（环境科学专业论文）三株轻度嗜盐反硝化菌的分离鉴定和降解特性初探.pdf

a b s t r a c t i nr e c e n ty e a r s ，d u et ot h er a p i dd e v e l o p m e n to fi n d u s t r ya n da g r i c u l t u r e ，t h ec o n t e n t o fn i t r a t ei nt h ew a s t e w a t e rd i s c h a r g e di n t ot h ew a t e ri sb e c o m i n gh i g h e ra n dh i g h e ra n d h a v ec a u s e d s e r i o u se u t r o p h i c a t i o n ，t h eq u a l i t yo fw a t e rd e p r a v a t i o na n dt h el a k e d e g e n e r a t e s o m e t i m e s ，t h ec o n t a m i n a t e dw a t e rw i l lt h r e a t e nt h ep e o p l eh e a l t ha st h e w a t e rs o u r c a t h eb i o l o g i c a ln i t r o g e nr e m o v a lp r o c e s sh a sm a n y a d v a n t a g e ss u c ha sc h e a pi nc o s t , e a s yi no p e r a t i o n , c o n v e n i e n ti nt r e a t m e n ts oi th a sb e e nw i d e l yu s e di nw a s t e w a t e r t r e a t m e n t i np e t r o l e u m ，c h e m i c a l ，s e a f o o dp r o c e s si n d u s t r y , m o s to ft h ed i s c h a r g ei s h y p e r s a l i n ew a s t e w a t e r i nh i g h - s a l te n v i r o n m e n t ，t h es a l t i n g - o u te f f e c tm a yd e c r e a s et h e m i c r o o r g a n i s m s d e h y d r o g e n a s ea c t i v i t y , l e a dt om i c r o b i a lc e l l sr u p t u r e s o m e t i m e s ，t h e s a l t i n g - o u te f f e c te v e nc a u s ed e a t ho fm i c r o b i a l s ot h eh i g hs a l tc o n c e n t r a t i o nh a sa n e g a t i v ei m p a c to nt h eb i o l o g i c a ln i t r o g e nr e m o v a le f f e c t t h e r e f o r e ，t h ei s o l a t i o no f d e n i t r i f y i n gb a c t e r i af r o mh y p e r h a l i n eh a b i t a t s w i l lp r o v i d ear e f e r e n c ev a l u ef o r h y p e r h a l i n eb i o l o g i c a ln i t r o g e nr e m o v a lp r o c e s s i nt h i s p a p e r , w eh a v ea c c o m p l i s h e dt h ee n r i c h m e n t ，i s l a t i o na n ds c r e e n i n g e x p e r i m e n t sf r o mt h es a l t - t o l e r a n ts l u d g es y s t e m su s i n gn i t r a t e 舔t h es o l en i t r o g e ns o u r c e s i xs t r a i n so fh a l o t o l e r a n td e n i t r i f y i n gb a c t e r i aw e r ep r e l i m i n a r yi s l a t e df r o mt h e a c t i v a t e ds l u d g e a c c o r