（环境科学与工程专业论文）鱼类测试抗生素废水和菌渣生物毒性的试验研究.pdf

河北科技大学硕士学位论文 制作用越强。m d a 的含量与对照组相比，各浓度组均明显降低，说明机体发生了脂 质过氧化反应。锦鲤鱼鳃组织中s o d 和c a t 活性被极显著诱导作用( p o 0 1 ) ，且 废水浓度越大，诱导作用越强。p o d 活性被诱导，但随着废水浓度的升高，p o d 活 性表现为不同程度的降低，认为在链霉素废水浓度较低时，对p o d 具有诱导效应， 但随着废水浓度的升高，诱导效应减弱直至变为抑制，a o c 活性极显著低于空白 对照组( p 0 0 1 ) ，说明抗氧化能力减弱。m d a 含量显著高于对照组( 0 0 1 p o 0 5 ) 。 s o d 和m d a 响应较敏感，适合作为链霉素废水暴露的生物标记物。 斑马鱼暴露于1 0 0 链霉素菌渣上清液，9 6 h 后无死亡，表明链霉素菌渣上清液 对斑马鱼没有急性毒性。 斑马鱼肌肉组织s o d 、p o d 活性表现出先降低后升高再降低的趋势：m d a 含 量呈现“双峰型”的变化趋势，暴露于最高浓度组( 5 0 ) 时，9 d 和1 2 d 时，s o d 均被极显著抑制( p o 0 1 ) ，表明锦鲤鱼机体已受到氧化胁迫，1 5 d 和1 8 d 时，m d a 含量显著低空白对照组( 0 0 l p 0 0 5 ) ，说明机体发生了脂质过氧化反应。 比较几种生化指标的敏感性发现，s o d 、m d a 可以作为推荐生物标志物评价抗 生素废水和抗生素菌渣对水生生物的污染胁迫影响。 关键词抗生素废水：菌渣：斑马鱼，锦鲤鱼；急性毒性；亚急性毒性 a b s t r a c t l 啦eq u 觚t i t ) ro f a n t i b i o t i cw 弱t e w a t e rw 嬲d i s c h a 唱e d 觚dl a 唱ea m o u n to fa n t i b i o t i c b a c t e r i a 聆s i d u ew 嬲p r o d u c e di i lt l l ep r o c e s o fa n t i b i o t i cp r o d u c t i o n t h e ym a y b ep 6 s ea 妒e a t r i s ka n dt l i e p o t e n t i a li i l l p a c t f o r a q u a o 唱a n i s m s d i f f i c u l tt o p r e d i c tb y b i o c o n c e n l r a t i o n ，l ef o o dd l a i na 1 1 do t l l e rs e c t o r s t h ee 丘色c t so fa n t i b i o t i cw a s t e w a t e r ( e m u e n to fp e m c i l l i n 趾do x ”e t r a c y c l i n e ，i n n u e n ta n de m u e n to fs 仃e p t o m y c i n ) a n d 锄t i b i o 矗cb a c t e r i a 北s i d u e o n 压6 ，彰渤a i l d ( 妇，加淞伊f d 、e r em e 船u r e db y c o n s i d e r i n gan 眦b e ro fp a r 锄e t e r si n c l u d i n g 锄t i o x i d a n te n z y m ea c t i v i t i e sa n dl i p i d p e r o x i d a t i o n t h e 矗a 洫r e s e a r c hr e s u l t sa r e 嬲f o l l o w s ： t h e9 6 hl c 5 0v 甜u e so fm ee m u e n to f p e n i c i l l i na i l do x y t e t r a c y c l i n et 0 乙6 饱加厅a i l j 0 矿胁淞伊面i s1 1 0 l 吼d1 2 9 6 ，r e s p e c t i v e l y e x p o s u r et oe 御u e n to fp e n i c i l l i na 1 1 do x ”e t r a c y c l i n ea td i 髓r e n tc o n c e n 僦i o n s ， s o da c t i v i 吼m d ac o n t e n ti l l 乃6 ，| 班 m u s c l es h 0 、v e dd e c r e 懿e i n c r c a s e d e c r e 缎el a w e x p o s u r et 0l 49 6 hl c 5 0g r o u