（环境科学专业论文）净化槽低温高效微量油脂降解微生物的选育技术研究.pdf

上海交逶大学硕士学谴论文 r e s e a r c ho fm l c r o o r g a n i s m st ob ea d d e dt o t h ep u r i f y i n gt a n k ，w h i c ha r ec a p a b l eo f d e g r a d i n gf a t se f f e c t i v e l ye v e na t5 a b s t r a c t o i l sa n df a t s c o n t a m i n a t e dw a s t e w a t e ri so n eo ft h em o s tw i d e s p r e a d e n v i r o n m e n t a ip o l l u t i o ni nt h ew o r l d i ti se s t i m a t e dt h a tt h e r ea r e5t ol0 m i l l i o ni i t e r so fo i l sa n df a t sp o u r i n gi n t ow a t e rs y s t e me v e r yy e a r h o wt o e l i m i n a t et h i sc o n t a m i n a t i o ne c o n o m i c a l l y , r a p i d l ya n dr e a s o n a b l y , h a s r e c e i v e dm u c hp u b l i ca t t e n t i o na n dt h u sb e c o m eam a i o rs o c i a lp r o b l e mi n t h e p a s t s e v g r a l y e a r s c u r r e n tp h y s i c o c h e m i c a lt e c h n o l o g i e s s u c ha s f l o t a t i o na n ds e d i m e n t a t i o na r eo f t e l li n s u f 五c i e n ta n dt i m e c o n s u m i n g w i t h t h ee x t e n s i o no fh h i t i a na c t i v i t i e st ot h eo c e a na n da r c t i c r e g i o n ，t h i s s i t u a t i o nb e c o m e sm o r es e r i o u s f a c u l t a t i v ep s y c h r o p h i l e c h a r a c t e r i z e db v i t sh i 2 hg r o w t hr a t e 。e n z y m ea c t i v i t i e sa n de 脯c i e n c yi nt h el o w t e m p e r a t u r e ， p r o v i d e sg r e a tp o t e n t i a l i nt h eo i l c l e a n u pt e c h n o l o g y t h es y s t e mw i t h s u i t a b l e p s y c h r o p h i l e i n o c u l u m m a yg r e a t l y s a v e p r o c e s s i n g t i m ea n d r e d u c e dt h ee n e r g yc o s ti nt h et r a d i t i o n a lh e a t i n g c o o l i n gm e t h o d h e r ew e i n v e s t i g a t et h ep o s s i b i l i t yo fp s y c h r o p h i l ei nt h eb i o d e g r a d a t i o n o fm i n i m a lo i l sa n df a t si nt h eh o u s e h o l dw a s t e w a t e ra tt h el o wt e m p e r a t u r e w i t hr a p e s e e do i la st h es o l ec a r b o ns o u r c e s i xi n d e p e n d e n ts t r a i n sw e r e i s o l a t e df r o mf i v ek i n d so fo i l sa n df a t s c o n t a m i n a t e dw a s t e w a t e r , a c t i v