（环境科学专业论文）两种典型手性农药的生态毒理差异研究.pdf

浙江大学硕士学位论史 性的差异。精甲霜灵对体长和幼蚤数母蚤影响比对胎数母蚤的影响更大，而对产蚤 时间没有明显的影响。而同一浓度甲霜灵和精甲霜灵对大型蚤的外观体征影响差别不 是很明显。大型蚤的慢性实验结果表明，精甲霜灵对大型蚤的毒性比甲霜灵大。 关键词：手性选择性；家蚕： r a c 异丙甲草胺；s 异丙甲草胺；酶活性；甲霜灵；精 甲霜灵；大型蚤 1 1 浙江人学硕i 一学位论文 a b s t r a c t a b o u t2 5 o fc u r r e n t l yu s e dp e s t i c i d e sa r ec h i r a l ，a n dt h i sr a t i oi si n c r e a s i n gw i t ht h e i n t r o d u c t i o no fm o r es t r u c t u r e - c o m p l e xp e s t i c i d e sac h i r a lp e s t i c i d eh a st w oo rm o r e e n a n t i o m e r st h a ts h a r et h es a m ep h y s i c o c h e m i c a lp r o p e r t i e sa n db e h a v i o r si na c h i r a l e n v i r o n m e n t h o w e v e r ，a sb i o c h e m i c a lr e c e p t o r sa n de n z y m e sg e n e r a l l yd i s t i n g u i s h c h i r a l i t y , e n a n t i o m e r so ft h es a m ep e s t i c i d em a yb e h a v ed i f f e r e n t l yi nb i o l o g i c a la c t i v i t i e s a n di nb i o l o g i c a l l ym e d i a t e de n v i r o n m e n t a lp r o c e s s e st h ew o r l d w i d er e s e a r c ho nt h e e n a n t i o s e l e c t i v eb e h a v i o ro fc h i r a lc o n t a m i n a n t si nt h ee n v i r o n m e n ti ss t i l la ti t se a r l ys t a g e ， e s p e c i a l l yi nc h i n a b e c a u s eo f t h eb i o a c t i v i t i e so fe n a n t i o m e r sb e i n gs od i f f e r e n t ，t h e ya r e s e l e c t i v e l yd e g r a d e da n di n t e r a c t e di nt h ee n v i r o n m e n t a lm e d i a m o r ea t t e n t i o n sh a v eb e e n g i v e nt oe n v i r o n m e n t a lb e h a v i o ro fe n a n t i o m e r s r a c e m i cp r o d u c to fm e t o l a c h l o rc o n t a i n st w or - e n a n t i o m e r sa n dt w os - e n a n t i o m e r s s - m e t o l a c h l o ri sn o ww i d e l yu s e di n s t e a do fr a e m e t o l a c h l o rf o rt h ef o r m e ri sm o r e e f f e c t i v ei nh e r b i c i d a la c t i v i t yt h a nt h el a t t e r ac o m p a r a t i v et o x i c i t ya s s e s s m e n to fr a c a n d s - m e t o l a c h l o rw a sd i s c u s s e dt h r o u g ht h e i re f f e c t so ns o m ee n z y m ea c t i v i t i e so ft h e f i f t h i n s t a rs i l k w o r m ，b o m b y xm o r il t h er e s u l t ss h