d i n gt ot h ed e g r a d a t i o nc h a r a c t e r i s t i c so fv a r i o u ss t r a i n s ，w e s e l e c t e dt h r e eo ft h e mf o rt h ef o l l o w i n gt e s t s a c c o r d i n gt ot h em o r p h o l o g i c a lo b s e r v a t i o n ，p h y s i o l o g i c a lb i o c h e m i c a lt e s ta n d s e q u e n c ea n a l y s i so ft h e16 sr d n a ，s t r a i nf x lw a si d e n t i f i e d 嬲p s e u d o m o n a s 跟；s t r a i n y l 一1w a si d e n t i f i e da sd i e t z i as p ；s t r a i ng y lw a si d e n t i f i e d 弱h a l o m o n a s s p w eh a v ei n v e s t i g a t e ds e v e nd i f f e r e n te f f e c tf a c t o r se f f e c t i n gt h ed e g r a d a t i o n c h a r a c t e r i s t i c ss u c ha ss a l i n i t y , d o ，i n o c u l u mc o n c e n t r a t i o na n ds oo nt og e tt h eo p t i m a l d e g r a d a t i o nc o n d i t i o no f e a c hs t r a i n t h eh e t e r o t r o p h i cn i t r i f i c a t i o np e r f e r m a n c eo ft h et h r e eb a c t e r i ah a sb e e nf o u n d w h e nt h e s et h r e eb a c t e r i aw e r ec u l t u r e di nt h ed m m e d i u m ，t h e yh a v eh i g h e rn i t r o g e n r e m o v a le f f i c i e n c y a n dt h er e l a t i o n s h i po fa e r o b i cd e n i t r i f i c a t i o na n dh e t e r o t r o p h i c n i t r i f i c a t i o np e r f e r m a n c ea b o u tf x lw a sd i s c u s s e d t h er e s u l ts h o w e dt h a ta e r o b i c d e n i t r i f i c a t i o nc a np r o m o t et h ee f f e c to f h e t e r o t r o p h i cn i t r i f i c a t i o n 2 t h e s et h r e eb a c t e r i aa r ea e r o b i cd e n i t r i f y i n gb a c t e r i aw h i c hc a ns i m u l t a n e o u s l y p e r f o r mh e t e r o t r o p h i cn i t r i f i c a t i o n , s ot h e yc a l lr e a l i z es i m u l t a n e o u sn i t r i f i c a t i o na n d d e n i t r i f i c a t i o n ( s n d ) t h et h r e eb a c t e r i ac a l la c h i e v es n di nh y p e r h a l i n ee n v i r o n m e n t ，s oo u rt e s t sh a v e b i ga p p l i c a t i o nv a l u ef o rn i t r o g e nr e m o v a lo fh y p e r h a l i n ew a s t e w a t e r k e yw o r d s ：h a l o t o l e r a n t ，a e r o b i cd e n i t r i f y i n gb a c t e r i a ，p h y l o g e n e t i ca n a l y s i s ， d e n i t r i f i c a t i o n ，h e t e r o t r o p h i cn i t r i f i c a t i o n 3 学位论文独创性声明 学位论文独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文系本人在导师指导下独立完成的研究成果。