e s l u d g ea n dc o n t a m i n a t e d s o i l t h es t r a i n sc 2a n dx 1w e r ec h o s e nf o rf u r t h e r a n a l y s i s t h eg r o w t hc o n d i t i o no f c 2a n dx li sa tp h6 - 9 、0 - 3 5 a n da t p h6 - 9 、0 - 4 0 w h i l et h eo p t i m a lg r o w t hc o n d i t i o ni sa tp h7 - 8 、15 - 3 0 a n da t 0 h7 8 15 3 5 r e s p e c t i v e l y t h eo r t h o g o n a li m p a c t c o n d i t i o n se x p e r i m e n ts h o w st h a tt h eo p t i m a lo i ld e g r a d a t i o nc o n d i t i o no f t h e s et w os t r a i n si sa tp h8 0 ，5 ，1 0 0p p mo i l u n d e rt h i sc o n d i t i o n t h e r e m o v a lr a t eo f r a p e s e e do i lo fc 2a n dx 1i n2 4ha r e9 2 6 2 a n d9 1 9 8 r e s p e c t i v e l y , a n d t h er a t eo fl a r dd e c r e a s et o3 9 4 9 a n d5 4 2 9 r e s p e c t i v e l y m e nu s i n g w a s t e w a t e ra st h e e x p e r i m e n t a ls y s t e m t h e r a p e s e e d o i l d e g r a d a t i o nr a t e o ft h e s et w os t r a i n sd r o p st oa b o u t7 8 i 海交遥大学硬士学位论文 f u r t h e ri n v e s t i g a t i o ns u g g e s t e dt h a ts h o r t t i m ea c c l i m a t i o nm a yi n c r e a s et h e d e g r a d a t i o nr a t ea b o u tlo f i n a l l y , t w oc o n s e r v a t i o nm e t h o d sw e r et e s t e d c o m p a r e d t o p a r a f f i n o i ls l a n tc u l t u r e v a c u u m l y o p h i l i z a t i o n i sm o r e e f f e c t i v e t h ed e g r a d a t i o no i lr a t em a i n t a i n sn e a r l yc o n s t a n tw i t h i nt h es i x m o n t ha f t e rl y o p h i l i z a t i o n t h es t r a i n sc 2a n dx la r en a m e da sp s e u d o m o n a sp s e u d o a l c a l i g e n e s a n dp s e u d o m o n a sm e n d o c i n a r e s p e c t i v e l ya c c o r d i n gt ot h ei d e n t i f i c a t i o no f b e i l i i n gi n s t i t u t eo fm i c r o b i o l o g y ，c a s k e yw o r d s ：o i l sa n df a t s c o n t a m i n a t e d w a s t e w a t e r , f a c u l t a t i v e p s y c h r o p h i l e ，r a p e s e e do i l ，b i o d e g r a d a t i o n 上海交通夫学硕士学位论文 第一章前言 1 1 低温微生物的基本概念 在地球上，微生物是分布得最广泛的一类生物。与高等生物不同，微生物体 积小、重量轻，它们可以通过各种方式传播到地球的每个角落，在地球上除了火 山的中心区域外，从土壤圈、水圈、大气圈直至岩石圈，到处都有微生物的存在， 我们可以毫不夸张地说微生物是无所不在的。 