（环境科学专业论文）不同培养方式下普通小球藻降解苯酚的研究.pdf

ab s t r a c t i s c u lt iv a t i o n , t h e m a x i m u m d ry w e i g h t o f c v u l g a r i s w e r e 1 4 . 1 幼 ， 1 2 .9 g / 1 r e s p e c t iv e ly , a n d t h e s p e c if i c g r o w th r a t e w e r e 0 .7 0 7 d t a n d 0 .6 8 6 d - . c o m p a r e d w i t h a u t o t r o p h i c c u l t i v a t i o n , h e t e r o t r o p h i c c u lt i v - a t i o n i s a b e tt e r w a y f o r c u lt i v a t i n g c v u lg a r is . wh e n s e l e c t e d t h e a d j u - s t e d s k m e d i u m , i t w a s s h o w n t h a t t h e p a rt o f a u t o t r o p h i c c u l t i v a t i o n m a k e a g o o d e ff e c t f o r in c r e a s in g t h e c e l l d e n s i ty , d ry w e i g h t a n d c h - l o r o p h y l l c o n t e n t . t h i s r e s e a r c h , p h e n o l w a s s e tt e d i n t h e f o l l o w i n g t w o c o n c e n t r a t e - o n s : 2 0 o m g / l a n d 4 0 0 m g / l , w i t h t h e 9 6 h - e c s 0 , 3 1 0 m g / 1 ( m i x t r o p h i c c u lt - i v a t i o n ) ,3 3 7 m g / 1 ( s e q u e n t ial h e t e r o t r o p h ic - a u t o t r o p h i c c u lt i v a t i o n ) . t h r e e p a r a m e t e r s w e r e s e l e c t e d a s t o x i c i ty i n d e x e s : a l g a l g r o w i n g r a t e , o p t i c - al d e n s i t y a n d c h l o r o p h y l l c o n t e n t , a n d w e r e d e t e r m i n e d e v e ry 2 4 h d u r - i n g a g r o w t h p e r i o d . a t t h e s a m e t i m e , t h e c u l t u r e o f al g a e w i t h t h r e - e d i ff e r e n t c o n c e n t r a t i o n o f p h e n o l w a s c al c u l a t e d . t h e n t h e k i n e t i c e q - u a t i o n s o f p h e n o l b i o d e g r a d a t i o n b y cv u lg a r i s w e r e e s t a b l i s h e d . cv u l - g a r is a p p e a r e d t o h a v e a c e r t a i n c a p a b i l i ty t o d e g r a d e p h e n o l . t h e b i o - d e g r a d a t i o n r a t e s o f p h e n o l 勿 cv u l g a r i s w it h i t s i n i t i al c o n c e n t r a t i o n b e i n g 2 0 0 , 3 1 0 ,4 0 0 m g / 1 ( m i x t r o p h i c c u lt i v a t i o n ) w e r e 9 6 % , 5 3 .5 % a n d 2 3 .5 % a ft e r 1 4 4 h , r e s p e c t i v e l y , w h i l e i n s e q u e n t i al h e t e r o t r o p h i c - a u t o t r o p h i c c u l t i v a t i o n w e r e 9 6 %, 6 3 . 