（材料学专业论文）壳聚糖明胶果胶复合材料的性能研究.pdf

中文摘要 组织工程的典型方法是在外源性的细胞外基质( e c m s ) 中种植细胞组成结 构物，在生物反应器中培养扩增，在体外形成新组织后植入患者体内，与组织整 合构建新的功能组织。因此，组织工程采用的外源性e a 出模拟天然组织的 e c m s 分子的功能。这种外源性e c m s 就是由生物相容性良好和可生物降解的 生物材料制备的复合材料。设计外源性e c m s 的最佳方法就是仿生，即模仿天 然组织中e c m s 分子的结构与功能，将天然e c m s 作为支架使细胞聚集而构建 组织，控制组织结构并调控细胞表型。 本论文从仿生角度出发，用化学交联的方法制备了壳聚糖明脚果胶水凝胶， 并考察了其理化性能。该水凝胶的压缩强度在0 0 5 - 0 4 m p a 之间，并随着壳聚糖 的分子量、果胶的含量和明胶的存在而变化。在p b s 模拟体液中，由于壳聚糖分 子量，果胶含量等因素的影响其降解速度也有所不同。其含水量可在2 0 - - - 8 0 ( g 水g 聚合物) 范围内变化，而增大水凝胶的交联度或溶液浓度会导致含水量的降 低。在水凝胶的基础了，本实验采用了延流法制各了壳聚糖明胶果胶薄膜，并 进行了下列测试：接触角实验证明果胶的加入提高了壳聚糖明胶基材料薄膜表 面的亲水性；x p s 光电子能谱对壳聚糖明j 捩果胶复合薄膜的表面进行分析，证 实果胶的加入使薄膜羧基和羟基含量增加；力学测试表明，壳聚糖明胶果胶复 合薄膜干态拉伸强度可达8 0 m p a 左右，湿态情况下薄膜强度降低但柔韧性增加。 另外，本实验还采用冷冻干燥技术制备了壳聚糖明胶果胶三维支架，和壳聚糖 明胶支架相比，壳聚糖明胶果胶支架无论是吸水率还是保水率都有明显的提 高，然而拉伸强度明显下降，同时断裂伸长率则增加明显，且体外降解速度要稍 慢一些。 为了考察该生物材料的生物相容性，本实验利用体外培养l 9 2 9 细胞来考察 细胞的壳聚糖明胶果胶薄膜和支架的生物相容性。实验结果表明，壳聚糖明胶 倮胶薄膜和支架具有良好的生物相容性。这些结果都说明了果胶是一种生物相 容性良好的生物材料，它的加入提高了复合材料的性能，为其在生物医学领域提 供了潜在的应用前景。 关键词：组织工程壳聚糖明胶果胶生物相容性 a b s t r a c t 1 i s s u ee n g i n 酗d n gu t i l i z e st h et h e o r i e sa n dm e t h o d so fl i f es c i e n c e sa n d e n g i n e e r i n gs c i e n c e s r e s e a r c h i n ga n dd e v e l o p i n gn e wc l i n i c 吼l b s d m 钯f o rh u m a n t i s s u ea n da p p a r a t u s i t st y p i c a lm e t h o di ss e e d i n gc e l l si nt h ea r t i f i c i a le x t r a c e l l a r m a t r i c e s ( e c m s ) t of o r mc e l l s a r t i f i c i a le c m sc o n s t r u c t s h e r et h em a n u a le c m s a r c t h r e e - d i m e n s i o n a lb i o m a t e r i a ls c a f f o l d sw i t he x c e l l e n tb i o c o m p a t i b i l i 何t h ef u n c t i o n s o fb i o m a t e r i a ls c a f f o l d sa c ta sa n a l o g u e st ot h en a t u r a le c m sf o u n di nt i s s u e s w h i c h p r o v i d ei n f o r m a t i o nf o rc e l l se x p r e s s i n gt h e i rf u n c t i o n s ，e g a d h e s i o n , p r o l i f e r a t i o n , d i f f e r e n t i o ne t c t h e r e f o r e ，t h ea i mf o rb i o m a t e r i a ls c a f f o l d sd e s i g ni st om i m i ct h e n a t u r a le c m s ，f r o mt h ec o m p o s i t i o n st ot h em i c r o s t m c m r e i nt h i sp a p e r , t h ee h i t o s a n g e l a t i n p e c t i nh