（材料学专业论文）基于纳米聚苯胺的dna电化学生物传感的研究.pdf

硕士论文基于纳米聚苯胺的d n a 电化学生物传感的研究 摘要 本论文围绕两种导电纳米聚苯胺修饰电极的制备以及其在d n a 电化学生物传感器 中的应用展开了以下研究： ( 1 ) 采用循环伏安法( c v ) 在金电极表面制备了三乙醇胺( t e a ) 掺杂的聚苯胺 纳米纤维( t e a p a n i ) ，并通过静电吸附将单链d n a ( s s d n a ) 探针固定在修饰电极 上。利用扫描电镜( s e m ) 和原子力显微镜( a f m ) 对d n a 固定前后修饰电极的表面 形貌进行了表征，同时采用c v 、差分脉冲伏安法( d p v ) 和方波伏安法( s w v ) 对三 乙醇胺掺杂的p a n i 修饰电极的电化学性质进行了表征。结果发现，有t e a 掺杂的p a n i 的导电性大大提高，而且t e a p a n i 纳米纤维较大的比表面积和丰富的阳离子更有利于 d n a 探针的静电吸附固定；以盐酸异丙嗪( p z h ) 为杂交指示剂，采用d p v 和交流阻 抗法( e i s ) 对杂交信号进行检测，成功实现了对互补序列d n a 片段的识别和定量检测， 探讨了该测试体系的机理。研究发现，t e a p a n i 纳米纤维中t e a 的存在大大增强了检 测的灵敏度。 ( 2 ) 电化学法制备了离子液体 b m i m b f 4 和硫酸共掺杂的纳米导电p a n i 修饰电极， 系统地研究了聚合方法、聚合时间、离子的掺杂、p h 值等一系列参数对p a n i 修饰电极 的电化学性能的影响。结合a f m 、紫外( u v ) 、红外( i r ) 光谱对它的形貌和结构进 行了表征。结果发现，纳米聚苯胺修饰电极聚合条件的最优结果为：选择采用恒电位法 ( o 8 v ) ，在i t o 电极上制备p a n i b f 4 h 2 s 0 4 修饰电极，聚合时间为1 5 0 s 。以p z h ( p b s ) 缓冲溶液作为电解液，当缓冲溶液的p h 值为6 1 时，p a n i 修饰电极的电化学性能最好； 红外和紫外光谱的测试结果显示离子液体已经掺杂到聚苯胺中，且离子液体的掺杂大大 提高了聚苯胺膜的导电性。此外，研究- j p z h 在p a n i b f 4 h 2 s 0 4 修饰电极上的动力学过 程。 ( 3 ) 在前面研究的基础上，利用纳米导电p a n i 和掺杂剂硫酸及离子液体 b m i m b f 4 三者的协同效应改善了探针d n a 的固定效果，制备了高灵敏度的d n a 电化学生物传 感器。以p z h 为指示剂，研究了p z h 与d n a 之间的相互作用机理，结果表明，p z h 与s s d n a 和d s d n a 之间分别存在着静电和嵌插两种不同的作用方式；p z h 在s s d n a 、 d s d n a 修饰电极上的化学反应不单纯受扩散控制，同时存在表面吸附。d p v 、s w v 和 e i s 三种测试方法证明该d n a 电化学生物传感器具有较高的选择性和较低的检测线， 能够实现对d n a 杂交的定量检测。 关键词：纳米聚苯胺，d n a ，电化学，生物传感器，三乙醇胺，离子液体，盐酸异丙 嗪 a b s t r a c t硕上论文 a b s t r a c t i nt h i sd i s s e r t a t i o n ，t h ep r e p a r a t i o no ft h em o d i f i e de l e c t r o d e sb yt w ok i n d so f c o n d u c t i v e p o l y a n i l i n e ( p a n i ) n a n o m a t e r i a l sa sw e l la st h ea p p l i c a t i o ni nt h ed n ae l e c t r o c h e m i c a l b i o s e n s o rh a v e b e e ni n v e s t i g a t e d t h em a i nc o n t e n t sa n dr e s u l t sa r ed i s c u s s e da sf o l l o w s ： ( 1 ) p o l y a n i l i n en a n of i b e r sd o p e dw i t ht r i e t h a n o l a m i n e ( t e a p a n i ) h a v eb e e nd e p o s i t e d o n t ot h ea ue l e c t r o d eb yt h eu s eo fc y c l i cv o l t a m m e t r y ( c v ) t h es s d n ap r o b e sa r e i m m o b i l i z e do nt h es u r f a c eo ft e a p a n in a n of i b e r st h r o u g he l e c t r o s t a t i ca d s o r p t i o n t h e m o