2 %a n d 2 0 . 5 %. k e y w o r d s : p h e n o l ; c .v u l g a r i s ;s y s t e m;k i n e t i c s i i i 学位论文独创性声明 学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。 据我所知，除了 文中 特别加以标注和致谢的 地方 外，论文中不 包含 其 他人已经 发表 或撰写 过的 研究 成果， 也不包含为获得 南昌大学 或其他教 育 机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何 贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学 位 论 文 作 者 签 名 (手 写 ): 及 救 签 字 日 期 : 07 年 月 ?a 日 学位论文版权使用授权书 本学位论 文作者 完全了 解南昌大学有关保留、 使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅 和借阅。 本人授权南昌大檬可以 将学 位沦 文的 全部或部分内 容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学 位 论 文 作 者 签 名 手 写 ):叉 r导师签一 书 签 字日 期 :0 7年 月 ? -0日 签 字 日 期 : 卿年 a -,o 日 学 位 论 文 作 者 毕 业 后 去 向 :诱 定 工作单位: 通讯地址 : 电 话 : 13 1 ? % is id t , 邮编: 第一章引言 第一章绪论 藻类作为生态系统的 初级生产者， 分布广泛， 种类繁多，且个体细胞小， 世代时间短，可以 在较短时间内作出某化学物质对其许多世代及其种群水平上 的 影 响 评价， 所得 结 果 可以 反 映 毒 物 对 水 体 中 初 级 生 产者的 影响 情 况 川 。 许多 国 家在化学品风险测试中选用藻类进行生物测试，并建立了多个藻类生物测试标 准方法121 . 同时， 一些研究表明藻类对有机物的降解潜力不可忽视， 尤其对表层 水中 物 质的 降 解 起 着 一 定 的 作 用 3 1 . 1藻类 1 . 1 . 1藻类的特征 藻类的大小相差很大，淡水单细胞藻类很小，在显微镜下才能看到，最小 只有几微米:藻类形态纷繁多样，有单细胞的，单列和分枝丝状的，叶状的， 囊状的等等。尽管藻类的形态万殊，大小差异极大，但它们有一些共同的特征: 都含叶绿素，能通过光合作用将无机物变成有机物，同时放出氧气，是一种能 独立生活的自 养型生物;藻类细胞具有含纤维素成分的细胞壁。这些特征不仅 为多 数 藻类所共 有， 而且也和高 等植 物基 本相同 ll 。 但是， 藻 类在植 物体、 生 殖 器官的构造及生殖方式等方面与高等植物又有很大的区别。 1 . 1 .l藻类的分类 淡水藻类从它们所含的色素和植物体的形态、 构造和繁殖方式等方面分为1 1 个门，门下又分纲、目、科、属、种，分别为轮藻门、绿藻门、裸藻门、黄藻 门、 金 藻门、 硅藻门 、 褐藻门 、甲 藻门 、 隐 藻门 、 蓝藻门 及红藻门 5 。 其中 绿藻 在自 然界有广泛的分布。 小球藻是绿藻门绿藻纲绿球藻目的一属，单生或聚生，细胞多为球形、椭 圆形;它们的细胞壁通常很薄，行无性繁殖，当似新抱子成熟时母细胞破裂， 饱子逸出， 然后长大为 新的 个体 6 !。 小 球 藻分 布 于全世 界， 多 生 活 在较小的 浅水 处，也能生长于容器、潮湿的土壤、岩石和树皮上，另有一些是海产种类。它 们还能生活在其它的动植物体内，如除能构成地衣外，我们可以在草履虫、水 第一章引言 及 各 种 神 经 系 统 的 疾 病， 严 重的 会引 起 死 亡。 酚口 服 致 死 量 为 5 3 0 m g / k g ( 体 重) 左右，而且甲基酚和硝基酚对人体的毒性更大。据有关报道，酚和其它有害物 质相互作用产生协同 效应，变得更加有害， 促进致癌化。 含酚废水对给水水源、水生生物也会产生严重影响. 水中含酚类物质为 0 .0 0 2 m g / l 时 ， 在 水 体加 氯 处 理 过 程中 会 产生 酚 臭: 浓 度 大 于 0 .0 0 5 m g / 1 时 的 水 就 不 能 饮 用 : 浓度 大 于 0 . 1 m g / l 时 ， 鱼肉 中 有 酚 味不 能 食 用; 浓 度 大 于 l m g / l 时， 对 鱼的生 殖 等活动 造成 严重影响: 而当 水中 酚 类含量大 于1 0 m g / 1 时， 鱼类等水生 生 物 不 能 生 存 2 5 1 。 若 用 含 酚 浓 度 高 于 10 0 m g / 1 的 废 水 直 接 浇 灌 农田 会 导 致 农 作 物 减产，甚至枯死。含酚废水的毒性还可抑制水体中其它生物的自 然生长速度， 破坏生态平衡。 