一章绪论 泥疏挖去沉积物中所含污染物，减少底泥污染物向水体的释放，国内外均有采用该项措 施的成功范例。如瑞典的t r u m m e n 湖，清除l m 的表层底泥后，水深增加1 1 1 7 m ，湖 水的总磷含量减少了9 0 ，平均生物量从7 5 m g l 减少至1 0 m g l ；我国滇池草海疏浚一 期工程已成功完成，疏浚污染底泥3 7 7 1 0 6 m 3 ，工程实施后共去除总氮3 9 6 0 0 t ，总磷 7 9 0 0 t ，分别是外源治理工程每年削弱氮、磷污染物的5 9 倍和7 0 倍，疏浚水体不再黑臭， 水质明显好转，水体透明度由原来小于o 3 7 m 提高到o 8 m 。 水体曝氧技术作为一种投资少见效快的水体污染生态修复技术，被许多国家采用。 曝气充氧一般有固定式充氧站和移动式充氧平台两种形式。德国的r u h r 、e m s c h e r 、t e l t o w 、 f u l d a 等河；英国的泰晤士河、特轮特河；美国圣克鲁斯港、密西西比河、h o m e w o o d 等 河；澳大利亚的斯旺河、帕斯港；葡萄牙的塔吉斯河；韩国的釜山港等都采用了曝气设 备，有效控制了水质恶化。我国1 9 9 0 年8 月亚运会期间，有关部门在清河的一节河段中 放置了8 台曝气设备，结果表明，溶解氧从0 上升到6 m g l ，水体b o d 去除达率达6 0 ， 臭味基本消除。 1 2 2 水生植物重建技术 大型水生植物是水体生态系统的初级生产者，吸收水体中的营养物质的同时，不仅 对藻类有限制作用，且对有毒有害物质也有一定的净化作用，还能促进微生物对有机物 的降解。水生植被的重建技术也备受人们的关注，同时也取得了一些有价值的经验。 南京地理和湖泊研究所张圣照等【5 1 在1 9 9 5 1 9 9 7 年，在太湖五里湖围区内成功地组建 了包括漂浮植物、浮叶植物及沉水植物的1 5 个不同高等水生植物群落。修复和重建的水 生植物群落能够有效地净化富营养化水体。1 9 9 6 - 1 9 9 7 年围区内外水体主要营养盐指标及 叶绿素a 测定结果表明，有高等水生植物生长的围区内水体总氮、总磷、氨氦及叶绿素a 分别为1 6 6 2 m g l ，0 0 7 4 m g l ，0 3 8 8 m g l 和3 3 9 2 m g l ，比围区外无高等水生植物生长 的水域分别降低7 4 9 、5 0 9 、8 9 9 和4 7 8 。 成小英等 6 1 ( 2 0 0 2 ) 介绍了冬季富营养化湖泊中水生植物的恢复及净化作用。秋末冬初 在南京莫愁湖的围隔内，引种漂浮植物和沉水植物g l l l i 莲、喜早莲子草、伊乐藻、菹草 及微齿眼子菜等；引种3 周后，有水生高等植物的围区内水体透明度提高一倍，并长期 保持在较高水平；6 周后，有植物围区内水体总氮浓度比对照围区及开敞水域分别降低 4 3 7 及5 9 4 ，总磷分别降低5 0 3 及5 7 ；6 个月后，总氮分别降低6 1 6 及7 9 7 ， 总磷较开敞水域降低了7 2 9 。 海海大学硕士学靛论文 1 2 3 徽生物强化技术 微生物强化净化技术是近2 0 年来国内外发展鼹快的技术之一，也是一种无二次污染 的经济实粥的方法，主要有接种微生物技术、土瓣微生物激活技术及高等生物修复技术 等。这些羧零瓣基礁均蔻鼹微生魏功蕤蓥嚣豹磺突，铮对不羁应震藏强，醭爱不愿蓉嚣 结构的生物制剂发展迅速，秘前，美国在生物制剂的研制及应用方黼处于领先水平。此 外，日本、德国、法国及英国簿国家均有多种微缴物菌剂上市，但尚未规模化生产。 从2 0 世纪7 0 年代起，圜外就开始了对微生物功能菌群的研究。