p ，s o d t i v i t ) ，w 弱i n l l i b i t e ds i g l l i f i c 鲫n ya t4 d ( p 0 o1 ) e x p o s e dt 0l 1 69 6 hl c 5 0g r o u p ，m d ac o n t e n tw 嬲h i 曲e rs i g l l i f i c 锄t l y 廿l 锄c o n 们la l8 d ( p o o1 ) b o t l ls o d 觚dc a l rl e v e l si nc 功，伽淞c 口伊f dl i v e rf i r s ti n c r e a s e da n dt h e n d e c r e 嬲e d s o da c t i v i t ) ri n d u c e ds i g n i f i c a n t l y ( o o l p 0 0 5 ) a t8 d ，m e a n w h i l ec a t a c t i v i t yi i l l l i b i t e ds i g n i f i c a n t l ya t1 0 d ( 0 0 1 p o 0 5 ) w h e nc 功，加淞c 口伊f de x p o s e dt ol 4 9 6 hl c 5 0 p o dl e v e l i n0 矿拥郴印f dg i l lf i r s td e c r e a s e d 觚dt h e ni i l c r e a s e da n dm d a c o n t e n ti n 铆一以淞c 叩幻s h o w e di n c r e a l s e d e c r e 嬲e - i n c r c 鹊el a w m d ac o n t e n tw 够 l l i 曲e rs i 鲥f i c 趴t l y ( p 0 o1 ) t 1 1 锄c o n 仃o la t4 da n d10 d ，m e 锄w h i l ep o dl e v e l i n h i b i t e d s i g l l i f i c 锄t l y ( o 0l p o 0 5 ) a t6 de x p o s e dt 0 l 49 6 hl c 5 0 n e r e f 0 陀，s o d 觚dm d a l e v e lw e 他m em o 心s e n s i t i v em a s u r e dp a r a i t l e t e r sa n d m a yb eu s e d嬲p o t e n t i a l b i o m 址e r sf o re 用u e n to fp e n i c i l l i na n do x ”e 们c y c l i n ee x p o s u r e t h e9 6 hl c 5 0v a l u e so ft 1 1 ei n f l u e n to fs t r e p t o m y c i nt 0z 匆6 协j l l 觚d ( 刁垆，加螂c 口印妇 i s2 7 5 3 a n d41 4 5 ，r e s p e c t i v e i y s o d t i v i t y p o da c t i v 时锄dm d a c o n t e n tm 乃6 ，口加矗m u s c l es h o w e dd e c r e 硒e - i n c 嬲e d e c r e 勰el a ww h e nt 1 1 ef i s hw 懿e x p o s e dt om ei n n u e n to fs 仃印t o m y c i n s o d 蚰d p o dl e v e l sw e r ei i l i l i b i t e d s i 鲥f i c 觚t l y ( 0 01 p 0 0 5 ) ，m d ac o n t e n tw a sl l j g l l e r s i 嘶f i c a n u yt l l 姐c o r l 仃0 l ( 0 0 l p o 0 5 ) a t1 5 da t 觚e x p o s u r el e v e lo fl 29 6 hl c 5 0 s o d t i v i t ) ，o f ( 枷加淞唧胁l i v e rs h o 、e di i l c r e 弱e d e c r e 勰e - i i l c 他嬲e - d e c r e 嬲el a w u p o n c x p o s u 坞t ol 29 6 hl c 5 0 ，s o da c t i v i t ) rw 鹪i n h i b i t e ds i g i l i f i c 觚t l ya t2 4 d 觚d2 8 d i 河北科技大学硕士学位论文 0 0 1 ) p o d a c d v 时 i n o 矽拥淞c 口印如 g i l l s h o w e di n c r