1 9 ”年美国 环保局根据有机物的毒性、生物降 解的可能性以 及在水体中出 现的几率 等因 素， 从7 万种有机化合物及其它污染物中 筛选出 6 5 类1 2 9 种优先控 制的污染物，有1 1 种酚位于此列。1 9 8 9 年4 月我国环保局提出了 适合中国国 情的 “ 水中 优先控制污染物名单” ， 俗称“ 黑名单” ， 包括1 4 类6 8 种有毒化学污染物， 有 6 种酚位于此列，包括苯酚。 随着石油化工、塑料、合成纤维、焦化等工业的发展，各种含酚废水也相 应增多，由于酚的毒性较大，而且涉及水生生物的生长和繁殖，污染饮用水水 源。因 此对含酚工业废水的排放必须有严格规定。一般条件下，规定饮用水的 含 挥 发 酚 浓 度 最 高 为 0 .0 0 1 m g / 1 : 水 源 水体 中 含 酚 最高 容 许 浓 度 为 0 .0 0 2 m g / l 。 根 据这种要求，必须对含酚废水的产生和已经产生的含酚工业废水采取有效的处 理措施， 严格控制排放，因此工业含酚废水的处理，已 成为废水处理方面or待 解决的问题之一。 1 . 2 . 2处理方法 对含酚废水的治理，最有效的方法是控制污染源。 一是合理选择工艺流程、 开发无公害工艺、无公害催化剂，使用无公害试剂的反应实现清洗工艺技术， 减少废水量或降低废水中的含酚浓度。例如，目前对氨基酚生产主要采用铁还 原法老工艺，生产1 吨成品出 料吨废水，废水量大，污染严重。 近年来人们开发 用硝基苯催化氧化法生产对氨基酚新工艺，1 吨成品只排放1 0 吨含酚废水，使污 染减少。 二是 选用有效的操作条件和生产设备，开发密闭 循环生产酚类化合物 系统， 尽量避免和减少污染物排入环境， 实现“ 零排放” 的清洁生产。 三是加强企 第一章引言 业的 管理， 对含酚 废 水采取有效 处理、回 收以 及 综合利 用2 6 1 含酚废水的处理方法是随着对含酚废水危害性的认识和水处理技术的不断 发展而逐渐发展起来的，目前已有很多关于含酚废水的处理方法，而且随着技 术的不断发展，各种处理方法间还进行着相互的渗透组合，以达到更好的治理 目的。总的来说，含酚废水的处理方法大致可分为物化法、化学法、电化学方 法 、 生 化 法 等 类 型 2 7 1 国内外研究发现，微生物如细菌、真菌和藻类对有机酚有较好的吸收和降 解效果。这类生化处理方法存在着成本低、无二次污染问题及可使废水资源化 等优点。近年来，许多学者专家在研究藻类降解有机废水的问题，取得了一定 的成果。 1 . 2 . 3 1 . 2 . 3 . 1 藻类对含酚有机废水的降解 降解机制 有关微生物降解机理的研究中，比较成熟的是菌类对于污染物的降解，普 遍认为的降解实质是:污染物进入细胞以 后进行以活性酶为主的降解反应。无 论是异养菌还是自 养菌，降解反应的控制步骤也几乎雷同。而藻类对有机污染 物的富 集和降 解 作用， 还只 是 停留 在 现象的 观察、 描 述和 机理的 猜测上 2 c h e n 1 9 9 4 ;马志珍，1 9 9 5 : s h i e t a l , 1 9 9 7 ; o g b o n n a e t a l . , 1 9 9 8 等。 9 第一章引言 1 .4本研究内容、目的及意义 1 . 4 . 1主要内容 在不同培养条件下，研究普通小球藻对苯酚的降解。与普通的光自 养和异 养不同，为了 提高小球藻的生长速率和细胞浓度，实验采用混养和异养一光自 养串联培养的方式。 酚降解测试:将含有不同浓度的苯酚溶液添加在兼养和异养一光自 养两种 培养方式下处于对数生长期的藻体，测定藻体的生长状况及酚降解能力的变化。 1 . 4 .2目的及意义 目前国内 外对利用藻体处理含酚废水已 进行了一系列研究，包括机理以及 酚类物质对藻体的毒性影响和藻体对酚类物质的降解能力等。本课题目的是利 用绿藻类的普通小球藻作为研究材料，通过研究兼养和异养 光合自养串联两种 方式下，验证普通小球藻在有无光照的情况下是否能通过快速生长和高浓度细 胞密度对苯酚有良 好的降解能力，为藻体技术处理含酚废水提供理论支持. 第二章 普通小球藻异养生长能力检测 第二章普通小球藻异养生长能力检测 2 . 1材料与方法 2 . 1 . 1实验材料 2 . 1 . 1 . 1 藻种来源 本 实 验 所 用 微 藻 为 普 通 小 球 藻 ( c . v u l g a r i s , f a c h b 编号: 2 6 ) 由 中 国 科 学院武汉水生所淡水藻种库购得。 以s o r o k i n - k r a u s s 培养基 ( 简称s k 培养基)为基础，做藻种的放大培养。 表2 . 1 s k 培养基组成 耐一1.251.251.0 me d i u m i n g r e d i e nt 0八un ，12.皿 k n o ; ( g ) k h 2 p o 4 ( g ) m g s o 4 -7 h 2 0 ( g ) c a c l 2 s t o c k l ) ( m l ) f e s o 4 s t o c k 2 ) (m) t r a c e e l e m e n t 3 ) ( ml ) 注: 1 ) c a c 1 2 - 2 1-1 2 0 6 . 