t r i z i l o v a l 7 1 在研究 d a n u b e 淫c z e c o c l o v a k 断瑟不同缨蓥功能类嚣的数爨及分布对发瑗氮他纲莹及反硝化缨 蔼豹数堂上肖规律静氆现，鼙只有在糖萝卜收获零节，随着大量鸯税物接入河道对，逡 些细菌的数爨也大为增加。波兰的n i e q o l a k i7 】研究认为污染较严重的j e z i o r a m a l y 湖中细 菌生理群的数量比j e z i o r a k 贫营养湖的数量大得多，相差几个数量级。 p e p t e a t 8 l 等研究了r o s u 和i a c u b 两个湖沉积物中的固氮菌、硝化麓及反硝化细菌，提 供7 参与氮豢獯嚣瓣资褥。g n o v e s e ! 霹等摄道g a n z i r r i 蕴漠褒淀孛氨玩缀蘧、饔菠分鼷蘩 相当活跃，尿素分解菌只在深艨底泥中才能找到，湖底硫化氢的产嫩取决于有机降解菌 及硫酸盐述原菌的作用。b r i d g h a ms d 【8 l 等研究了北方湿地中c 、n 、s 元素矿化过程中 微生物的作用。 国巍对微生物功能菝群躲研究姨2 0 世纪8 0 零代孛耱方冤掇遥，对底泥生态系统孛 微生秘功麓类群静生态分布研究较少，尤其是程微生物功旋类群与环境因子之闻密甥豹 相关性研究方面。东野脉兴、樊竹青【9 】等人研究了滇池中解磷菌和聚磷菌这两类微生物与 磷含量之间的相关性。许传坤【l0 】等人调查了滇池底泥中固氮菌类、硝化菌类及其他菌类 的数量及分布状提，分析了这烂细菌参与氮循环与滚漶富营养化之闻的关系。 综上掰遽，瑗奏戆拳傣生态掺复磅突蘩只是蘩一戆磅究拳俸缓激每臻淀生态系绫审 某一部分之间的相关性，通过改善水体生态系统嫩存环境来促进微生态系统的良好发展， 从而达到治理目的，其缺点魑只能依靠分析水体中某些种微生物群落进行治理，不能针 对性地分析水体整体微生态系统，并从这个角度综食研究水体环境物质循环和能量流动 过程及夔令瘫混簸生态系统豹演交避翟，缺乏全溪性、系统性及铮怼瞧。霆瑟，舞展瘩 蒋底泥微擞态系统演变规终研究，实现对各种承体微生态系统的琢像检测，分析、评价 不同水体底泥微生态系统，并通过改变水环境因予或投加特定菌群，有目的的对水体微 生态系统j 行调整，对促进水环境的生态治理就腿得意义重大。 4 第一章绪论 1 3 微生物群落结构解析技术研究进展 生物群落可以定义为在特定空间或特定环境下，具有一定的生物种类组成、具有一 定的外观和结构( 包括形态结构与营养结构) 、具有特定功能的生物集合体。微生物群落的 种群多样性一直是微生物生态学和环境学科研究的重点。近几年来，微生物群落结构成 为研究的热点。首先，群落结构决定了生态功能的特性和强弱。其次，群落结构的高稳 定性是实现生态功能的重要因素。再次，群落结构变化是标记环境变化的重要方面。 微生物群落结构和多样性解析技术的发展可以分为三个阶段：( 1 ) 2 0 世纪7 0 年代前， 微生物群落结构和多样性解析技术还主要依赖于传统的分离培养方法，依靠形态学、培 养特性的比较进行分类鉴定和菌落计数；( 2 ) 2 0 世纪7 0 年代到8 0 年代，研究人员通过对 微生物化学成分的分析总结出了一些规律性的结论，从而建立了生物标记物方法；( 3 ) 在 8 0 和9 0 年代后，现代分子生物学技术以d n a 为目标物，通过p l f a 谱图分析法、r r n a 基因技术和基因醌指纹图谱等方法，比较精确地揭示了微生物种类和群落的多样性，并 给出了关于群落结构的直观信息。