o w e dt h a tr a c m e t o l a c h l o ra n d s m e t o l a c h l o rh a v ed i f f e r e n te f f e c t so ne n z y m ea c t i v i t i e so f5 t hi n s t a rs i l k w o r ml a r v a et h e l d h a c t i v i t ya n dt h ec a t a l a s ea c t i v i t y i nh e m o l y m p ht r e a t e dw i t hr a c m e t o l a c h l o rw e r e m u c hl o w e rt h a nt h a to fs - m e t o l a e h l o rt r e a t m e n t t h ea c pa c t i v i t yi nh e m o l y m p hw a s 4 4 7 3 h i g h e ri nl a r v a eo fc o n t r o lt h a nt h a to fr a c m e t o l a c h l o rt r e a t m e n t ，b u tt h e r ew e r e n ob i gd i f f e r e n c eb e t w e e ns - m e t o l a c h l o rt r e a t m e n ta n dc o n t r 0 1 t h ea l k pa c t i v i t yo f m i d g u tt r e a t e dw i t hr a c m e t o l a c h l o rw a s4 6 l o w e rt h a nt h a to fc o n t r o l ，a n dt h ee f f e c to f s - m e t o l a c h l o ro na l k pa c t i v i t yo fm i d g u tw a sm i n o r t h ed i f f e r e n c eo ft h et w oh e r b i c i d e s e x i s t e dm a i n i n gi nt h eb e g i n n i n g5d a y so ft h e5 t hi n s t a r ，a n dt h e nr e c o v e r e da f t e r5d a y so f t h e5 t hi n s t a r i ti ss h o w e dt h a tr a c m e t o l a c h l o rh a si n d u c e dm o r et o x i c i t yo ne c o n o m i c a l l y i m p o r t a n ts i l k w o r m sb yd i s t u r b i n g s o m eo ft h ee n z y m e sa n dt h em e t a b o l i s mt h a n s m e t o l a c h l o rd i d m e t a l a x y l ，ac h i r a lf u n g i c i d e ，h a sb e e nw i d e l y u s e d t h r o u g h o u t t h e w o r l d ，i t s e n a n t i o s e l e c t i v et o x i c i t yt o d a p h n i am a g n a w a si n v e s t i g a t e d i n t h i sr e s e a r c h t h e i t l 一 4 8 h l c s oo fm e t a l a x y la n dm e t a l a x y l mw e r e51 5 ( 4 55 ，5 8 3 ) m g la n d4 1 9 ( 3 52 ，4 98 ) m g l ，r e s p e c t i v e l yt h e s ew e r eb o t hl o wt o x i c a n ta c c o r d i n gt oc l a s s i f i c a t i o ns t a n d a r do f t o x i c i t y p a r a m e t e r ss u c ha sl e n g t h ，t h en u m b e ro fb r o o d sp e rf e m a l ew e r es i g n i f i c a n t l y ( p 肌肉 肾脏，其中肝脏样品中的( + ) 一o - h c h 几 浙江大学碳i j 学位论文 乎就是对映体纯：肌肉样品中e r 值 ( + ) - d h c h ( ) d h c h 约为7 0 ；肾脏中 约为16 ( k a l l e n b o r ne ta 1 ，1 9 9 1 ) 。