3 5 g ; 2 ) f e s 0 4 .7 h , o 2 . 4 9 g , e d t a 2 5 g ; 3 ) h 3 b 0 3 1 1 . 4 2 g , z n s 0 4 - 7 h 2 0 8 . 8 2 g , mn c ,z h 2 o 1 . 4 2 g , ( n h 4 ) 6 m o , 0 2 ; 4 h 2 0 0 . 8 7 0 7 g , c u s 0 4 d h 2 0 1. 5 7 g , co(n03)2 6 h 2 0 0 . 4 9 g ; 1 ) -3 ) d i s t i l l e d w a t e r 1 0 0 0 m l . 2 . 1 . 1 . 2实验仪器 ( 1 ) 血球计数板， 浙江玉环县求精医用仪器厂制造 ( 2 ) s p x - g光照培养箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂生产 ( 3 ) l d z x - 4 0 c i 型立式自 动电热压力蒸汽灭菌器， 上海博迅实业有限公司医 疗设备厂生产 ( 4 ) 浮游植物荧光仪，德国w a l z 公司生产 ( 5 ) 7 2 1 型可见光分光光度计，上海精密科学仪器有限公司生产 ( 6 ) s a r t o r i u s p b -1 0 型酸度计，上海精密 科学仪器有限公司生产 ( 7 ) l r h - 2 5 0 a型生物安全柜，上海精密科学仪器有限公司生产 ( 8 ) o l y m p u s c x 3 7 型生物显微镜，上海尚 光显微镜有限 责任公司生 产 第二章 普通小球藻异养生长能力检测 ( 9 ) h a n g p i n g j a 2 0 0 3 型电 子天平， 上海精密科学仪器有限公司生产 ( 1 0 ) t g l - 1 6 g高 速台 式离心机， 上海安 亭科学仪器厂生产 ( 1 1 ) h h 一数 显恒温水 浴锅，国华电 器有限公司生产 ( 1 2 )锥形瓶:容积分别有 1 5 0 ml , 2 5 0 ml , 5 0 0 m 1 及1 0 0 0 m1 2 . 1 . 2 实验方法 2 . 1 .2 . 1普通小球藻的纯化及无菌化 在实验前用s k 培养基进行藻种预培养，温度控制2 5 士 1 c，光强为1 9 0 0 1 1 0 % l x ， 光周期1 2 h l / 1 2 h d ， 每天摇动两次， 7 - 1 。 天后， 取生长良 好的 普通小球 藻藻液经适当稀释后， 用吸管吸取一滴置于载玻片上，在显微镜下观察有无原 生动物或者其它微生物污染，如果培养被污染，则整个培养液呈灰白色，高倍 显微镜下可观察到大量的细菌，如果没有，且生长良好，即可用于实验。试验 前， 先置于1 0 0 l x 的 低光环境下， 适应性生长一周。 上述培养基及所用实验器材全部高压或紫外线灭菌， 操作均在无菌工作台 中进行。 2 . 1 .2 .2普通小球藻异养培养条件的 确定 ( 1 ) 培养基 根据s k 培养基改良 后的 培养基，简称 h - s k 培养基， 如 表3 . 1 所示。 表3 . 1 h - s k 培养基组成 me d i u m i n g r e d i e n t h- s k me d i u m g l o u s e ( g ) k n o 3 ( g ) k h 2 p o 4 ( g ) m g s o 4 - 7 h 2 0 ( g ) c a c l 2 s t o c k l ) ( m l ) f e s o 4 s t o c k 2 ) ( m l ) t r a c e e l e me n t 3 ) ( ml ) 0 , 5, 1 0. 1 5 , 2 0, 2 5 4.51.251.015105 注:按照葡萄糖的浓度梯度，依次设定为 # 0 , # 1 . # 2 . # 3 . # 4 和 # 5 . 普通小球藻在自 养条件下的 培养基不添加葡萄搪。 ( 2 ) 温度 温度是 影响 藻 类所有 代谢 活动的 一 个主 要因 子5 1 1 . 小 球藻的 适宜生长 温度 在 不 同 藻 株 间 存 在 差 异 ， 根 据 培 养 小 球 藻 需 要 的 最 适 温 度， 可 将 小 球 藻 分 为 两 第二章普通小球藻异养生长能力检测 类:低温藻株，生长最适宜温度为2 5 -3 0 1c;高温藻株，生长最适温度为3 5 - 4 0 c。普通小球藻属于低温藻株.本实验的温度选择在2 8 * c . ( 3 ) p h 值 p h 是 影响 藻 类 有关生长 代谢 等许多 生 理过程的另一 重要因 子 5 q 。 一般 来 说， 小 球 藻 存 活的 p h 范 围 为 4 .5 - 1 0 .6 , p h 在 5 .5 8 .0 时 有 利 于小 球 藻 的 生 长。 在小 球 藻 异养培养体 系中 多 数 情况下采 用 p h 6 .0 - 7 . 0 。 