微生物种类繁多，不同种类的微生物之司千差万别，已知的微生物种类已经 超过1 0 万。随着现代科技分离探测和培养手段的提高，微生物的新种、新属、 新科甚至新目、新纲屡见不鲜，目前我们了解的微生物种类可能只有生活在自然 界中的微生物总数的1 1 0 。 微生物除了分布广、种类丰富和数量多外，还具有惊人的适应性和变异性。 地球上有各种各样的环境，包括一些极端环境，如高温，低温，强酸，高盐，高 压环境等。在这些极端环境中存在着各式各样的微生物，它们在生物进化过程中， 通过自然选择获得了对极端环境的超强适应性，这些微生物被我们称为极端环境 微生物。 1 _ 1 1 嗜冷菌、专性嗜冷菌、兼性嗜冷菌和低温微生物 低温环境是一种常见的极端环境，在这一环境中存在大量的微生物。自从 1 8 8 7 年f o r s t e r 分离到能在o c 条件下生长的微生物以来，人们已经从许多自然 的与人造的低温环境中分离到了各种类型的微生物。尽管人们研究低温微生物已 经有一百多年，但从历史上看，关于低温微生物还没有一个统一明确的概念。先 后出现过的描述低温微生物的名词有g l a e i a l eb a k t e r i e n ，r h i g o p h i l e ，p s y c h r o t o l e r a n t ， p s y c h r o c a r t e r i c a s ，p s y c h r o b e ，t h e r m o p h o b i c b a c t e r i a ， c r y o p h i l e ， f a c u l t a t i v e p s y c h r o p h i l e ，o b l i g a t ep s y c h r o p h i l e 和p s y c h r o t o p h i cb a c t e r i a 等。显然，我们不能 笼统的将从低温环境中获得的微生物都称为低温微生物，因为许多非低温微生物 在低温条件下并未死亡，而是处于休眠状态，这些处于休眠状态的微生物在适宜 的温度条件下又可恢复活力而进行生长。 上海交遵大学疆士学谴论文 m o r i t a ( 1 9 7 5 ) 根据微生物的最适生长温度以及生长的上下限温度对嗜冷菌 作出了最初的定义。他认为嗜冷菌( p s y c h r o p h i l e ) 就是指那些最适生长温度等 于或低于1 5 ，上限生长温度等于或低于2 0 下限生长温度等于或低于0 的微生物的总称b i 。但随着越来越多低温微生物的发现，科研人员发现m o r ic a 的 定义并不精确和完整。例如，有些从南极水域中分离到的微生物的上限生长温度 低于1 0 。然而，有些微生物不仅可咀在o c 条件下生长，在2 0 以上的温度 条件下也可以进行生长，一些嗜温菌( m e s o p h i l e ) 如巨大芽孢杆菌、枯草芽孢 杆菌或某些节杆菌和棒杆菌等均可在低于5 的温度条件下进行生长；而鼠疫耶 尔森氏菌( y e r s i n i a p e s l i s ) 在- 2 0 o c f d4 0 。c 的温度条件下生长一样良好，这些微 生物显然超出了m o r i t a 所确定的嗜冷菌的范围。 h u c k e r 在m o r i t a 的基础上提出了兼性嗜冷菌( f a c u l t a t i v ep s y c h r o p h i l e ) 和专 性嗜冷菌( p s y c h r o p h i l e ) 的概念。其中专性嗜冷菌是指那些只能生活在低温下 且最高生氏温度不能超过2 0 的一类微生物，它们的最适生长温度不超过1 5 c ， 在0 及以下都可以繁殖生长；而兼性嗜冷菌则不同，它们的最高生长温度可以 超过2 0 ，在o 5 的环境中可以生长，一般生长温度范围为o 3 5 。这里的 专性嗜冷菌就是严格意义上的嗜冷菌。 我们现在所院的低温微生物就是指专性嗜冷菌和兼性嗜冷菌合称，亦即将所 有能在低于或等于5 条件下生长的微生物统称为低温微生物。这类微生物能在 0 c 下生长和繁殖，以此区别于嗜温菌( m e s o p h i l e s ，其最佳生长温度在2 0 4 0 。c 之r 司) 。 l _ 1 2 低温微生物的分布 由于地理位置的差别、季节变化及阳光的照射程度不同，使地球上不同区域 温度差别很大。虽然地球上存在一些高温环境，如一些温泉的水温可达i 0 0 ， 但地球上生物活动的大部分地区温度偏低。占地表7 0 以上的海洋约9 0 的部 分温度低于5 。极地陆地及常年积雪高山等地区的温度也常年低于5 。在 1 0 0 0 0 米高空，气温低于1 0 c ，高度增加，气温进一步降低。生物圈约8 0 以 上的部分为永久性低温地区，即常年低于5 c 的低温环境。根据温度变化的程 度，我们可以将低温环境分为稳定的低温环境和不稳定的低温环境。深海温度稳 定，属于前者：而大部分温带地区土壤温度随季节交替由低于0 至2 5 以上变 上海交通大学硬士学证论文 化，属于后者。值得注意的是，我们不能将永久性低温环境与稳定的低温环境混 淆，即使在某些永久性低温地区，温度也很不稳定。例如，一些极地地区的空气 及土壤的温度可在一8 8 3 5 c 这个范围变化。