（环境科学专业论文）ams研究无铅汽油添加剂mtbe及tba与体内生物大分子的化学作用.pdf

剂量下明显小于m t b e 的加合，且修复时间也较快，这说明m t b e 加合主要不 是通过t b a 途径，而是通过另一甲醛( h c h o ) 代谢途径。另外，参考北京大 学a m s 研究组最近有关h c h o 在体内快速氧化的产物甲酸( h c o o h ) 与d n a 的加合研究，讨论了h c o o h 与d n a 链戊糖5 一o 作用，并使得d n a 链戊糖 5 - c 一甲酰化的加合机理。 更为重要的是，进一+ 步认识到测得的m t b e 加合值，很可能有相当大的一 部分，并非束自上述的h c o o h 的加合，而是来自h c o o h 以单碳途径参与嘌 呤和嘧啶的合成，直接掺入d n a 。为证实此假设，深入的工作正在继续进行中。 关键词：甲基叔丁基醚( m t b e ) ，叔丁醇( t b a ) ，加速器质潜( a m s ) ，d n a 加合物，血红蛋白( h b ) 加合物，白蛋白( s a ) 加合物 中图分类号：x 5 0 3 2 2 c h e m i c a lr e a c t i o no fl e a d - f r e eg a s o l i n ea d d i t i v e sm t b ea n dt b a w i t hb i o l o g i c a lm a c r o m o l e c u l e s nv i v os t u d i e db ya m s a b s t r a c t t h ea d d i t i o no fo x y g e n c o n t a i n i n gc o m p o u n dt og a s o l i n em a yr e m a r k a b l y i n c r e a s et h ea n t i k n o c ka b i l i t ya sw e l la st h eb u r n i n ge f f i c i e n c yo fg a s o l i n ef o rt h e l i g h td u t yv e h i c l e s h e n c e ，t h a tr e d u c e st h ee x h a u s te m i s s i o no fc o ，0 3a n dv o l a t i l e o r g a n i cc o m p o u n d s ( v o c s ) a n dg r e a t l yi m p r o v e st h ea i rq u a l i t yi ne n v i r o n m e n t b e c a u s em e t h y l ， t - b u t y le t h e r ( m t b e ) p o s s e s s e ss o m em a r k e dm e r i t s ，s u c ha sl o w c o s t ，g o o dm i s c i b i l i t y w i t hg a s o l i n e ，l o wv a p o rp r e s s u r ea n db o i l i n gp o i n ti n b l e n d i n ga n de a s yp r o d u c t i o na n dt r a n s p o r t a t i o n ，n o w a d a y si th a sb e e nam o s t w o r l d w i d eu s e dg a s o l i n ea d d i t i v es u b s t i t u t i n gf o rt h el e a d c o n t a i n i n ga n t i - k n o c k a d d i t i v ef o rt h el i g h td u t yv e h i c l e s t e r t - b u t y la l c o h o l ( t b a ) i ss o l u b l ei no r g a n i c s o l v e n t w h i l eb l e n d i n gw i t hm e t h a n o li tc a na l s ob eu s e da sa l la d d i t i v et oi n c r e a s e t h eo c t a n ev a l u eo fg a s o l i n e i ti sn o t e dt h a tt b ai so n eo ft h ei nv i v om e t a b o l i t e so f m t b e i nt h e p r e s e n tt h e s i s ，w er e p o r tt h e d o s er e s p o n s ea n dt i m ec o u r s eo ft h e a d d u c t i o no fm t b ea n dt b aw i t ht h eb i o l o g i c a lm a c r o m o l e c u l e s ，d n aa n