e 勰e - d e c r e a s e i 1 1 c 他硒e - d e c 陀嬲el a w 锄dmi ) ac o n t e n tf i l 妞d e c r e 勰e da n dm e ni l l c r e 勰e da i l dd e c r e 硒e d a ti a s t p o dl c v e li l l d u c e ds i 嘶f i c 觚t l y ( 0 0 l p o 0 5 ) a t 1 2 d 锄d1 6 d 觚dm d a c o n t e n t w 勰l l i g h e rs i g n j 丘c a n 廿y ( 0 0l p 0 0 5 ) t h 锄c 0 i l t r o la t2 0 d 、7 l 植c hi i l d i c a t et 1 1 ef i s ha r e e x p o s e dt 0p o i l m e d 聊l 把灿d y 锄d t 1 1 eb o d yw 嬲d 锄a g e d s o da n dp o da c t i v 蚵i n 岔6 吲洳m u s c l ei i l h i b i t e ds i 鲥f i c a n t l y ( o 01 p 0 0 5 ) a t 9 6 ha t 锄e x p o s u r cl e v e lo flo o a n d 汕i b i t e dm o r e 、i t i lt t l ec o n c e n 仃a t i o ni n c r e a s i n g e x p o s i n gt 0m ee m u e n to fs 廿e p t o m y c i n c o m p a r e dv v i 也吐忙c o n 仃o lg r o u p ，m d ac o n t e n t w a ss i 鲥f i c a n n yl o w e rf o re a c hc o n c e n 仃a t i o ng r o u p ( o 0l p o 0 5 ) s o da n dc a tl e v e l s i n 劬加。心c 讲矽幻百l lw e r ci i l d u c e ds i g i l i f i c a n t l y ( p o o1 ) w k l ei r l l l i b i t e dm o r e 、析t 1 1i t s c o n c e n 仃a t i o ni i l c r e a s i n g p o da c t i v i 妙w 2 u si n d u c e db u ti td e c r e a s e dw i t l li t sc o n c e n 仃a t i o n i n c r e a s i n g r - a o cl e v e lw 嬲1 0 w e rs i 盟i f i c a j l t l yt l l a nc o n 仃0 l ( p o 01 ) ，、v h i c hm e a n si t d e c r e a s e m d ac o n t e n tw 雒s i g n i f i c a n t l yh i g h e rt 1 1 a nc o n t r o l ( o o l p 0 0 5 ) t 1 1 e r e f o r e ， s o da n dm d a 、v e r em em o r es e n s i t i v ep a r a m e t e r s 锄dm a yb e u s e d 嬲p o t e n t i a l b i o m a r k e r sf o rt 1 1 ei n n u e n to fs 仃c p t o m y c i ne x p o s u r e n od e a t l lw h e nz e b r 娟s he x p o s e dt ol0 0 s u p e 删o fs 唧t o m y c i nb a c t e r i a r e s i d u e 心e r9 6 址w l l i c hs h o 、e d 吐l a tt 1 1 e r ew 弱n o ta c u t et o x i c i t ) ，f o ri tt 0z e b r a f i s h s o d a c t i c 毋 a n dp o d a c t i v 蚵 i n 压6 ，咖厅 m u s c l es h o w e dd e c r e a s e i n c r e a s e - d e c r e 嬲el a we x p o s i n gt ot h es u p e m a t a n to fs t r e p t o m y c i l lb a c t e r i ar e s i d u e ，w h i l e m d ac o n t e n ti i l 乙6 相渤m