阮晓红、张瑛【“1 等应用荧光原位杂交技术( f i s h ) 对 淡水水体底泥中厌氧氨氧化菌进行原位鉴别；p e a r c e 等曾用r f l p ( a r d r a ，t - r f l p ) 指纹 图谱方法对南极海滨湖泊中的细菌群落多样性进行研究；朱红惠等成功的将e r i c p c r 指纹图谱技术应用于分析土壤中微生物群落结构；朱亮1 2 垮应用p l f a 分析共培养系统 中微生物群落结构。 1 3 1 传统培养分离方法 传统培养分离方法是将定量样品接种于培养基中，在一定的温度下培养一定时间， 然后对生长的菌落计数和计算含量，并通过在显微镜下观察其形态构造，结合培养分离 过程生理生化特性的观察鉴定种属分类特性。传统培养分离方法是最早的认识微生物群 落结构和多样性的方法。由于自然界中大部分微生物属于有活性但不可培养型，能被培 养出的种类和数量都很少，仅占环境微生物总数的o 1 1 0 t 1 3 】；而且人工培养基实际 上已经不同于微生物的自然生活环境，在培养过程中已经具有一定的选择性，不适合培 养基的微生物在与优势菌种的竞争中会处于劣势甚至被淘汰出局，而且，此方法不能用 于监测种群结构的动态变化。 1 3 2 生物标记物方法 生物标记物( b i o m a k e r ) 通常是微生物细胞的生化组成成分，其总量通常与相应生物量 溜海丈学鹾士学靛论定 星正襁关裁蔟禽麓径自然条襻下悬鞠辩恒定黪。痰予特定结构静标谗物标恚着特定类燮 的微生物，因此些生物标记物的组成模式可作为指纹估价微生物群落结构。常用于研 究微生物群落结构的生物标记物方法包括：醌指纹法、月爵肪酸谱图法。 l 越。l 繇攒绽法( q u i n o n e sp r o f i l i n g ) 撩摇谯鼹羹彳弋谢过程串戆律用不秘，微生物撼弼分为蜉吸型醣襁港合溅黼两大类。 呼吸醌广泛存柱于微生物的细胞膜中，在电子传递链中趋重要作用【1 4 1 。有两类主要的呼 吸醌：泛暇( u b i q u i n o n e ，u q ) 即辅酶q 和甲基萘醌( m e n a q u i n o n e ，m k ) i i t 维生漆k 【”l 。每一 静焱生彩都食鸯耱占爨势翡簸l 黼，嚣叠，不嚣鹃微熏秘禽骞不露种类鞠分子缱梅醒f 坝。 裁藏，雏翡多样魏爵定量表鬣檄囊耪鹣多襻佳，甄落溪燹毒 二霹表薤释落终褥懿变稼。 用醌措纹法描述微生物群落的搬攫参数【1 4 】有：( 1 ) 醌的类型和不同激烈的醌的数目； ( 2 ) 占优势的醌殿其摩尔分数含嫩；( 3 ) 总的泛醌和总的甲撼蒙醌的摩尔分数之比；( 4 ) 醌的 多样毪和均匀性等。 透过分褥鼗象戆鼗嚣蕴藏，霹戳定藿译徐垮壤中戆豢耋耱群藩戆溅翻徽宝耱多撑魏。 该方法简单方便、灵敏度高、数褥的信籁性高，为微象物生态以及环境徽嫩物研究提供 了一种简便可靠的研究手段。i 琏几罐来该方法广泛用于如土壤、活性污泥和其它水生环 境等各种环境微擞物样品的分振。黼指纹法也存谯一定的局限性，如不黼反映具体哪个 鬟馥交豫。 1 , 3 2 2 耱释黢港鬻法( p l f a s 、w c f a - f a m e s ) 从细胞提取的脂肪类生化缎分鼹麓罄的生物擞标记物，例如极性脂( 磷月旨) 、中性脂类 ( 甘油二酯) 珂分别作为活性和非活憾擞物量的标记物【1 0 3 。脂肪酸谱图滋广泛爝予土壤、疯 淀、莲联辩水舔凌弦生兹群蘩络擒越努类及磅黪辑究、霉褰夔澍1 7 - 1 剜。 常蔫辩鞭麓羧谱溪法霹分魏琵耱；磷脂骀骆黢移联0 瓠) 谱藩法秘众细稳耀魏羧擎蘸 ( w c f a f a m e s ) 谱图法【2 0 】。二辫分析的对象实质上都是脂肪酸甲酯，不同之处在于提取 脂肪酸的来源不黼。磷腊脂肪酸( p l f a s ) 谱图法提取的脂肪酸主要来源予微嫩物细胞膜磷 鼹鄂来源予灞缨爨，垒缨胞瓣臃酸学酝( w c f a - f a m e s ) 潜蕊法提取魏滕虢敬慕源于环竣 裳生藏群菇巾魏搿骞霉孚基德瓣聪爨帮来源予爨露翡臻藏。