（动物学专业论文）池蝶蚌血细胞类型及吞噬活性的研究.pdf

摘要 摘要 本文通过光镜和扫描电镜的观察及密度梯度离心对池蝶蚌血细胞的形态和 表面结构进行了研究。根据血细胞形态、大小、密度及核质比等特征将血细胞 分为6 类：颗粒缅聪、透明缀匏、浆液细胞、类淋巴细胞、梭形细胞和血栓细 胞，并对各种血细胞显微结构予以描述，统计了血细胞胞体大小、细胞核大小、 核质比、密度及所占比例。表面结构观察也显示有6 种形念：椭圆形细胞、圆 形细胞、大型圆形细胞、小型圆形细胞、梭形细胞和纤维纽胞。密度梯度离心 结果为4 层：1 0 2 0 的p e r c o l l 细胞分离液中主要是类淋巴细胞；2 0 3 0 的 p e r c o l l 中主要是透明细胞、梭形细胞和血栓细胞；) 0 - 4 0 的p e r c o l l 中主要是 颗粒细胞：而4 0 ，5 0 的p e r c o l l 中大部分是浆液细胞。 通过对池蝶蚌血细胞形忿动念变化的连续观察，发现血细胞存在彤念变化 现象，推测细胞问可能存在相互转化的情况。血细胞刚取出时全为圆球形，而 在体外l - 2 m i n ，绝大部分细胞伸出伪足和棘突，并逐渐加长增多，只有少数细 胞一直保持球形。约3 0 r a i n 后，部分血细胞伪足又会变少，甚至部分血缀歉伪 足完全消失，重新变的圆滑。梭形细胞和透明细胞之间能够转化。约1 1 5 h 后， 细胞拉长，膜破裂，细胞死亡。死亡后的细胞大都聚集成团，颗粒分布在细胞 周围。 通过池蝶蚌对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌和嗜水气单胞菌吞噬 过程发现：第一，池蝶蚌血细胞的吞噬过程由两种途径完成，一种是血细胞伸 出丝状或片状伪足。另一种是m 细胞形态发生变形，形成凹陷。第二年龄对 血细胞对不同细菌的识隽q 、吞噬能力的影嚷奄所不同，其中只对嗜水气革潍菡 的吞噬率和吸附率有较大影响( p o ，0 5 ) ， 但是对吞噬指数和吸附指数影响都很大( p o 0 5 ) 。总体而言，池蝶蚌j 衄细胞 在对这4 种细菌的吞噬过程中，从l 龄一4 龄，吞噬活性随年龄的增长逐年增长， 4 6 龄之间吞噬活性则有逐年递减的趋势。l 龄蚌血细胞的吞噬活性最低，4 龄 蚌血细胞的吞噬活性最高。 利用联苯胺过氧化氢法，光镜下可观察到池蝶蚌血细胞内蓝色或棕褐色沉 淀两定位过氧化物酶( p o d ) ，结粟表明：豫粪淋巴细胞外，其余血缅胞均具 南r 人学硬i 1 4 f 筝生学位咤义 有p o d 活性，i 型颗粒细胞和浆液细胞p o d 活性高于i i 型颗粒细胞、透明细 胞和梭形细胞。 关键词；池蝶蚌；血细胞；形念结构；形念变化；细菌；吞噬活性 a b s t r a c t a b s t r a c t t h eh a e m o c y t e so ft h eh y r i o p s i ss c h l e g e l iw h i c hw e r es t a i n e dp u r p l eb y g i e m s aw e r eo b s e r v e db yl i g h tm i c r o s c o p e a tt h es a m et i m et h em o r p h o l o g yo f l i v i n gh a e m o c y t e sw i l l s a l s oo b s e r v e d t h eh a e m o c y t e sw e r ec l a s s i f i e da s6t y p e s b a s e do nt h ec h a r a c t e r i s t i c s ，a m o u n to fg r a n u l ea n di t sr e l a t i v es i z e ，t h en u c l e o l u s p l a s m ( n p ) r a t i o n e ya r eg r a n u l o c y t e ，h y a l i n o c y t e ，s e r o u sc e l l ，l y m p h o i dc e l l ， s p i n d l y c e l la n dt h r o m b o c y t e s c a ne l e c t r o nm i c r o s c o p ew a su s e dt 。o b s e r v e u l t r a s t r u c t u r eo ft h eh a e m o c y t e sa n ds i xk i n d so fh a e m o c y t e sw e r er e c o g n i z e d ： c i r c u l a rc e l l ，o v o i dc e l l ，l a r g er o u n dc e l l ，s m a l lr o u n dc e l l ，s p i o d l yc e l la n df i b r ec e l l f o u rl a y e r sw e r es e p a r a t e db yd e n s i t yg r a d i