u s c l es h o w e di n c r e a s e d e c r e 懿e i 1 1 c r e a s e d e c r e a s el a w u p o n e x p o s u r et 05 0 ，s o da c t i v 时w a si n h i b i t e ds i 鲥f i c 觚n ya t9 d 锄d12 d ( o ol 四环素( 2 2 5 “g l ) 氯四环素( 3 4 9 p g l ) 氟诺沙星( 5 “i l g l ) 磺胺甲恶唑( 7 5 0 p g l ) 环丙沙星 ( 2 0 2 2 肛g l ) 磺胺二甲嘧啶( 3 1 2 6 p 鲥【1 4 j 。 p o m a t i 等【1 5 】研究了几种抗生素在浓度1 1 0 0 0 “g l 时，对集胞藻 ( s y n e c h o c y s t i s ) 和浮萍( l e r 皿am i n o r ) 生长的影响，红霉素、四环素、异丁苯丙 酸对l e 砌a7 d 的e c 5 0 分别为5 6g l 、1 og l 和4 0 9 l 。 依据0 e c d2 0 1 准则藻类生长抑制测试( 0 e c d ，1 9 8 4 ) ，f e 玎e i r a 研究了四 环素对扁藻的生长抑制情况。通过9 6h 暴露，在四环素浓度大于5 3 m g l 溶液中， 扁藻的生长受抑制显著。最低无抑制浓度( n o e c ) 值为3 6 m g l ，最低影响浓度( l o e c ) 值为5 3m g l ，7 2h 及9 6hi c 5 0 值分别为1 3 1 6 ( 9 5 置信区间为：1 0 2 4 1 8 8 9m g l ) 和1 1 1 8m g l ( 9 5 置信区间：8 3 9 一1 5 8 4m g 几) 1 川。 1 3 3 对水生动物的影晌 s a n d e r s 0 n 等采用定量结构活性关系和水生生态毒理学试验数据，评价了2 2 6 种抗生素的生态危害。结果表明，1 6 的抗生素对大型潘极毒( e c 5 0 o 1m 幽， 4 4 为非常毒( e c 5 0 大型潘，四环素的毒性明显低于金霉素【2 。根据毒性分 级标准判定，四环素对3 种水生生物均属低毒，金霉素对大型涵属低毒，对于斑马 鱼和鲫鱼则属中毒。 曲甍甍等【2 2 j 对斑马鱼暴露于土霉素的急性毒性和对鲫鱼肾细胞d n a 损伤进行 了试验。急性毒性试验表明，土霉素对斑马鱼9 6 hl c 5 0 为1 3 4 1 7 6 4m l 。彗星试验 结果表明，土霉素能引起d n a 较大损伤，与阴性对照相比均有极显著性差异。土霉 素在所设的浓度范围，对鲫鱼肾细胞产生较大的d n a 损伤，这表明土霉素可能有一 定的基因毒性。 用水生毒理学方法测定青霉素、硫酸庆大霉素对红剑鱼、孔雀鱼的2 4h l c 5 0 ， 结果表明，青霉素对红剑鱼、孔雀鱼的2 4l l l c s o 值分别为2 6 7 6 8m l 和3 1 9 9 9m l ；硫酸庆大霉素对红剑鱼、孔雀鱼的2 4 l l l c 5 0 值分别为5 7 5 0 m l 、6 4 1 4 m l 。 孔雀鱼对青霉素、硫酸庆大霉素的敏感性小于红剑鱼1 2 引。 梁惜梅等评估了诺氟沙星( n o m o x a c i n ，n f l ) ( ) 对剑尾鱼的急性毒性及其肝脏谷 胱甘肽硫转移酶( g s t ) 、丙二醛 d a ) 、过氧化氢酶( c a d 及7 一乙氧基异吩恶唑酮 脱乙基酶( e r o d ) 活性的影响。结果表明，n f l x 对剑尾鱼的毒性属于低毒。n f l x 的暴露浓度为5 m g 几时，g s t 和c a ：r 均被最大程度的诱导。随着n f l x 暴露浓度的 增加，g s t 和c 衄呈现出先诱导后抑制的典型“钟型曲线”变化规律，而m d a 含量 ：和d 活性则逐渐增加。其中，m d a 和e r o d 较为敏感，适合作为n f l x 暴露 的生物标志物洲 聂湘平等i 巧j 测试了抗生素药物盐酸环丙沙星( c i pr o n o x i i l 蛳h l o r i d e ，c p ) 4 第l 章绪论 对剑尾鱼枥b 嘶d ，淞 p 如哟的急性毒性及其对代谢酶活性的影响。结果表明， c p f x 对剑尾鱼无急性毒性，c p f x 对剑尾鱼肝脏还原型谷光苷肽( g s h ) 、谷光苷 肽硫转酶( g s d 和7 乙氧基异吩恶唑酮脱乙基酶( e r o d ) 都存在诱导作用，雌雄个 体在e r o d 的诱导响应有一定的差异性，其中雌性个体e r o d 对c p f x 暴露响应变 化较大。 1 4 生物标志物 t 4 1 生物标志物的定义和分类 随着分子生物学理论和技术的迅速发展，生物标志物研究作为一个崭新的领域 逐渐引起了国内外学者的共同关注1 2 叫。1 9 8 7 年，美国国家科学院首次将生物标志物 定义为由生物体或样品可测出由外来化合物导致的细胞学或生物化学组分或过程、 以及结构或功能的变化【2 7 1 。