y d r o g e lw a sf a b r i c a t e da n dt h e p h y s i c e c h e m i e a lp r o p e r t i e so fh y d r o g e lw a ss t u d i e d 皿ec o m p r e s s i v es t r e n g t ho f t h eh y d r o g e lw a sb e t w e e n0 0 5a n d0 4m p a , a n dt h ei n f l u e n c e so fm o l e c u l a rw e i g h t ( m w ) o f e h i t o s a na n dt h ec o n t e n to f p e c t i na n dg e l a t i no nt h ed e g r a d a t i o na n dw a t e r c o n t e n to f t h eh y d r o g e lw e r ei n v e s t i g a t e d b a s e do nt h ef a b r i c a t i o no ft h eh y d r o g e l ，t h ec h i t o s a n g e l a t i n p e c t i nm e m b r a n e w a sp r e p a r e db ys o l u t i o nc a s t i n gm e t h o d i n c o r p o r a t i n gp e c t i nc o u l di m p r o v et h e h y d r o p h i l i t yo f t h em e m b r a n e ，a n df f l l h a n c et h ee a r b o x y lg r o u pc o n t e n to nt h es u r f a c e i t sm a x i l n u l nv a l u eo f t e n s i l es 血e n g t hw a sa b o u t8 0 口ai nd r y - s t a t e w h i l ed r o p p e d d o w ni nw e ts t a t e a n dt h ef l e x i b i l i t yo ft h em e m b r a n ei n c r e a s e di nw e ts t a t e 耵 a d h e s i o na n dp r o l i f e r a t i o no fl 9 2 9c e l l sc u l t u r e do nc h i t o s a n g e l a t i n p e c t i n m e m b r a n e sw e r eh i g h e rt h a nt h a to f t h et i s s u ec u l t u r ep l a t e m e a n w h i l e ，t h ep r o p e r t i e s o fc h i t o s a n g e l a t i n p e c t i ns c a f f o l dp r e p a r e db yf r e e z e - d r y i n gm e t h o dw e f c i n v e s t i g a t e d t h ew a t e ru p t a k ea n dr e t e n t i o na b i l i t i e s ，t h er a t eo fd e g r a d a t i o na n dt h e b r e a kr a t i oo ft h ec h i t o s a n g e l a t i n p e c a ns c a f f o l dw e t ei n c r e a s e dc o m p a r e dw i t h c h i t o s a n g e l a t i ns c a f f o l d , a n dt h et e n s i l es t r e n g t hw a sd e c r e a s e d l 9 2 9c e l l sc o u l d a d h o l eo nc h i t o s a n g e l a t i n p e c t ms c a f f o l d sa n dp r o l i f e r a t et of o r mc e l l s c a f f o l d c o n s t r u c t i o n t h er e s u l t ss h o w e dt h a tc h i t o s a n g e l a t i n p e c t i nc o m p o s i t eb i o m a t e r i a l sp r o v i d i n g am i c r o e n v i r o n m e