m o s s n e r 等( 1 9 9 2 ) 对赤道以北初生海豹的脑、 肝脏和肺等器官中o h c h 的e r 值进行了检测，发现n h c h 在脑中的e r 值远远高 于其它器官。 生态系统中不同营养级对手性污染物的酶降解特性有所不同。p f a f f e n b e r g e r 等 ( 1 9 9 2 ) 对北海德国湾内不同海域的水样、蓝贻贝、比目鱼和绒鸭进行了研究，结果 表明，水样中q - h c h 的e r 值为08 4 士00 3 ，这与f a i l e r ( 1 9 9 1 ) 的结果基本吻合：不 同海域的蓝贻贝体内的e r 值非常接近，约为o 8 9 土0 1 4 ，与海水中相似，说明在它体 内没有发生a h c h 的对映体选择性降解：绒鸭肝脏对( ) 一d h c h 的降解快于( 甚 至完全) ( + ) 一一h c h ；高污染海域的比目鱼肝脏中的e r 值( 0 8 9 士0 0 3 ) 要高于低 污染海域的( o 8 0 士0 0 3 ) ，说明污染物可能会提高酶的活性和对映体选择性。处于较 高营养级的陆栖和海洋动物的肝脏中，不同的酶体系可能会有不同的对映体优先降解 结果。对狍的肝脏样品的分析表明优先降解( + ) 一n h c h 并且优先富集( + ) 一氧化 氯月和( + ) 一顺环氧七氯( p f a f f e n b e r g e r 等，1 9 9 4 ) ，与海洋生物j ：f 好相反。w o n g 等 ( 2 0 0 1 ) 在研究水体和河岸生物中手性多氯联苯( p c b s ) 的对映体组成时，发现在相 同的取样点中鱼和贝类体内的e f 值 e f = e r ( i + e r ) 1 与沉积物中的存在着显著的差 异。 随着对手性污染物研究的不断深入，对新农药的手性环境行为研究也成为热点。 b u s e r 和m o i l e r 等人首次用手性气相色谱和高效液相色谱对四种乙酰胺类农药( 甲草 胺、乙草胺、异丙甲草胺和甲霜灵) 进行了对映体选择性分离，发现碳手性的分离要 比轴手性分离容易。研究发现尽管甲霜灵降解最慢，但它却表现出最高的对映体选择 性： s ( + ) 一甲霜灵在污泥中降解较快，具杀菌活性的r ( - ) 甲霜灵在土壤中降解较快。 甲霜灵培养了6 4 天的土壤中e r 值为2 8 ，表明残留甲霜灵的7 3 为不具杀菌活性的 s - ( + ) 一甲霜灵，假设在用地条件下发生相似的行为，使用纯r ( ) 甲霜灵的残留量将大 大降低( b u s e r ，1 9 9 5 ；m f i l l e r ，1 9 9 5 ) 。b u s e r 等( 2 0 0 2 ) 研究了甲霜灵的对映体选择 性降解，在外消旋体甲霜灵培养过程的检测中，发现活性成分r 一对映体被选择性地降 解而s 对映体则在土壤中残留富集，其羧酸代谢产物地进一步代谢也具有手性选择 性。m o n k i e d j e 等( 2 0 0 3 ) 研究了热带和温带土壤中甲霜灵外消旋体及对映体纯的选 择性降解，所有形式的甲霜灵在德国土中的降解均快于c a m e r o o n 土的降解，德国土 浙江大学硕十学位论文 优先降解r 一对映体。而c a m e r o o n 土则优先降解s 一对映体。作者认为是由于不同 地区的土壤中含有不同的微生物种群，使用不同的降解酶而导致降解的选择性差异。 这与l e w i s 等( 1 9 9 9 ) 的研究结果一致，l e w i s 等( 1 9 9 9 ) 认为土壤环境条件的改变 可以通过改变土壤中活性微生物基因型而引起对手性污染物降解选择性的改变，在巴 西土壤中几乎所有的草地土壤样品均优先降解2 ，4 滴丙酸中非除草活性的对映体 f i r s ) 一2 ( 2 ，4 二氯苯氧基) 丙酸) ，而森林土壤样品优先降解除草活性对映体或与非除草 活性的对映体降解速率相同；丰富的有机营养会改变甲基一2 ，4 滴丙酸的对映体选择 性，倾向于使非除草活性的对映体的降解，从而可能导致甲基一2 ，4 一滴丙酸的残留对 植物毒性的增加。b u s e r 等( 1 9 9 8 ) 的研究表明土壤中的m c p p 和d c p p 的剥映体选 择性导致土壤中r 一对映体的富集，在一些瑞士的湖泊中与培养土壤一样导致r 一对映 体的浓度高于s 一对映体，但在另一些湖泊却发现s 一对映体浓度高于r 对映体，这 现象也与环境中生物作用因素的差异有关。土壤的p h 值与手性农药的对映体选择 性存在着一定的相关性，在实验条件下的好氧土壤中，当p h 5 0 时具有杀菌活性的r 型甲霜灵降解的要比s 型甲霜灵降解快，即k r k s ，从而导致s 型甲霜灵的残留要 大于r 型的；当p h 为4 0 5 0 时，两种对映体的降解速度基本上相同，即k r = k s ； 而当d h 4 0 时对映体选择性发生了翻转，s 型甲霜灵降解的要比r 型甲霜灵快，即 k r k s 。