d p r o t e i n s a tt h em o l e c u l a rl e v e l u s i n g t h eu l t r a s e n s i t i v ea c c e l e r a t o rm a s s s p e c t r o m e t r y ( a m s ) t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t s a r ep r e s e n t e di nf o u r i t e m sa s i b l 】o w s ： 1 t h em t b e d n aa d d u c t si nm o u s el i v e f f l u n g k i d n e yw e r em e a s u r e dw i t ha m s w e f o rt h ef i r s tt i m e o b s m w e dt h ed e f i n i t ea d d u c t i o no fm t b ew i t hd n ao f m o u s el i v e r 1 u n ga n dk i d n e yi nap o s i t i v e d o s e r e s p o n s er e l a t i o n s h i p i n a d d i t i o n ，ag o o dl i n e a rc o r r e l a t i o nb e t w e e nt h el i v e r l u n g k i d n e yd n aa d d u c t s l e v e lw i t hh b ( h e m o g l o b i n ) a d d n c t sl e v e lw a so b s e r v e d t h u s ，w es u g g e s t e d t h a tm t b e h ba d d u c t sc o u l db eag o o ds u r r o g a t eo fm t b e d n au s e da sa b i o m a r k e rf o rm t b ee x p o s u r e b e s i d e s ，m t b e s aa d d u c t sc o u l da l s ob eu s e d a sab i o m a r k e rf o rm t b ee x p o s u r e 2t h et i m ec o u r s eo f t h em t b e d n aa d d u c t so f m o u s el i v e r l u n gw a sm e a s u r e d t h em t b e d n aa d d u c t sj e v e 】j nl i v e r l u n gp e a k e da ts e v e r a 】hp o s td o s i n g a t i e rt h a tt h ec o n c e n t r a t i o nd e c r e a s e dr a p i d l yu n t i l5d t h e nd e c l i n e ds l o w l y r j h e d e c a yo fa d d u c t si m p l i e st h a tt h em t b e d n aa d d u c t sc a n b e p a ty e l i m i n a t e db x l h ed n a r e p a i r 3t h et b a d n aa d d u c t si nm o u s el i v e r t u n g k i d n e yw e r es t u d i e db va m s t b a d n aa d d u c t si nl i v e r l u n g k i d n e yw e r ed e f i n i t e l yf o r m e dw i t hp o s i t i x ，e d o s e r e s p o n s er e l a t i o n s h i p a tt h es a m ed o s e s m t b e - d n aa d d u c t sl e v e l sw e r e m u c hh i g h e r ( 1 - 2o r d e ro f m a g n i t u d e ) t h a nt h a to f t b a d n a 4 t h et i m ec o u r s ec u r v eo ft h ef b a d n aa d d u c t so fm o u s el i v e r l u n gw a s m e a s u r e db va m s t b a d n au d d u c t si 1 3 】i v e rp e a k e da ti2h t h e nd e c l i n e d u n t i l1da n dk e p ti nas t e a d y1 e v e l ，na l s oi n d i c a t e st h a