n ta p p r o p r i a t ef o rc e l l s , w h i c hc a nb eap o t e n t i a lc h o i c ef o rt i s s u e e n g i n e e r i n gi nt h ef u t u r e a l t h o u g ht h i si sap r e l i m i n a r ys t u d yf o rc h i t o s a n g e l a t i n p e c t i nb i o m a t e r i a l si nt i s s u ee n g i n e e r i n g ，d a t aw i l lb eh e l p f u lf o rf u t u r ew o r ki nt i s s u e k c y w o r d s ：s g e n g i n e e r i n g , c 艋t o s a n , g e l a t i n , p e c 血b i o c o m p a t i b i l i t y 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得鑫鲞盘堂或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：予长讶眸 签字日期：口占年f 月乃日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解：苤洼盘茎有关保留、使用学位论文的规定。 特授权盘洼盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅a 同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名： 张嗳年 导师签名： 签字日期：，年，月，日 签字日期：，年，月f 歹日 第一章仿生化组织过程生物材料研究进展 第一章仿生化组织工程生物材料研究进展 1 1 组织工程 1 1 1 组织工程的定义 1 9 9 3 年美国麻省理工学院 , a n g e r 和哈佛大学v a c a n f i 在s c i e n c e 杂志上提出 了组织工程( t i s s u ee n g i n e e r i n g ) 概念【l 】，此后组织工程学科引起了各个领域的 专家学者们的关注所谓组织工程，是指运用工程科学与生命科学的基本原理和 方法研究与开发生物替代物，从而恢复、维持和改进人体组织功能的一门新兴交 叉学科它暗示了组织工程的三个要素，使用活细胞，结合天然或合成细胞外基 质组分，制备可植入的部件来重塑或替代缺失的功能。 组织工程的基本原理和方法是将体外培养扩增的正常组织细胞吸附于一种 生物相容性良好并能被机体吸收的生物材料上形成复合物，将细胞一生物材料复 合物植入机体组织、器官的病损部分，细胞在生物材料上逐渐被机体降解吸收的 过程中形成新的形态和功能方面与相应器官、组织相一致的组织，而达到修复创 伤和重建功能的目的。它是生命科学发展史上的又一新的里程碑，标志着医学将 走出器官移植的范畴，步入制造组织和器官的新时代。 1 1 2 组织工程的研究内容 组织工程的研究主要集中于种子细胞、组织工程支架和组织工程化组织【2 】， 以下就这三个方面分别进行阐述。 1 1 2 1 种子细胞的研究 种子细胞的培养是组织工程的基本要素，细胞主要来源于自体、同种异体、 异种组织细胞等。自体组织细胞应为首选。由于组织工程细胞培养多需要高浓度 的细胞接种，自体组织细胞存在数量上的局限性及长期传代后细胞功能老化的问 题。目前解决这些问题的方法主要有下几种：( 1 ) 微载体等技术用于细胞的快 速增殖口】。( 2 ) 干细胞工程【4 】是利用现代生物医学和组织工程技术，通过对间充 质干细胞、胚胎干细胞等前体细胞进行体外分离纯化、定向诱导分化、转基因及 核移植、大量扩增和整合构建，在体外重建入骨、软骨、肌肉，真皮、神经、血 第一章仿生化组织过程生物材料研究进展 管、皮肤、角膜等组织( 3 ) 采用各种生长因子和端粒酶调节与延缓细胞的老化 5 1 0 ( 4 ) 采用各种方法( 包括自身转化、化学、物理、病毒等方法) 诱导细胞发 生转化，使其倍增时间减少，生命期延长。 1 1 2 2 组织工程支架的研究 组织工程支架是细胞附着的基本框架和代谢场所，其形态和功能直接影响所 构成的组织形态和功能。理想的组织工程支架应具有以下特点：生物相容性好， 在体内不引起炎症反应和毒性反应；可吸收性，能彻底的被自身组织所替代；可 塑性，可成任意的三维结构，植入后在体内仍可保持特定形状；表面化学特性和 表面微结构利于细胞的粘附与生长；降解速度可根据不同细胞的组织再生速度而 进行调整。 1 1 2 3 组织工程化组织 目前研究主要集中于人工软骨、骨、皮肤等，其中软骨的研究最为活跃。曹 谊林课题组将牛肋软骨细胞接种于具有人耳形状的p g a 纤维多孔支架后，植于 老鼠背部皮下组织内，成功地生成了具有入耳形状的软骨。 