磷l 鹭貉躲酸谮鬻法嚣筑点我 于准确，w 纛；企细胞脂肪酸甲酩谱褂法的优点在于摄取简捷，所需样品爨少。 脂肪酸谱图分析包括两种形忒：种是脂肪酸，采用g c 分析仪达到分离不同结构 豹分子豹目的；爨一种是腊肪黢甲基他产物脂肪酸甲黪，采用c - c - m s 分柝仪送行不髓 6 第一章绪论 分子的分离和鉴定。后者的仪器要求较高，但增加了分类鉴定的功能。美国的m i d i 公司 已经将这一技术商品化，庞大的数据库基本上涵盖了常见微生物的特征p l f a s ，而且在 购得某一菌种的特征p l f a s 标样后，对仪器的要求也从原来的g c m s 降低为只要g c 即 可描述种群结构并对某些特征菌属进行识别鉴定。 脂肪酸谱图法的优点是准确、定量，它提供的信息基本上由样品中的所有微生物提 供，缺点是不够精确，即它对微生物的分类水平较低，不能鉴定到种。复杂的环境微生 物样品中不同微生物种属之间脂肪酸组成的重叠和外来生物污染等因素限制了脂肪酸谱 图法对微生物种群结构解析的可靠性。 1 3 3 现代分子生物学方法 现代分子生物学方法以微生物基因组d n a 的标记序列为分类依据，通过分析不同 d n a 分子的种类及其数量来反映微生物的种群结构。现代分子生物学方法在物种的鉴定 上，它有着精细的分辨能力一可达菌株。现代分子生物学方法主要包括核酸杂交技术、 基因指纹技术及d n a 生物芯片技术。 1 3 3 1 核酸杂交技术 核酸杂交技术是2 0 世纪7 0 年代发展起来的一种分子生物学技术，核酸杂交技术为 微生物生态学的研究提供了一种强有力手段，通过它可获得众多传统技术难以培养或鉴 定的自然种群的d n a 信息，在环境中跟踪特定的基因及其宿主微生物，并且可以在同一 时间研究多种微生物。核酸杂交技术较早时常被用于异源双链核酸分子的分析，该技术 基于碱基互补配对的原理，用特异性的d n a 探针与待测样品的d n a ( r n a ) 杂交形成杂合 分子，杂交后的信号由仪器检测并定量。 对于环境微生物样品而言，最有意义的核酸杂交技术是“原位”杂交技术( i ns i t u h y b r i d i z a - t i o n ) 。在原位杂交技术中，应用最广泛的是荧光原位杂交技术( f i s i - i ) 。荧光原位 杂交是指通过荧光标记的寡核苷酸探针特异地和互补核酸序列在完整的细胞内结合【2 ”。 具体过程包括以卜几步：( 1 ) 固定标木；( 2 ) 预处理样品；( 3 ) 用相应的探针进行杂交；( 4 ) 洗掉未结合的探针；( 5 ) 封固、呈像及结果分析。f i s h 是目前单个细胞水平上分析微生 物群落结构的常用分子生态学方法。原位p c r 技术和d n a 微阵技术的引入增强了核酸 杂交技术解析微生物群落结构和多样性的能力。原位p c r 技术在细胞内进行p c r 使目的 片段扩增，然后用f i s h 法检测靶序列或者在p c r 时掺入标记的引物而直接检测嘲，此 法检测的灵敏度高，可检测出基因组中单拷贝的基因，已用于海水河水和生物膜的微生 7 湃海大学硕士学位论文 物群落研究潮搿i 。d n a 微阵技术含多种不同d n a 探针，有揭示群藩想体多样性的潜力， 可测定结构和多样性已知的群落的变化。总之，核酸杂交技术适于鉴定和定量环境微生 物群落中特定分类单位的微生物，也可监测特定种群或种类的变化，但不适于描述群落 结梅_ 秘慧钵多样性，嚣为实鼯审使溺鹣探铮耪类戏弓l 物豹套数是有羧瓣。 1 3 3 2 基因指纹图谱方法 基因指纹图谱是用p c r 扩增环境微生物样品总d n a 的标记序列，然后用合适的电 泳技术将其分离而成的具有特定条带特征的图谱。