文中 依法引用他人的成果，均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上 已属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的论文或成 果。 本人如违反上述声明，愿意承担由此引发的一切责任和后果。 论文作者签名：弯p 4 良万，j 醐啪7 年例猸 学位论文知识产权权属声明 本人在导师指导下所完成的学位论文及相关的职务作品，知识产权归属学校。 学校享有以任何方式发表、复制、公开阅览、借阅以及申请专利等权利。本人离校 后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名单位仍然为 青岛大学。 本学位论文属于： 保密口，在年解密后适用于本声明。 不保耐 ( 请在以上方框内打“”) 论文作者张带蜘 嗍1 年月上同 导师签名：芗侈1 乞萝 r 期：夕歹年月，zr ( 本， i 明的版权门青岛火学所有，未经许可，任何单位及任何个人不得擅自使用) 8 0 青岛大学硕士学位论文 第一章综述 随着人类文明的进步和工农业的快速发展，环境负效应随之而来，其中水污染 问题备受瞩目。由于工业废水的大量排放、化学氮肥和畜禽粪肥的过量施用l l j ，全 球许多地区的水体都受到了硝酸盐的污染，我国大部分地区的地下水也遭受到不同 程度的硝酸盐污染l z j 。 在我国的北方地区，一般以地下水作为生活用水且多数是浅层地下水，受到硝 酸盐污染一般都比较严重，其对人们健康的危害特别大。可见硝酸盐污染水体的治 理及防治已迫在眉睫，当前硝酸盐污染问题已被各国政府列入议事日程中，也引起 了广大科技工作者的极大关注。目前世界各国已经制定了一系列标准来限制硝酸盐 的排放和控制饮用水中的硝酸盐含量。 1 1 水资源现状 1 1 1 水资源危机 水是地球上一切生命赖以生存、人类生产生活必不可少的宝贵的自然资源。地 球上水的总储量约1 3 8 6 亿m 3 ，其中9 7 以上是海水，淡水只占2 5 3 。在占地球 总水量2 5 3 的淡水中，两极冰盖和高山冰川中储水目前也无法直接利用，便于人 们利用的只有河水、淡水湖水和浅层地下水，仅占地球总水量的0 2 左右。若把地 球上所有的水比喻为一桶水，那么可用的淡水只有几滴。现在全世界有8 0 个国家约 2 0 多亿人口正面临着淡水资源危机，其中2 6 个国家的2 亿多人正生活在缺水状态。 联合国警告说，到2 0 2 5 年，世界将近一半的人口将会生活在缺水地区，5 0 年 后每个国家里将有l 4 的人要面临缺水的困扰【3 】。我国虽然拥有2 8 1 亿m 3 的水资源 总量，但由于人口众多，人均水资源量仅为世界人均水资源量的1 4 ，是缺水国之一， 水资源短缺已经成为我国很多地区国民经济和社会发展的最大制约因素【4 j 。 1 1 2 我国水资源现状 随着经济的发展和人口的增加，排放到环境中的污染物r 益增多。目前，我国 的江河湖库及近海海域普遍受到不同程度的污染，总体上呈加重的趋势，三河、三 湖( 淮河、海河、辽河；太湖、巢湖、滇池) 污染严重。 2 0 0 7 年中国环境状况公报显示【5 】，全国地表水污染依然严重，七大水系总体为 中度污染，湖泊富营养化问题依然突出。长i j ：、黄河、珠江等七大水系水质与上年 齐平，1 9 7 条河流的4 0 7 个断面中，i - - 1 1 1 类、i v 、劣v 类水质的断面分别 第一章综述 为4 9 9 、2 6 5 和2 3 6 。其中，珠江、长江总体水质良好，松花江为轻度污染， 黄河、淮河为中度污染，辽河、海河为中度污染。 我国大部分湖泊、水库已达到富营养化或超过富营养化程度。2 8 个国控重点湖 库中，v 的5 个占1 7 9 ；劣v 类的1 1 个，占3 9 3 。太湖、滇池总体水质为劣v 类，巢湖总体为v 类，均为重度污染。 水体污染和水质富营养化问题迫使很多国家和地区制定严格的氨、氮排放标准。 我国的污水综合排放标准( g b 8 9 7 8 1 9 9 6 ) ) ) 也明确规定了适用于所有排污单位非常 严格的氨氮排放标准，这意味着今后大多数城市污水和工业废水处理厂都必须考虑 废水的脱氮处理。 1 1 3 硝酸盐污染与反硝化 由于工农业生产的迅速发展，氮素经各种途径输入水系，促使了水体富营养化 的发展，水域污染越来越严重。引起水体富营养化的因子之一就是硝酸盐。 硝酸盐在人体内可被还原为亚硝酸盐。亚硝酸盐与人体血液作用，形成高铁血 红蛋白，从而使血液失去携氧功能，使人缺氧中毒，轻者头昏、心悸、呕吐、口唇 青紫，重者神志不清、抽搐、呼吸急促，抢救不及时可危及生命。不仅如此，亚硝 酸盐在人体内外与仲胺类作用形成亚硝胺类，它在人体内达到一定剂量时是致癌、 致畸、致突变的物质，可严重危害人体健康。