1 1 3 组织工程生物材料面临的挑战 工程科学与生命科学融合孕育的组织工程学提供了开发能恢复、维持或改善 组织功能的生物替代物的新机遇；同时对在组织工程中起着重要作用的生物材料 提出了新的挑战。从材料科学与工程观点可将组织视同细胞复合材料。它由细胞 及其分泌的细胞外基质( e c m s ) 组成，细胞外基质是蛋白质和糖胺聚糖( g a g s ) 的化学和物理交联网络。其功能为从空间使细胞集团化且构建组织，并提供细胞 环境信号，细胞接受其信号而重构它们的e c m s 。它们问存在多重相互作用，出 现了各个组元所不具有的新功斛“。 目前组织工程用外源e c m s 主要应用生物可降解的材料羟基酸聚酯，如聚乙 醇酸( p g a ) 、聚乳酸( p l a ) 及其共聚物和水凝胶如聚( 氧化乙烯氧化丙烯 氧化乙烯) ( p l u r o n i c , b a s f ) 及天然材料如胶原、硫酸软骨素、透明质酸和藻酸盐 等。天然材料优点是具有特异的细胞相互作用，但不易大量获取且批量间性能有 差异。合成材料能规模生产，易调控所制备e c m s 的微结构、力学性能和降解速 率，但其最大的不足为缺乏细胞识别信号【_ ”。因此无论是天然生物材料还是合成 生物材料都有其不足之处。而组织工程生物材料不仅要求其生物相容性，更要求 产生所期望的细胞和分子响应，才能满足组织修复与重建的需求。这便是组织工 程生物材料面临的挑战。 2 第一章仿生化组织过程生物材料研究进展 目前已进入研究与开发第三代生物材料的阶段，即细胞和或基因活化生物 材料。如将特异蛋白质、肽和其它生物分子固定化在材料表面，模拟细胞外基质 环境，且提供多功能细胞粘附表面这就需要从材料表面与本体特性对目标细胞 行为控制与介导出发，设计与制备仿生生物材料。因此仿生生物材料的研究，已 经逐渐成为组织工程生物材料的研究熟点。 1 2 组织工程用生物降解材料 生物降解材料按来源可分为天然材料和合成材料。天然材料主要有多糖和蛋 白质两大类：合成材料按大分子主链的结构特征又分为聚酯类、聚酸酐类、聚酰 胺类和聚原酸酯类等。天然材料已广泛应用于组织工程。但天然材料因其来源不 同，结构与性能存在批次问差异，故有其局限性。这就促使人们对天然材料进行 改性，或使用各种合成材料，而后者的特点是结构与性能可精确调控。 1 2 1 合成材料 合成材料的研究主要集中于聚羟基乙酸( p g a ) ，聚乳酸( p l a ) 及两者的 共聚物( p l g a ) ，聚p 一羟基丁酯，聚原酸酯，聚磷酸酯，聚酸酐，聚乙烯醇 ( p v a ) ，p l t t r o n i e s 等( 结构如图1 5 ) 。 p i a p h b 扣2 一牲恤咄娼 p c l p e g f 呱咖啡啷咄 a 曲 p l m 葩印陀d 黔 图1 1 常用合成生物聚合物材料 合成聚合物材料的共同特点是：具有生物相容性及可塑性。合成聚合物材料 的性质通常可以通过分子设计得到精确的控制，还可以通过大规模的生产获得性 3 一喝 厂_ l l 1 k p 1 凡 o=警 卜 第一章仿生化组织过程生物材料研究进展 质相同的材料。针对不同的组织工程要求，合成聚合物材料的物理和机械性能可 以很容易的通过分子结构的变化而调整。虽然合成聚合物材料具有优异的物理机 械性能，但相对于天然大分子来说，其生物相容性远远不能满足组织工程和生物 医用领域飞速发展的需要，尤其是一般的合成聚合物材料上缺乏可以用于键接生 物活性因子的官能团，这为其进一步生物相容化增加了难度。 1 2 1 1 脂肪族聚酯 常用的脂肪族聚酯材料有聚乳酸p l a 、聚己内酯p c l 、聚乙醇酸p g a 和聚3 羟基丁酸等等。这些聚合物的降解速度比聚原酸酯和聚酸酐慢，降解方式为本体 降解，即聚合物从内部到外部同时降解。聚- - l - - 乳酸( p u a ) 为左旋聚乳酸， 属于立构规整聚合物，有较高的结晶度，它的降解速度要慢于聚一d ，l 一乳酸 ( p d l l a ) 和p g a 。聚己内酯也是一种可降解聚酯，但其降解速度较前两者慢。 聚乳酸分子中有一个不对称的碳原子，因此有两种光学异构体，可形成四种 不同构型的聚合物：两种立体规整形构型，右旋聚乳酸和左旋聚乳酸( d 构 型和l 构型) ，可表示为p d l a 和p u a ；一种外消旋构型的聚乳酸表示为 p d l l a ；第四种是内消旋型，在实际中很少用。 p d l l a ( m b w b = 2 2 万；d l 单体比l ：1 ) 的试样，经y 射线灭菌后植入鼠 背肌袋内，4 周后试样由透明变为混浊，2 0 周试样表面可观察到丰满的凸起， 2 4 周试样外层有裂纹，植入物脆性增大，3 2 周后己成p d l l a 碎片，至5 6 周 p d l l a 植入部位仅留有很薄的疤痕。植入试样的三点弯曲强度植入4 周后仍为 1 0 2 n m m ，6 周后强度保持9 0 ，1 2 周后保持6 0 1 8 1 。 v a c a n t i t g l 等将自体牛软骨分离得到的软骨细胞接种到用p g a 和p l a 纤维织 成的支架上，在体外培养一周后植入裸鼠皮下，结果表明均获得了透明软骨组织 的生成，支架不仅在体内新软骨形态形成时起到了适当的内部稳定作用，而且可 能对软骨生长有引导作用。