e n t ，l y m p h o i dc e l l ss t a yi nt h el a y e ro f 10 - 2 0 p e r c o l le x t r a c t ，h y a l i n o c y l e ，s p i n d l yc e l la n dt h r o m b o c y t ei n2 0 3 0 p e r c o l l e x t r a c t ，g r a n u l o c y t ei n3 0 4 0 p e r c o l le x t r a c ta n ds e r o u sc e l l i n4 0 5 0 p e r c o l l e x t r a c t ， t h ed y n a m i cv a r i a t i o no ft h eh a e m o c y t e sw a so b s e r v e di nv i v ou n d e rt h e l e i c ad m 5 0 0 0b m i c r o s c o p e ，n a m e l y , t h em o r p h o l o g yo fh a e m o c y t e sd i p p e do n t h es l i d e su n d e r w e n tm a n i f e s tc h a n g e sf o ras h o r tt i m e t h es h a p e so fh e m o c y t e sj u s t t a k e no u tf r o mt h es h e l lw e r ea l lr o u n d s h a p ea n dm o s to ft h e mf o r m e dp e s u c l o p o d s a f t e rl ，2m i n u t e s a b o u t3 0m i n u t e sl a t e r , t h ep e s u c l o p o d sw i t h d r a wa n dh a e m o c ：y t e s b e c a m er o u n da g a i n a ni m p o r t a n tr e s u l tt h r o u g hc o n t i n u eo b s e r v a t i o ns h o w st h a t t h eh y a l i n o c y t ea n dt h es p i n d l yc e l lc a nt r a n s f o r me a c ho t h e r , 1 1 1 es p i n d l yc e l l t r a n s f o r mt oh y a l i n o c y t ew a sc o m p l e t e da b o u t1h o u r t h ed e g r a n u l a t i o nf r o mo n e s i d eo fc e l lb o d yw a sav o l u n t a r ya n dh a r m l e s sp r o c e s s t h eg r a n u l e sw o u l db e d i s s o c i a t i v ea n da c t i o n l e s sa f t e r b e i n gr e l e a s e d o a to fh a e m o c y t e s a l lt h e h a e m o c y t e sb e g a nt od i ea n d d i s i n t e g r a t ew i t h i nl ht o1 5 h p h a g o c y t o s i sp r o p e r t yw a se v a l u a t e db yt h ea n a l y s i so ft h ep h a g o c y t o s i so f h a e m o c y t e sa g a i n s te s c h e r i c h i ac o l t ，& a p h y l o c o c c u sa u r e u s ，b a c i l l u s s u b t i l i sa n d a e r o m o n a sh y d r o p h i l at h er e s u l t ss h o w e dt h a tp h a g o c y t o s i sc a r lb ed i v i d e di n t ot w o m o d e s ，o n em o d ei st h a th a e m o c y t ee x t e n d sp s e u d o p o d i ao ff i l a m e n to rs h e e ls h a p e ， 南禺大学颁i 捌f 究生学位论义 a n dt h eo t h e ri st h a th a e m o c y t em o r p h o l o g yc h a n g e sa n df o r m sd