r p h o l o g yo ft h ee l e c t r o d e sm o d i f i e dw i t ht e a - p a n ii se x a m i n e du s i n gs e ma n da f m t h ee l e c t r o c h e m i c a lp r o p e r t i e so ft h em o d i f i e de l e c t r o d e sw i t ho rw i t h o u tt e ah a v ea l s o b e e ns t u d i e db ym e a n so fd i f f e r e n t i a lp u l s ev o l t a m m e t r y ( d p v ) ，s q u a r ew a v ev o l t a m m e t r y ( s w v ) a n dc v t h er e s u l t ss h o wt h a tt h ec o n d u c t i v i t yo fp a n id o p e dw i t ht e ah a sb e e n e n h a n c e dg r e a t l y t h el a r g es p e c i f i cs u r f a c ea r e a so ft e a p a n in a n of i b e r sa n dr i c hp o s i t i v e i o n sb e n e f i tf o r t h ei m m o b i l i z a t i o no fd n a p r o b e ( n e g a t i v e l yc h a r g e d ) t h r o u g he l e c t r o s t a t i c a d s o r p t i o n t h eh y b r i d i z a t i o ns i g n a l s a r em o n i t o r e du s i n gd p va n de l e c t r o c h e m i c a l i m p e d a n c es p e c t r o s c o p y ( e i s ) t e c h n i q u e sw i t ht h eh e l po fp r o m e t h a z i n eh y d r o c h l o r i d e ( p z h ) a sah y b r i d i z a t i o ni n d i c a t o r t h ea p p r o a c hd e s c r i b e dh e r eh a sb e e nu t i l i z e ds u c c e s s f u l l yf o r t h ed i s c r i m i n a t i o na n dd e t e c t i o no ft h ec o m p l e m e n t a r yd n a t h em e c h a n i s mo ft h ed e t e c t i o n s y s t e mi sa l s ob e e ni n v e s t i g a t e d t h es e n s i t i v i t yo ft h ef a b r i c a t e ds e n s o rc a nb er e m a r k a b l y i m p r o v e di nt h ep r e s e n c eo ft e ad o p i n gi nt h ep a n in a n of i b e r s ( 2 ) t h em o d i f i e de l e c t r o d e ( p a n i b f 4 h 2 s 0 4 ) b yt h ec o n d u c t i v ep a n ic o d o p e dw i m i o n i cl i q u i d 【b m i m - b f 4a n dh 2 s 0 4h a sb e e np r e p a r e d t h ei n f l u e n c e so fp o l y m e r i z a t i o n m e t h o d ，p o l y m e r i z a t i o nt i m e ，t h ed o p e di o n sa n dp hv a l u eo nt h ee l e c t r o c h e m i c a lp r o p e r t i e s o ft h em o d i f i e de l e c t r o d ea r es t u d i e ds y s t e m a t i c a l l y t h em o r p h o l o g ya n dc h e m i c a ls t r u c t u r e a r ec h a r a c t e r i z e db ya f m ，u va n di r t h ec o n d i t i o n so fp a n ip o l y m e r i z a