从稳定的低温环境( 如深海和冰 洞) 中分离出来的微生物通常为专性嗜冷菌。专性嗜冷菌地分布很受环境温度限 制且数量少，即使南北两极常冷地环境中，分离到的微生物中专性嗜冷菌只占很 少部分。它们对高于其上限生长温度( 2 0 。c ) 的温度条件非常敏感，2 0 以上很 快即引起死亡，为狭温性微生物( s t e n o t h e r m a lm i c r o o r g a n i s m ) 。这些专性嗜冷菌 的一个显著的特点是，它们通常是革兰氏阴性菌，特别是那些上限生长温度在 1 0 1 5 。c 范围内的细菌，多为直的或弯的杆菌，多属于假单胞菌属和弧菌属等。 当然，从稳定的低温环境中也分离到革兰氏阳性菌，如节杆菌、棒杆菌和短杆菌。 相比之下，从不稳定低温环境( 如极地土壤、湖泊、冰层及高空气体等) 分离出 来的微生物的生长温度范围较宽，即使其原位( i ns i r e ) 最高环境温度从未超过 1 5 ，有些微生物在高于其原位最高环境温度2 0 3 0 的条件下也能生长。另 外，还有一些微生物能够忍受低于其下限生长温度5 0 的温度，在这种不稳定 低温环境中难以分离到专性嗜冷菌，通常分离到的兼性嗜冷菌多为革兰氏阳性的 球菌和杆菌主要有节杆菌、棒杆菌、短杆菌及库特氏菌等，这类微生物的特点 是在极端环境下有较强的生存能力。 低温微生物的生长受多种因素的综合影响，相对来说，在稳定的低温环境 中主要受营养条件的影响，而在不稳定低温环境中主要受温度及水分的影响。低 温微生物生存时间的长短与次级代谢作用有关。有人根据在原位条件下是否能进 行连续的代谢作用，将微生物分为两类：一类是固有型( a u t o c h t h o n o u s ) 微生物， 另一类是发酵型( z y m o g e n o u s ) 微生物。固有型微生物能利用其天然环境中的原 有有机物质进行低速而稳定的代谢活动：发酵型微生物则倾向于利用新加到其所 处环境中的“新鲜”有机物质进行代谢活动。真正的固有型微生物没有次级代谢 系统，这些微生物一直在进行着初级代谢作用，它们长期生存的机会较少。稳定 的低温海洋环境中的固有型微生物因长期适应稳定的低温条件而成为专性嗜冷 菌。与固有型微生物不同，发酵型微生物不仅在稳定的低温环境中存在，在不稳 定的低温环境中也能存在。在稳定的低温环境中的发酵型微生物一直进行着低水 平的生理代谢，而在不稳定的低温环境中的发酵型微生物只在解冻的夏季( 取决 上海交通太学碛士学槛论文 于温度高低和水分获得的难易程度) 具显著的生理活性，当温度进一步降低时则 最终进入休眠状态。发酵型微生物在经过旺盛的生长期后即进入较长的停滞期， 并在这段时间内进行次级代谢。在最佳条件下进行次级代谢作用的微生物处于最 佳的存活状态。值得注意的是，微生物进行次级代谢作用的最佳条件与微生物生 长或进行初级代谢作用的最佳条件是不致的，从温度这方面来说，进行次级代 谢作用的最佳温度常比最佳生长温度低2 0 。c ，因此，对发酵型微生物来说有两 个最佳温度。海洋环境中，发酵型微生物具有在高于原位环境温度条件下生长的 能力，而在原位温度条件下( 低于最佳生长温度2 0 。c ) 可以进行次级代谢作用， 所以低温海洋环境中大量的兼性嗜冷菌多为发酵型微生物。在稳定及不稳定低温 环境中的兼性嗜冷菌有一个显著的特点：它们在原位低温条件下进行初级代谢作 用的速度虽然十分缓慢，但很有效，特别是考虑到大多数低温环境中的营养物质 水平较低，太快的代谢作用会很快地消耗可能获得的有机物质，而低速高效的代 谢方式有利于它们的长期生存。 1 1 3 低温微生物的种类 目前发现的低温微生物种类繁多，它们几乎遍及全球的各个角落。从寒冷 的南北两极到大洋的海底，从高原冰i i 旧人为制造的冰库，这些鲜为人知的微生 物正逐渐引起科学家的广泛重视。至今所分离的低温微生物大致可分为七类： 1 粘细菌：如橙色粘球菌( m y x o c o c c u s l v u s ) , r i d , 堆多囊菌( p o l y a n g i u m s o f e d i a t u m ) 2 蓝细菌 3 细菌：在已知低温微生物中，细菌是数量和种类最多的，比较常见的有 假单胞菌属( p s e u d o m o n a s ) 和芽孢杆菌属( b a c i l l u s ) 。f e l l 等( 1 9 9 4 ) 对 1 2 0 株来自南极的细菌进行了分析，其中大部分为海洋异养需氧革兰氏阴性 杆菌或球菌，只有3 株为革兰氏阳性。在这些细菌中有5 株分别可以分泌。卜 淀粉酶、酯酶、d 内酰胺酶以及蛋白水解酶。这些菌株一般在o 2 5 。c 之间 生长，3 0 左右死亡，4 时平均代值为扯1 0 小时。随着温度的升高，这些 分泌酶的活性呈现下降趋势【3 】。 4 放线菌：如链霉菌属( s t r e p t o m y c e s ) 和诺卡氏菌属( n o c a r d i a ) 5 酵母菌：如假丝酵母菌属( c a n d i d a ) 和隐球菌属( c r y p t o c o c c u s ) i 海交通丈学礓士学位论文 6 真菌：如青霉菌( p e n i c i l t i u mr o q u e f o r t i ) 7 藻类 1 i 4 低温适应机制 低温微生物由于长期生活在寒冷的环境中，在自然选择的作用下形成一系列 独特的与低温环境相适应的机制。