e n t i n g h a e m o c y t e s f r o mhs c h l e g e l io fd i f f e r e n ta g e sh a v ed i f f e r e n tr e c o g n i t i o no fb a c t e r i aa n d p h a g o c y t i ca c t i v i t y t h e r ei sag r e a te f f e c to nt h ep h a g o c y t o s i sr a t et oa h y d r o p h i l a f p o 0 5 ) b u tn o tt h eo t h e rt h r e eb a c t e r i a s t h ea d s o r p t i v er a t ei sn o ta f f e c t e do nt h e f o u rk i n d so fb 如t e r i a s b u tt h e r ei sag r e a ti m p a c to np h a g o c y t i ci n d e xa n da d s o r p t i v e i n d e x i ng e n e r a l t h ep h a g o c y t i ca c t i v i t yo fh a e m o c y t et ot h ef o u rb a c t e r i a sv a r i e d f r o md i f f e r e n ta g e s p h a g o c y t o s i sa c t i v i t yo fhs c h l e g e l io fl y e a ro l di st h el o w e s t a n di st h eh i g h e s ti nt h e4 - y e a ro l ds h e l l t h ep h a g o c y t o s i sa c t i v i t yi n c r e a s e dw i t ht h e g r o w i n gf r o ma g e1t o4b u td e c l i n e df r o ma g e4t o6 t h el o c a t i o no fp e r o x i d a s e ( p o d ) w a so b s e r v e du n d e rl i g h tm i c r o s c o p e a c c o r d i n gt ob l u eo rb r o w ni nt h eh a e m o c y t e st h r o u g hb e n z i d i n ea n dh y d r o g e n p e r o x i d em e t h o d 1 1 1 er e s u l t ss h o w e dt h a ta l lk i n d so fh a e m o c y t e se x c e p fl y m p h o i d c e l lh a v ep o da c t i v i t y it y p eo fg r a n u l o c y t ea n ds e r o u sc e l lh a v eh i 曲e rp o d a c t i v i t yt h a n 1 1t y p eo f g r a n u l o c y t e h y a l i n o c y t ea n ds p i n d l y c e l l k e yw o r d s ：h y r i o p s i ss c h l e g e l i ；h a e m o c y t e ；m o r p h o l o g y ；d y n a m i cv a r i a t i o n ； b a c t e r i a ；p h a g o c y t o s i s v 学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 为获得直昌太堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与 我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示谢意。 学位论文作者签名( 手写) ：孑仞巯 签字日期：弘叼缉月日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解直昌太堂有关保留、使用学位沦文 的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁 盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权直昌盔堂可以将学位论文的全 部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存、汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研究 所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向 社会公众提供信息服务。