c h u 等【lo l 将同种的软骨细胞接种在多孔的p l a 支架 上，然后植入1 6 只成年新西兰白兔的踝关节软骨缺损处，术后6 周，解剖发现 9 6 ( 1 5 1 6 ) 的实验动物的软骨缺损处有新软骨生成，其颜色和正常关节表面 相似。 1 2 1 2 医用聚氨酯 聚氨酯p u 具有优异的力学强度、高弹性、耐磨性、润滑性、耐疲劳性、生 物相容性、可加工性等性能，广泛应用与生物材料，尤其是血液接触材料和长期 植入的医用装置等。但是未经处理的p u 的表面往往不利于细胞的生长。高长友 等【l l 】对p u 膜表面进行光化学接枝甲基丙烯酸二甲胺基乙酯( d m a ) 、丙烯酸羟 乙酯( 珏认) 、丙烯酰胺( a a m ) 等功能基团，得到了具有良好内皮细胞相容 4 第一章仿生化组织过程生物材料研究进展 容性的聚氨酯材料 1 2 1 3 聚氨基酸 聚氨基酸是一种新型的聚合物，具有良好的生物相容性，其降解产物为a 一 氨基酸，是一类理想的体内可吸收生物材料。如高分子量的多聚赖氨酸p o l y ( l - l y s i n e ) 用于材料表面改性，能促进材料对细胞的粘附。但由于目前尚缺乏理想 的生成高分子量聚氨基酸的聚合方法，生产成本过高，导致其实际应用受到限制。 目前已成功研制出的多肽丝绒型人工皮肤就是由多肽薄膜与尼龙丝绒复合制成 的【1 2 1 。这种人工皮肤外观似尼龙，透明、柔软、耐高温，可高温蒸汽消毒，抗 张强度大在创面应用上，贴附性、柔软度、膜下细菌数减少等方面均优于聚乙 烯醇和聚氨酯海绵。 1 2 2 天然生物大分子材料 天然大分子材料，如胶原、明胶、透明质酸、果胶、壳聚糖和海藻酸钠及其 衍生物，其优点在于可以作为组织填充物而长期存在，有较好的组织相容性和亲 和性，完整的天然大分子材料可能存在着某些复合生长因子，可诱导调节细胞的 生长、繁殖、分化等。但天然大分子材料一般由植物、动物或人体组织分离获得， 价格昂贵而且不同批次材料之间的性质还会有所差异，因此不适于大规模的批量 生产。另外生物大分子材料的物理机械性能较差，不能满足根据组织工程需要而 对降解时间等性能进行设计的要求。 1 2 2 1 壳聚糖 壳聚糖 9 一( 1 4 ) 2 - 胺基- 2 一脱氧- d 葡萄糖】是一种独特的碱性多糖，由甲壳 素【b - ( 1 - - * - 4 ) - 2 乙酰胺基2 脱氧一d 一葡萄糖】脱乙酰化而制各。甲壳素是甲壳类动 物的外壳、昆虫的表皮和真菌类的细胞壁组成物。甲壳素的脱乙酰化很少能达到 完全，大多数产物是n 乙酰化葡糖胺( n a g ) 和n - 葡糖胺的共聚物( 图1 2 ) ， 平均分子量为3 0 1 0 0 万d a 。两种重复单元的比例与壳聚糖的来源及制备方法有 关，但以葡糖胺为主，通常大于6 0 ，即脱乙酰化度( d d ) 大于6 0 。 5 第一章仿生化组织过程生物材料研究进展 坍龟 图1 2 壳聚糖结构式 o 壳聚糖( p k a = 6 5 ) 在中性和碱性p h 介质中不溶于水；在酸性条件下，i l p 2 p h 6 时由于氨基质子化而溶子水，此时它转变成高正电荷密度的线性聚电 解质。它的特性粘度受p h 和离子强度的影响。壳聚糖的酸性水溶液可与聚阴子 物质如肝素、海藻酸钠、羧甲基甲壳素等反应生成聚电解质配合物。 1 2 2 1 1 壳聚糖在软骨工程中的应用 三维( 3 d ) 支架对工程化软骨组织的发展是必需的。理想的支架应该是生 物相容性良好的、生物可吸收的，并且有可预计的孔隙率和降解速率。它们为新 组织的向内生长提供了框架，并且使其力学特性能与天然组织匹配【l 引。由于c s 的结构与关节软骨中的g a g s 的结构非常相似，c s 已被用做软骨组织工程支架材 料【1 4 】。这一点是非常重要的，因为g a g s 在调控软骨形态、分化和功能中起着关 键的作用。 海藻酸盐是另外一种重要的软骨组织工程用生物材料，但它的细胞粘附性很 差。1 w a s a k i ! ”】等报道了一种海藻酸盐基一壳聚糖复合高分子纤维，该纤维跟单 纯的海藻酸盐纤维相比，细胞的粘附和增生都有一定程度的提高。该纤维有很好 的拉伸强度，可用作开发软骨重建的三维承载支架。体外在壳聚糖基质上培养的 软骨细胞，其形态仍为圆形，并能合成特定的细胞外基质( e a 出) 。壳聚糖已 被用于提高软骨细胞在p l l a 薄膜上的粘附，这种改性的基质细胞粘附、增生和 生物合成活性都有所提剐1 6 1 。壳聚糖也可与透明质酸盐结合来制各软骨用生物 纤维。在该纤维上软骨细胞的粘附、增生，型胶原的合成和分泌比c s 纤维上 的提高很多l l ”。同样，为了提高细胞在c s 上的粘附，h s u 等开发了壳聚糖一海藻 酸盐一透明质酸盐复合物，并在该复合物上共价连接了r g d 蛋白质。种植了细 胞的支架显示，在体外有新软骨的形成，将种植了软骨细胞的支架植入兔膝盖软 骨缺损处，一个月后可观察到部分修复的形成，表明该复合物可用于软骨重建。 壳聚糖支架可以控制的释放生长因子，用以促进软骨细胞的向内生长和生物 合成能力。【船等【l 目制备出承载t g f b l 的c o u a g c n c s g a g 支架。该支架能控制 t g f b l 的释放，并能促进软骨的重建。