这些机制包括营养物质的吸收和转运d n a 的复制合成，蛋白质的合成，合成代谢和分解代谢的正常进行，能量代谢的正常 进行，细胞的分裂，分子机制等。 膜中脂的组成提供了膜流动和相结构的前提条件从而保证膜中镶嵌的蛋白 质发挥正确的功能如离子和营养的吸收、电子转移等。膜中脂类的改变会引起膜 流动性的改变。因此微生物必须调节脂类的组成，从而调节膜的流动性和相的结 构以此适应环境温度的变化。当微生物处于低温时最经常看到的变化是增加不饱 和脂肪酸的比例。比较中温酵母和嗜冷酵母同时处于低温时清楚地发现嗜冷酵母 合成地不饱和脂肪酸含量增加。细菌处于低温时除了不饱和脂肪酸的改变外尚有 其他变化如缩短酰基链的长度、增加脂肪酸支链的比例和减少环状脂肪酸的比例 等。所有这些变化对于低温时维持膜的流动性具有重要意义。而膜的流动性为营 养物质的转运和吸收提供了基础。中温菌在接近o 时溶质吸收不活跃，其细胞 膜中的运载蛋白对冷敏感，溶质分子不能与相应的运载蛋白结合，且在低温条件 下由于能量缺乏不能支持营养物质的跨膜运输。而嗜冷菌细胞膜中的运载蛋白对 冷不敏感。比较研究嗜冷的、中温的和嗜热的t o r u l o p s i s 酵母菌株，发现只有嗜 冷菌能在2 运转葡萄糖。 嗜冷菌中的蛋白质在低温下能保持结构上的完整性，这可能是由于其蛋白质 分子含有更多的氢键和盐键从而能形成相对松动和具有弹性的结构。嗜冷菌中的 某些酶称嗜冷酶，在低温下具有很高的催化活性，其酶的最适反应温度与中温菌 相比一般要低2 0 3 0 。c 。这就保证了嗜冷菌在低温下生命活动的正常进行。嗜 冷菌具有在0 合成蛋白质的能力。这是由于其核糖体、酶类以及细胞中的可溶 性因子等对低温的适应性。体外实验表明，在同样低温条件下嗜冷菌体外蛋白质 翻译的错误率最低。许多中温菌不能在0 合成蛋白质一方面是由于其核糖体对 低温的不适应，翻译过程中不能形成有效的起始复合物，另一方面是由于低温下 细胞膜的破坏导致氨基酸等内容物的泄漏。由此可见嗜冷菌适应低温的能力表现 i 海交通丈学礓士学位论文 6 真菌：如青霉菌( p e n i c i l t i u mr o q u e f o r t i ) 7 藻类 1 i 4 低温适应机制 低温微生物由于长期生活在寒冷的环境中，在自然选择的作用下形成一系列 独特的与低温环境相适应的机制。这些机制包括营养物质的吸收和转运d n a 嘘，再剖4 融孟丘l 匣曲会些釜兰鲁釜釜些蛩垒目哩鲈证监王= = 譬二_ 二暑_ 包：芷音一 上海交通丈学硕士学位论文 在蛋白质合成过程中翻译机制的适应性以及在低温下能保持完整的膜结构，从而 保证低温下蛋白质合成的正常进行hj 。 与嗜中温性的微生物相比，这些由低温微生物分泌的酶分子体现出一种独特 的分子适应性：它们在0 3 0 。0 有着更高的催化活性，并且对热表现出更强的敏 感性。般来说，酶的比活性是和其热稳定性密切相关的。蛋白分子的热稳定性 主要来源于分子的刚性，刚性的增强使得酶与底物的相互作用受到影响，从而导 致了酶括性的下降。相反，柔性的增加使得酶促反应时的能量消耗减少，提高酶 的催化活力【5 l 。 自1 9 9 6 年a g h a j a r i 等第一个阐明来自嗜冷菌的仅淀粉酶的三维晶体结构以 来1 6 1 ，科学家们已经先后对c a 2 _ z n 2 + 金属蛋白水解酶i7 l 、磷酸丙酮异构酶1 8 i 、柠 檬酸合成酶9 1 以及苹果酸脱氢酶进行了晶体结构分析。这些酶都均由来自南极 的嘈冷菌分泌。三维结构表明，与那些来自嗜中温性的微生物的分泌酶不同，这 些来自嗜冷菌的分泌酶在蛋白质的某些部位存在着下述细微的差别【“1 ： ( 1 ) 与蛋白质折叠和稳定性相关的弱作用( 如氢键和盐键) 的减少； ( 2 ) 以一个低疏水性的疏水区域形成蛋白质的核心； ( 3 ) 删除和替换蛋白质二级结构的环和转角处的脯氨酸； ( 4 ) 通过增加带电荷的测链以增加溶剂和亲水表面的作用； ( 5 ) 在结构功能域附近出现甘氨酸簇： ( 6 ) 更广范围的钙离子配位作用。 根据上述的结构特征，现在普遍认为这些酶分子的低温适应性主要依赖于酶 分子内基团之间相互作用的减弱以及酶和溶剂分子的相互作用的增强。这样的分 子结构变化使得酶分子更具有柔性，增强了其与底物的作用，降低了反应的活化 能，从而提高了催化活性。 e m m a n e u l 等( 1 9 9 7 ) 进一步利用了定点突变的方法对株采自南极的嗜冷 菌( 枯草杆菌) 分泌的蛋白酶进行了分析。结果表明，当对蛋白分子的钙离子配 体t h r ”进行修饰后，可以使酶的热稳定性与嗜中温的枯草杆菌蛋白酶相同，并 且保持催化活性高出2 0 倍。这一发现表明，在某些嗜冷微生物的分泌蛋白中热 稳定性与高催化活性可能存在于不同的活性部位。通过基因工程的方法可以使 这些蛋白质在保持高催化活性的前提下提高其分子的热稳定性。