由 于培 养基中 加 有 硝酸盐， 培养 过 程中 硝 酸 根 被 利 用以 后 p h 会 上 升 到 6 .。 以 上 ， 如果 培 养 过 程中 不 能 控 制 p h 时 ， 采用的 起始 p h 在6 .0 以 下. 2 . 1 . 2 3普通小球藻摇瓶自 养和异养培养 取2 5 0 m 三角瓶装2 0 0 m 低糖或高糖液体培养基，1 2 1 灭菌2 0 分钟， 用之前 培养的藻种接种， 密度为3 . 3 x 1 0 6 接种量5 % ( v / v ) ， 异养用3 层黑色塑料袋将三角 瓶包起来 ( 露出棉塞便于通气) ， 使其不透光，放入恒温摇床中暗培养。则培养 温度2 8 1c ，摇床转速1 5 0 r / m i n 。光照为5 0 0 0 l x( 自 养时) ，光照比1 2 h l : 1 2 h d o 每天定时测定生物指标。 从接种开始，每隔2 4 小时取样一次，取样量l o m l ，分别测定藻液的生物量、 葡萄糖含量。 2 . 1 . 3指标测定方法 2 . 1 3 . 1生物量的测定 ( 1 ) 细胞干重法 取1 0 n il 藻液于已预烘干的离心管中， 6 0 0 0 r / m i n 离心3 分钟，弃去上清液， 用 吸水纸吸去管壁表面附着的水分，把离心管敞口 放入烘箱中，8 0 烘至恒重， 测定干重。做3 个重复，取其平均值. ( 2 ) 细胞浊度法 虽然用光密度法测定的o d 值随微藻的培养条件、生长状况等不同而有一定 的误差，不能完全与实际的藻细胞数目 对应，但该法方便快速，所以在测定大 量样品时， 还是 值得推广的。 一般用国产7 2 1 型分光光度计( 测定波长范围 3 6 0 - 8 0 0 毫微米)就可以，只要选择在各类微藻的吸光度最大的波长上进行测定，就可 以 得 到 较 高 的 准 确 度 52 -53 本实验用7 2 1 型分光光度计测定5 4 0 n m 处藻液的吸光值 ( o d s a o ) a 第二章普 通小球藻异养生长能力检测 ( 3 ) 细胞密度法 国内 常用的是 b x - k - 2 5 型血球计数板， 每片计数板上有下两个计数池， 每个 计数池由 9 个大方格组成 ( 四周8 个大方格，每个又分划成1 6 个中方格:中间的 一个大方格则分成4 0 0 个小方格)每大格的面积都是1 平方毫米的空间， 所以 在 这1 大格中计数到1 个藻细胞，即表示1 毫升水体中含有1 0 0 0 0 个藻细胞。每个计 数池我们取对角线上的大方格计数。共5 个，每片计数板共计数1 0 个大方格，重 复 3 次， 则 将3 0 个朋方格内 计数到的藻细胞数， 取其平均值，即表示该藻液样品 的 藻 细 胞 密 度 154 1 2 . 1 .3 .2 p h 的 测 定 用p h 计测定 2 . 1 3 3葡萄糖含量的侧定 葡萄糖氧化酶法 用上海生物制品所生产的葡萄糖试剂盒进行测定。样本中的葡萄糖经葡萄 糖氧化酶作用生成葡萄糖酸和过氧化氢，后者在过氧化物酶的作用下，将还原 性 4 - 氨基 安替比 林与酚 偶联 缩合成可被 分 光光 度计 测定的 醒 类 化合物， 】 。 2 . 1 3 . 4计算 最 大比 生 长 速 率( u ) = ( l n n 一 l n n , ) i ( t 2 - t , ) ( 2 . 1 ) 式中: u 每天的分裂速率 n , 培养开 始时的 细胞 干重 n 2 培 养 t 天 后的 细 胞 干重 t , j 2 对应的 培养时间 ( d ) 糖 对 细 胞 转 化 率( y e ) = x -i s . 式中: x 一 最大 细 胞 干重( a / 1 ) s o 初始 葡 萄 糖 浓 度 ( s / 1 ) ( 2 . 2 ) 第二章普通小球藻异养生长能力检测 2 .2结果与分析 2 .2 . 1葡萄 精对普通小球藻生长的 影晌 在微藻的异养培养研究中，葡萄糖一直是应用最广泛的有机碳源之一。由 图 3 . 1 可知， 在不同的培养条件下其生长情况差别不大，但与生长缓慢的自 养培 养相比，其生长速度有很大幅度的提高。 细胞的生长过程呈现典型的“ s 型，可以划分为四个阶段:调整期、对数生 长期、稳定期、衰亡期。但种子在对数生长期直接接入继续培养，则无调整期， 若 在 稳 定 期 接 入， 会出 现 较 长的 调 整 期 156 1 。由 图 2 . 1 可 知， 在 培 养的 1 天时 间内 ， 不同异养条件下的 o d 值增加很少，图 上表现为一段较为平滑的曲 线，此段时间 即为普通小球藻的调整期，此时小球藻主要是适应新的环境，细胞重量及数目 增加不多，但其菌体内物质增加，代谢机能活跃。而后在几天之内出现一段“ 陡 坡” ，# 1 和# 2 的出现在培养第5 天。其它三种浓度下基本出现在第6 天。此期间即 为普通小球藻的对数生长期，细胞数目以几何级数增长，从光学显微镜下可见 此期间，小球藻体积增大，各个藻体大小不均一，细胞内有分裂现象有二个或 四 个子细胞在大 藻体内， 此时对外界环境因子较为敏感.随后， # 1 和# 2 的 o d 值 趋于稳定，若再增加培养时间，细胞体积较稳定期会减少，生物量会稍有下降， 由于培养基内己无营养源，普通小球藻利用自 身的能量进行呼吸作用，且进入 衰亡期，细胞会逐渐老死。