b e n s o n 等【2 s 】认为生物标志物是在生物个体所测得的生物 化学、生理学或病理学反应，而这些生物学反应能给出环境污染物的暴露，或由暴 露所引起的亚致死效应资料。 生物标志物是研究污染物与不同层次生物组织的反应，并用所产生的影响来反 映污染物的作用。生物标志物可衡量环境污染物的暴露及效应的生物反应，是生物 体受到严重损害之前，在分子、细胞、个体或种群水平上因受环境污染物的影响而 产生异常变化的信号指标，可以用于环境污染的探查和快速筛选以及环境健康的风 险性评价。通过生物标志物不仅能了解污染物在时间和空间上的累积效应，而且可 确定环境污染物暴露和风险的对应关系。另外，通过生物反应的特异性，可从机理 上了解污染物对生物体的危害，并表现混合污染物之间毒性相互作用的联合效应1 2 9 j 。 生物标志物具有特异性、可操作性、预警性、广泛性和稳定性等特点【3 0 】。根据 基因型和表型的特点，生物标志物可分为基因型生物标志物和表型生物标志物，基 因型生物标志物包括基因类型及突变型、d n a 多态性、d n a 加合物等；表型生物标 志物包括蛋白质、脂质、多肽、糖类和其他在体液和血清中可检测到的特异分子。 根据致病因子作用于机体的过程，生物标志物可分为接触生物标志物、敏感性生物 标志物和效应生物标志物3 类。接触生物标志物指示生物体对污染物的暴露，即污 染物所引发生物体的反应，此类生物标志物有助于研究环境中化学分析方法很难监 测到的不稳定化合物的暴露，但不能指示污染物对生物的毒性效应。敏感性生物标 志物指示生物个体对污染物的敏感性。效应生物标志物指示污染物对生物体健康状 况的损害效应，例如指示d n a 损伤的d n a 加合物【3 1 1 。确定污染物的生物学效应的 生物标志物很多，从最简单的如体重变化至复杂的如采用免疫化学技术测定特定同 功酶。效应生物标志物在环境毒理学中具有更重要的作用，它可以解释污染物毒性 效应的分子反应机理【3 2 1 。 河北科技大学硕士学位论文 1 4 2 常用于环境污染监测的生物标志物 生物标志物由于不仅能提供污染物质的环境水平，更能够反映生物体的生化反 应，引起学者们的广泛关注。近年来，分子或细胞水平上的生物标志物作为污染物 暴露和毒性效应的早期预警指标受到广泛关注，并已成为国内外生态毒理学研究的 热点之一。目前人们对污染物胁迫造成的分子与细胞生理影响机制研究逐步深入， 主要针对重金属、有机农药、苯类、o c s 、多环芳烃( p a h s ) 、多氯联苯( p c b s ) 和 p c d d f s 类污染物等污染物，而对于硝基芳烃化合物的研究则较少。国外学者研究 了牡蛎、蛤蜊、扇贝、鳗鱼等海洋水生生物肝脏的抗氧化酶活性、丙二醛、d n a 加 合物等，如s o d 、c a t 、g s h p x 活性与生物体组织内有机化合物浓度的相关性，并 证实了生物标志物反映出来的问题与物理化学实验所反映的同一位置水质恶化的情 况一致【3 3 】。 1 ) 酶类生物标志物 酶活性的改变是反应生物体生理变化的一项灵敏指标。当生物体暴露于污染的 环境中时，其体内的生理生化反应在产生致死甚至半致死效应之前就已经发生了明 显的变化，酶的活性或被抑制或被诱导。因此，近年来，生态化学和生态毒理学领 域越来越广泛地把生物体内各种酶学指标作为生物标志物，评价外源物质对受试生 物的生态毒性效应瞰1 。 酶类生物标志物主要有两大类，抗氧化酶类和非抗氧化酶类。抗氧化酶类的生 物标志物主要有超氧化物歧化酶( s o d ) 、过氧化氢酶( c a t ) 、抗坏血酸专一性过氧化 物酶( a p x ) 、谷光甘肽过氧化物酶( g p x ) 和谷光甘肽硫转移酶( g s t ) 等：非抗氧化酶类 主要有7 乙氧基o 型脱乙基酶( e r o d ) 、乙酰胆碱酯酶( a 淝) 、腺苷三磷酸酶 ( a t p a s e ) 、蛋白磷酸酶和混合多功能氧化酶( m f 0 ) 等i j 纠。 经过长期的进化，生物体形成了一套抗氧化防御系统，用以维持体内生理生化 和代谢反应的正常进行。当受到污染物的胁迫时，抗氧化防御系统的酶活性会发生 改变，其改变可间接反映环境中污染物的变化i ) 6 j 。目前，国内外学者对抗氧化酶研 究主要集中于超氧化物歧化酶( s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ，s o d ) 、过氧化氢酶( c a t a l a s e ， c a t ) 、谷胱甘肽过氧化物酶( g l 此l m i o n ep e r o x i d 硒e ，g s h p x ) 等【3 7 ，弼j 。人们认为s o d 是发挥关键性作用的抗氧化物，同时又是高度诱导酶。s o d 可有效清除生物体内的 超氧阴离子自由基，保护细胞免受损伤，而这一过程产生的大量过氧化氢( h 2 0 2 ) ， 可由c a t 和g s h p x 清除，使生物体免受氧化损伤。