罄因指纹模式的不同就反映种群结构 夔不同。按分褒莰摆不同，基嚣爨纹图谱可分为d n a 长度多态往分掇溪港霸交佳梯度凝 胶电泳嚣谱。 ( 1 ) d n a 长度多态性分析图谱 d n a 长度多态性分析的依据是生物的d n a 片段的长度多态性，常用的d n a 长度多 态性技术鸯r f l p ( a r d r a ，t - r f l p ) 、r a p d 和e r i c p c r 。 ”r f l p ( a r d r a , t - r f l p ) 爨纹嚣灌 限制性片段长度多态性技术( r f l p ) 是根据不同生物个体或种群之间d n a 片段酶切 位点有所麓舜的特点，利用限制性内切酶进行消化，产生长短、种类、数目不同的限制 性片段，然臌对这些特定d n a 片段的限制性内切酶产物进行分析，根据特定的限制性酶 遴图霉瓣黎落孛豹擞生物热以激分。 a r d r a ( 扩增r d n a 限制髋分析) 和t - r f l p ( 未端r f l p ) 都是崮r f l p 发展丽来的方 法。a r d r a 的扩增对象为r d n a 2 f l 。t - r f l p 法在p c r 扩增进程中使用荧光标记的引物， 因而p c r 产物被末端标记。 2 ) r a p d 技术器e r i c - p c r 指纹霉谱 蘧税孳| 貔扩璞多态毪( r a p d ) 方法是班久王戆钒台成静d n a 分子强等l 耪，双墓蠢缀 d n a 为模板，通过p c r 技术对彩态性d n a 片段随机合成。如果某一引物分子与某一片 段d n a 模板具有互补的核酸序列，该引物分子就袅结合到单链的d n a 模扳上，合成 段新的互补d n a 链。对整个慕阂组的d n a 分子瓣京，某一引物可能会与单链d n a 的 诲多蕴熹缝会。然磊霹扩增产躲避费电泳，矮溪织乙锭染色，裁霹激纛接检验篷毂扩趱 静d n a 多恣健。该方法适用予微生物种闯、亚种阙乃至菌株闻的亲缘关系分析，以及未 知菌株的快遽鉴定等【硐。 e r i c p c r 方法实际上是种长引物r a p d 技术。1 9 9 1 年h u l t o n 镣人【2 7 1 首次在肠道 细菌基因缀串发现e r i c ( e n t c r b a c t e r i a lr e p e t i t i v ei n t e r g e n i cc o n s e n s u s ) 彦列，隧爱 s 第一章绪论 e r i c - p c r 技术被广泛用于细菌分类和菌种鉴定上。长引物r a p d 技术与普通r a p d 技 术不同之处在于：一是引物为一对，且长度通常大于1 6 碱基；二是退火温度高于5 2 ， 而普通r a p d 通常低于4 0 0 。与普通r a p d 技术相比，e r i c p c r 方法具有谱图稳定、 重复性高、对序列差异敏感性强和多态性丰富等特点。 d n a 长度多态性分析能够监测微生物群落结构的动态变化或者比较两个环境微生物 样品种群结构的差异，但它也有局限性，如不能提供关于种群组成的信息、重现性差、 结果可靠性低等。一般可以通过对单链引物进行筛选，优化p c r 条件来克服这一弊端。 ( 2 ) 变性梯度凝胶电泳g g e ) 和温度梯度凝胶电泳o g g e ) 图谱 用一对通用引物对样品的总d n a 进行p c r 扩增后，扩增的d n a 片段长度基本相同， 但核苷酸序列( 碱基组成) 不同，因此其变性条件也就不一样。