根据世界卫生组织规定，硝酸盐含量 不能超过l o m “7 1 。所以现在各国对饮水中硝态氮含量有比较严格的规定。我国饮 用水水质标准中规定硝态氮含量不大于1 0 m l 【8 】。然而，长期以来，脱氮主要强调 污水中氨氮的脱除，不对硝态氮进行处理，导致水体中硝酸盐含量不断升高。 因此，面对硝酸盐的污染问题，人们必须想办法将化合态氮转变为分子态氮， 对反硝化作用的研究就是在这样的大背景下开始的。 生物反硝化脱氮是近年来大力开发并广泛应用的废水处理技术。生物反硝化脱 氮同化学、物理除氮相比，具有运行费用低、除氮效果高的优点，并且可杜绝难以 处置的化学污泥，因此该技术在国内外得到迅速的推广。 反硝化作用是微生物还原硝酸盐为亚硝酸盐、氨和氮气的作用，又称脱氮作用 t 9 】。利用反硝化作用能消除土壤和水体中过多的硝酸盐，因此反硝化作用己经引起 越来越多的关注 1 2 好氧反硝化研究进展 1 2 1 好氧反硝化的发现 2 青岛大学硕士学位论文 2 0 世纪8 0 年代中期以来，人们在各种不同的环境中如土壤、沟渠、池塘、活性 污泥、沉积物等分离出了一些好氧反硝化菌。最早提出好氧反硝化的是r o b e r t s o n 和 k u e n c n 1 0 1 ，他们在除硫和反硝化处理系统的出水中首次报道分离出好氧反硝化菌泛 养硫球菌t h i o s p h a e r ap a n t o t r o p h a ( 现更名为脱氮副球菌p a r a c o c u sd e n i t r i f i c a t i o n s ) 、假 单胞菌属( p s e u d o m o n a s 踱) 和粪产碱菌( a l c a l i g e n e s f a e c a l i s ) 。试验结果证明：在菌 体生长过程中，0 2 和n 0 3 - - n 共同存在时，其生长速度和反硝化速率比两者单独存在 时都高。此后国内外有很多的研究证明好氧反硝化菌的存在，许多不同种属的好氧 反硝化菌被筛选出来u 。 近些年来研究者不断的在实际工程中发现好氧条件下的脱氮现象。另外在许多 实际运行中的好氧硝化池中常常发现有3 0 左右的总氮损失，这些现象充分证实了 好氧反硝化现象的存在。 1 2 2 细菌好氧反硝化作用机制 图1 1 细菌反硝化过程中的电子传递模型 早期理论认为，0 2 的得电子能力阻止了电子传递给n 0 3 - 或n 0 2 。，从而抑制了 反硝化的进行。而最近研究结果表明，某些细菌的好氧反硝化酶系和好氧呼吸系统 同时存在。n 0 3 - 被还原的同时0 2 被还原，氧并不是抑制反硝化酶活性和反硝化酶生 3 第一章综述 成的直接因素。缺少 n 0 3 - 或0 2 都会降低细菌的生长率和反硝化率。w i l s o n t l 2 1 等人 提出了细菌反硝化过程中的电子传递模型如图1 1 所示。 从图1 1 可看出：n 0 3 。、0 2 均可作为最终的电子受体。反硝化菌可将电子从被还 原的物质传递给0 2 ，同时也可通过硝酸还原酶将电子传递给n 0 3 。 h 硝酸盐还原酶( n a r ) 由于一些细菌能够利用硝酸盐作为最终电子受体，膜结合硝酸盐还原酶在一些 菌种中得到鉴定。 b e l l 1 3 。4 】等人把厌氧条件和好样条件下生长的t p a n t o t r o p h a 细胞分离为细胞质 膜部分和周质部分，并利用b 矿和n a d h 对分离的细胞质膜和周质进行了化验研究。 该酶一般以两种形态存在：一种是膜质硝酸盐还原酶；另一种是周质硝酸盐还原酶， 这两种硝酸还原酶的作用产物称为亚硝酸盐。 这两种酶的催化特性的主要区别为：膜质硝酸盐还原酶活性可以和n a d h 脱氢 酶活性结合起来，而周质硝酸盐还原酶缺不能与之结合；膜质部分可以催化n a d a 依赖型和b 旷氯酸盐还原酶，但周质部分不具有这种功能。 亚硝酸盐还原酶( d n i r ) 亚硝酸盐还原反应由亚硝酸盐还原酶( d n i r ) 催化。该酶分布于细胞壁与细胞膜 之间，有两种类型：一种是人们最熟悉的细胞色素c d l ，为二聚体，能将亚硝酸盐转 化为n o 和n 2 0 的混合物；另一种是一种可溶性含铜酶，含c u 活性中心，位于细胞周 质上。在很长时间内，一直认为n 2 0 是d n i r 的作用产物。细胞色素c d l 型亚硝酸还原 酶是一种双功能酶，它能催化亚硝酸得到一个电子转变成n o ，并使0 2 得到4 个电子生 成【1 5 】。最近研究发现，一种四血红素c 型细胞色素n a p c 能增强c d l 型亚硝酸还原酶 的活性【。 n o 还原酶( n o r ) n o 还原反应由n o 还原酶m o r ) 催化。目前，关于好氧反硝化菌的一氧化氮还原酶 方面的报道还比较少。该酶结合于细胞膜内，已在p s t u t z e r i 和p d e n i t r i f i c a t i o n s 等细菌 中分离提纯，是四个脱氮酶中最后被分离到的酶，伴随n o 的还原有a t p p _ - l f i e 1 7 舶】。 好氧反硝化细菌的一氧化氮还原酶是一种膜结合的细胞色素b c 型酶，它由2 个亚 基组成，其大亚基n o r b 是疏水性细胞色素b 类，小亚基n o r c 是细胞色素c 类。