这一研究成 6 i 海交通大学硕士学往论文 果将大大的推动低温微生物在纺织、食品及生物治污等行业的开发和利用。 l 1 5 低温微生物在生物修复中的应用 地球上低温微生物的资源非常丰富。低温发酵可生产许多风味食品且可节约 能源及减少嗜温菌的污染。分离自嗜冷菌的脂酶、蛋白酶及半乳糖昔酶在食品工 业和洗涤剂中具有很大潜力。从海洋低温微生物中分离到的生物活性物质可用于 医药、食品等。对这些方面的研究已有不少报导，这里着重介绍低温微生物在生 物修复中的应用。 1 概念 现在，坏境污染同益严重，不仅危害到污染地域的动植物区系，从而导致食 物链中有害化学物质的累积与级联放大；在某些情况下，还会严重危害到人体健 康甚至引起基因损伤。因此人们对环境污染问题日渐重视和敏感。从8 0 年代 开始，欧洲等发达国家开始研究污染土壤生物修复技术( b i o r e m e d i a t i o n ) ，就是 利用微生物将诸如土壤、废水中的环境污染物降解为无害的c 0 2 和h 2 0 的过程 t 3 1 。与传统的物化方法相比，则行之有效得多。生物修复的主要优点为：成 本低；不破坏植物生长所需的土壤环境：处理效果好，使污染物残留量降到 很低水平：对环境影响小，无二次污染；可以就地处理。一般生物除污都是 利用嗜温菌在常温下进行处理。而在温带地域，温度随季节会大幅度的变化，低 温会抑制微生物对有机污染物如油和脂的降解效果。低温微生物的代谢机理使它 们能够在低温下很好的生长和代谢，因此在寒冷及适温环境条件下应用低温微生 物对广受污染的寒冷地域环境进行废物处理越来越受到人们的重视。污染物生物 降解能力的提高不能仅考虑嗜温菌，受污染土壤的恢复可通过低温微生物的原位 清洁作用( i ns i t u c l e a n i n g ) 来实现。这一过程通常发生在1 5 v 以下，温度不会 受外部因素而改变。如果采用适当的菌种、起始温度和保持条件，不但大规模的 牲畜粪便的厌氧耐冷分批消化( d i g e s t i o n ) 是可行的，在低温条件下对鱼类加工 厂中的大量油渣进行消化以及对寒冷地区污染物( 如泄漏于土壤、海洋中的原油， 废弃物等) 的生物降解作用也是可行的州。近年来各国的科研人员对低温微生 物在环保领域中的应用作了大量的工作，为环境污染的防治开拓了新的领域，并 大大丰富了生物修复的理论。 k o l e n c 等( 1 9 8 8 ) 在耐玲型pp u t i d a 中进行了嗜温型质粒( t o l 质粒p w w o ) i 海交通大学硬士学位论文 介导的降解能力的转移和表达。该转移接合体在o 的低温条件下能够降解甲苯 甲酸盐并以之作为唯一碳源 】。将嗜温菌在代谢方面的有用性能经质粒介导转 移至低温菌中，这一方法的建立能够增进利用低温微生物从不同的相对寒冷环境 中去除污染物质的可能性。 2 降解表面活性剂 合成的阴离子表面活性剂如s d s 广泛的应用于工农业生产中，比如洗涤剂和 农用化学喷雾，因而在环境中存在着大量的表面活性剂，以致造成日益严重的环 境污染。同时，表面活性刺对人体以及水生生物危害的短期效应和长期效应都不 容忽视。因此，表面活性剂已是污水处理的一大课题。大多数表面活性剂降解实 验的实验温度都比自然条件下的温度要高，因此筛选到的都是一些嗜温微生物【i “ ”- 吲。但是在诸如北极、高山这样的低温环境中，表面活性剂的污染是很常见的， 因此低温微生物的研究势在必行。m a r g e s i n 等( 1 9 9 8 ) 利用耐冷型降解柴油微生 物在1 0 下对s d s 进行降解。2 9 种培养物中有1 6 种在9 6 小时内能够完全降解 5 0 0 1 0 0 0m g l 的s d s ，而其中只有三种不能降解2 0 0 0m g l 的s d s 。实验选定 了其中的六种培养物测定了s d s 浓度( 1 0 0 0 和2 0 0 0m g l ) 和培养时间对降解 效果的影响，结果7 2 小时后s d s 含量极低，无法检出。温度实验的结果表明培 养物r m 8 i t 在5 3 0 范围内可完全降解2 0 0 0m g l 的s d s 。作者还研究了s d s 含量对脱氢酶活性的影响，当高s d s 含量时，脱氢酶活性受到抑制，因此可利 用脱氢酶活性测试来监测环境中的阴离子表面活性剂的污染情况【】们。 3 降解原油 环境中最广泛存在的污染可以归之为石油污染。随着石油运输的不断发展， 造成原油泄漏，石油污染不断增加。所以，大量的生物降解研究都集中在石油污 染上。 m a 唱e s i n 等( 1 9 9 7 ) 研究了温度( 扣3 0 ) 对液体培养基中和土壤中柴油降解 效果的影响。柴油的非生物损失随培养时间和温度的增加而增加，在液体培养基 中的损失则比土壤中要少。在液体培养基中( 5 0 0 0m g l 柴油) ，耐冷型酵母 砌舢w m 幻o t i c a 在1 0 2 0 范围内表现出最大的降解活性；若接种到高山土壤 中( 5 0 0 0m g 柴油k g 土壤干重) ，仅在15 以下才有降解活性，而且比液体培 养基中要低得多。土壤中固有的微生物( 土著微生物) 在实验温度( 扯3 0 ) 下 上海交通大学硕士学垃论文 都能降解柴油。