tt b a d n aa d d u c t sc a n b ep a r t l ye l i m i n a t e db yd n a r e p a i l _ t h er e a c t i o nm e c h a n i s mo fm t b ea n dt b aw l t hm a c r o m o l e c u l e si s p r e l i m i n a r i l y d i s c u s s e d t h e l a r g e d i f f e r e n c eb e t w e e nt h ea d d u c t s1 e v e lo f m t b e d n aa n dt h a to ft b a d n aa tv a r i o u sd o s e si n d i c a t e st h a tt h ep r e d o m i n a n t r o u t eo fa d d u c t i o ni sn o tv i at b a ：b u ta n o t h e rr o u t ef o r m a l d e h y d e w h i c hi s e n z y m a t i c a l l y o x i d i z e dt oh c o o hi nv i v o q u i c k l y r e f c r r e dt ot h er e c e n l e x p e r i m e n t a lr e s u l t so ft h eb i o - a m sg r o u p ，p k uo nt h ea d d u c t i o no fd n aw i t h h c 0 0 h ，w es p e c u l a t et h a tt h ea d d u c t i o nm e c h a n i s mo fm t b eo n t od n a i sm a i n l y v i ac o v a l e n tf o r m y l a t i o no f5 - o s i t eo np e n t o s eo f n u c l e o t i d e m o r ei m p o r t a n t l y ，w en o t ef u r t h e rt h a tt h em e a s u r e dm t b e d n aa d d u c t sa r e n o ta l lr e s u l t e df r o mt h ea d d u c t i o no l 、h c o o h ( m e t a b o l i t eo ff o r m a l d e h y d e ) o n t o d n a ，b u tr e s u l t e di nal a r g ep o r t i o nf r o mt h ei nv i v oo n e c a r b o np a t h w a ys y n t h e s i s o fp u r i n ea n dp y r i m i d i n ef r o mh c o o h ，h e n c ee n t e r i n gd n am o l e c u l e sd i r e c t l y f o rp r o v i n gt h eh y p o t h e s i s ，t h ei n t e n s i v ee x p e r i m e n t a lw o r ki so n g o i n g k e yw o r d s ：m e t h y lt e r t b u t y le t h e r ，t e r t b u t y l a l c o h 0 1 b i o a c c e l e r a t o rm a s s s p e c t r o m e t r y ，d n aa d d u c l s ，h e m o g l o b i n ( h b ) a d d u c t s ，s e r u ma l b u m i n ( s a ) a d d u c t s 中图分类号：x 5 0 3 2 2 论文指导小组专家名单 唐孝炎教授 刘元方教授 陈立民教授 周祖铭教授 第一一童引言 第一节世界各目汽油无铅化避翟 第一章引言 第一节世界各国汽油无铅化进程 长期以来，四乙基铅 p b ( c 2 h 5 ) a 由于成本低、来源广、抗爆性好，它 满足了发动机高压缩比对汽油高辛烷值的要求，在全世界得到了广泛的应用。 但随着汽车工业的发展，机动车尾气中铅排放量增加，造成了火气的铅污染。 自四乙基锚抗爆剂应用于车剧汽油以来，经汽油燃烧排放进入大气的铅已达数 百力吨，大气中8 0 的铅来源于含铅汽油的尾气排放( g a g h a t e ，1 9 9 9 ) 。城市 和公路两侧是铅污染比较严重的地区，研究表明，公路边土壤中销含量可达1o o 一5 0 0 m g k g 。 钳是一种对人体尤其中枢神经系统有害的重金属元袭，严重影, i 自j l 童的智 力发育。铅颗粒还会吸附在催化剂表面，使净化汽车尾气用的三元催化转化器 中的铂、钯和铑等贵金属催化剂发生“中毒”，从而使净化效率大幅度降低，且 冠著地缩短转化器的寿命，阻碍了汽车净化尾气装置的应用( 王建昕，2 0 0 1 ) 。 