而在绝大多数厌氧性土壤中，情况与在p h 鳞翅目( l e p i d o p t e r a ) 蛾亚目( h e t e r o e r a ) 一 蚕蛾科 ( b o m b y c i d a e ) 一 蚕蛾属( b o m b y x ) 家蚕种( b o m b y xm o r i ) 。家蚕的属名b o m b y x 由希腊文b o m b y x ( 绢鸡的意思) 而来，种名m o r i 由桑树属名m o r i 而来( 中国养蚕 学) 。 浙江人学坝i j 学位论史 1 2 家蚕的生活史 家蚕属完全变态昆虫，一生要经过卵、幼虫、蛹、成虫四个形态完全不同的发育 阶段。 1 2 1 蚕卵 家蚕以卯繁殖。当雌雄蚕蛾交配后，雄蛾产下受精卵，卵内逐渐形成胚胎，胚胎 经过发育成幼虫而孵化。蚕卵是胚胎发育成幼虫的阶段。 蚕卵外观呈扁平椭圆型，一端稍尖，另一端稍钝，膨起一方为腹侧，相对一方为 背侧。初产卵为淡黄色，如是越年卵，经3 4 日后变为淡茶褐色，4 - - 5 曰后转为品 种固有色，因品种不同，卵色有狄、褐、绿、白等，通常以扶紫色居多，不越年卵产 下后一般不变色。蚕卵的大小和重量，因品种、营养和饲料条件不同而有差异。正常 情况下，欧洲种较大，中国种和日本种次之；春用种较大，夏秋种较小。目前生产上 常用蚕品种1 克卵有1 8 0 0 2 1 0 0 。粒卯。 1 2 2 幼虫 刚孵化的幼虫体躯细小，呈黑褐色，形似蚂蚁，又叫蚁蚕。蚁蚕通过摄食桑叶迅 速成长，体驱很快长大，体色逐渐变淡转呈青白色。蚕儿生长到一定程度后，需褪去 旧皮，生长较为宽大的新皮，体驱才能继续长大，这叫蜕皮。在蜕皮期间，蚕儿不食 不动，固定在蚕座上称为眠。眠其实是蜕皮过程，刚蜕皮的蚕叫做起蚕。眠又是划分 蚕龄的依据，蚁蚕食桑后称第一龄蚕，第一次蜕皮以后丌始食桑到第二次蜕皮称第二 龄蚕，第二次眠后叫第三龄蚕，依次类推，一般蚕儿耍就眠和蜕皮4 次，经过5 个龄 期，蚕儿发育到五龄末期，逐渐停止食桑，蚕体收缩透明，此时叫熟蚕，并吐丝结茧， 待营茧结束蜕皮去蚕皮化蛹，此时蚕儿阶段结束。 1 23 蚕蛹 熟蚕吐丝结茧后2 - - 3 天，体驱显著缩短，略呈纺锤型，经2 3 同蛹皮形成，即 蜕去幼虫表皮而化蛹。刚蜕皮的蛹皮呈白色而柔软易破，以后变黄色，最后成黄褐色 且蛹皮逐渐硬化。蛹期是幼虫向成虫过渡的变态阶段，外观上不食不动，无形态变化， 淡体内却在剧烈蜕变幼虫器官的解离，改造和成虫器官的发生均在此期间完成。 1 2 4 成虫( 蚕蛾) 蛹经1 2 - 15 天，蛾体在蛹内发育完成后，羽化为成虫，从茧内钻出，经交配产 卵，繁殖后代，约经7 同左右成虫自然死亡，一个世代至此结束。 浙江大学硕士学位论文 1 3 蚕的生活条件 蚕的生活条件主要指蚕生活中接触的气象环境和营养卫生环境。气象环境主要是 温度、湿度、光线、空气及气流等微气象因素，这些因素不仅直接影响蚕儿，而且影 响蚕儿的营养卫生环境。 1 3 1 蚕与温度 家蚕属于变温动物，体温易受周围气温支配，体温与气温基本一致。蚕体体温的 来源，主要是体内新陈代谢，促使有机物质进行氧化分解而产生热能，同时亦受环境 热能的影响，如太阳辐射和人工加温等。蚕体温度下降则通过蒸发、传导、辐射和对 流等途径来实现，其中以蒸发和传导为主。蚕体内4 0 的水分，是通过气门蒸发的。 蚕的体温因龄期不同而有变化，在相同环境条件下，一般壮蚕比稚蚕体温高。在同一 龄期，龄中比龄初高。体温的变化主要和体表面积有关，体表面积越大，体温越低。 在蚕的体温适温范围内，随着温度的升高，蚕的新陈代谢旺盛，生理机能活跃，蚕的 血液循环加快，呼吸作用加强，单位时间内的食桑量、消耗量增加，生长发育加快。 反之，温度降低时，蚕的各种生理机能减弱，发育缓慢。温度的高低之所以能影响蚕 的发育速度，主要是由于温度能加强或减弱蚕体内各种酶的活力。在一定温度范围内， 温度升高，酶的活力增强。但温度超过3 0 。c 时，各种酶的活力即下降，如果温度再大 幅度升高，酶即遭到破坏，蚕正常生理活动受到阻碍而发病。酶在低温条件下，仍具 有微弱的活力，并不消失，保持酶活性的适温范围为2 0 一3 0 0 ，在此范围内随着 温度的升高酶的活性增强，高于或低于此温度范围，酶的活性都将受到抑制。 根据蚕的正常生理和产茧考虑，饲育温度以稚蚕偏高、壮蚕偏低效果最好，一般 至二龄期2 6 2 8 0 c ，三至四龄期2 5 2 6 ，五龄2 3 - - 2 4 。 1 3 2 蚕与湿度 蚕体排出水分，除了通过泌尿管形式随蚕粪排出外，也在蚕体进行呼吸作用时， 以水气的形态随气门排出。在蚕适温范围内，随着湿度的增大，蚕体液循环加快，发 育时间缩短，尤其以稚蚕最为明显。 1 3 3 营养 桑叶质量对所产卵的化性有影响。一股叶质充实，蛋白质和糖的比例适当，食桑充 足，多产滞育卯；若用营养不良的未成熟叶或食桑不足，产不滞育卵的比率显著增加，这 在状蚕期更为明显营养条件对化性的影响，不但影响到下一代蚕卵的化性，而且会延续 浙江大学硕士学位论文 到下代蚕所产蚕的化性。 13 4 光线 光线也以胚胎发育后期最为敏感，但影向远比温度小。催青温度在2 5 。c 以上或 1 5 c 以下，光线不显现影响，只有在中间温度2 0 * c 催青时，光线有利于产滞育卵，黑 暗则产不滞育卯( 中国养蚕学) 。 