每个n o r 中含有两个血红素基团和几个非血红素的铁，后者的功能尚不清楚n 螂1 ，它的作用 产物是n 。0 。该酶很不稳定，这也是很久以来未被鉴定的原因之一。 卿n 2 0 还原酶( n o s ) n 2 0 还原反应由n 2 0 还原酶( n o s ) 催化。该酶位于细胞壁与细胞膜之间，是一种含 4 青岛大学硕十学位论文 铜蛋白，作用产物是n 2 。n 2 0 还原酶存在于周质中，根据氧化还原特性和光谱学分 析可分1 个a 型铜和1 个z 型铜。该酶的每个亚基都包含6 个c u 原子，它们排列成2 个 不同类型的活性中心，一个是双核电子传递位点c u a ，另一个是四核催化位点c u z t 2 。 反硝化过程中还有一些细胞色素、c y t c5 5 4 等的参与。它易受低p h 的抑制，对氧的敏 感性也高于其它脱氮酶。由于n 2 0 还原酶受到抑制，在高浓度和低p h 的环境中，n 2 0 常成为反硝化的主要产物。 1 2 3 好氧反硝化的影响因素 1 2 3 1 碳源 无论是利用氧气或氮氧化物作为电子受体，都需要相应的电子供体存在才能形 成完整的产能过程。反硝化微生物大多需要碳源作为电子供体，碳源的种类在很大 程度上影响到反硝化性能。碳源是生物反硝化过程所必不可少的一种物质，可以利 用的碳源种类较多，如糖、醇、有机酸等化合物，但各种碳源对反硝化的促进程度 不同。 殷芳芳2 2 1 研究了低温环境下反硝化细菌对各种碳源的直接反应，以甲醇、乙醇、 乙酸钠、丙酸钠、葡萄糖、生活污水及内源物质为碳源，试验结果表明：乙酸钠为 碳源时的最大比反硝化速率( m a x i m u ms p e c i f i cd e n i t r i f i c a t i o nr a t e ，m s d r ) 最高，但 是其反硝化效率( d e n i t r i f i c a t i o ny i e l d ，d r ) 最低，而且存在亚硝酸盐积累现象。甲醇 为碳源时的m s d r 相比其他几种单一碳源要低，反硝化细菌对甲醇碳源需要一定时 间的适应。 于爱茸【2 3 】等发现其筛选的反硝化菌株b a c i l l u sw 2 ，分别以葡萄搪、蔗搪、乳搪 和甲醇为碳源时，其反硝化作用相差很大。其中，当以葡萄糖为碳源时，其反硝化 作用相对最好；以蔗糖和乳糖为碳源时，反硝化作用次之，速度较慢；当以甲醇为 碳源时，虽有反硝化作用，但是速度十分缓慢。 1 2 3 2 碳氮比 好氧反硝化作用中，碳源作为电子供体，氧和硝酸盐共同作为电子受体。有机 碳源作为反硝化菌的碳源和能源，在有氧的条件下，要同时为氧和硝酸盐或亚硝酸 盐提供电子，因而有机物的浓度越高，反硝化的速度越快。 一般情况下，柠檬酸杆菌( c i t r o b a c t e rd i v e r s u s ) 在c n 为4 - - 5 时，反硝化速率达到 最大【2 4 1 ，在低于4 的情况下，随c n 的降低，有机碳源浓度较低不能为反硝化提供做 够的能量，反硝化速率逐渐减小【2 5 1 ，也容易导致亚硝酸盐的大量积累和n 2 0 释放量 增加【2 6 1 。k a t a r z y n ab e n l a t 的研究结果表明：t h i o s p h a e t ap a n t o t r o p h a 的适宜c n 波动 范围较大，为1 9 1 0 4 【2 ”。 1 2 3 3 温度 5 第一章综述 温度对微生物的生长、繁殖关系非常密切，温度的变化直接影响酶反应动力学、 微生物生长速度以及化合物的溶解度等，因而对温度对污染物的降解转化起着关键 作用。微生物在适应温度范围内，随温度逐渐提高，代谢活动加强，生长、增殖加 快；超过最适温度后，生长速率逐渐降低，生长周期也延长。 温度对反硝化作用的影响比其他的废水生物处理过程要明显。对反硝化作用来 说，最适宜的运行温度是2 0 4 0 c ，低于1 5 4 c 时，反硝化速率明显下降，而温度低于 5 c 时，反硝化过程虽能进行但反硝化速率极低。曾庆副2 8 】对一株地衣芽孢杆菌研究 结果表明：在c o d m n 为3 3 0m l ，温度为2 0 4 c 时，亚硝酸盐积累比较严重，直接导 致了反硝化脱氮率的降低，在2 8 或者3 7 时，反硝化作用进行得比较完全。进一 步的研究表明：随着c o d m n 的降低，在2 0 。c 、2 8 c 、3 7 c 时的脱氮率逐渐降低。c o d m b 相同时，2 8 和3 7 时的反硝化作用没有明显差别，但都显著优于2 0 c 时的情况。 1 2 3 4p h 环境的p h 值不仅影响反硝化速率，而且还影响到反硝化的最终产物。当p h 低于 6 0 - - 6 5 时，反硝化作用受到一定抑制【2 9 1 ，最终产物中n 2 0 占优势；当p h 大于8 时， 会出现n 0 2 的积累，并j ；1 p h 愈高，n 0 2 积累愈严重，但它们彻底还原n 0 3 。和n 0 2 的 总时间相同，研究发现高p h 值抑制了亚硝酸盐还原酶的活性所致【3 。另一方面，p h 直接影响废水中氮的存在形式p 。 