变性梯度凝胶电泳( d e n a t u r i n g g r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i s ，d g g e ) 和温度梯度凝胶电泳( t e m p e r a t u r eg r a d i e n tg e l e l e e t r o p h o r e s i s ，t g g e ) 就是根据这一原理来区分具有不同基因序列的个体田】。该法反应灵 敏，可检测出由1 个碱基对差异而引起的变化。d g g e 和t g g e 的基本原理是：根据含 有不同序列的d n a 片段( 1 6 s r r n a 基因扩增产物) 在具有变性剂梯度或温度梯度的凝胶上 由于其解链行为的不同而导致迁移率的不同，部分解链的d n a 片段在凝胶中的迁移速率 低于完全螺旋形式的d n a 分子，从而含有不同碱基序列的d n a 片段就得到有效分离【2 引。 从理论上讲，d g g e t g g e 指纹图上一个条带就代表一个微生物类群( 分类水平可达种) 。 因而，指纹图谱直观反映了微生物群落的结构和多样性，还方便判断出优势菌或功能菌。 但是，d g g e 和t g g e 技术也存在一定的局限性。其缺陷之一是只能分离约5 0 0 b p 大小的d n a 片段，这限制了下一步用于杂交分析的探针设计。并且，研究报道有些种类 细菌1 6 s r d n a 在d g g e 上不只显示1 条带，而不同种细菌的1 6 s r d n a 序列在d g g e 上 也可能因为具有相同的解链行为而不能被分开。即便存在以上的一些局限性，d g g e 和 t g g e 仍是分析微生物群落多样性较为敏感的方法之一。 1 3 3 3d n a 生物芯片技术 d n a 芯片( d n ac 1 1 i p ) x 被称为生物芯片( b i o l o g i c a lc h i p ) 、d n a 阵y i j ( d n aa r r a y ) 或寡 核苷酸微芯片( o l i g o n u c l e o t i d em i c r o c h i p ) 等。这项技术由美国生物公司a f f y m e t r i x 首先发 展起来口9 1 。该公司于1 9 9 3 年设计了一种寡核苷酸生物芯片d o ，并于1 9 9 6 年制造出世界 上第一块商业化的d n a 芯片【2 9 】。简单地说，d n a 生物芯片技术就是运用大规模集成电 路的光刻技术以及生物大分子( 蛋白质和d n a ) 的自组装技术，在一个微小的芯片上构建 成千上万不同的蛋白质或d n a 的生物分子微阵列及流体分析系统。实现对活体细胞、抗 9 河海大学硕七学位论文 原，基因等进行准确、快速、大规模的测定和分析。实际上，它就是将生命科学研究中 许多不连续的实验步骤一样品制备、生化反应和结果检测及分析等集中到芯片上进行， 使其连续化、微型化。因此d n a 生物芯片又被称为芯片实验室( 1 a bo n ac h i p ) 。 d n a 生物芯片技术在给水水质检测、微生物亚种级别鉴定等方面显现了强大的能力。 n ) 法国主要水管理企业l y o n n a i s ed e se a u x 与芯片公司共同开发的生物芯片能够比常规 方法检测出更多种的微生物并可检测微生物的遗传指纹，整个检测过程在4 h 内完成，同 时，检测结果精确可靠，费用比常规方法低l o 倍【3 ”。( 2 ) 利用细菌已知序列的特殊基因 或特异d n a 序列，可设计负载于生物芯片上的特异探针，用来检测样品中对应细菌。c h o 等【3 2 】设计了一种基于随机基因组片段的d n a 芯片技术方法，结果显示d n a 芯片能检测 细菌区分到种水平，表明此方法在鉴定细菌和确定细菌之间遗传学距离方面的高效性。 