为减少和控制铅污染，美国、日本等工业发达国家早在上个世纪7 0 年代后 期即开始实施汽油低铅化和无铅化。美幽存1 9 7 3 年1 2 月6 日宣布丌始实施逐 步淘汰含铅汽油的战略，经过二卜多年的努力，含铅汽油从1 9 9 6 年1 月起已从 美幽市场消失。日本于1 9 7 2 年开始汽油无铅化进程，1 9 8 7 年普通和优级汽油 已全部不加四乙基铅，成为世界上完全实现汽油无铅化最早的幽家。欧洲各国 对汽油限铅的态度不一，但目前汽油无铅化的进程也在加速。1 9 9 3 年，奥地利 成为第一个停止使用含铅汽油的欧洲国家，随后，瑞典、芬兰、挪威也已全部 实现汽油无铅化。 我国于1 9 9 7 年开始推+ 使用无铅汽油。1 9 9 8 年9 月2 日困务院办公厅发御 了关于限期停止生产销售使用车用含铅汽油的通知( 国办 1 9 9 8 1 1 2 9 号) ，规 定白2 0 0 0 年1 月1 日起，全国停止生产含铅车用汽油，改产标号9 0 号以上的 无铅汽油，7 月1 日起停j 销售和使用含铅汽油。自2 0 0 0 年1 月1 日起，汽车 制造企业生产的所有汽车都要适合使用无铅汽油，新生产的轿车要采用电子喷 射装营并安装排气净化装霞。在实现汽油无铅化的同时，为控制无铅汽油中的 其他有害物质，1 9 9 9 年6 月1 日，国家环境保护局发布了我国第一个国家燃油 污染控制标准车用汽油有害物质控制标准( g w k b l 1 9 9 9 ) ( 该标准为强制 性标准，自2 0 0 0 年1 月1r 起实施) ( 冯波，1 9 9 9 ) 。 第一章引i 第z - 节无铅汽油潘加剂曲使用 第二节无铅汽油添加剂的使用 要在除铅的同时保持汽油的抗爆性及动力性能，实现车用汽油高标号化，需 要在汽油生产过程中采取其它技术措施来提高辛烷值。无铅化的方法通常是以催 化裂化、烷基化、重整汽油来代替简单的直馏汽油，用各种含氧化合物作为汽油 添加剂以代替四乙基铅。 在众多的汽油添加剂中，甲基叔丁基醚 ，t t c h o 诱导的基因效应主要是d n a 一 蛋白交联( s p e i t ，2 0 0 0 ) 。因此，有学者认为，在评价m t b e 的毒性时，必须 考虑到其代谢产物t b a 和h c h o 所起的作用( 周伟，1 9 9 8 ) ，但c a s a n o v a ( c a s a n o v a ，1 9 9 7 ) 的研究则认为代谓 产生的h c h o 在m t b e 的致癌作用中影 响4 i 大。由于受实验方法和条件的限制，实验动物的染毒浓度往往偏高，其结 果与低水平接触下引起的毒性是有差异的。 4 基因毒性研究 m t b e 在标准a m e s 试验( k a d o ，1 9 9 8 ) 、小鼠骨髓微核试验( k a d o ，1 9 9 8 ) 、 小鼠肝细胞非常规合成试验( m c k e e ，1 9 9 7 ) 、小鼠脾淋巴h p t r 突变体试验( w a r d ， 1 9 9 5 ) 中均呈阴性结果。唐国慧( 唐国慧，1 9 9 7 ) 等用单细胞凝胶电泳法研究 了m t b e 与人白血病细胞( h l 一6 0 ) d n a 的作用，m t b e 可引起d n a 单链断 裂并存在正相关的剂量响应关系，但其所用m t b e 浓度较大，最低为lm m o l l ( 8 8 1 5m g l ) 。由于m t b e 只在高浓度条件下才诱导肿瘤的发生，因而有学者 认为m t b e 的致癌性是由细胞损伤引起的。 但w i l l i a m s h i l l 的研究( w i l l i a m s h i l l ，1 9 9 9 ) 发现，在大鼠s 9 混合功能 酶的作用下，m t b e 可诱导t 1 0 2 中等程度的回复突变，添加甲醛脱氢酶( f d h ) 可抑制2 5 3 0 的回复。当以人s 9 取代大鼠s 9 时，m t b e 和t b a 均能诱导 t 1 0 2l ：旦1 复突变，由此，作者认为，m t b e 及其代谢产物有一定的致突变性。另 外，z h o u ( z h o u ，2 0 0 0 ) 用大鼠肝原细胞进行程序外d n a 合成试验时发现， 高浓度m t b e 对d n a 有损伤，不过这种损伤能彼切割修复系统所修复。 实验结果的不一致可能是由于m t b e 挥发性大、水溶性立了，而目前所用的 实验体系或程序尚不健全，因而未找到合适的实验体系( a h a m e d ，2 0 0 1 ) 。由 于动物试验中m t b e 的染毒浓度偏高，试验结果又仪局限于啮齿类动物，人们 接触剑的m t b e 的浓度通常较低，m t b e 别人是否有致癌性至今尚无定论。 第二章甲基叔丁基醚( m t j b e ) - 5 叔丁醇( t 1 3 a ) 的研究第一节甲基敏t a t 醚( m t b e ) 1 9 9 7 年美国e p a 将m t b e 暂时定为- g e e 可能对入体有致癌作用的物质 ( c a p r i n o ，1 9 9 8 ) ；1 9 9 8 年国际癌症研究协会( i a r c ) 把m t b e 归为第三类， 即尚彳；能肯定对人有致癌作用。欧洲生态毒理和化学物质毒理中心( e c e t o c ) 也认为，在现有的职业接触水平和消费暴露水平条件下m t b e 不会对人体健康 有影响。 