不同的反硝化菌最适的p h 不同，a l e x a n d e r l 3 2 】以脱氮副球菌、脱氮假单胞菌、铜 绿假单胞菌和地衣芽孢菌做实验，发现他们反硝化最适宜p h 范围分别在7 - 8 、6 7 、 7 - - - 8 和7 8 。李树刚【3 3 】从以乙酸纳为碳源的富集培养物中分离筛选出三株脱氮活性 较高的菌株( 分别编号为b 5 、b 9 和b 1 3 ) ，三株菌适宜在偏碱条件p h 7 5 8 5 条件下 进行，p h 低于7 0 和高于9o 脱氮速率下降。 总之，大多数学者【蚓认为反硝化的最佳p h 在中性和微碱性之间，当环境偏离这 一最佳值时，反硝化速率逐渐下降。 1 2 3 5 溶解氧( d o ) 溶解氧对反硝化的影响也比较大。d o 值增大，由于n 2 0 还原酶受到抑制，致使 产生更多的n 2 0 t 3 5 - y 。 有些研究表明：好氧反硝化菌的降解性能不受d o 的影响。s u 等人【3 8 】分离到1 株 反硝化细菌p s e u d o m o n a ss t u t z e r is u 2 ，当气体中0 2 浓度为9 2 时，其反硝化率在9 0 h 之内达到9 9 2 4 ，好氧反硝化细菌的反硝化率不受0 2 浓度的影响。h u a n ghk 的研 究表明：p s e u d o m o n a ss p 在d o 浓度为4 m g l 时仍具活性，在d o 低于2 m g l 时，其 反硝化活性反而减弱；柠檬酸杆菌对d o 的耐受性也优于其它好氧反硝化菌，可达 5 m g l t 3 9 】。 6 青岛人学硕士学位论文 1 2 4 已经发现的反硝化菌及特性 能够进行反硝化的微生物很多，近年来一些好氧反硝化菌株相继被分离出来。 他们不属于一个特定类群，已知多个不同菌科的5 0 多属各类营养类型微生物都可以 进行反硝化【4 0 4 5 1 ，如表1 1 所示。 表1 1 已经发现的好氧反硝化细菌 反硝化菌最终产物 a l c a l i g e n e s 产碱杆菌属 n 2 p a r a c o c c u s副球菌属 n 2 p s e u d o m o n a s假单胞菌属 n 2 b a e i l l u s 芽孢杆菌属 k 1 e b s i e l l a 克雷伯氏菌属n 2 h a l o b a c t e r i u m盐杆菌属 n 2 p s y c h r o b a c t e r 嗜冷杆菌 n 2 a g r o b a c t e r i u m 土壤杆菌属n 2 r h o d o c o c c u s红球菌属 c o m a m o n a s丛毛单胞菌 n 2 o c h r o b a c t r u m 苍白杆菌属n 2 z o o g l o e a 动胶菌属n 2 从国内外的研究现状可见，具有好氧反硝化能力的细菌是种类很多，不同菌属 中都有可能存在好氧反硝化菌。但由于缺乏统一的测定好氧反硝化能力的标准，导 致测定条件和好氧反硝化能力的表示方式不同，在一定程度上影响了各菌株之间好 氧反硝化能力的比较。 1 3 异养硝化研究进展 1 3 1 异养硝化的发现与验证 异养硝化的研究始于1 9 世纪末和2 0 世纪初，在土壤的硝化过程中被发现。然 而该现象主要是在野外环境中，异养硝化过程难以监测和确定，所以关于异养硝化 的研究发展比较缓慢，但是目前国内外已有大量关于异养硝化现象的报道 4 6 - 4 8 】。 肄养硝化菌具有生长速率快、细胞产量高的优点，需要的d o 不高，并且能耐受酸性 蚪境片 1 活性高4 9 1 。 7 第一章综述 由于异养硝化菌的出现，工艺上可以实现在一个反应器里完成硝化反硝化，现 解决了传统生物脱氮处理启动时间长、硝化环节条件要求苛刻、硝化和反硝化不能 同步进行等缺点，具有较好的发展前景，异养硝化菌同益受到人们的重视。 1 3 2 异养硝化的原理 异养硝化菌在代谢底物时，有着与自养硝化菌相似的酶系统，即先由氨单加氧酶 ( a m m o n i am o n o o x y g e n a s e ，a m o ) 催化铵氧化，得到羟胺，然后由羟胺氧化酶 ( h y d r o x y l a m i n eo x i d a s e ，h a o ) 催化进一步氧化得到亚硝酸 矧。 n 氨单加氧酶( a m o ) 在对异养硝化菌t p a n t o t r o p h a 的a m o 的研究中发现，t p a n t o t r o p h a 的a m o 有很 多特性与自养硝化菌相似。但是，与自养硝化菌不同，t p a n t o t r o p h a 的a m o 需要 n a d p h 作辅酶，对光敏感，镁离子能刺激其活性【”】。并且，该酶对羟胺敏感程度远大 于自养硝化菌 5 2 】。 o 羟胺氧化酶( h a o ) w e h r f r i t z 等【5 3 】从t p a n t o t r o p h a 纯化的h a o 是一种溶解性的单体周酶，2 0 k d a ，铁离子能提高其活性，螯合剂e d t a 会抑制其活性。这个酶与自养硝化菌的h a o 有 很大的不同，它可以使用周质还原蛋白、细胞色素c 5 5 1 和亚硝酸盐还原酶作为反硝 化酶。 