谷胱甘肽硫转移酶( g s t s ) 是生 物体内重要的解毒酶，可保护d n a 及一些蛋白质免受损伤，而且可与一些难溶于水 的物质如血红素、染料、胆酸和激素等外源或内源的代谢产物结合，使之成为水溶 性化合物排出体外【3 9 l 。国内外学者研究了农药、多环芳烃等有机物质对各种生物的 6 第1 章绪论 潜在毒性，通过测定生物不同靶器官( 消化腺、鳃、生殖腺、血细胞) 的抗氧化酶 ( 谷胱甘肽转移酶、过氧化氢酶、总谷胱甘肽等) ，分析化合物对生物所产生的氧化 应激作用。研究表明，评价暴露于多环芳烃有机污染的鱼类的生物学效应适宜以内 脏中的g | p x 、g s t 、g s h 作为生物标志物；双壳贝暴露于铅的环境浓度时，机体中 的s o d 、c a t 和g p x 活性显著降低。综合多种生物标志物研究河流污染和各种污染 物潜在毒性成为当前的研究热点删。 欧盟水框架指令监测计划中用于潜在生态毒理状态评价的非抗氧化酶类生物标 志物有：7 乙氧基o 型脱乙基酶( e r o d ) 、乙酰胆碱酯酶( a c l l e ) 、氨基乙酰丙酸 脱水酶( a l a d ) 【4 l 】。e r o d 是受烃类诱导的生物转化酶，其对多氯联苯、多环芳烃 和二恶英等化合物比较敏感。有机磷农药对乙酰胆碱酯酶具有特异性抑制作用，是 目前研究最广泛和最成熟的1 4 2 1 。乙酰胆碱酯酶在传导过程中主要分解神经递质乙酰r 胆碱，乙酰胆碱酯酶受到抑制的中毒动物会出现兴奋和痉挛，最后瘫痪或死亡。乙 酰胆碱酯酶受抑制的动态变化，可以用来监测有机磷农药污染的情况。腺苷三磷酸 酶( a 胛a s e ) 是生物体内重要的酶，存在于所有细胞中，在细胞的供能活动如离子平衡 中起着重要作用。已发现多种水生生物包括鱼、乌贼、虾、水生昆虫以及鱼的多种 组织如鳃、脑、肾的多种a r p 嬲e 对不同的污染物均有反应，如有机氯农药、多氯 联苯、金属离子、炼油废水等【4 3 l 。各种生物、各种器官的不同使得污染物对不同生+ 物、不同组织作用程度有差异。 2 、脂质过氧化和d n a 损伤的研究 近年来，随着生物技术的迅速发展，国内外学者对环境污染物毒性的研究已深 入到分子水平，污染物对各种水生动物脂质过氧化和细胞d n a 损伤的研究逐渐增 多。 脂质过氧化是指活性氧自由基攻击生物膜中多烯不饱和脂肪酸( p a ) 而引起 的一系列氧化过程，当生物体受到外源性化学物质进攻时，产生的自由基得不到及 时清除，常会对机体造成损伤。自由基可使不饱和脂肪酸过氧化，分解成丙二醛 ( m d a ) 、共振二烯荧光产物等物质。其中，丙二醛含量可间接反映机体的脂质过氧 化水平及自由基对机体的损害程度，这在多项研究中都有体现1 4 4 1 。吴伟等【4 5 j 研究了 2 ，2 ，4 ，4 ，四溴联苯醚( p b d e _ 4 7 ) 对鲫鱼离体肝脏组织的损伤，m d a 含量的增加表 明，机体组织内产生了一定的脂质过氧化作用，间接反映出组织细胞受到一定的损 伤。聂芳红等嗍首次发现二嗯英能导致斑马鱼肝脏肝脏m d a 含量增加，间接说明 了斑马鱼的机体细胞受到自由基的攻击。此外，二嗯英能参与机体的脂质过氧化作 用，增加哺乳动物包括大鼠等机体0 2 - 的产生，使脂质过氧化的产物如m d a 等增加， 引起抗氧化酶如s o d 、谷胱甘肽过氧化物酶( g p x ) 和过氧化氢酶等活力下降【4 7 】。 c h a r i s s o u 等【4 刚通过分别测定脂质过氧化程度( m d a 含量) 和8 氧代? 7 ，8 二氢2 7 河北科技大学硕士学位论文 脱氧鸟苷( d n a 加合物) 的含量的方法来研究淡水双壳类的细胞膜和染色体组的氧 化损伤。研究发现，对于淡水双壳类贝类脂质过氧化与d n a 氧化损伤并不直接相关， 有必要进一步研究；生物标志物反映出来的问题与物理化学实验所反映的同一位置 水质恶化的情况一致，并证实了利用生物标志物来评估水循环系统水质的灵敏性【4 9 】。 陈伟兴等【5 0 】人采用单细胞凝胶电泳( s c g e ) 方法检测了不同浓度硝基苯染毒后的斑马 鱼肝胰脏、肾脏、鳍条表皮和精子细胞d n a 的损伤情况。研究表明，当水环境中硝 基苯的浓度低于国家地表水环境质量标准时，对斑马鱼的体细胞及精子细胞没有明 显的毒性作用；硝基苯的浓度高于国家地表水环境质量标准时，对斑马鱼的体细胞 和精子细胞具有较强的毒害作用，且细胞d n a 的受损率随着硝基苯剂量的增加而增 加，并呈现一定的剂量损伤效应。 3 ) 其他生物标志物的研究 其他生物标志物的研究包括维生素、氨基酸、应激蛋白h s p 7 0 、金属硫蛋白 ( m t ) 、卵黄蛋白原( v t g ) 和代谢产物等，如：v e 、v c 、半胱氨酸、色氨酸、葡 萄糖等。暴露于我国污水处理厂的日本雄性青鳝鱼，在所有暴露浓度水平下，血浆 中的v t g 被诱导，但是不呈剂量关系1 5 l 】。o z d e nb 撕m 掣5 2 1 研究了暴露于污染物中 淡水小龙虾体内的维生素a 、e 、c 、p 胡萝卜素含量及污染物对小龙虾的氧化胁迫 作用。