在土壤中，接种物( 外来微生物) 对柴油的利用率随培养时间和 温度的增加而降低，而土著微生物对柴油的利用率和柴油的非生物损失则增加 【2 0 】。 m a r g e s i n 等( 1 9 9 7 ) 研究了五种高山亚壤土样品中柴油( 5g k g 土壤干重) 的 生物降解性能。实验在1 0 下进行了2 0 天，比较了下述三种情况下的生物降解 活性：仅利用土著微生物；利用筛选到的柴油降解兼性嗜冷菌接种物( 外来微 生物) ：以及无机营养物( c ：n ：p = 1 0 0 ：1 0 ：2 ) 的生物刺激作用。添加嗜冷菌接种物 和添加无机营养物都可大大增强土著微生物的降解活性，只是后者的生物刺激作 用比前者的生物放大作用行之有效得多，而两者的同时加入，其去污效果并不如 营养物的单独加入那么有效。研究还发现，有16 - 2 3 的柴油消耗于非生物过 程。没添加营养物时总去污率约为1 6 3l ，而添加营养物后总去污率则可达 2 7 5 3 i2 | 1 。 m a r g e s i n 等( 1 9 9 8 ) 研究了1 0 下车库洗车废水中的生物去污。该车库废水 中含有阴离子表面活性剂( 5 7m g l ) 和燃料油( 1 8 4r a g l ) 。加入无机营养物后 土著微生物可有效地降解这两种污染物。反应7 天后，污染物剩余量为1 1m g l 阴离子表面活性剂和2 6m l 燃料油。反应3 5 天后，表面活性剂含量降低到3 m g l 。耐冷接种物的生物放大作用可利于降解碳氢化合物( 柴油) 和阴离子表 面活性剂( s d s ) 。在反应的前3 天柴油的降解加快而s d s 的降解在最初2 i 天 内受到抑制f 2 2 】。 使人迷惑不解的是，一些科研者研究了外加表面活性剂对疏水性化合物降解 的影响作用后所得结果是矛盾不一的，有人认为存在抑制作用，有人认为没有影 响，还有的人认为有促进作用。m a r g e s i n 等( 1 9 9 9 ) 检测了不同s d s 浓度( 0 ，5 0 ， 1 0 0 ，5 0 0 ，1 0 0 0m g k g 土壤) 对高山土壤中柴油的生物降解性能的影响。实验在 1 0 下进行了3 2 天。在液体培养基中低浓度s d s ( 5 0 1 0 0p p m ) 可极大增强耐 冷培养物对油的降解作用，而高浓度s d s ( 5 0 0 1 0 0 0p p m ) 则抑制油的降解； 呼吸速率测定表明，各种实验浓度的s d s 不会对土壤中微生物的活性产生负面 影响。然而s d s 的存在则严重抑制了土壤中油的可生物降解性能，且s d s 浓度 越高，抑制越厉害。实验3 2 天后，空白对照中剩余油量为原有油量的4 3 ，而 在含有5 0 、1 0 0 、5 0 0 和1 0 0 0m g s d s & g 土壤的土样中，残余油量分别为原有油 9 上海交通大学硬士学垃论文 量的5 5 、5 7 、6 7 和7 7 。而表面活性剂本身在两种环境下部可迅速的被降 解1 2 ”。r e d d y 等( 1 9 8 2 ) 认为，表面活性剂可减弱烃类和表面活性剂溶液之间的 内部张力并加大流动性和表面积以增加微生物细胞与烃类接触的机会，因此可 促进有机物的生物降解。而d e s c h e n e s 等f 1 9 9 6 ) 试着解释了表面活性剂的抑制 作用。他们认为在表面活性剂与污染物之间存在着底物竞争作用。优先利用表面 活陛剂就导致了烃类污染物的降解被抑制。另一个可能的解释就是表面活性剂微 团中疏水物质的分隔( 假设在微团中微生物不直接与化合物接触) 1 2 5 1 。 如何监测生物修复过程中污染物的降解过程，一直是生物修复技术的难点之 一。近年来国外有人作了尝试。例如，w h y t e 等( 19 9 8 ) 并1 j 用生化和分子技术研究 了链烷烃的代谢途径，在0 和5 下，红球菌属r h o d o c o c c u sq 1 5 对短链烷烃 ( 十二烷和十六烷) 的矿化作用强于长链烷烃( 二十八烷和三十二烷) 。q 1 5 可 在5 下利用柴油燃料中大部分的脂肪族化台物( c l o - c 2 1 链烷烃、支链烷烃和 取代基环己烷) 。接种了0 1 5 的烃类污染土壤及原始无污染土壤中，十六烷的矿 化作用要比未接种的土壤强得多。利用色谱，质谱联用法检测十二烷和十六烷的 代谢中间产物以及中间产物的利用表明q 1 5 氧化链烷烃可通过末端氧化途径和 亚末端氧化途径。p c r 和核酸序列分析发现0 1 5 含有一个与r h o d o c o c c u s e r y t h r o p o l i st h c a 基因高度同源的脂肪族醛脱氢酶基因。q 1 5 含有两个分别为9 0 k b 和1 1 5k b 的大质粒。它们对链烷烃的矿化不是必需的，尽管在5 和2 5 下 9 0k b 质粒可增强些链烷烃的矿化作用并利于在柴油存在下生长【2 6 】。 总的来说，许多石油化合物的生物降解已经见诸于各种不同的陆地及海洋冷 环境中，包括北极、高山及南极的土壤，阿拉斯加的地面水以及南极海水2 7 0 引， 还有温带( 平均气温不超过1 0 c ) 亚壤土和地面水。