2 农药对家蚕毒性研究 我国是茧丝绸生产大国，生产的茧丝绸产品占世界的7 0 左右，蚕茧产量和茧丝 绸产品出口量均占世界首位。农药中杀虫剂的应用，有力地减少了害虫的危害，保证 了我国粮食生产的稳产高产。然而，在我国主要蚕桑生产区蚕桑生产和粮食生产是 混杂在一起的。由于蚕本身是昆虫，在蚕桑生产季节大阳用药不合理，就容易使蚕中 毒死亡，或使桑叶被少量农药污染，蚕食下含少量农药的桑叶后虽能发育不表现明显 的中毒症状，但熟蚕时却无法正常吐丝结茧，使蚕农的物力财力遭受巨大损失。目前 我国每年因蚕病造成的损失，仍占整个桑蚕生产的l o 以上，其中相当一部分是由于 农药中毒死亡或因少量农药污染桑叶使蚕微量积累性中毒而不结茧，抵抗力降低引发 其它蚕病造成的。此外，由于农村工业化的发展，各类废气粉尘( 氟化物、二氧化硫) 污染桑叶，蚕吃下被污染桑叶后引起中毒( 晓岗译，1 9 9 5 ) ，为减轻各种有毒物质对 蚕桑生产的危害，各国学者在有毒物质对家蚕的毒性、生理生化的影响方面，t 展了一 些研究。虽然人们在农药防治害虫方面的研究己取得了许多成就，但在丌发利用农药 时，在其毒效测定方面均是以农林业上的靶标害虫为对象，对益虫如家蚕、蜜蜂等的 安全性测定工作做得远远不够。加上家蚕对农药十分敏感，因此在农药使用过程中， 不仅要研究其在桑田、蚕室使用时对家蚕的安全性影响，还要注意其在附近农田使用 时对非靶标生物家蚕的安全性问题。 2 1 农药对家蚕的急性毒性研究 农药的种类、作用方式不同对蚕的毒性、中毒症状、桑叶残留期也不同。陈小平 等( 1 9 9 8 ) 将农e 开常用的1 9 种农药对家蚕的触杀毒力进行了研究，得出触杀毒力顺 序为：灭扫力，来福灵，氟氯菊酯 新光一号，兴棉宝 速灭沙丁 菊马乳油 敌杀死 喹 硫磷，甲基对硫磷，克蚧威 敌敌畏 敌百虫 杀虫双 甲胺磷 水胺硫磷，氧化乐果 乐 果。叶志毅( 1 9 9 1 ) 等比较了7 种常用农药对家蚕的胃毒毒力和触杀毒力，以杀灭菊 酯毒力最强，以后依次为杀虫双、敌百虫、敌敌艮、甲胺磷等。其他农药对蚕的毒性 浙江大学删：l 学位论文 为扑虱灵2 5 0 p p m 对家蚕无影响( 余智勇等，1 9 9 0 ) ，但1 0 0 0 p p m 污染桑叶喂蚕可引 起慢性中毒( 江坤荣等，1 9 9 4 ) 。用杀灭菊酯污染的稻草制作的草笼，对熟蚕有极强 的毒性，可导致蚕大量死亡( 郭希才，1 9 9 1 ) 。党建友等研究了高效氯氰菊酯、高效 氯氟氰菊酯，丙溴磷和残杀威对家蚕的毒性，发现4 种农药都是熏蒸毒性低于胃毒和 触杀毒性；胃毒毒性最大。2 种菊酯类农药剥家蚕急性毒性都相对较高；丙溴磷的胃毒毒 性中等，触杀毒性和熏蒸毒性都相对低毒；残杀威3 种毒性都相对较低( 党建友等， 2 0 0 5 ) 。 各类农药中毒蚕的症状为：菊酯类出现乱爬、打滚、膨胸、倒退、吐液、卷曲成 环等症状。沙蚕毒素类( 杀虫双等) 有拒食、静伏、体躯伸直柔软、背脉搏弱等症状 ( 叶志毅等，1 9 9 1 ) 。 2 2 农药对蚕生长发育、产卵及后代的影响研究 原蚕食用带微量甲胺磷的桑叶后，龄期延长，茧型小，不蜕皮、半蜕皮蛹较多， 产卵量较e 常少( 王伟春，1 9 9 6 ) 。孙克坊等调查了微量菊酯类农药对家蚕的毒性， 发现低剂量( 1 0 n g l 1 的菊酯类农药连续添食家蚕可影响家蚕的生产发育和茧质( 孙克 坊等，2 0 0 2 ) 。2 0 1 1 t 蝉散乳油5 0 0 倍液对家蚕无影响( 陈俊英等，1 9 9 5 ) ，特勃隆乳 剂稀释6 4 万倍仍可使三龄蚕不蜕皮死亡( 大金f 美，1 9 9 0 ) 。 用7 种农药( 甲胺磷、氧化乐果、敌敌畏、敌百虫、氟戊菊酯、杀虫双、可百威) 处理五龄饷食后2 4 小时的桑蚕，将未中毒死亡蚕f 常饲养，结果后期发育大多减慢， 幼虫、蛹死亡率增加，蛹体重下降，总死亡率杀虫双最大( 叶志毅，1 9 9 0 ) 。 2 3 农药对蚕生理生化的影响研究 f e n x y c a r b 在家蚕五龄前期强烈抑制前胸腺的分泌活性，使蚕体发育减缓( d e t o se t a 1 ，1 9 9 6 ) 。 有机磷杀虫剂f e n i t h r o t h i o n 和e t h i o n 对五龄蚕脑、脂肪体和丝腺中的乙酰胆碱 酯酶活性均有抑制，同时组织中乙酰胆碱含量有所升高，使得蚕神经细胞能量代谢加 速而死亡( n a t hb s 1 9 9 9 ) 。用致死剂量和半致死剂量的f e n i t h r o t h i o n 和e t h i o n 处 理五龄蚕血淋巴和月目肪体中总蛋白减少的同时自由氨基酸增加，两种组织中的蛋白 酶活性均有所增加，丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶活性显著增加，谷氨酸转氨酶活 性也有所增加，表明蚕体内发生严重蛋白水解作用和多种氨基酸的转氨作用( n a t h b s ，1 9 9 7 ) 。 一一 还有一些有机磷杀虫剂，如杀螟松、乙硫磷以及一些其它的杀虫剂，对家蚕的食 物代谢、生长、繁殖、乙酰胆碱、乙酰胆碱酯酶、能量储存以及些蛋白质代谢方面 的不利影响也有研究报道( n a t hbs e ta l ，1 9 9 7 ，1 9 9 9 ，2 0 0 2 ) 。 