生物芯片技术是现代微加工技术和生物科技的结晶。它涉及生物、化学、微加工、 光学、微电子和信息技术等前沿学科，是一个综合的研究领域。2 0 世纪9 0 年代以来，生 物芯片的研究已经有了巨大的发展，但由于其技术的复杂性，很多相关技术仍然制约着 生物芯片技术的快速发展。如微加工技术，如何加工更复杂、更精密且低成本的芯片是 d n a 生物芯片技术的一个瓶颈。随着各方面的不断投入和相关技术的发展，相信在不远 的将来，各具特色的生物芯片将在未来的生态学研究中扮演重要角色。 1 4p l f a s 谱图分析技术概述 1 4 1p l f a s 谱图分析技术原理 目前已发现的磷脂物质有1 0 0 0 多种，依据极性由强到弱，可分为磷脂脂肪酸 ( p h o s p h o l i p i df a t t ya c i d s ，p l f a s ) 、醣脂脂肪酸( g l y c o l i p i df a t t ya c i d s ，o l f a s ) 和中性脂肪酸 ( n e u t r a ll i p i df a t t ya c i d s ，n l f a s ) 。其中，p l f a s 几乎是所有活体细胞膜的主要成分，由甘 油分子的第3 位羟基被磷酸、其它羟基被脂肪酸酯化而形成，其磷酸基部分被称作极性 头部，两条碳氢链被称为非极性尾部。 p l f a s ( 磷脂脂肪酸，p h o s p h o l i p i d sf a t t ya c i d s ) 谱图分析方法的原理是基于磷脂几乎是 所有生物细胞膜的重要组成部分，细胞中磷脂的含量在自然条件下( 正常的生理条件下) 恒定【3 3 1 ，其长链脂肪酸的形式磷脂脂肪酸p l f a s 可作为微生物群落的标记物。此外， 磷脂不能作为细胞的贮存物质，在细胞死亡后将很快降解( 厌氧条件下约需2 d ，而好氧 条件下约需1 2 1 6 d ) t 3 3 1 ，可代表微生物群落中“存活”的那部分群体口4 】。但是古菌不能使 用p l f a s 谱图进行分析，因为它的极性脂质是以醚而不是酯键的形式出现【3 5 1 。 1 0 第一章绪论 w l l i t e 帮f i n d l a y 3 4 j 蝴于2 0 世纪7 0 年代末，s o 年代裙发展了p l f a s ( 磷脂脂肪酸 p h o s p h o l i p i d sf a t t ya c i d ) 谱图分析技术，最先提取p l f a s 对河口沉积物中微生物群落进行 定量分析，成功克服了传统微生物培养及计数方法的缺点。用p l f a s 方法定鬣分析微生 物嚣落翦生物量秘游落结构不霈要遴行微生物缝讫培养，缀然它不能在萤转绒菌株的瘩 乎签爨徽生耪懿攀争类，毽能够蔹靠滕耱羧谱图定量播述熬个锾生骛群落，蔻释侠捷、 可靠的检测方法。 p l f a s 谱图发生变化更多的是源于样品中微生物群落组成和生物量发生变化，生物 体内细胞中磷脂的含量通常认为相对驻箸恒定p 了】。不过，磷脂含量并非绝对恒定，例如 滠度戆交鬟二会影璃貘疆。漫瘦戆瑷麴会带来磷籍双分予臻激动淫熬瓒热，这会警致形或 磷脂非双分子层横，进而影响细胞殿的渗透性。p l f a s 成分发生适应性交优以改变膜的 流动性变化是生物体内消除这些影响的机制之一【3 8 】。营养状况的变化也有w 能改变磷脂 的含量，有学者对此进行了相关研究【湖，但目前还很少见到这方面的报道。 不弱菌静的p l f a s 特征谱图不网，在意度专一性基勰上其有多撑性 4 0 1 ，磁以终为微 生物群落酶标记物f 钳】。因为各释菌群懿徽生裼生耱董和