而且，在胶原支架中加入壳聚糖能够提 6 第一章仿生化组织过程生物材料研究进展 高其力学性能，并能通过抑制胶原酶的合成，提高胶原支架的稳定性。k i l n 掣聊 用冻干的多孔壳聚糖支架载含t g f b 1 的微球来治疗软骨缺损。t g f b 1 可以被控 制释放，促进软骨细胞的增生和基质合成。 1 2 2 1 2 壳聚糖用于骨组织工程 壳聚糖在骨组织工程中已被大量应用，因为它能通过成骨细胞体外培养促进 细胞生成和矿物基质沉积。而且，壳聚糖生物相容性良好，生物可降解的，并能 被制成多孔结构。一些研究关注子用壳聚糖一磷酸钙( c p ) 复合物来达到这个 目的【2 0 】。一种结合了多孔壳聚糖海绵的三维大孔磷酸钙生物骨水泥已经被z a n g 等人开发出来。在这种支架中，网状的壳聚糖能通过基质加固来提高骨水泥的力 学强度，并能保留造骨细胞的表现型1 2 1 1 。同样地，结合了庆大霉素的大孔壳聚 糖支架可通过用p 一磷酸三钙( p 。t c p ) 加固增强其力学性能。结合了羟基磷灰 石( h a ) 的大孔壳聚糖支架或磷酸钙生活玻璃已经被制成，其相互贯通的孔的 直径大约有1 0 0 1 _ l m 。 壳聚糖被用作骨水泥的辅助成分来提高骨水泥的可注射性，并能保持其物理 化学性能，有利于手术应用( 如固定时间和力学性能) 。将壳聚糖用于此用途的 原因是基于壳聚糖溶液凝胶的p h 范围是从弱酸性到生理p h 环境；实际上，壳聚 糖一磷酸三钙复合物引出的问题是骨填充物在生理条件下能够固化，而不是在体 外混合时固化。同样，当将壳聚糖加到磷酸钙水泥( c p c ) 中后，可得到八价磷 酸钙( o c t o c a l c i u mp h o s p h a t e ) ，该物质的可注射性和强度都有所提高。许多这 种壳聚糖凝胶复合物被建议主要用在非承载骨缺损部位 2 2 1 。 1 2 2 2 胶原和明胶7 胶原是人体和哺乳动物体内的主要结构蛋白，是支持组织的主要成分。胶原 蛋白中含有大量的氨基酸、脯氨酸和羟脯氨酸。胶原蛋白的基本单位为胶原蛋白 分子，该分子定向整齐排列，分子之间通过共价键交联形成胶原微纤维，再聚集 成胶原纤维。根据原胶原分子组成的肽链结构不同，胶原分为若干类型，如成纤 维细胞的细胞外基质中胶原类型为i 型，而关节软骨细胞的细胞外基质中则富含 型胶原。胶原分子由三条多肽链组成，为典型的三螺旋结构大分子。胶原是应 用最早和使用最成熟的生物材料之一，可用于皮肤、软骨、骨和神经等组织的修 复重建。从牛肌腱和牛皮提取的可溶性胶原在3 7 c 生理缓冲溶液中形成原纤维 后可挤出成型各种直径的纤维材料。但由于在体外不能催化如体内那样的赖氨酸 衍生的交联反应，该纤维的拉伸强度很低。因此研究者们采用各种方法交联胶原， 以提高其力学强度。动物皮经蛋白酶消化得到的胶原( c o i l , i ) 是水溶性的，常 用戊二醛( 1 i ) 进行交联以制备胶原基材料。交联反应主要在戊二醛的醛基和胶 7 第一章仿生化组织过程生物材料研究进展 原赖氨酸和羟基赖氨酸残基上的氨基( i ) 之间发生，如图1 4 所示。y a a n a s 等人吲首先用胶原一硫酸软骨素多孔交联的支架成功地制得了人工皮肤。据临 床报告，这种人工皮肤能治疗严重伤的病人。 浒腿 ( 1 锄f 图l - 3 胶原与戊二醛的交联反应 明胶是胶原的部分变性衍生物，它由胶原的三重螺旋结构解体为单链分子而 形成。实验证明明胶无抗原性。明胶有两种类型，即明胶a 和明胶b ，明胶a 是在热变性前用酸预处理的明胶，而明胶b 则是用碱预处理，使其谷氨酰胺与 天冬酰胺的酰胺残基转变成谷氨酸和天冬氨酸，因此明胶b 的羧基含量至少比 明胶a 的羧基含量高2 5 。 明胶水溶液的温度降至3 5 以下时形成热可逆性凝胶，此时大分子链从线 团状构象转变成螺旋状，这个过程中它们容易恢复到胶原的三重螺旋结构。物理 凝胶明胶的转化温度和凝胶浓度、陈化时间、p h 等参数相关。 明胶凝胶的物理网络在较高温度下解体，不适于3 7 下长期使用。同时明 胶水凝胶热稳定性和力学稳定性也不高，因此有待通过化学交联改善。明胶凝胶 可用n ，n - ( 3 二甲氨丙基) - n 乙基碳二亚胺( e d c ) 和n 羟基丁二亚胺( n h s ) 化学交联，形成化学交联明胶凝胶，此时明胶( g e l a t i n ) 上的羟基和胺基在e d c 和n h s 存在下，相互反应形成酰胺交联键： g e l a t i n - c o - o h + n h 2 一g e l a t i n g d a t i n - c o - n h g e l a t i n 通过上述反应，明胶的物理交联网络转变成化学交联网络，图1 5 所示为它 们的示意图，明胶的物理网络中含有三重螺旋结构结合点，其官能度为6 ，通过 化学交联分子间和分子内形成官能度为4 的结合点。 l e e 四】等采用冻干法制备明胶藻酸盐孔隙率6 0 的海绵体，且以水溶性的 1 乙基3 - ( - 3 二甲基氨丙基) 碳二亚胺( e d c ) 交联。将其负载外用抗菌药硫 酸庆霉素( g s ) 或磺胺嘧啶银( a g s d ) ，药物能缓释4 天。