而# 4 和# 5 的则继续呈增长势头，说明随着葡萄糖浓 度的增高，藻细胞的生长期延长。由于没有出 现明显的o d 值下降现象，说明五 个不同浓度的葡萄糖浓度对普通小球藻的生长都起了很大的促进作用。 o n g / 1 .s . / i . 阿15呵25 32口.0.日，万 it，t众众已 o.e,.a 李 尹二 飞吕坦长彭 : : z3a a a 培养时间( d ) 图2 . 1 普通小球藻不同 葡萄糖浓度下的摇瓶异养培养 第_章普通小球藻异养生长能力检测 由图2 .2 耗糖曲 线可知，在调整期细胞不生长分裂，需糖不多，所以曲线下 降平缓。在对数生长期，细胞数目以几何级数增长，因而耗糖多，曲 线陡然下 降。 # 1 和# 2 中的葡萄糖在培养期间被小球藻分别于第5 天和第6 天消耗完， # 3 . # 4 和 # 5 中 的 葡萄 糖 浓 度 在培 养 结 束 后 依 次 为 0 .8 1 动、 3 .6 0 1 幼和 4 .2 1 8 幼， 葡 萄 糖 的利用率分别是9 4 %, 8 1 .6 % 和8 3 %。普 通小球藻生长 进入稳定期后，由于糖含 量太低， 细胞无法利用，生物量不再增加，则表现为一平滑曲线。 y u a n - k u n l e e 曾做过对比实验， 设计了 两种实验条件， 即在充足的光照条件 下比 较 含有 葡 萄 糖 的 培 养基 与 不 含葡 萄 糖的 培 养基 分 别 对 c h lo r e l la s p . 的 产量的 影 响， 结 果 发 现前 者的 产量 最 高 可 达 0 .5 6 g / l ， 而 相比 之下 后 者 的 光 合 作用 几乎 表 现不出生长 迹象。由 此可见葡萄糖对微藻的生长促进作用是十分明显的。 研究发现微藻对葡萄糖的 利用存在着两种吸收机制5 7 1 :一种是很低的浓度 便可使吸收达到饱和，而高浓度易对藻细胞产生致死效应;另一种是相当高的 浓度方可 使 细胞吸收 达到 饱和。 本实 验中 所设葡萄 糖的 最 大浓度为 2 5 幼， 而 最 适生 长 浓度为l o g / 1 ， 并且实验 显示 在较高的 有机 物浓度出 现细 胞生长抑 制现象， 由 此推测普通小球藻对葡萄糖的利用属于第一种机制。 m g / l 1 0 m g 八 1 5 m g / 1 2 0 m g / l 一 2 5 -1. 佰10 1溉日侧说椒汐演 2 3 4 5 6 培养时间( d ) 图 2 .2 异 养培 养的 糖耗曲 线 另 外 研究发 现， 光 对 葡萄糖的 吸 收 起调 节作用55 。 对 某些微藻而言，当 光 强 低于5 w m 一 时， 会对葡 萄 搪运送器的 合成 产生 抑制 作 用， 使 得藻细胞 膜上的 葡 萄 搪 运 送 器 锐 减， 从 而 对 葡 萄 糖 的 吸 收 带 来 影 响 5 9 1 . r ip p k a 6 1 1报 道 s n e c h o c y s t is 第二章普通小球藻异养生长能力检测 可 营 光 学 异 养( p h o to h e t e r o tr o p h ic g r o w th) ， 但 不 能 化 学异 养( c h e m o h e t e r o t r o p h i c g ro w th ) ， 前 者 有 微 弱光 存 在， 后者 完 全黑 暗。 在黑 暗 条 件下， 将 s y n e c h o c y s t i s 接种到含2 % 葡萄糖的液体培养基中， 3 8 小时后看不到任何生长迹象， 但如果补 充 1 0 0 2 0 0 l x 的 光 照 可 产 生 明 显的 生 长 现象 16 0 1 ， 这里 所 说的 光 有 时 并 不 提 供能 源，而只是作为一种诱导信号存在。 根据表2 . 1 可知，随着葡萄搪浓度的升高，藻的生长时间明显延长，最大比 生长速率和糖对细胞转化率有所降低。5 组不同葡萄糖浓度中# 1 , # 2 最高生物量 出现时间最短，# 2 比生长率和糖对细胞转化率最大，是生长特性很好的培养基 浓度，适合普通小球藻的异养培养，所以在之后的不同方式培养比较实验中选 择 添 加 l o g / 1 的 葡 萄 糖 浓 度。 表2 .2 不同葡萄糖浓度摇瓶培养的生长参数 生长指标 最高生 物量 ( g / 1 ) 最高生物量出 现时间 ( d ) 最大比 生长率 ( d 7 ) 糖对细胞转 化率 ( g (g ) 1 1 . 61 2 . 8 1 . 7 1 7 1 . 7 3 1 0 . 6 3 4 0 . 7 1 7 0 . 6 6 7 0 . 7 0 . 9 8 0 . 7 3 0 . 5 8 0 . 5 1 2 2 .2 . 2异养培养下对各项生长指标的关系 研究 检测藻生长的常用方法有浊度法、干重法，细胞密度法等。藻干重测定法 是测定生物量最直接的方法之一，但操作过程烦琐，而浊度法具有快速、无损 伤性的特点，因此成为测定藻浓度最常用的方法。在很多情况下藻液浊度与藻 细胞干重或藻细胞密度之间存在良好的正相关关系，可作出标准曲线图或建立 回归方程，在通过测定光吸收的简单方式推算样品中生物量的多少。 