相比较而言，人们对于低 温下芳环及聚环芳环化合物的生物降解了解甚少。w h y t e 等( 19 9 6 ) 指出，耐冷型 假单胞菌在低温下( 5 i o 。c ) 可降解甲苯和萘。w i l l i a m s 和m a y ( 1 9 9 7 ) 卿j 在4 下观察到了受污染河流沉积物中含有三个氯取代基的多氯联苯的好氧降解 3 0 l 。m o h n 等( 1 9 9 7 ) 也在7 c 下观察到了北极土壤中好氧微生物对多氯联苯的降 解作用【j l i 。 1 2 微生物菌种保藏的基本原理和方法 1 2 1 微生物菌种保藏的基本原理 掌 上海交诬太学硬士学位论文 微生物菌种的保存已有一百多年的历史。从1 9 世纪著名微生物学家柯赫 ( k o c h ) 创立细菌纯培养技术开始，微生物菌种( 纯种) 的长期保存问题就引 起微生物学家的高度重视。至今，微生物菌种的保存方法从无到有，由简单到复 杂，不断更新，不断完善，现已有二十几种保存方法。尽管微生物菌种的保存方 法很多，但原理却大同小异：根据研究和生产的目的，选择优良的菌种：创造干 燥、低温、缺氧、避光和贫乏营养的条件，使菌种处于不能进行旺盛的新陈代谢 的休眠状态：添加适宜的保护剂，控制菌种保存质量。在实际工作中，研究人员 可选择适用范围广、保存期长、稳定性好、节省人力物力的方法。 微生物菌种保存方法虽然很多，但从总体上分不外乎四大类：传代法、干燥 法、玲冻法及拎冻干燥法，其中冷冻保存法和冷冻干燥保存法是目前公认的长期 保存微生物菌种的最安全、可靠的方法。 由于微生物种类繁多，不同类别的微生物之间千差万别，其各自生长、存活 所需的外界条件也各式各样，在实际工作中选择菌种的保存方法要针对不同类别 微生物的各自特点，并从保存菌种的目的出发。一般来说，选择菌种保存方法应 注意以下几点： ( 1 ) 保证菌种具有较高的存活能力。 ( 2 ) 避免筛选导致的菌中细胞群体组成变化。 ( 3 ) 保持菌种的纯度。 ( 4 ) 避免菌种遗传性质的改变。 ( 5 ) 控制菌株的数量。 ( 6 ) 注意菌株的价值。 ( 7 ) 节省费用。 ( 8 ) 方便菌种的供应和运输。 ( 9 ) 预见菌株的使用频率。 1 2 2冷冻干燥保存法的介绍 由于使用的菌种在4 下仍能较好的生长，所以一般保藏方法不适用，作者 选择了冷冻干燥保存法。冷冻干燥( 简称冻干) 是制各和保存生物材料的极佳方 法，它融冷冻和干燥技术特点为一体，使众多的生化产品、菌苗、疫苗、微生物 菌种能用此法直接冻干后长期保存是一种保存细菌、病毒、酵母、产孢子真菌 i 海交避大学硕士学 莹论文 及其他微生物的有效方法。原理很简单，首先使微生物冷冻，然后在减压下利用 升华现象除去水分，使微生物处于干燥、缺氧状态，其生理活动停止。安瓿贮于 低温条件下，能长期保存，尤其是有利于微生物菌种的取存、运输、销售、交换。 冷冻干燥至少有五个重要的技术优点：能保证冻干材料基本特性的稳定： 能使冻干微生物菌种的新陈代谢基本停止，使其处于体眠状态：能获得易于 复水的粉状固形物：能有效除去冻于材料中的多余溶剂；能浓缩体积过大的 生物材料，使其体积减少，便于贮存。显而易见，非细胞形状的生化产品或化学 制剂的冷冻干燥，足以使冻干材料获得预期的效果。但是，对于活细胞材料，如 微生物菌种、菌苗的冷冻干燥而言，除充分利用冷冻干燥的技术优点外，不能不 考虑细胞本身的基本特性，因为微生物菌种的冻干效果是以冻干后细胞的存活性 及特性的稳定程度作为评估指标的。如果冷冻干燥过程造成细胞的损伤致使冻干 后的细胞活性极低，甚至基本特性丢失的话，无任何贮存价值，失去了冻干的意 义。所阱微生物的冷冻干燥保存建立在牢固的细胞学基础之上，微生物细胞的 结构特点、生存环境及其生理状态是冷冻干燥获得成功的保证。 冷冻干燥法保存菌种需要冷冻干燥机，常用的冻干机有两种类型：离心式和 箱式。采用离心式冻干机冷冻干燥菌种时，以冷冻和真空来减少菌悬液的潜热。 第一次干燥阶段，通过离心增加悬液暴露的表面积并避免溶于菌悬液中的气体外 逸时产生泡沫。在第二次干燥阶段，采用歧管进一步以真空除去剩余的水分。安 瓿在真空或充入惰性气体的状态下密封保存。利用箱式冻干机时，菌悬液在真空 干燥前要预冻，样品装在小玻璃瓶中，不需以歧管进行二次干燥。 1 3 油脂废水研究背景及进展 含油废水是一种量大而面广的污染源，世界上每年至少有5 0 0 0 - - 1 0 0 0 0 万吨 油类通过各种途径进入水体口“。而油脂废水是含油废水中的一类，在食品加工、 肉类联合加工、合成洗涤剂厂及餐饮业的生产过程中都不断有这类废水排出。而 且随着人们生活水平的提高，动植物类油脂的消费以惊人的数字增长，由此而产 生的含油脂污水量大幅度增长，已成为城市生活污水的重要组成部分。世界各国 都纷纷制定了相应的法律规定来限制含油废水的排放。 进入城市污水处理厂的油类物质包覆在填料外层，令氧的传质受阻，导致好 氧微生物代谢紊乱1 3 ”。若油类物质进入水体，则漂浮于水体的表面，影响水体 上海交通太学碛士学垃论文 的复氧及其自然净化过程，危害水体生态系统口“。此外，由于此类水中多数含 有表面活性剂物质，油脂呈现出良好的乳化性和亲水性，少量油脂就能导致