3 实验内容与方法 3 1 实验材料与试剂 实验用蚕：来自浙江大学动物科学院薪杭科明蚕种。 主要药剂和试剂列于表2 1 中 表2 2 实验试剂的纯度与来源 t a b l e2 - 1t h e p u r i t ya n ds o u r c eo fc h e m i c a l s 试剂名称 纯度 来源 一 r a c 一异丙甲草胺9 53 山东滨州农药厂 s 一异丙甲草胺 钼酸铵 氢氧化钠 巴比妥铀 高锰酸钾 过氧化氢 乳酸脱氢酶试剂盒 磷酸二氢钾 抗坏血酸 三氯醋酸 b 一甘油磷酸钠 冰醋酸 亚硫酸氢钠 9 6 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 瑞士诺华作物保护公司 合肥工业大学化学试剂厂 中国杭州化学试剂有限公司 中国医药上海化学试剂公司 浙江杭州萧山化学试剂厂 浙江省兰溪市三鹰化工试剂厂 宁波市慈城生化试剂厂 湖州湖试化学试剂有限公司 中国医药上海化学试剂公司 如皋市金陵试剂厂 n e wl e r s e y ，u s a 南京化学试剂一厂 上海化学试剂有限公司 米土尔 分析纯 中国华东师范大学化工厂 3 2 主要设备和仪器 分光光度计( u l t r o s p e c3 1 0 0p r o ，b i o c h r o ml t d ，c a m b r i d g e ，e n g l a n d ) 高速离心机( c f l 6 r ，r 立) 浙江人学坝l j 学位论文 培养箱( g n p 9 0 5 0 ，上海顿克仪器科技有限公司) 水浴锅( d k 一8 d 型，上海金鸿实验设备厂) 3 3 实验方法 3 3 i 家蚕预处理 3 3 ，1 1 试验前先做预备试验，用以9 5 酒精和蒸馏水混合的稀释水配制并稀释药 液。去除桑叶的粮脉，每l o g 桑叶添加5 m l 药液，使桑叶上药量达到规定的浓度供家 蚕食用。通过预试验确定家蚕全部致死和全部存活的浓度范围，设桑叶添加稀释水为 空白对照组。在直径为7 c m 的塑料盒中饲养2 5 3 0 头4 龄家蚕为一个试验组，每处 理设3 个重复。用不同浓度的药液浸渍桑叶供蚕食用，2 4 h 后改喂无药新鲜桑叶，分 别观察2 4 ，4 8 ，7 2 h 的中毒死亡情况。( 因所用农药对家蚕的急性毒性不是很大，在 4 2 0 0 m g l 的浓度下仍没有完全死亡，所以选择6 0 0 m g l ) 3 _ 3 i2 桑蚕的培养： 2 6 士2 。c ，7 0 一8 5 r h 和1 2 l ：1 2 d 光周期条件下的无病蚕 卵开始培养( m i a o y ge ta l ，2 0 0 3 ) ，待到5 龄起分成3 区，每个区挑选1 0 0 尾大小接 近的桑蚕。实验做三个重复，取平均值。 3 _ 3 】3 桑叶处理：以9 5 酒精和蒸馏水混合的稀释水( v 酒精：v 水= 2 ：1 ) 为溶 剂配制6 0 0 m g l 的异丙甲草胺( m e t o l a c h l o r ，由山东滨州农药厂生产，纯度9 53 ) 和s 异丙甲草胺( s - m e t o l a e h l o r ，由瑞士诺华作物保护公司生产，纯度9 6 ) 以该 溶剂为对照。挑选大小形状近似的桑叶，分别浸于上述溶液中5 r a i n ，并在洁净表面皿 上晾1 0 m i n ，喂给0 2 4 h 的五龄蚕，每8 小时喂次。2 4 h 喂完后用无毒桑叶。 3 ，31 4 取样：五龄期每天在各区随机取5 尾蚕，称重。将离心管分区分组织编号， 剪尾角取5 尾蚕血液置于一个1 5 m l 离心管内。解剖后取5 尾蚕的丝线、中肠、脂肪 体分别置于另三个15 m l 离心管内。立即置于冰箱内冷冻。 3 3 2 血液过氧化氢酶( c r s ) 的测定酸性k m n o 。法( 承宪成等，1 9 9 2 ) 3 3 2 1 操作步骤：分别取各区5 龄5 同蚕1 0 条，剪尾角取血液于干净小试管中， 用l m l 刻度吸管吸取血液l m l ，用蒸馏水在容量瓶中将其稀释到1 0 0 m l 待用。 取5 0 m l 三角瓶6 只，分成两组，即实验组和对照组，每瓶放入经稀释的血液1 0 m l ， 然后将对照组的三瓶放在电炉上煮沸2 分钟，冷却至室温待用。 在6 只烧瓶中同时加入1 h 2 0 2 液l m l ，摇匀，在2 5 室温下作用2 0 分钟后，各 瓶同时加入i o h 2 s 0 4 3 m l ，摇匀立即用o 1 n 高锰酸钾溶液滴定其剩余的h 2 0 2 ， 浙江大学硕士学位论文 滴定终点为桃红色。 3 3 2 2 计算和趋势差异图绘制： 先以下式计算：0l m l 血液在2 5o c - f2 0 分钟内所能分解h 2 0 2 ( 毫克) = 滴定用 k m n 0 4 液量的差数( 毫升) k m n 0 4 当量浓度1 7 ( h 2 0 2 克分子量) 。再经换算使单位 统一。 以五龄期天数为横坐标，以过氧化氢酶活性( 每分钟分解的每m 】血液中的过氧 化氢) 为纵坐标画出趋势图。 