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：芳p 磊 签- - 7 - e t 期：三日口扩年月阳 导师签名：澎9 卜 签字日期：弘一晷年，月分日 第1 市引言 第1 章引言 贝类是具有重要经济意义的养殖种类。f u 频发的病害严重阻碍了贝类养殖业的 发展。近年来从生态，病理，育种，免疫等各方面对贝类病害进行了很多研究。其 中从贝类免疫学角度进行的研究，前人涉足较少，f u 是对于贝类病害防治意义显著， 近印来发展迅速，正在成为水产动物痫害研究的热点。 贝类免疫学研究可追溯到1 9 世纪中期h a e c k e l 的工作，s t a u b e r 及其学牛f e n g 和t r i p p 等从1 9 5 0 年开始的工作首次将注意力集中于免疫细胞在免疫防御中的作 用，即开始跟e 塞观察颗粒和可溶性的外源物质在美洲牡蛎( c r a s s o s i t r e av i r g i n i c a ) 体内的变化，从而真正开创了贝类细胞免疫学研究领域i 。此后的2 0 印间，贝类免 疫学研究丰要是对贝类免疫细胞的形态、结构及其免疫功能的研究。这些工作形成 了贝类细胞免疫的摹本框架。8 0 币代以后，除继续对贝类免疫细胞的结构和功能 进行研究之外，血淋巴中若干参与免疫防御的可溶性蛋白因了被识别和分离，若干 类似高等动物中的细胞因子样物质被发现。这些工作填补了贝类体液免疫研究的空 白，开创了贝类免疫学研究的新局面。国内有关贝类免疫学的研究工作较少陈竞 春等【2 】、，余燕萍等【3 】和刘世良等f 4 3 作了有关贝类血细胞和免疫牛物学的综述。 贝类的宿手防御包括细胞和体液系统1 ”。血细胞可以大体分为颗粒细胞和透明 细胞两种类型，能在体幽或体外吞噬各种有机和无视颡粒，清除病原体颡粒和自体 损伤或死亡的细胞，并参与损伤修复等功能，是贝类丰要的防御机制。血细胞能产 生各种体液因了，包括凝集素( a g g u l u t i n ) 、条理索( o p s i n ) 、外源凝集素( l e c t i n ) 、 抗菌肽( a n t i m i c r o b i a lp e p t i d e s ) 、非特异性的水解酶系及许多行使调控作用的蛋白 因了，而且这些体液因了在防御中起到了重要的作用。 在贝类免疫反应中涉及到哪些细胞，这些细胞的形态结构和相应的功能是什 么? 是贝类免疫学研究首先要回答的一个问题。 1 1 血细胞的形态与分类 不同贝类的血细胞形态差异很大，同时由于不同学者采用的方法和标准不同 南昌人学坝i j 研究生毕业论文 往往从不同的角度进行分类和描述。有些学者依据活体的形态特征来分类，有些依 据染色特性和细胞质特征来分类，也有些依据亚显微结构分类，还有一些学者借助 密度梯度离心中血细胞的密度和流式细胞仪等，根据细胞的一些表面特征和体积对 血细胞进行分类。因此迄今为止，对于贝类参与细胞免疫的血细胞至今还没有形成 一个公认的分类标准。 1 1 1 根据血细胞的活体形态与行为特征分类 沈亦平等冲j 活体观察了褶纹冠蚌( c r i s t a r i a pl i c a t al e a c h ) 血细胞的形态，并根 据其贴壁行为，将血细胞分为二类：透明细胞，占4 0 芹右，贴壁迅速，胞质突起 较丰富；a 型颗粒细胞，占3 0 芹右，贴壁行为类似于透明细胞，胞质中有大小 不的液泡科j 点状的折光性颗粒，胞质突起丰富；b 型颗粒细胞，占2 0 寿右， 充分贴壁伸展，无胞质突起和棘突，液泡和小颗粒较多：浆液细胞，数目较少，贴 壁能力差，几乎不伸展，细胞质中含有大量球状颗粒。作者认为，大小颗粒细胞是 同类细胞不同的发育阶段。同时认为许多研究报告中对浆液细胞的报道较少，可 能是因为其贴壁能力差，很容易被洗掉的缘故。 石安静【”等通过活体观察将椭圆背角无齿蚌( a n o d o n t aw o o d i a n ae l l i p t i c a h e u d e ) 血细胞分为4 类：颗粒细胞、无颗粒细胞、透明细胞和类淋巴细胞。细胞 在体外交形的速度和存活时间与所处温度有一定关系，温度较低时。细胞形态变化 较慢，存活时间也较长。其分类标准与沈亦平等相似，f u 是观察到的各类细胞的比 例却有很大不同。作者同时认为，因为贝类没有获得性免疫，不能产牛抗体，所以 一些文章中对浆液细胞的称渭欠妥。 1 1 2 根据染色特征不同在光镜下对血细胞分类 这种方法被广泛应用于贝类血细胞的研究中，辛要参照血细胞常用染色方法， 至今采用的染色方法丰要有：g i m s a ，w r i g h t ，m a yg r u n dg i m s a 及h e 等。虽然 采用的染色方法不同，但是多数研究者通常将贝类血细胞分为有粒血细胞和透明血 细胞( 无粒血细胞) 两大类，并根据细胞质内颗粒的嗜酸和嗜碱特性进一步分类 从而将双壳贝类的血细胞分为：嗜酸性颗粒细胞、嗜碱性颗粒细胞和嗜碱性无颗粒 细胞3 类。w o o t o n 等【8 】发现食用鸟蛤( c e r a s t o d e r m a ， 4 u l e ) 血细胞除上述3 种类 第1 市引高 型外，还有一种特有的i i i 型嗜酸性细胞，该类血细瞧球形。