t i o nh a sb e e n o p t i m i z e da sf o l l o w s ：p o t e n t i o s t a t i cm e t h o d ( 0 8 v ) ，p o l y m e r i z a t i o nt i m eo f l5 0 s t h eo p t i m a l p ho fp b sb u f f e ri s6 1 f o rt h eb e s te l e c t r o c h e m i c a lp e r f o r m a n c eo ft h ep a n im o d i f i e d e l e c t r o d ew h e np z hi su s e da sa ni n d i c a t o r t h ek i n e t i cp r o c e s so fp z ho nt h e p a n i b f 4 h 2 s 0 4m o d i f i e de l e c t r o d ei sa l s oe x p l o r e d t h er e s u l t sf r o mi ra n du vi n d i c a t e t h a ti o n i cl i q u i d sh a v ed o p e di n t op a n i ，w h i c hl e a d st ot h eg r e a te n h a n c e m e n to ft h ep a n i c o n d u c t i v i t y ( 3 ) o nt h eb a s i so ft h ep r e v i o u sr e s u l t s ，ah i g h l ys e n s i t i v ed n ae l e c t r o c h e m i c a l b i o s e n s o rh a sb e e nd e v e l o p e d ，a n dt h ei m m o b i l i z a t i o no fd n a p r o b e si si m p r o v e dd u et ot h e s y n e r g e s t i ce f f e c tw i t ht h ec o m b i n a t i o no fn a n o p a n i ，h 2 s 0 4a n di o n i cl i q u i d 【b m i m 一b f 4 w ea l s os t u d i e dt h ei n t e r a c t i o nm e c h a n i s mb e t w e e nt h ed n aa n dt h ei n d i c a t o r ，p z h t h e r e s u l t sr e v e a lt h a tt w od i f f e r e n tb e h a v i o r so fe l e c t r o s t a t i ca n di n t e r c a l a t i o ni n t e r a c t i o n sh a v e b e e nf o u n db e t w e e np z ha n ds s d n ao rp z ha n dd s d n a ，r e s p e c t i v e l y t h ee l e c t r o c h e m i c a l p r o c e s so fp z ho nt h es s d n ao rd s d n am o d i f i e de l e c t r o d e si sc o n t r o l l e dn o to n l yb yt h e d i f f u s i o n ，b u ta l s ob yt h ea d s o r p t i o n t h ed n ae l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o r ss h o wt h eh i g h e r s e l e c t i v i t y ，l o w e rd e t e c t i o nl i n e ，w h i c hc a nb ea c h i e v e df o rt h eq u a n t i t a t i v ed e t e c t i o no fd n a h y b r i d i z a t i o n k e yw o r d s ：n a n op o l y a n i l i n e ，d n a ，e l e c t r o c h e m i s t r y , b i o s e n s o r , t r i e t h a n o l a m i n e ，i o n i c l i q u i d ，p r o m e t h a z i n eh y d r o c h l o r i d e 1 1 1 声明 本学位论文是我在导师的指导下取得的研究成果，尽我所知，在本学 位论文中，除t , d n 以标注和致谢的部分外，不包含其他人已经发表或公布 过的研究成果，也不包含我为获得任何教育机构的学位或学历而使用过的 材料。