1 3 3 已经发现的异养硝化菌及特性 异养硝化菌较自养硝化菌具有生长速率快、细胞产量高的优点，近年来一些异 养硝化菌株相继被分离出来，他们不属于一个特定类群，如表1 2 所示 5 4 - 6 2 。 表1 2已经发现的异养硝化菌及特性 异养硝化菌硝化产物 羟胺n 0 2 n 0 3 一 a l c a l i g e n e s f a e c a l i sn o 4粪产碱杆菌 + a c i n e t o b a c t e rs p 不动细菌属 | + + b a c i l l u ss p p 芽孢杆菌 a c i n e t o b a c t e rs p y y 4 不动细菌属 | + p s e u d o m o n a sa l c a l i g e n e sa s - 1产碱假单胞菌| b a c i l l u ss u b t i l i s 5 8 枯草芽孢杆菌 | + b a c i l l u ss p l y 杆菌 + + 8 青岛人学硕士学位论文 ia l c a l i g e n e s f a e c 口l ss u b s p p a r a f a e c a l i s 粪产碱杆菌 |+ l 口枷口c i l l u ss p l y 短芽孢杆菌属 注：+ ：检测到产物生成：一：未检测到产物生成：文献未提及 1 3 4 异养硝化在污水脱氮中的应用 目前，关于异养硝化菌的的应用研究还停留在实验室规模的小试阶段。 a n s h u m a n “6 3 】从活性污泥中分离出八株异养硝化菌，通过对它们的异养硝化性能进 行研究发现：其中四株菌h p c8 0 5 、8 1 5 、8 2 和8 5 6 的c o d 和氨氮去除率分别为8 5 - - 9 3 和9 2 - 9 6 ，八株异养硝化菌均具有较好的异养硝化性能。 杨宗政m 】为提高水处理过程中的脱氮率，实现好氧条件下对总氮的去除，通过试 验分离出一株异养硝化菌，将该茵扩大培养后接种于活性污泥系统并进行了处理模 拟废水的试验。结果表明：用该菌株强化的活性污泥系统对以氨氮、亚硝酸盐氮、 硝酸盐氮为惟一氮源、葡萄糖为唯一碳源的人工合成废水进行处理，4 h 的总氮去除 率分别为8 5 、6 0 、7 0 。 林燕等畔】从具有8 0 1 的s n d 效果的m b r 系统中分离筛选出2 株异养硝化细 菌，通过批式试验考察了它们的硝化性能。结果表明，b a c i l l u ss p l y 及b r e v i b a c i l l u s 踱l y 具有异养微生物的性质，在充分利用有机碳进行有氧呼吸的同时还具有较强 的硝化及脱氮能力。2 4 d 好氧培养后，c o d 的去除率分别为7 1 7 及5 2 6 ；氨氮 的转化率分别为7 8 2 及5 1 2 ；总氮的转化率分别为6 9 2 和3 5 6 。 1 3 5 异养硝化一好氧反硝化菌 研究者【6 5 】发现许多异养菌不但能完成有机氮和无机氮( 氨氮) 的硝化过程，而且 这些异养菌中的大部分具有在缺氧或好氧条件下的反硝化能力，即这些异养硝化菌 同时也是好氧反硝化菌。目前已知的有p s e u d o m o n a ss p p ，a l c a l i g e n u sf a e c a l i s ， p a r a c o c c u s p a n t o t r o p h u s 和t h i o s p h a e r ap a n t o t r o p h a 等，这些微生物均可在好氧条件 下将亚硝酸根离子或硝酸根离子还原为氮气。 随着越来越多的异养硝化一好氧反硝化菌不断地被筛选出来，揭示了异养硝化 好氧反硝化作用的广泛性。对这种现象展开持续而深入的研究，说明在工艺上可以 实现在一个反应器里完成硝化反硝化，并为废水的生物脱氮处理带来更广阔的前景。 1 4 本论文研究的目的和意义 水体富营养化是当今我国水环境面临的重大问题，我国七大水系- f t 近 f 4 , i 段 9 第一章综述 污染严重，全国湖泊约有7 5 的水域受到显著污染，水体富营养化问题严重地阻碍 着我国国民经济的发展，因此水体脱氮在废水处理过程中显示越来越重要的位置。 生物脱氮原理是通过硝化细菌将氨氮氧化为亚硝酸盐至硝酸盐、反硝化细菌将 硝酸盐还原为氮气。生物脱氮工艺因具有处理效果好、处理成本低，操作管理方便 等优点而得到广泛应用，为水体中氮的去除提供了有效手段。在石油、化工、海产品 加工和养殖等行业中，外排含氮废水大多具有高盐的特点。研究表明，在高盐环境 下由于盐析作用致使微生物的脱氢酶活性降低；盐浓度升高时，水的渗透压也会随之 升高，使微生物细胞脱水引起细胞原生质分离，从而导致微生物细胞破裂而死亡忡j ， 因此高盐浓度对生物脱氮的效果带来不利影响。 国内外对于高盐度废水生物处理的的研究多集中在以下几个方面：盐度对生物 处理系统污染物去除效果和活性污泥沉降性能的影响；污泥在含盐环境的驯化过程 中优势菌群、微生物相的变化。大多数文献没有明确研究活性污泥中具有特定处理 功能的各菌群( 硝化菌、反硝化菌以及聚磷菌) 在受到盐度冲击时所能承受的盐度范 围，以及盐度对其活性和去除效果的影响。高盐这一特殊生境中反硝化细菌的分离 培养和特性研究将有助于了解高盐生物脱氮工艺的可行性。 