每隔 2 4 h 监测不同 葡萄糖浓度异养培养条件下的 藻细胞千重 和藻细胞密度。 结果见图2 .3 , 2 .4 0 第二章普通小球藻异养生长能力检测 少少 g/10e/15s/10s/1 奋， 口盛.了口.召u4，1月.n 1、.侧申星界 2 3 4 5 6 培养时间( d ) 图 2 . 3 不同 葡萄搪浓度下细胞干重变化 随着葡萄糖浓度的增高，培养结束后，相应组分的细胞干重和细胞密度也 依 次 增 大 。 最 高 为 # 5 ， 分 别 为 1 3 .8 郎 和 2 0 x 1 护 个 / ml. # 1 干重 增 幅 最 小 ， 仅 3 .9 g /l , 说明细胞干重与 葡萄糖浓度呈正相关性，这一点与文献一致。这可能是在葡萄 糖含量充足时，细胞摄取葡萄糖的速度快于细胞分裂，细胞将摄取的葡萄糖转 化为脂质储存起来，使得每个细胞相对较重，但当葡萄糖浓度相对低时，细胞 利用自 身储存的脂质进行分裂，细胞变得相对较轻。但# 3 . # 4 和# 5 的最终干重 相 近，说 明 普通小 球藻 对葡萄糖的 吸收是有限的，当 葡萄糖浓度 超过1 5 g / l 时， 最大 细胞 干 重 将 趋于平 稳。 当 超 过 2 5 g / l 时， 细胞 干重 不 增反降， 说 明 浓 度过高， 对细胞生长出现抑制作用。各组的最大细胞干重都出现在第六天，但是增长幅 度变小，说明当实验周期结束时， 普通小球藻的生长即 将进入稳定期，如若继 续培养，细胞干重将明显出现稳定下降的趋势。 第二章 普通小球藻异养生长能力 检测 24 a : 届、令乞昌赵脚纂异 1 2 3 4 5 5 培养时间( d ) 图2 . 4 不同葡萄糖浓度细胞密度变化 藻细胞密度的变化曲线与生长曲线相似。由图2 .4 可知，培养第一天为延滞 期，生长比较缓慢，待适应了培养基则迅速进入对数期，消耗碳源用于自 身生 长，五个组的生长数量也相差不大，从第四天开始，随着葡萄糖的消耗，# 1 的 藻密度相对增长减缓， 最终为1 9 .6 x 1 0 5 个 / n il . 生长曲 线可知， 由 于# 4 . # 5 中 葡萄 糖浓度相对较高， 从而抑制了普通小球藻的生长，其影响也反映在藻细胞密度 上。 待 培 养 周 期 结 束 ， 其 细 胞 密 度 相 对 # 2 低 些 ， 分 别 为 2 0 .9 x 1 0 个 /m l 和 2 0 .5 - 1 0 6 个 i n - a . # 2 和 # 3 的 细 胞密度相 差不 大， 分别为 2 2 .4 x 1 护 个 / m l 和2 2 . 8 x 1 护 个 / m l 。 可 见，培养周期结束时，最终藻密度随着葡萄糖浓度的增加而减少。 由图 2 .5 到图 2 . 8 可知，在异养条件下，尽管葡萄糖浓度不同，但在培养周期 内监测的细胞光密度 ( 吸光值)与细胞干重呈良 好的线性相关。随着添加葡萄 糖浓度的 增高， 相关系数r 分别为 0 .9 8 7 4 9 , 0 .9 9 6 1 9 , 0 . 9 5 2 9 1 , 0 . 9 7 7 8 2 和0 . 9 5 5 2 8 , 可见当葡 萄糖浓度为l o g / l 时， 两者的 相关 性最 好. 细胞干重增长 速率的 变化也 和藻生长曲线一致，在对数生长期的 干重增幅最大， 由图2 .9 到图2 . 1 3 可知，藻细胞密度与光密度也呈良 好的线性关系。 # 1 到# 5 的相关系数分别是0 . 9 8 9 4 3 , 0 .9 8 7 0 2 , 0 .9 7 3 4 8 , 0 . 9 5 7 7 1 和0 .9 3 5 3 4 。随着葡萄糖 浓度的增高，其相关性依次变小。 第二章普通小球藻异养生长能力检测 一一 5 g / l 葡萄糖 拟合方程:r = - 3 . 7 4 4 . 1 1 . 1 4 9 xr = 0 . 9 8 7 4 9 1巴侧十理界 02 04 图2 . 5 一. 一 吸光 值( d d 5 4 0 # 1 光密度与细胞干重的拟合方程 l o g / l 葡萄糖 拟合方程: 之省阁一型异 0 月0 月0 _ 8 吸光值( o d , ) 图2 . 6 # 2 光密度与细胞干重的拟合方程 第二章 普通小球藻异养生长能力检测 -. - 1 5 8 / 1 葡萄搪 1 2 , 拟合方程: 1/盆佃扁盈妥 0. 0 0. 2 0. 4 0 . 8 0. 8 1 . 0 1 . 2 1 . 4 吸光 值( o d , 沪 图 2 . 7 # 3 光密度与细胞干重的拟合方程 一 一 2 0 g / l i d 4 % 糖 1、冒橱十盈界 0 . 4 0 . 8 0 . 8 培养时间 ( d ) 图2 . 8 # 4 光密度与细胞千重的拟合方程 第二章普通小球藻异养生长能力检测 一 一 2 5 g / 1 葡萄糖 拟合方程: y = - 2 . 6 4 2 + 1 6 . 4 9 4 x，r = 0 . 9 5 5 2 8/ 1娜厚料申理界 氏 0 0 .1 0 .2 0 . 3 0 .4 0 . 5 0 名0 70 名0 . 