结果显示，研究不同地点同一性别小龙虾体内的维生素e 、c 、b 胡萝卜素含 量的变化具有统计学意义。金属硫蛋白( m t ) 是一种低分子量的蛋白质，富含半胱氨 酸，与特定金属离子如锌、铜及镉等有高度亲和力，属于重金属污染的专属标志物。 s d v a t o r ef a s u i o 等【5 3 j 对环境污染物对海底生物的影响进行了研究，采用r 1 - p c r 技 术测定m t 、应激蛋白h s p 7 0 及m 融蛆的表达，暴露于污染物中的鱼类，其m t 和 应激蛋白h s p 7 0 的表达水平有所提高。 1 4 3 生物标志物的研究方向 生物标志物技术是一种综合考虑了外界污染源、生物吸收、污染迁移及生物反 应的相互作用体系。该技术当前的研究和应用主要集中在欧美地区，而且处于发展 生物标志物阶段。将生物标志物应用于实际问题的解决是目前的研究热点，也是生 物标志物研究的最终目标，其主要从以下几方面进行研究f 5 4 ，5 5 ，5 6 j ： 1 ) 目前国内外学者对生物标志物研究的热点集中在污染环境中生物体内的分子 水平的生化变化，这些变化常涉及酶活性改变、d n a 分子的变化或蛋白水平的变化。 生物标志物的单项指标可以反映污染物毒性的重要方面，但由于生物标志物的反应 受到环境因素如温度、盐度等【明以及生物体自身特点如年龄和体质等的影响【5 引，因 此需要应用多种生物标志物的反应对环境污染物产生的压力进行诊断。自从l9 9 8 年 意大利v i g 撇等【5 9 】提出同时用几种标志物进行检测，以减少研究结果的模糊性和误 8 第l 章绪论 导性后，研究者们更重视利用多项分子生态毒理学指标综合评价有毒化合物的生物 毒性，以提供更多信息和更可靠的数据删。所以，建立各类污染物的特定多指标检 测体系是生物标志物研究的主要任务之一。 2 ) 生物标志物对各种污染物的敏感性不同，而且不同生物体以及不同器官、组 织的敏感生物标志物也不同，所以需要建立相关污染物的敏感生物标志物体系，并 试图找出生物标志物与污染物间的剂量效应关系。 3 ) 在实际环境中，生物有机体主要暴露于复合污染物而非单一化合物，研究复 合污染暴露体系下生物标志物效应，将会大大提高生物标志物在指示实际环境中暴 露和效应的准确性和灵敏度，使生物标志物检测能更准确地反映真实的环境状况。 4 ) 生态系统中各指标的变化趋势和相互关系、生物标志物在野外真实环境的早 期诊断和生态风险评价的应用以及污染物的微观致毒机理也是目前需要加强的研究 方向。 1 5 研究的内容 1 5 1受试物种的选择 在水生毒理学研究中，所选择的受试生物一般具有如下特点： 对受试物敏感； 具有代表性，且具有一定的经济或生态价值； 应在最终传递到人的食物链上； 分布广泛，来源丰富，且取材方便； 体型小，性成熟时间短【6 1 1 。 1 5 2 研究内容 本课题以典型抗生素废水( 青霉素和土霉素综合废水) 和菌渣( 链霉素菌渣) 为研究对象，采用室内实验方法，利用化学、生物学的方法和技术，重点研究抗生 素废水和菌渣对鱼体急性毒性、亚急性毒性的影响，具体研究内容如下： 1 ) 青霉素和土霉素综合废水和链霉素菌渣对试验鱼的预实验研究：筛选抗生素 废水和菌渣对锦鲤鱼、斑马鱼的急性毒性浓度范围，计算2 4 h l o o 死亡浓度( 2 4h l cl 曲和9 6 h 无死亡浓度( 9 6 l l l c 0 ) 。 2 ) 青霉素和土霉素综合废水和链霉素菌渣对试验鱼的急性毒性研究：即研究青 霉素和土霉素综合废水和链霉素茵渣对锦鲤鱼、斑马鱼的急性毒性水平，计算 2 4 l l l c 5 0 、4 8 l l l c 5 0 、7 2 i l l c 5 0 、9 6 i l l c 5 0 ，获得衡量青霉素和土霉素综合废水和链霉素 茵渣急性毒性大小的基本数据。 3 ) 青霉素和土霉素综合废水和链霉素菌渣对试验鱼抗氧化指标( s o d 、p o d 、 河北科技大学硕士学位论文 c a lm d a 、i 认o c 、g s h g s s g 等) 的影响：采用水生动物体内试验方法，低剂 量短期和长期暴露方式，研究青霉素和土霉素综合废水和链霉素菌渣对鱼体抗氧化 指标的影响，通过实验研究和数据分析，筛选比较敏感的生物标志物和鱼种，以评 估抗生素废水和菌渣对生物潜在的负面影响。 1 5 3 研究方法 本实验采用斑马鱼和锦鲤鱼作为受试生物。斑马鱼( 历6 ，口加协是一种亚热带淡水 鱼类，体小、卵大，繁殖周期短，在毒性实验的应用上具有明显的优势，并于上世 纪8 0 年代被国际标准化组织推荐为毒性试验的标准实验用鱼，同时斑马鱼也被经济 合作开发组织【6 2 】的指导手册列为了健康毒性和环境毒性检测实验的标准鱼类。锦鲤 鱼作为鲤鱼的一个变异种，是鲤科常用的一种试验用鱼，它具有以下优点：生命力 强，体型小，食杂性，饲养成本低。锦鲤鱼作为鱼类试验材料目前在国际上已有较 广泛的应用。 