d n a 加合物是化学物质经生物转化后的亲电活性产物与d n a 链特异点位 上的结合物，多数为共价结合。要判断某种药物或化学物质是否有致畸、致癌 性，往往要对它进行多个体内体外的基冈毒性试验和( 或) 致癌性试验。当实 验的结果出现不一致时( 某些实验结果阴性，某些结果阳性) ，测定它能否与 d n a 加合是一种比较有效的方法( p h i l l i p s ，2 0 0 0 ) 。m t b e 及其代谢产物t b a 能否与体内生物大分子加合以及加台能力强弱，国内外至今尚未见报道。 三、各国的使用政策 1 9 9 9 年底，美国e p a 的b l u er i b b o n 小组经过一年多的调查建议：全国要 大量减少m t b e 及其它汽油添加剂的使用。美国现有7 个州已立法逐步禁止 m f b e 的使用，另有三个州则限制汽油中m t b e 的添加浓度。为禁止m t b e 的 使用，e p a 甚至建议应当放宽机动车尾气的排放标准，从而使汽油供应商更方 便地用乙醇作为取代物。根据m i l l e r 的预测，全球m t b e 的需求量在2 0 0 1 年 达到蜂值后将逐渐减少。2 0 0 0 年3 月2 4 日美国e p a 发布了一项通告( a n p r ) ， 建议限制或中止m t b e 在配方汽油( r f g ) 中的使用。加利福尼亚州则计划用 3 年的时间逐步淘汰m t b e ，到2 0 0 5 年底全面禁止m t b e 的使用。 在西欧，作为使用m t b e 的大地区，拟采取与美国不同的政策，即维持现 有水平，在若干年内不禁用( a c f a & e f o a ，2 0 0 2 ) 。东欧和中欧的需求将继续 增长；拉丁美洲的需求维持在现有的较低永平；中东地区的需求存2 0 0 5 年则略 有下降，随后又继续增长；亚洲地区对m t b e 的需求仍将保持较快的增长势头， 到2 0 1 0 年将比现有需求增加5 0 。 随着我国经济发展，目前全国约1 5 0 0 万辆汽油车每年使用约2 0 0 万吨 m t b e 。对m t b e 的使用采取什么样的政策，是个事关财政支出、环境保护 和人身安全的重大问题，近年来，国家环保总局列此十分关注。2 0 0 4 年3 月受 幽家环保总局局长觯振华的委托，我们向他呈交了一份关于使崩m t b e 可能引 起的环境问题的简要报告，解振华局长立即回信( 见附件一) ，希望我们尽快提 交一份洋细的报告。结合我们的实验工作，并在调查研究的基础上，我们撰写 了“兀铅汽油添加剂m t b e 等的研究进展及对其使用的建议”报告( 杜慧芳， 第二章甲基叔丁基醚( m t b e ) 与叔丁醇( t b a ) 的研究第二节叔丁醇( t b a ) 2 0 0 4 ) 。在报告中明确提出了政策性的建议：“继续使用，加强防范，逐步限制， 积极开发”。环保总局在回信( 见附件二) 中给予了积极肯定，认为这样做比较 符合中国的国情。 四、我们的前期加速器质谱法( a m s ) 研究 我们用超灵敏的生物加速器质谱法在分子水平上研究m t b e 与生物大分子 的体内加合，以深入研究醚类添加剂的基因毒性及毒理，具有一定的理论意义和 现实意义。 我们的前期研究结果表明( 许丽红，2 0 0 2 ) ，灌胃单次染毒6h 后，”c 标记 的m t b e 能与小鼠肝d n a 、血红蛋白h b 在体内形成加合物，且在实验浓度范 围内有很好的l g l g 线性响应关系，而且我们的最低染毒浓度为1 0g g k g b w ， 只相当于环境剂量水平。m t b e 能与生物大分子形成加合物，这在国内外属首次 发现。但由于a m s 不能提供加合物的结构信息，因而我们现在尚不能获得加合 物的结构信息。 第二节叔丁醇( t b a ) 进入大鼠体内的m t b e 主要分布于m 、脑及肾周围脂肪组织，在肝脏中经 细胞色素p 4 5 0 的氧化去甲基作用代谢生成t b a 和甲醛，t b a 再进一步代谢为 2 一甲基一1 ，2 一丙二醇( m p d ) 、羟基异丁酸( h b a ) ，尿中所含的这三种代谢的清除 均很快( 半衰期低于5h ) ( d e k m l t ，2 0 0 1 ) 。凶此，研究t b a 与生物大分子体内 加合作用既能了解t b a 的作用机理，也有助于了解m t b e 的作用过程。 t b a 又称三甲基甲醇，是无色的结晶，可溶于大多数有机溶剂，如醇类、 酯类、酮类、芳香族及脂肪烃类。这些性质使t b a 在精细化工领域有7 。泛的用 途。由于较多的含氧量，t b a 也被用作无铅汽油添加剂( 一般作为甲醇的共溶 剂使用) 。t b a 可用于生产高纯度异丁烯，作为原料生产甲基丙烯酸甲酯( m m a ) 。 另外，t b a 还可作为烷基化剂用于多种农药的生产。由于t b a 的广泛使用，它 也成为生活饮用水的污染物，人们接触t b a 的途径主要有皮肤接触、食入和吸 入( a c h a r y a ，1 9 9 5 ) 。 一、t b a 的主要生产情况 美国是世界上t b a 的主要生产国。近年来，我国的t b a 生产也有显著的增 加。l u 东潍坊天德化工有限公司2 0 0 2 年底已拥有年产5 0 0 0 吨无水t b a 、6 0 0 0 第二章