直径1 0 1 2 9 i n ，有一个 大液泡占据细胞质丰要部分，细胞质少，位于边缘。细胞质中只含有少量的颗粒。 孙虎山、李光友【9 】根据血细胞h e 染色及其超微结构观察，将栉孔扇贝( c h l a m y f a r r e r i ) 的血细胞分为6 类：拟淋巴细胞、血栓细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、 嗜酸性较缅匏和巨噬绍施6 类。除了盘栓细胞矫，筻他5 类细胞己被不同研究看分 别用于不同贝类血细胞的分类命名。而邢婿等利用吉姆萨染色观察，将栉孔扇贝 血细胞分为透明细胞和颗粒细胞，透明细胞的细胞质中颗粒很少，细胞核圆形，居 中，细胞质较少，核质比大：颗粒细胞比透明细胞大且多，染色深，f u 核质比小， 在细胞质中有颗粒，有些颗粒细胞具有双核。 杨军等】采用w r i g h t 氏染色、g i m s a 伊红染色 u j e n n e r 氏伊红美兰染色等方 法研究了3 种淡水珍珠蚌一圆背角无齿蚌( a n o d o n t aw o o d i a n a p a c _ ；， c dh e u d e ) ，二 免帆蚌( h y r i o p s i sc u m i n g i il e a ) 承i 禚纹冠蚌酾盔缅毵。将3 种辨钓盘细胞分为4 种： 无颗粒细胞、颗粒细胞。透明细胞平u 类淋巴细胞，无颗粒细胞的细胞核里紫红色或 红色，形状多为椭圆形，也有呈柱状或不规则状，胞质较多，染成蓝色，无颗粒， 胞体伸展形状多样，胞质突起大而长，伸展较远常相瓦连接或是与其他类型细 胞相连接构成网状；颗粒细胞胞体多为圆形，细胞核呈圆形或椭圆形，多偏位于胞 体的一侧，染成红色或紫红色，胞质内充满球状颗粒，颗粒致密，着色较深；透明 细胞核多为圆形，呈红色或紫红色，胞体宽大，形状较圆，有的为扇形，胞质的内 容物稀少，着色很浅，里透甥状，无伪足：类淋巴细缒相对于其他3 类缡匏的体积 较小，核深染呈蓝紫色，多为圆形，占据细胞体积的大部分，只在核的边缘能见到 少量的蓝色胞质。x i n g 等【”1 通过细胞化学染包方法将栉孔扇贝的血细胞分为颗粒 细胞和透明细胞。 1 1 3 根据亚显微结构对血细胞分类 现在多数的研究者除在光镜下对血细胞开展研究外，还结台了电镜下细胞的结 构特征进行分类，使血细胞的分类特征更加明确。在亚显微水平上，丰要根据细胞 核、细胞器的形态结构特征以及胞质中有无特殊颗粒等特征，将血细胞分为两大类： 颗粒细胞和透明细胞。m i x ”】的研究认为透明细胞是血细胞中最原始的类型，它可 以分化为不同类型的颗粒细胞，在电镜下观察还发现了一类具有极微颗粒的透明细 南昌人学硕i j 研究生毕业论文 胞，经研究后认为颗粒的分化与高尔摹体的作用有关推测它是j 五明细胞中颗粒的 产牛者。陈全震等4 迹过透射电饶观察将锻纹盘鲍( h a l i o t i s d l 。, c u s h a n n a i ) 血细胞 分为大颗粒细胞、小颗粒细胞、特殊颗粒细胞、透明细胞和淋巴样细胞。 w o o t o n 等”纠将浅沟蛤( s c r o b i e u l a r i a p p l a n a ) 血细胞分为3 类：大颗粒血细胞， 含有高电子密度的大颗粒、脂滴，少量的糖原德存物、滑面出履网秘高尔基体；小 颗粒血细胞，含有高电了密度的小颗粒、大量的糖原储存物、线粒体王 ；及高尔筚体； 无颗粒血细胞，胞质内摹本无颖粒，细胞最小，细胞器最少，核质比最大，部分胞 质内含有糖原。张维翥等【i6 j 利用扫描年u 透射电镜，将海湾扇贝( s c a l l o pa r g o p p c t e n i r r a d i a n s ) 血细胞分为5 类：圆形血细胞，表面光滑无伪足：梨形或梭形血细胞 梨形细胞表面光滑无伪足，梭形血细胞有较多的球状突起；松果形血细胞，表面多 褶铍，伸出许多纤细、透明的伪足：阿米巴样细胞，具吞噬功能：大型细胞，常呈 现不规则的多角形态和蜂窝状的表面结构表面多镀硝。附有较多的分泌颗j 量。作 者同时还发现，超微结构观察结果表明，颗粒细胞含有二种类型的颗粒：i 型高电了 密度颗粒，i i 型低电了密度颗粒和i i i 型中等电了密度颗粒。n a k a y a m a 等f l7 姬过光 学显微技术和电予显微技术，认为黄砗磲( t r i d a c n ac r o c e a ) 存在4 种血细胞，而 不是通幕认为筋两类，命名为颗粒缅胞无颗粒缅胞，浆液细胞，桑葚胚样细胞。 并发现4 类细胞在吞噬作用和血细胞凝集等过程中表现不同的功能。h i n e 岬j 认为 在贝类血淋巴中颗粒细胞是一种独立的类群，而无颗粒细胞在表型和超微结构上是 不同的，可分为3 种细胞胚样细胞、嗜碱性巨噬榉细胞、透明细胞。颗粒纽胞和 巨噬样细胞的功能不同，血淋巴的组成在个体间变化很大，而且认为颗粒细胞在早 期和发育过程中可能是透明的，胚样细胞的区别表明造血过程可以发牛在周围相连 的广泛组织中，产牛血细胞的方式与脊椎动物相似。 1 1 4 其他分类方法 f o r d i ”】应用c o u l t e r 计数器和流式细胞计数器，测量的结果，将牡蛎血细胞分 为二种颗粒细胞和一种无颗粒细胞二个亚群。