本论文在实验室已驯化成熟的嗜盐污泥系统基础上，采用硝酸钾作为惟一氮源， 进行嗜盐反硝化菌的富集、分离和筛选，对各菌株进行生理生化特性分析与种类鉴 定。以脱氮率为指标评价菌株的脱氮性能，研究不同初始培养条件( 盐度、温度、p h 、 碳源、碳氮比等) 对菌株反硝化性能和脱氮性能的影响，并初步研究各菌株的异养硝 化性能，优选对高盐环境适应性强的高性能嗜盐反硝化细菌。 本研究内容是对高盐环境下生物脱氮新理论和新技术的有力补充，具有新颖的 学术研究价值和广阔的实用价值，能对高盐生物脱氮提供指导和借鉴作用。 1 5 主要研究内容和解决的主要问题 本试验从m b r 工艺经过长期驯化的嗜盐活性污泥中，富集、分离、筛选出耐高 盐度的反硝化细菌，根据各菌株降解能力的不同优选降解性能好的优势菌株，首先 研究各菌株的形态特性、生理生化特性，对菌株进行分子生物学鉴定；其后研究了 菌株在不同的环境因素条件下以及在不同盐度下的降解性能。 主要研究内容如下： ( 1 ) 反硝化菌株的富集、分离 取m b r 反应器中的活性污泥用高速组织捣碎机处理后，以7 天为一个周期用 反硝化细菌液体培养基富集培养，取富集后的培养液用极限稀释涂布法将稀释液涂 | ，板洲wj i3 0 。c 的恒温培养箱中培养一周挑取单菌落并进行纯化培养。 2 fj 1 誓i f ，l 、f l ，j 带选 1 0 青岛大学硕十学位论文 将上述培养出的代表性细菌的单菌落接种于液体培养基中在气浴恒温振荡培养 器中3 0 恒温培养。定时取培养液测定硝态氮和亚硝态氮的变化量，根据各菌株的 反硝化速率和总氮去除率判断其反硝化性能的强弱，同时考察菌体生长代时和生长 稳定性，最终选出降解性能较好的优势菌株，做进一步鉴定和性能测试。 ( 3 ) 菌株的鉴定 菌株的鉴定采用传统方法和分子生物学两种方法进行鉴定。 传统的鉴定方法主要依据常见细菌系统鉴定手册【67 】和伯杰细菌鉴定手册 【6 8 1 ，从菌株个体形态特征、菌落特征、生理生化特征等方面进行。 ( 4 ) 研究不同培养条件对菌株的降解特性的影响，找出最佳脱氮条件，并考察 混合菌株情况下的降解效果。 研究不同盐度、d o 、p h 值、温度、碳源、接种量和c n 比对各种菌反硝化作 用和脱氮作用的影响，确定最佳的反硝化条件，并对混合菌株的降解效果进行初步 研究，为确定投加嗜盐菌处理高盐度废水的工艺参数提供试验依据。 ( 5 ) 初步研究菌株的异养硝化效果 据报道某些好氧反硝化菌会有异养硝化效果，故本实验也将考察验筛选的嗜盐 反硝化菌的异养硝化情况，并初步考察各种环境因子对其异养硝化作用的影响 第二章实验材料及方法 2 1 实验材料 2 1 1 实验仪器 第二章实验材料及方法 实验所涉及的主要仪器有：光学显微镜( c x 3 1 ) ，7 2 0 0 分光光度计( u n i c ) ，高 压火菌锅( y x q l s 一5 0 s i i ) ，生化培养箱( s p x 1 5 0 b z ) ，气浴恒温振荡- 器( t h z - 9 2 a ) ， 超净工作台( s w - c j i f ) ，数显恒温水浴锅，高速冷冻离心机，6 0 1 0 型便携式p h 计，电子天平，溶解氧仪( s e n s od i r e c to x 2 4 ) ，p c r 仪，电泳仪等。 2 1 2 富集培养基 富集培养基：f m 培养基是好氧反硝化菌的富集培养基，是在牛肉膏及蛋白胨培 养基基础上添加硝酸钾配置而成，对好氧反硝化菌具有富集及诱导好氧反硝化酶表 达的效果。本实验采用的富集培养基是在f m 培养基的基础上增加2 n a c i ，培养基 的具体配方如下： 富集培养基( l ) ：牛肉膏1 o ；蛋白胨5 0 ；k n 0 31 o ；n a c i2 0 ；p h 值7 2 。 2 1 3d m ( 高盐) 培养基 d m ( 高盐) 培养基：该培养基是在d m 培养基【6 9 】的基础上增加2 的盐度，该 培养基在为好氧反硝化菌提供丰富的碳源及氮源的同时，也提供了多种微量元素， 同时还具用良好的缓冲效果。具体配方如下： d m 培养基( g l ) ：k n 0 3l ；k 2 h p 0 4 3 h 2 07 9 ；k h 2 p 0 4 1 5 ； c h 3 c o o n a5 ；m g s 0 4 7 h 2 00 1 ；n a c l2 0 ；微量元素2 m l ；p h7 2 7 4 ； 其中c h 3 c o o n a 、k n 0 3 的量可根据实验要求进行调整，固体培养基加2 琼脂。 微量元素溶液( l ) ：n a 2 e d t a6 3 7 ；z n s 0 42 2 ；c a c l 2 5 5 ； m n c l 2 - 4 h 2 05 0 6 ；f e s 0 4 7 h 2 05 o ；n a 2 m 0 0 4 4 h 2 0 1 1 ；c u s 0 4 5 h z o 1 5 7 ； c o c l 2 6 h 2 01 6 1 ：p h7 0 。 2 1 4 异养硝化培养基 异养硝化培养基( g l ) 【7 0 】：异养硝化培养基是测试异养菌的硝化效果的一种培 养基，其中添加氨氮作为唯一碳源。具体