、 33 3 中肠碱性磷酸酶( a k p ) 的测定( m i a oy g ，2 0 0 2 ) ： 3 3 3 1 试剂配制： 基质液的配制：在蒸馏水4 0 0 m l 中加入1 3 - - 甘油磷酸钠5 9 和巴比妥钠9 9 ，溶解 后转入1 0 0 0 m l 容量瓶中，蒸馏水稀释约9 0 0 m l ，加入0 ，1 nn a o h 约3 0 m l 校准p h 值 到96 0l ，最后稀释到1 0 0 0 m l 刻度，加石油醚5 m l 以防腐，保存于冰箱中各用。 定磷试剂的配制：蒸馏水：6 n 硫酸：2 5 钼酸铵：1 0 抗坏血酸= 2 ：1 ：1 ：1 ( 体积比) ， 摇匀。f 缶时配肯0 。 3 3 32 酶液的制取：从冰箱取出中肠样品，分散后放在滤纸上5 r a i n ，均化后称 取0 1 9 中肠于i 5 m l 离心管内，加1 5 m l 蒸馏水，将离心管置于冰块中研磨5 m i n ，均 匀离心1 0 m i n ( 3 0 0 0 r p m ) ，上层清液即为酶液。根据预试验确定稀释倍数。 33 _ 3 3 碱性l 临酸酶活性的测定步骤： 吸取1 5 m l 于离心管，再离心( 3 0 0 0 r p m ，1 0 m i n ) 3 - 33 4 绘制标准曲线： 以分析纯磷酸二氢钾( 分子量1 3 6 0 8 ) 按上述定磷比色的方法制作。得标准曲线 2 0 浙江大学坝1 j 学位论文 o 6 o 5 0 4 羹呲 昏o 2 。1 0 碱性磷酸酶 y = 0 0 5 0 7 x + 0 0 0 0 2 r = 0 9 9 8 4 o246 8 磷( j g r a l ) y = 0 0 5 0 7 x + 00 0 0 2 r 2 = 0 9 9 8 4 y 一吸光度x 一磷浓度( ug m 1 ) r 一相关系数 将测得样品数据( 吸光度) 代入标准曲线算得磷浓度，并经换算统一单位。以五 龄期天数为横坐标，以碱性磷酸酶活性( 每分钟能分解每m g 中肠里磷的“g 数) 为 纵坐标画出趋势图。 3 3 4 血液酸性磷酸酶测定方法( 临床生化检验，1 9 7 9 ) 原理同碱性磷酸酶b 一甘油磷酸测定法，酶反应在酸性缓冲液中进行。 3 3 4 1 试剂配制： 基质贮存液：在蒸馏水8 0 0 m l 中加入b 一甘油磷酸钠1 0 5 9 和巴比妥钠8 5 2 9 。溶 解后移入1 l 容量瓶内，加石油醚1 0 m l 以防腐，再以蒸馏水稀释至水层液面达1 l 刻 度，混合，置冰箱中可保存2 3 月。 基质应用液( p h5 0 ) ：将基质贮存液1 0 0 m i 加入2 0 0 m l 容量瓶内，用蒸馏水加至约 1 5 0 m l ，加入1 n 醋酸溶液( 冰醋酸l m l ，用蒸馏水稀释至1 7 5 m l ，即1 n ) 1 0 m 1 此 时p h 应为5 0 ，若有偏差，再行校正。苒加入石油醚5 m l ，最后以蒸馏水稀释至水层 液面2 0 0 m l 。混合，置冰箱可保存2 周。 5 0 三氯醋酸溶液：溶解三氯醋酸5 0 9 于蒸馏水中，并用蒸馏水稀释至1 0 0 m l 。 钼酸试剂：溶解钼酸钠( n a 2 m z 0 4 - 2 h 2 0 ) 2 5 9 于2 5 nh 2 s 0 4 中并用2 5 nh 2 s 0 4 稀释至1 0 0 m l 。 还原试剂：溶解亚硫酸钠( n a 2 s 0 3 ) 3 9 于蒸馏水中，再加入米吐尔( 硫酸甲基 浙江大学颁：i 。学位论文 对氨基苯酚) o 5 9 ，溶解后，用蒸馏水稀释至l o o m l ，盛于棕色试剂瓶中紧盖保存。 磷贮存标准液( 1 m g m 1 ) - 称取磷酸二氢钾0 , 4 3 8 9 9 ，置于l o o m l 容量瓶中，以蒸 馏水溶解并稀释至刻度，加氯仿l m l 防腐。 磷应用标准液( 8 ug m 1 ) ：准确吸取磷贮存标准液o8 m l ，加入1 0 0 m l 容量瓶中， 以蒸馏水稀释至l o o m l 刻度。临用前配。 33 4 2 实验步骤： 取血液3 0 0u l 于离心管中，加3 0 0u 1 水，充分摇匀，混合，记为血液a 混匀离心( 3 0 0 0 转，1 0 m i n ) ，吸上清夜加入相应编号试管 浙江火学硕卜学位论文 o 8 蜊0 6 米0 4 督0 2 o 酸性磷酸酶 y = 0 。1 2 4 9 x + 0 0 0 1 7 n r = 0 9 9 9 6 0246 磷( 灿g m 1 ) 系列l i 一线性 ( 系列1 ) 得标准曲线y = 01 2 4 9 x + o0 0 1 7 r 2 = 09 9 9 6 y 一吸光度x 一磷浓度( ug m 1 ) r 一相关系数 3 34 4 计算和绘制趋势差异图 将测得样品数据( 吸光度) 代入标准曲线算得磷浓度，并经换算统一单位。以五 龄期天数为横坐标，以酸性磷酸酶活性( 每分钟能分解每m 1 血液磷的ug 数) 为纵坐 标画出趋势图。 3 - 3 5 血液乳酸脱氢酶测定方法 ( l d h 试剂盒，宁波市慈城生化试剂厂) 取血液样品5 0 ui 于离心管内，加试剂i 2 7 0uj ，试剂1 i3 0u l ，在3 7 水浴中放置l o m i n ，于3 4 0 n m 处测波长。