体内w i s t a r 鼠背皮 损伤修复动物实验确认，载a g s d 的创伤1 2 天几乎完全愈合。i k a d a 2 4 等对采用 8 第一章仿生化组织过程生物材料研究进展 冷冻干燥法制备明胶支架过程中，冷冻参数对孔隙结构的影响进行了研究，并制 备了含有b f g f 的明胶支架材料，可用于兔颅骨缺损的修复，实验结果表明其成 骨密度较高。 国 。 釉 o g d 。姐邑川h + n 吼g 幽妯罴g 幽蛞扛邑娟卜6 幽妇 g d 抽叫帕h l g d 毫i n _ 三三三g e k t i 妒删卜6 d t i n 图1 4 物理交联( a ) 和化学交联( b ) 明胶网络示意图及e d s n h s 交联反应( c ) 物理交联网络含三重螺旋结构结合点( ；) ；化学交联网络含分子间和分子内结 合点( ) 1 2 2 3 透明质酸 透明质酸是天然细胞外基质( e c m s ) 中糖胺聚糖( g a g s ) 的重要组成物， 它在创伤愈合中起着重要作用，透明质酸能被细胞和血清中的透明质酸酶降解。 透明质酸分子中含有的大量的羧基和羟基可与水形成氢键而结合大量的水，基质 中的透明质酸具有固定及阻止水流动的功能；透明质酸的亲水作用赋予组织一定 的渗透压，透明质酸及其赋予组织的渗透压是组织得以维持正常状态所必需的； 透明质酸是滑液的主要成分，赋予滑液良好的粘弹性和润滑作用。透明质酸对细 胞具有多种作用，可在细胞表面形成细胞周分子笼蔽( p e r i c e l l u l a rm o l e c u l a r c a g e ， p m c ) ，保护细胞免受溶胞物质、病毒等的攻击，对氧自由基、白介素。1 和植物 凝集素的降解或侵害也有防护作用，可以影响细胞的移动、增殖和分化，影响细 胞的吞噬功能，屏蔽细胞膜上的机械感受器等。 利用透明质酸钠中葡萄糖醛酸结构单元的羟基可制备透明质酸苄酯。意大利 f i d i a 先进生物聚合物公司( a b a n ot e r m e ) 已开发出直径4 0pm 的纤维无规排 列的透明质酸苄酯无纺布网( n o n - w o v e nm e s h ) h y a f l 逾一，它可作为三维支架 用以修复关节软骨缺损。s u bh w a l 等【2 5 谰冻干法制备了胶原一透明质酸三维多 孔支架，并用e d c 交联，用l 9 2 9 细胞检测了支架材料的生物相容性。实验结 9 第一章仿生化组织过程生物材料研究进展 果表明，与高密度聚乙烯材料相比，胶原一透明质酸多孔支架具有更好的生物相 容性。从仿生角度出发，可以设想透明质酸及其衍生物可以为体外培养的细胞提 供良好的生长环境，特别是干细胞或成人细胞在这个类似于胚胎的环境里引发分 化。因此，采用透明质酸基生物材料制备组织工程用生物支架，为组织工程的发 展开辟了新的领域。 图1 5 透明质酸的分子结构 1 2 2 4 海藻酸盐 海藻多糖是广泛使用的生物材料。这是因为它具有温和的凝胶条件和良好的 生物相容性。海藻酸盐的主要来源是褐藻。由于对离子的选择性，海藻常以不溶 的凝胶形式存在，。常被存在的钙离子交联。藻酸是d 甘露糖醛酸( m ) 和l 葡萄糖醛酸( g ) 的共聚物，来源不同，组成比例不同，物理和机械性质也就 不同。同种单体单元的长度决定其性质，富含g 的海藻酸钙是硬质材料。 海藻酸钠的敏感二价离子为b a 2 + ，s r 2 + , c a 2 + 。敏感性随g 含量增加而增大， p o l y m 基本没有敏感性可用海藻酸酶调整m g 比例，达到改性效果。 藻酸盐可在温和条件下凝胶加入m 9 2 + 凝胶化能避免细胞免疫性这使得海藻 酸钠成为十分有前途的可注入性生物材料海藻酸盐被广泛用作细胞免疫隔离基 质软骨组织工程的可注入基质等。 1 2 2 5 果胶 果胶物质在化学分类上属于碳水化合物的衍生物，其基本组成单位是部分甲 酯化的d 一吡喃半乳糖醛酸，并以n 1 ，4 糖苷键连接起来而形成的高分子化合 物( 即多聚半乳糖醛酸) ，分子量在5 0 3 0 0 k d ，其结构式如图1 - 6 所示。纯品果 胶为白色或淡黄色的粉末，略有特异气味。在2 0 倍的水中几乎完全溶解，形成 一种带负电荷的粘性胶体溶液，但不溶于乙醚、丙酮等有机溶剂。一般认为，果 胶及果胶酸在水中的溶解度与自身的分子结构有关：一是随链的增长而降低；二 是随酯化程度的增大而升高，( 其衍生物甲酯、乙酯较易溶于水) 。其原因可能是， 果胶物质的分子不是以直线形存在，而是多呈折叠形式，极易形成分子内氢键； 1 0 第一章仿生化组织过程生物材料研究进展 而酪化程度较高时，分子内氢键相对减弱，因此溶解反会有一定的增加。在不加 任何试剂的条件下，果胶物质水溶液呈酸性，主要是果胶酸和半乳糖醛酸。因此， 在适度的酸性条件下，果胶稳定。但在强酸与强碱作用下，易引起果胶分子降解 使长链变成短链。 仔母t 图1 6 果胶结构示意图 近年来，果胶在医药领域的应用备受关注，美国药典2 1 版已收载了药用果 胶的质量标推，据国内外文献报道，果胶有较高的药用价值，除了具有抗菌、止 血、消肿、止痛、解毒、止泻、降血脂、抗辐射等作用外，还是一种优良的药物 制剂基质，能抑菌，延长药物在体表的停留时间，促进皮肤吸收和表皮再生、保 持皮肤湿润光泽等。