邢婧等f 10 j 根据密度梯度离心结合台盼 兰染色，发现栉孔扇贝血缅胞悬液在p e r e o l l 梯度溶液中分为3 条带，2 0 3 0 的 p e r c o l l 中丰要是透明细胞，3 0 - 4 0 的p e r c o l l 中有4 2 的透明细胞，5 8 的颗粒 细胞，而4 0 ，5 0 的p e r c o l l 中大部分是颗； 细胞。x u e 等 2 0 1 根据密度梯度离心 第1 章引者 ( s d s p a g e ) 将食用牡蛎( o s t r e ae d u l i s ) 血细胞分为颗粒细胞大透明细胞和小 透明细胞。 r u s s e l l p i n t o 等1 2 l j 发现不同血细胞类型对绵羊细胞有不同反应，并用光镜、电 镜及酶细胞化学法研究后，也将血细胞分为二个类型：j 型为大的伸展细胞呈酯 酶秘酸姓磷酸酶阳性，能吞噬绵羊红血球；l i 型细胞球堑，细胞器少，与绵羊红细 胞形成e 花环；型细胞圆形，胞质中充满含颗粒性物质的泡。n o e l 等 2 2 ) 应用单 克隆抗体技术，对赂贝( m y t i l u se d u 凰) 血细胞的亚群从其抗原性特征进行了研究， 通过免疫染色鉴定了4 种单抗。从免疫染色的结果来看，贻贝至少可以区分出3 种 不同类型的血细胞。m a r i a 2 3 】根据单克隆抗体方法将地中海贻贝( m y t i l u s g a l l o p r o v i n c i a l i s ) 血细胞分为透明细胞、大颗粒细胞和小颗粒细胞。 1 1 5 血细胞类型之间的关系 血细胞类型的划分，具有很大的人为性，这是因为人们对血细胞的发牛、血细 胞的多态等方面了解的还很少。比如当细胞呈现一般颗粒细胞的形态，f u 缺乏或稍 有颗粒时认为它是颗粒细胞还是非颗粒细胞就比较闲难。在美洲牡蛎( c r a s s o s t r e a v i r g n i c a ) 和硬壳蛤( m e r c e n a r i am e r c e n a r i a ) 中就存在这种细胞，当时f o l y 和 c h e n g t z 4 l1 9 7 2 年把它认为是纤维细胞：f u 是1 9 7 5 印他们又认为是丧失功能的颗粒 细胞【2 5 】；a u f f r e t 2 6 3 则认为是牡蛎的囊状血细胞。颗粒细胞的颗粒还可能在吞噬过 程中通过降解而丢失刚，因此，就曾经在0 ，e d u 凰中被看作是透明细胞川在 d r a i s s e n ap o l y m i , p h a 中被看作是透明细胞和大的碱性血细胞【z 8 】，在膨m e r c e n a r i a 中又被看作是透明细胞和某些纤维细胞口“，在c e r a s t o s e r m ae d t i l e 中为i i i 型血细胞 1 2 9 1 ，在s c a p h a r c ai n a e q u i v a l v i s 中为i i 型血细胞0 0 】等。这类细胞中的某些细胞有卵 圆形的囊泡，可能是滑面内质网或胞内囊泡，佃都缺乏网状：”。l ：因此，a u f f r e t 2 q 丰张：牡蛎具有囊泡的血细胞可能是颗粒细胞发育系中的初级阶段。d p o l y m o r p h a 中的透明细胞和较大的碱性血细胞也可能是未成熟的颗粒细胞，只不过缺乏滑面内 质网或细胞内空泡l 2 8 1 。f u 也有人不这样认为，因为出扇贝之外，几乎所有双壳类部 有颗粒细胞，囊泡血细胞仅在牡蛎1 2 6 、鸟蛤1 2 ”、拱形蛤和斑马贻贝( z e b r a m u s s e l s ) 。 还有一类血细胞，内含少量颗粒，仙又不具有颗粒细胞的一般特征，在分类归 南昌人学颂l ：研究生毕业论文 属上也显得十分困难。贻贝碱性颗粒细胞有一个卵圆形或不规则的细胞核，曾被认 定为巨噬细胞1 3 l 】，或较大的碱性白细胞 3 2 j ，或小型颗粒白细胞酬。 总之，贝类血细胞类型之间的关系，目前还是比较模糊，这给分类带来了一定 困难。 1 2 贝类血细胞的非特异性免疫功能 现在的研究一般认为，低等动物没有像高等脊椎动物一样发达的免疫系统，因 此它们抵御外界主要依赖于固有的天然免疫系统。贝类的免疫机制是以血细胞为基 础的，主要通过吞噬作用、包囊作用来清除体内的异物及外来病原微牛物。同时血 细胞还释放一些体液因子参与免疫防御。 1 2 1 吞噬作用和杀伤机制 吞噬作用的功能事要是清除侵入机体的外源异物。如牛物大分了、无机物颗粒、 细菌、真菌以及自身的坏死细胞及细胞碎片等，同时也是提供营养的一种下段p ”， 而且其血细胞吞噬外来异物时，清除率大小取决于细胞表面的特征口”。在大多数报 道的贝类中吞噬作用辛要由粒细胞完成，透明细胞也具有一定的吞噬能力，f u 不是 丰要的【3 6 - 3 ”。w o o t o n 等1 8 】在研究3 种双壳贝类的免疫学特征时发现，只在e n s i s m l i q u a ( 一种竹蛏) 中观察到血清的调理作用。并且发现不同贝吞噬能力存在差异， 同一贝对不同细菌的吞噬能力也不同。浅沟蛤血细胞无法吞噬酵母聚糖，w o o t o n i 认为可能是因为颗粒太大的缘故。 吞噬作用的过程大致可以分为趋化、识别、黏附、内吞四个阶段，最后达到杀 死消化的目的。