将测得样品数 据( 吸光度) 换算统一单位后以五龄期天数为横坐标，以血液乳酸脱氢酶活性( 每分 钟能分解每m l 血液磷的ug 数) 为纵坐标画出趋势图。 4 结果和讨论 4 1r a c 异丙甲草胺及其s 型对映体对家蚕血液乳酸脱氢酶的影响 乳酸脱氢酶( 1 a c t a t ed e h y d r o g e n a s e 简称l d h ，e c1 11 2 7 ，l - - 孚l 酸：n a d + 氧化 还原酶) 广泛存在于生物细胞内，是糖代谢酵解途径的关键酶之一，可催化下列可逆 反应： 浙江人学f i i ii 一学位论文 乳酸氧化型辅酶 c o o h h = 。+ n a d h + h + c h 丙酮酸还原型 辅酶 乳酸脱氢酶( l d h ) 主要存在于家蚕的血液和脂肪体，在碳水化合物代谢中起着很 重要的作用，而且和肝细胞的产能关联。从图2 3 看出经r a c z 异丙甲草胺处理过家蚕 血液的乳酸脱氨酶活性从五龄的第二天起就比空白的低，到第三天比空白低了3 6 ， 之后趋势和s 一异丙甲草胺接近，而经s 异丙甲草胺处理的与空白相比，差别没有外消 旋型的大。 i 一2 5 。 i 争 三如 三童 ii 。 蚕5 。 图2 3r a c 一异丙甲草胺及其s 型对映体对家蚕血液l d h 的影响 f i g 2 - 3e f f e c to fr a c - m e t o l a c h l o ra n ds - m e t o l a c h l o ro i ll d ha c t i v i t yo fh e m o l y m p ho f s i l k w o r m ，b o m b y xm o r il 0 - 2 4 ho l d 5 t hi n s t a rl a r v a ew a st r e a t e dw i t hr a c m e t o l a c h l o ra n d s - m e t o l a c h l o rt h r o u g he q u a l q u a n t i t a t i v em u l b e r r yl e a v e sd i p p e di n t ot h ec o n c e n t r a t i o no f 6 0 0 m g lf o r5 m i nr e s p e c t i v e l y 经外消旋型处理的l d h 活性降低意味着血液中碳水化合物代谢在五龄期的前几 天受抑制了，随后慢慢恢复。由于碳水化合物是一种必不可少的能量来源，在r a c 异 丙甲革胺影响下的同化作用也同样意味着家蚕体内能量代谓 的减弱。 另一方面，l d h 活性的显著降低也意味着丙酮酸的减少，导致了在毒物胁迫下， 为适应能量需求，从好氧到厌氧的转变，降低的l d h 活性也可能意味着通过有氧途 径的能量代谢减弱，从而调整到厌氧状态，作为毒物入侵后的补偿措施( n a t hbs ， 煮 时 h + p 铲叫 叫 浙江大学砸一卜学位论文 2 0 0 0 ) 。 4 2r a e 异丙甲草胺及其s 型对映体对家蚕血液过氧化氢酶的影响 氧化氢酶( c a t ) 是清除氧自由基的主要酶类，能将细胞代谢产生的毒性物质 h 2 0 ：迅速加以清除，保护机体免遭有毒物质的伤害，维持机体f 常的生理代训功能。 高活性的c a t 将快速分解大量有毒物质h 2 0 2 ，使机体细胞尽可能保持在无毒环境中。 自由基是含有一个不配对电子的原子或原子团的总称。机体自由基以氧自由基 ( 、0 2 、1 h 2 0 2 、o h 、0 2 ) 为最多，正常生理条件下，氧自由基占机体总耗氧量的1 2 ( 莫简医用自由基生物学导论，1 9 8 9 ) 。过量的氧自由基对机体的损伤主要在 于它与机体内的多价不饱和脂肪酸结合，产生有细胞毒性的过氧化脂质、丙二醛及乙 烷等物质。这些物质严重影向和损伤机体的膜结构，如细胞膜、线粒体及微粒体膜等 最后造成细胞的破坏和溶解，可使核酸链断裂碱基修饰和氢键破坏，使氨基酸修饰， 蛋白质聚台和断裂。自由基引起的氧化损伤几乎可以发生在各种细胞器、大分子或其 聚合体内，氧自由基主要作用于不饱和脂肪酸，生物膜使自由基损伤的重要靶结构之 一。氧自由基是许多疾病发生的基础( 何学民等，1 9 9 2 ) 。在正常代谢中，尽管生物 体内也能产生一定量的活性氧自出基( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i s e s 简称r o s ) ，但机体细 胞通过一整套保护何修复功能的防御体系，使产生的r o s 得以清除，从而使r o s 的 含量维持在非危害水平( 曾红等，2 0 0 0 ；张铣等，1 9 9 7 ) 。 机体中的超氧化物歧化酶( s o d ) 、过氧化氢酶( c a t ) 、过氧化物酶( p o d ) 、 谷胱甘肽过氧化物酶( g s h p x ) 等使机体内的抗氧化酶系，其作用是清除体内的自 由基，防止自由基对细胞结构的损伤，特别是防止生物膜中不饱和脂肪酸的过氧化作 用而导致机体内过氧化脂质的生成