9 1 刀1 . 1 吸 光 值 ( o d , ) 图 2 . 9 # 5 光密度与细胞干重的拟合方程 ，5 g / 1 / 回归方程y = 0 .3 1 2 + 0 尸 08070605 飞己。划袭多 2 46 8 1 0 1 2 1 4 1 61 8 2 0 2 2 藻细胞密度( 1 0 8 / m l ) 图 3 . 1 0 # 1 光密度与 细胞密度的 拟合方程 第二章 普通小球藻异养生长能力检测 . l o g 八 众认氏 孑。划架彭 藻细胞密度c l o fi m l ) 图2 . 1 1 t o 光密度与细胞密度的拟合方程 . 1 5 g / 1 .犯卜应叉哎 xax i s下t 地 图 2 . 1 2 1 ! 3 光密度与细胞密度的 拟合方程 第二章普通小球藻异养生长能力检测 . 2 0 g / l 回归方程 飞 8玛长奋 0.4 1 才/ 藻细胞密度( 1 0 6 / m l ) 图 2 . 1 3 # 4 光密度与细胞密度的 拟合方程 .2 5 盯1 回归方程 0 . 1 i 飞。划架咨 藻 细胞密度c 1 o 6 / m l ) 图2 . 1 4 # s 光密度与细胞密度的拟合方程 第二章 普通小球藻异养生长能力检测 2 .3小结 通过五组实验不同 浓度的葡萄糖对普通小球藻的生长的影响，在培养过程 中发现碳源浓度的差异可明显导致藻细胞的生长速率的差异及藻细胞延缓期持 续时间的差异等。 这可能是由于普通小球藻在生长过程中自 身分泌某些物质， 该物质对细胞的生长起促进作用，适宜的碳源浓度使藻细胞能够迅速适应，迅 速 进 入 指 数 生 长 期 16 2 1 通过对比实验， 我们可以得到的结论是，葡萄糖对普通小球藻的生长有很 好的促进作用。 如图 2 . 1 5 . 诵佃14住仙临0.0公 二哥罕州五 图 2 . 1 5 不同 葡 萄糖浓 度的比生 长率 由 本章的实验可知，葡萄糖浓度差异会导致普通小球藻生长的差异性。葡 萄糖 浓度 在5 幼 2 5 幼的 范围内 对 普 通小 球藻的 生 长都 没 有产生明 显的 抑 制现 象， 对普 通 小 球藻 生 长 促 进 效 果 最 佳的 葡 萄糖 浓 度 是1 o g / i 和1 5 幼。 以 此为 基 础， 设计了以后章节的实验。 第二章 不同 培养方式对普通小球藻生长的 影响 第三章 不同培养方式对普通小球藻生长的影响 3 . 1材料与方法 3 . 1 . 1实验材料( 同第2 章的2 . 1 . 1 ) 3 . 1 . 2实验方法 3 . 1 .2 . 1 培养方式 采用兼养培养方式， 用5 0 0 m l 锥形瓶装 2 0 0 m l 液体培养基， 1 2 1 灭菌 2 0 分钟。 接种量1 0 % ( v / v ) ，接种密度为3 x 1 0 6 个/ m l ，放入恒温光照培养箱中，培养温度 2 8 1c. 采用异养 一光自 养串联培养方式，取上述同等培养基接种相同藻量，先放 入振荡培养箱中暗培养， 转速1 5 0 r / m i n 。 待培养基中葡萄糖消耗完后， 放入光照 培养箱中开启外部光源进行自 养培养， 培养温度2 8 0c ，光强5 0 0 0 l x . 3 . 1 .2 . 2监侧方法 藻体叶绿素含量测定 叶绿素荧光测定法 用德国w a l z 公司产的浮游植物荧光仪p h y t o - p a m ( w a l t , e ff e e t n i e h , g e r m a n y ) 进行叶绿素含量的 测定，由 于瞬间荧光产量 ( f 值) 和叶绿素浓度在 一 定 范 围 内 成 正比 ， 通过 f 值可 直 接 测出 叶 绿 素 含 量 【6 3 1 每天定时测定生物指标 ( 同第2 章的 2 . 1 . 3 ) . 3 . 2结果与分析 3 . 2 . 1生长曲线 为了 反映串 养培养中的光自 养培养环节对普通小球藻生长的影响，当 第一 阶段的异养结束后， 将藻液分出一部分继续暗培养， 剩余部分放入光照培养箱 中光自 养。其生长 情况见图 3 . 1 . 第三章 不同培养方式对普通小球藻生长的影响 : : 100s 飞吕划长彭 0e以 1 2 3 4 5口7 培养时间( d ) 图 3 .1 不同 培 养方式下的 生长曲 线 由图3 . 1 可见，兼养和串 养的方式都使普通小球藻的生物量大幅度提高。生 长曲 线与前期时间 所得结果相似。 培养的第一天藻生长缓慢，待适应了培养基 环境后便呈几何数级增长。 兼养培养下， 在实验的第6 天出现增长速率减缓现象， 说明藻细胞生长进入稳定期。而串 养培养下的稳定期出现较早，在第5 天，当进 行光自 养后，藻细胞的生长不减反增，而另一部分继续暗培养的藻细胞则趋于 稳定。从普通小球藻的光密度对比 来看，在兼养的生长情况要优于异养，由实 验可知普通小球藻的光密度与细胞密度呈正相关，所以串养后期的光照培养对 提高藻密度有很大帮助。 由于在进行串养培养时，要待培养基中的葡萄糖全部耗尽才能进行光自 养 培养。由图3 .2 可知，兼养的耗糖曲线相对串养的要陡些，说明兼养的耗糖速率 比串养快。刚开始培养第一天，两者的耗糖速率都很慢，而从第二