h o w l a n d l 3 8 】i i eh , q 牡蛎的血细胞对多种细菌具有趋化性。k a n a l e y l 3 9 i 由实验得出血细胞表面受体成分类似于n 乙酸氨摹葡萄糖或2 一甲幕毗喃甘露糖，成 为贝类血细胞表面受体在免疫识别中起作用的直接证据。s u z u k i l 4 0 】还发现血清中的 凝集素也能参与对非自身物质的识别，它与无颗粒细胞、颗粒细胞质膜表面的凝集 素的糖链成分有显著差异。通过对外来物质的识别，血细胞的伪足伸展包绕外物， 伪足相接触后，形成吞噬小体将外源颗粒吞入细胞，接着形成吞噬小泡与溶酶体融 合。c a j a r a v i l l e 等旧对贻贝亚显微结构的电镜研究表明，粒细胞和透明细胞都可 6 第1 章引言 以由局部细胞质膜内陷形成衣被小泡或无衣被的电了透h 月的内吞小体完成内吞。 粒细胞完成对异物的吞噬后，通过两条途径对其进行处理。一是吞噬体与溶酶 体融合，其内容物被溶酶体中的水解酶类消化降解1 4 “。溶菌酶( l y s o z y m e ) 是非 特异性免疫系统的重要成员，在无脊椎动物免疫中起重要作用。c h e n g 等1 4 5 l 的试验 表鹳，膨m e r c e n a r i a 在受到细菌刺激时，会使活跃吞噬的血缅胞将溶菌酶释放到 血清中，与在腹足类b i o m p h a l a r i ag l a b r a t a 中得到的结果类似【4 6 ) 。他们认为，溶菌 酶作为一种体液防御因了释放到血清中，代表着机体对抗入侵牛物的一种体液防御 机制。 另一条途径是通过伴随吞噬作用的呼吸暴发( r e s p i r a t o r yb u r s t ) 产牛多种活性 氧自由基来激活位于质膜上的n a d p h 氧化酶( n a d p h o x i d a s e ) 。产牛多种活性氧 中间体( r e a c t i v eo x y g e ni n t e r m e d i a t e s ，r o l s ) 直接杀伤吞入的微小有机体( 图1 1 ) 。 此过程中产生的r o l s 包括超氧化物自由笨( s u p e r o x i d e s ) 、过氧化氢( h y d r o g e n p e r o x i d e ) 、羟基自由摹( h y d r o x y lr a d i c a l s ) 和单线态氧( s i n g l e to x y g e n ) 等1 4 “”。 n o e l 等【2 2 】对紫贻贝( m y t i t we d u l i s ) 血细胞吞噬作用的化学发光剂行了分析，测定 了静息状态下的基础化学发光，收集不同p e r c o l l 密度梯度离，c 得到的血细胞，用酵 母聚糖a ( z y m o s a na ) 刺激吞噬活性后纪录化学发光情况，发现最大化学发光出现 在4 0 5 0 密度组分，然后利用抗紫贻贝嗜碱性粒细胞的单克隆抗体对各密度组分 的细胞进行分型鉴定，最终确定最大化学发光活性是由嗜酸性粒细胞造成的由此 认为伴随着吞噬作用的活性自由基丰要由嗜酸性粒细胞产牛。 u 在某些贝类中没有 发现活性氧自由基，比如文蛤( r u d i t a p e sd e c u s s a t e s ) 的血细胞无论是否经过酵母 聚糖的调理，在吞噬过程中并不产牛活性氧中间体，而对照组长牡蛎的血细胞能产 生活性氧中间体】。 南昌火学硕i j 研究生毕业论文 l病簌感染 i f n a d ( p ) h 氰化酶的激活 氰耗增加 10l 网 l 酶体酶l 1 j 共同起到对痫原菌的杀火作用 图1 1 活性氧的产生及其作用( 摘自刘志鸿，海洋双壳姒类的免疫特性砹凋节) 。 1 2 2 吞噬作用 吞噬作用是一种很强的非特异性过程，牛物大分了、无机物颗粒、细菌、真菌， 以及自身的坏死细胞及细胞碎片等都可以被血细胞吞噬。f u 并不是所有的血细胞都 有吞噬活性。孙虎山等 4 9 】研究发现栉孔扇贝血细胞对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均 有根强鼹吞噬能力，注射细菌l s hj 吾，否噬牢分别达2 5 私2 7 。小颡较( 嗜中性 颗粒) 细胞吞噬能力最强。中颗粒( 嗜碱性颗粒) 细胞吞噬能力较弱。大颗粒( 嗜 酸性颗粒) 细胞无吞噬能力。无颗粒细胞中只有少量较大的细胞具有吞噬能力。 李静等【】7 】发现损伤后圆背角无齿蚌颗粒血细胞的吞噬能力最强无颗粒血细胞 的吞噬活性随着手术时间的延长而逐渐增强，透明血细胞和类淋巴血细胞没有吞噬 能力。研究还发现，在有血清存在的情况下，损伤蚌和对照蚌血细胞的吞噬活性都 有明显增加，说明血清具有调理作用。张峰等【3 6 】同样发现血淋巴的各噬活性明显高 于分离的盘细胞的吞噬靖性。 g 第1 带引高 1 2 3 包囊作用 贝类机体成功地将外来物质隔离后，如果异物比血细胞大得多，例如寄牛虫、 坏死组织、外源植入物等，不能通过单个血细胞的吞噬作用摄入，血细胞就对该异 物的吞噬动员全部的细胞膜表面积，表现为血细胞在异物表面上完全伸展，扁平化， 由若干吞噬细胞共同将外物包裹起来。