果胶可单独或与其它赋形剂合用配制软露、膜剂、栓剂、微 囊、外用涂膜剂等药物制剂。美国的一项专利以果胶为基质，配以多种维生素制 成的护肤洗液可使粗糙皮肤变得柔软。也可以果胶为基质配以多种中药馏出液制 成外用制剂，具有滋润肌肤的功效。 根据果胶分子甲酯度的不同可将其分为低甲氧基果胶( l m ，其甲酯度不超 过5 0 ) 和高甲氧基果胶( i - i m ，其甲酯度高于5 0 ) 。果胶的甲酯度对其凝胶 能力有很大的影响。 d 讧果胶在蔗糖等的存在下会生成凝胶【2 6 】，据报道，该凝胶 的形成是由于氢键相互作用和疏水相互作用。l m 果胶在二价离子存在的情况下 会形成凝胶。i m 果胶和钙离子形成的凝胶网路是著名的蛋壳结构。同样，有报 道称果胶还可以与阳离子大分子如壳聚糖相互作用形成凝胶【明。 果胶已经被用于结肠内药物控制释放基质。在结肠内，没有蛋白酶的存在， 许多蛋白质类药物可以在该区域被吸收进入血液循环和免疫系统而不会被蛋白 酶破坏。近年来，已经有很多合成或天然高分子材料被研究用于结肠内药物释放 的载体。这些载体需要满足以下条件：首先，它们在消化道内在未达到结肠位置 之前需要保持完整性，以免结合的药物在消化道内被化学降解或酶降解；其次， 到达结肠位置之后它们必须马上能释放出结合的药物。果胶在酸性环境下能保持 其大分子的结构，在中性p h 溶液中，果胶大分子开始分解和膨胀。而且，果胶 不会被消化道上段所存在的蛋白酶和淀粉酶降解，相反，果胶会被在结肠内大量 第一章仿生化组织过程生物材料研究进展 存在的微生物群降解。由于上述原因，果胶可用作结肠内药物释放的载体，将蛋 白质或多肽药物通过口腔运送到结肠内。果胶最吸引入的性能之一就是其凝胶性 能。影响果胶凝胶能力的因素包括果胶的类型，浓度，脱甲酯度，溶液p h 值， 温度，阳离子的存在以及其他一些因素。果胶的类型和果胶分子的结构不同，其 凝胶的方式也不同。凝胶可能在酸性条件下发生，在与钙离子交联的情况下发生， 或者在与海藻酸盐的协同作用下产生。对于在酸性条件下产生的果胶凝胶，果胶 的水合作用被降低了，结合到互相缠绕的链里面的水也就相应减少了。当溶液的 p h 值升高的时候，果胶的酯基团被质子化了，能与钙离子相互作用形成钙一果 胶盐凝胶，钙离子和果胶上羧基的相互作用是分子问的鳌合作用。果胶和海藻酸 盐的混合溶液在d 一葡糖酸内酯存在的情况下会形成凝胶，该凝胶是在海藻酸盐 上的质子化的“g g ”结构单元和果胶上的甲酯基团之间形成的网。 利用果胶和其他高分子材料制成结肠药物释放载体已经有所研究。新合成的 复合物结合了两种高分子材料的优点，或者形成了新的性能。例如，果胶和醋酸 纤维素复合物结合了果胶的酶易感性和醋酸纤维素的保护性能。果胶和壳聚糖或 果胶和聚甲基丙烯酸甲酯的复合物都带有不同数量的氨基集团，他们都能被酶降 解，疏水性更强。 人们将果胶和纤维素溶解在去离子水中，制成混合溶液，将其用作涂敷片剂 药物的表面，来研究其对药物在结肠释放的效果。试验结果表明，形成的复合物 涂层对药物来说是不能通过的，这就在消化道的上段对药物起到了保护作用，而 当涂层遇到结肠内存在的微生物群而降解的时候，药物就可以被释放出来。增加 醋酸纤维素的含量或者涂层的厚度能降低药物在p h 值从1 到7 4 的环境中的释 放。为了得到适当的力学强度，果胶在混合物中的最佳含量应不超过2 0 。混 合物中果胶的含量增加时，涂层只能稍微延迟结合药物的释放。研究发现果胶和 醋酸纤维素之间的结合是在水相中，而不是在干燥的薄膜中。相反，由果胶和醋 酸纤维素制备的薄膜上有孔存在，孔隙率主要是由水相成分的挥发控制的。为了 提高该复合物在结肠药物释放中应用，必须提高他们的疏水性。当果胶的钙盐用 于该复合物的时候，薄膜可实现控制释放，因为果胶钙盐比果胶的疏水性好，而 且分子尺寸比未交联的果胶更大嗍。 果胶是一种阴离子生物大分子，能够和带相反电荷的表面相结合，并能与带 相反电荷的聚合物形成复合物。果胶能和阳离子大分子结合形成凝聚物，如壳聚 糖，聚赖氨酸，以及含有四价氨基的聚丙烯酸酯衍生物。壳聚糖有良好的生物性 能，如无毒，生物可降解性，良好的组织结合活性等。果胶和壳聚糖复合物也被 研究用作药物释放载体【3 0 】。果胶和壳聚糖混合粉末( 质量比为1 0 ：1 ) 被压缩包 被到含药小球表面，里面包被的药物是盐酸氯丙嗪。体外释放的结果显示该复合 第一章仿生化组织过程生物材料研究进展 物有希望用于结肠药物释放。在另外一项试验中，用压缩包被的方法制备了用壳 聚糖和果胶混合物( 质量比为l ：5 ) 包被的茚甲新片剂。就象预期的一样，在 体外当环境p h 值为6 时，茚甲新的释放最为明显。因此，有必要对果胶，壳聚糖 涂层的性能特别是孔隙率做进一步的研究，使该涂层材料满足结肠内药物释放载 体的要求。 除了在药物释放领域的应用之外，果胶还被研究用作组织重建基质。l i u 等 人【3 l 】研究了将疏水性的聚乙丙交酯( p l o a ) 和亲水性的果胶制备成生物可降解 的支架材料。该研究利用钙离子作为果胶网络形成过程中的制孔剂和交联剂，该 方法将孔的形成和聚合物交联过程合为一步。将干态的果胶粒子和氯化钙加入到 p l g a 氯仿溶液中，便