本课题包括青霉素和土霉素废水，链霉素废水，链霉素菌渣等毒性试验，每个 受试物的实验时间为3 个月，每种抗生素废水和菌渣的毒性实验又大体上分为两个 阶段：急性毒性实验以及亚急性毒性实验。抗生素废水和菌渣试验方案总体设计见 表1 2 。急性毒性试验的安排见表1 3 ，亚急性毒性试验的设计见表1 _ 4 。 表l - 2 抗生素废水和菌渣试验方案总体设计 l o 第l 章绪论 表1 3 急性毒性试验 研究受试物大荆量给予受试生物后，在短时间内所引起毒性作用的过程。获得受试物急性毒性 实验目的 大小的基本效据，为后续暴露实验提供数据 实验仪器溶解氧测定仪水硬度计，温度控制仪。酸度计分析天平。2 0 l 玻璃水族缸数只，曝气装置 预实验：结合查阅文献资料，确定预实验的浓度范围不设平行组实验持续9 6 h ，每日至少 两次记录各容器内的死鱼数，并及时取出死鱼，2 4 小时换一次试液正式实验：根据预实验得 实验步骤 出的结果，在2 4 h 鱼全部死亡的最低浓度( 2 4 h l c 啪) 和9 6 h 鱼全部存活的最高浓度( 9 6 h l c o ) 之间按等对数间距设置5 个浓度组，每个试验浓度组设2 个平行，同时设空白对照组和助溶剂 对照组 预实验：8 一l o 个浓度组，静态方式不设平行，每组6 尾鱼；正式实验：5 个浓度组，每组设 剂量分组 2 个平行和空白对照对照，每纽8 尾鱼 预实验：2 4 h 鱼全部死亡的最低浓度( 2 4 h l c i ) ；9 6 h 鱼全部存活的最高浓度( 9 6 h l c o ) 实验结果正式实验：2 4 h 、4 8 h 、7 2 h 、9 6 h 时的每个浓度的累积死亡率；2 4 h 、4 8 h 、7 2 h 、9 6 hl c 如 及其9 5 的置信限鱼的异常反应 实验控制按急性毒性实验的要求严格控制实验条件 测定指标 测定p h 值、溶解氧、温度、受试物浓度 实验结果分用寇式法和概率单位法分别计算2 4 h 、4 8 h 、7 2 h 、9 6 hl c ，并计算此受试物的9 蹴置信限 析实验结果毒性分级评价 表l - 4 亚急性毒性实验 实验目的 在急性毒性实验基础上进一步观测受试物在低剂量作用的条件下。对机体的抗氧化酶的 影响 实验仪嚣 u v 2 5 5 0 紫外可见分光光度计、酶标仪、微量移液器、台式冷冻高速离心机、电子天平、 电热恒温水浴锅、玻璃匀质器 染毒方式 长期暴露实验( 2 8 d ) l5 个剂量组，4 d 、蹦、1 2 d 、1 6 d 、2 0 d 、2 4 d 、2 8 d 取生物样，进行 分析 1 l 河北科技大学硕士学位论文 剂量分组 根据测定的抗生素废水和菌渣对鲤鱼的急性毒性数据9 6 h “值，再分别配镥 9 6 h l c l 弘i ，2 的抗生素废水菌渣溶液设置5 个浓度梯度，外加空白对照组 观察与检测项目 生化指标( 鲤鱼肝脏的s o d 、p o d 、c a t 酶活力，似o c 的变化以及m d a 的变化) 实验结果 不同染毒剂量组s o d 、p o d l l 0 a t 酶活力，a o c 的变化以及m d a 的变化 实验关键 实验生物的选择、喂饲、环境条件的控制等 测定方法 用u v 2 5 5 0 紫外可见分光光度计、酶标仪测定 实验结果统计分析采用计算机统计软件s p s s l l 5 进行统计分析 1 2 1 6 技术路线 _ _ - - - - - - 一 1 3 河北科技大学硕士学位论文 第2 章斑马鱼和锦鲤鱼暴露于青霉素和土霉素综合 废水出水的毒性试验 2 1 青霉素和土霉素综合废水出水对斑马鱼和锦鲤鱼预试验和急 性毒性试验 急性毒性指实验生物一次或在9 6 h 内多次摄入( 接触) 较大量受试物质后在较 短时间内对机体产生的毒性作用，是用来判断污染物毒性的简便而快速的方法。对 于急性毒性试验而言，死亡是最容易是别的生物受损表现，且在摄入( 接触) 较大 剂量受试物时最容易发生，所以常常根据导致死亡的污染物水平( 浓度、剂量) 比 较受试物的毒性。目前，水生生物急性毒性试验是评价环境污染物毒性的重要手段， 对于控制工业废水排放而言是一种常规的监测方法。在急性毒性试验中，一般采用 半数致死剂量或半数致死浓度( l d 5 0 或l c 5 0 ) 来表示受试物的急性毒性大小1 6 3 1 。 2 1 1 材料和方法 ( 1 ) 试验生物选用1 龄锦鲤鱼( o 伊，抑螂c 口伊f d ) 和斑马鱼( 乙6 ，咖办) 成鱼为受 试生物，由石家庄市槐底花鸟鱼虫市场提供，锦鲤鱼体长为( 5 0 3 7 士0 1 8 ) m m ，体重为 ( 1 9 2 士0 - 2 1 ) g ，斑马鱼体长为( 3 2 1 3 士o 13 ) m 瑚，体重为( o 2 9 士o 0 8 ) g ，实验鱼经5 食盐 水消毒后进入实验室，用4 8 h 曝气的脱氯自来水在实验室驯养7 d ，在试验前一天和试 验期间不予喂食，避免鱼饵对实验产生影响。 ( 2 )仪器设备f e 2 0 型实验室p h 计，梅特勒托利多仪器( 上海) 有限公司； j p b j 一0 8 型便携式溶解氧测定仪，上海精密科学与仪