这称为包囊作用( e n c a p s u l a t i o n ) ，被认为是 受挫的吞噬作用 5 0 o 最初，血细胞对异物的包裹比较疏松，随着越来越多的细胞聚 集到异物处，与异物直接接触的细胞变扁平，并充分伸展，形成包裹异物的连续的 细胞层，最后，包囊变得越来越坚固，通过细胞山和细胞外消化将被包囊的异物清 除，包囊内层为成纤维细胞状细胞利酸性粘多糖，外层为一厚层网状的纤维状物质， 其中含有糖蛋白或粘蛋白以及中性枯多糖，同时还有血细胞渗入。若被包围形成包 囊的是寄牛虫，渗入其中的血细胞则能分泌r 一葡萄糖苷酸酶将它们降解破坏【5 ”。 1 2 4 影响贝类血细胞数量、形态和吞噬作用的因素 1 2 4 1 血细胞数量的变化 一般来说，贝类血细胞数量的增多可能是由于污染导致了血细胞的增牛，或者 组织中的细胞渗入到血淋巴液中。同样，血细胞数目的降低可能是由于血细胞的溶 解、血球渗出、增殖受抑制或者从循环系统进入组织中造成的。贝类皿细胞总数在 受到外来污染的作用后会发牛不同程度的变动。f u 由于个体本身存在着差异，同时 季节性波动及其他诸多环境因素也会严重影响贝类血细胞的数量【5 2 1 。因此在研究数 据时还需要慎重考虑，综合分析。 1 2 4 2 血细胞形态的变动 贝类血细胞被分为不同的细胞亚群，这些细胞亚群各自具有不同的功能，有一 些具有吞噬能力，释放水解酶和活性氧自由摹来杀灭外来病原。c o e s 5 3 1 报道c u 2 + 使贻贝的嗜碱性颗粒细胞的比例增高。 1 2 4 3 对血细胞吞噬作用的影响 室内实验表明，双壳贝类在受到短期、低浓度污染时，其血细胞的吞噬指数会 有所增加【5 4 - 55 1 ，但是在受到高浓度，长期污染的作用后吞噬指数则会下降。s a m i l 5 6 l 南昌人学颂j 研究生毕业论文 实验证明来自多环芳烃( p a h ) 污染地区的牡蛎血细胞的吞噬能力低于来自非污染 地区的，h a u t o n 等1 5 7 ) 研究了温度和盐度对食用牡蛎的影响：结果发壬兕血细胞在盐 度2 8 ，温度1 5 c 时最稳定，在低盐时，血细胞的适应能力降低。在温度1 5 的情 况下，溶酶体在高盐度( 2 5 ，2 8 ) 时保持中性红的时问比在低盐( 1 6 ，1 9 ) 时要长。 这表明，在低盐时，细胞的稳定性降低。细胞稳定性的降低可能反映了细胞出与血 淋巴间渗透压的不平衡。 o t l a v i a n i 等 5 8 1 用细菌注射刺激蜗牛p l a n o r b a n i u sc o t e z l 后，发现在注射后2 h 内细菌清除率最高，清除率达到7 6 1 9 2 h 后几乎全部清除，证明血细胞否噬率 能够作为贝类机体免凌反应的一个指标，并能够很好的反应出机休的免疫活性。 孙虎山等 5 9 1 对栉孔扇贝注射大肠杆菌后，测定了扇贝血清和血细胞中7 种酶活力 的变化情况，发现大肠杆菌可以促进血细胞中a c p 的产牛和释放。丁秀云等 6 0 i 发现大肠杆菌和弧菌的免疫刺激，对皱纹盘鲍血清的溶菌活力、超氧化物歧化酶 和酚氧化酶活性均产牛不同程度的诱导作用。c a m i n o l 6 l j 利用帕金虫凡m 肌f w a t l a n t i c u s 进行刺激实验发现，在未感染蛤体中，血细胞浓度、吞噬率和抗菌活力 。较高，而溶菌酶活力、血清蛋白含量和凝集效价却低于被感染个体，由此可见 pa t l a n t i c u s 对其免疫系统产年了一定的影确。 1 3 本研究的主要内容及其意义 池蝶蚌是日本特有种，原产于g 本滋贺县的琵琶湖。它与我国的二角帆辨为同 属不同种。对其抗病性等方面的研究表明，池蝶蚌对二角帆蚌蚌瘟病具有较强的抵 抗力。虽然有关贝类血细胞形态和吞噬活性的研究报道较多，f u 池蝶蚌血细胞的分 类研究却未见报道，而且下龄对贝类吞噬活性影响的研究也很少。为了进一步验i 正 池蝶蚌的高抗病性能及其抗病机理，本实验顶采用活体观察、染也观察、扫描电了 显微镜观察、密度梯度离心等几种方法对池蝶蚌血细胞的形态结构、表面结构、形 态变化、过氧化物酶定位平u 吞噬活性等几个方面进行研究，并将这几方面有机结合， 以舰使分类结果敛到相互对应。为其它贝类缸缅跪豹分类研究提供可靠的参考标 准；了解其吞噬过程、吞噬后血细胞形态结构的变化和年龄对吞噬能力的影响，为 贝类的血细胞及免疫学研究提供有价值的参考资料。 第2 市池蝶蚌血细胞的分类及足形态变化的研究 第2 章池蝶蚌血细胞的分类及其形态变化的研究 摘要：通过光镜和扫描电镜的观察对池蝶蚌血细胞的形态和表面结构进行了研究。 根据血细胞形态、大小、密度和核质比等特征将血细胞分为6 类：颗粒细胞、透明 细胞、浆液细胞、类淋巴细胞、梭形细胞和血栓细胞，并对各种血细胞显微结构予 以描述，统计了血细胞胞体大小、细胞核大小、核质比、密度及所占比例。颗粒细 胞和透明细胞是两种主要的细胞类型，颗粒细胞呈椭圆形，内有折光性颗粒，分为 i 型和i i 型，占( 4 5 ，8 4 ：t = 2 2 0 ) 。透明细胞里圆形，胞质少且均匀，无明显颗粒 占( 3 6 3 6 ：3 4 7 ) 。浆液细胞体积最大，一 包体直径最大可达2 5 9 9 m ，f u 核质比最 小，仅为0 0 8 芹右。类淋巴细胞核质比最大，可达0 4 6 。梭形细胞、血栓细胞和 透明细胞的体积和核质比相差无几。表面结构观察也显示有6 种形态：椭圆形