与我一同工作的同事对本学位论文做出的贡献均已在论文中作了明 确的说明。 研究生签名： 学位论文使用授权声明 南京理工大学有权保存本学位论文的电子和纸质文档，可以借阅或上 网公布本学位论文的部分或全部内容，可以向有关部门或机构送交并授权 其保存、借阅或上网公布本学位论文的部分或全部内容。对于保密论文， 按保密的有关规定和程序处理。 研究生签名： 砷年6 月狮 硕 ：论文皋于纳米聚苯胺的d n a 电化学生物传感的研究 1 绪论 自1 9 6 2 年c l a r k 提出设想，1 9 6 7 年h i c k s 和u p k i k e 首次研制出了生物传感器以来， 生物传感器这一新技术已经引起了生物医学、农业科学、环境科学等领域科学家的重视， 使之在国际上开始被广泛研究。所谓生物传感器，是指用固定化的生物材料( 酶、抗原、 抗体、激素、d n a ) 或生物体本身( 细胞、细胞器、组织) 作为敏感元件的传感器。 近年来，d n a 生物传感器对基因序列的明确分析得到了快速地发展，随着d n a 合 成技术、微电子技术以及纳米材料技术的发展，d n a 生物传感器的发展更加趋于完善。 电化学d n a 生物传感器【i - 3 j 是近期发展起来的一种新型的生物传感器，为分子生物学的 研究提供了全新的基因检测技术。电化学分析具有准确性好、灵敏度高、线性范围宽、 检测限低、仪器简单等优点，近年来得到了较快的发展，加上它与纳米技术、表面科学 等方法交叉起来，应用领域极其广泛。因此，基于纳米材料的d n a 电化学生物传感的 研究己成为研究的热点之一一j 。 1 1d n a 电化学生物传感器 1 1 1i ) n a 的组成与结构 d n a 是核酸的一种，是大量脱氧核苷酸的聚合体。脱氧核苷酸由碱基、脱氧核糖 和磷酸组成。脱氧核糖是2 位没有羟基的五碳糖。碱基有嘌呤和嘧啶两种，嘌呤有鸟嘌 呤( g u a n i n e ) 和腺嘌呤( a d e n i n e ) 两种，嘧啶也有胞嘧啶( c y t o s i e n ) 和胸腺嘧啶 ( t h y m i n e ) 。碱基位于脱氧核糖的l 位，磷酸基团连接在脱氧核糖的3 位羟基或5 位羟 基位上。d n a 在碱基组成上遵从c h a r g a f f 规则，即鸟嘌呤和胞嘧啶的物质的量相等， 腺嘌呤和胸腺嘧啶的物质的量相等，嘌呤总数等于嘧啶总数。 d n a 分子的一级结构是脱氧核糖核苷酸通过3 ，5 磷酸二酯键连接成没有支链的直 线形或圆形结构1 5 j 。1 9 5 3 年，w a s t o n 和c r i c k 6 】提出了d n a 分子的二级结构是双螺旋结 构模型，即d n a 分子是由两条脱氧核糖核酸链组成的，两条链上的碱基是相互匹配的， 称为碱基互补，腺嘌呤和胸腺嘧啶以两个氢键相连，鸟嘌呤和胞嘧啶以三个氢键相连， 在d n a 分子中，互补碱基含量相等。d n a 的三级结构是d n a 的双螺旋进一步扭曲， 包括线状双链中间可能有的扭结和超螺旋多重螺旋及d n a 中诸如超螺旋和连环之类的 各种拓扑学状态，其中，超螺旋是d n a 三级结构中的一种最常见的形式。 1 1 2d n a 电化学生物传感器的工作原理 d n a 电化学生物传感器是电化学、电分析化学与分子生物学相互交叉的一项新技 术，为生命科学的研究提供了一种新的方法。d n a 电化学生物传感器是由一个支持探 针d n a 片段的电极和用于检测的电活性杂交指示剂构成的。d n a 探针序列( s s d n a ) 1 绪论 硕j ：论文 与其靶序列是互补的，在适当的温度、p h 值和离子强度下，固定在电极表面上的已知 序列的单链d n a 片段( d n a 探针) 与溶液中的待测d n a 发生杂交，利用两条互补的 单链d n a ( s s d n a ) 间的特异性相互作用，形成双链d n a ( d s d n a ) ，从而导致电极 表面的结构发生改变。可以通过具有电活性的杂交指示剂在杂交前后的电化学信号的改 变，来识别这种杂交前后的结构差异，从而达到检测目标基因的目的。一般而言，在一 定范围内，指示剂的响应信号与待测d n a 的物质的量成线性关系，据此来检测d n a 的含量，达到定量测量的目的。d n a 电化学生物传感器的工作原理如图1 1 所示。 一o 警 簟 i 链d 舭片断 警一喙蝴二 图1 1d n a 电化学传感器原理示意图 d n a 电化学生物传感器是以电极为换能器，根据d n a 杂交反应前后电化学信号的 差异来构建的d n a 传感器。d n a 电化学生物传感器测定d n a 的过程包括以下四步： 一是d n a 探针的固定，即要将探针序列s s d n a 固定到一个固体电极表面，形成d n a 探针电极；二是杂交过程，将d n a 探针电极放入被测溶液，当互补的靶d n a 与之相 遇时，它们将在电极表面杂交形成d s d n a ，这一过程必须控制合适的杂交条件；三是 杂交的指示，即如何将杂交信号转化为可以测量的电化学信号；四是电化学信号的检测， 可以将电流、电压或电导作为检测信号，根据杂交前后电化学信号的改变来检测目标基 因。其中d n a 探针的固定、杂交条件的选择以及杂交指示剂是此类传感器的三大关键 问题。 此类传感器依靠生物体内物质间特有的亲合力，能够直接、快速地获取复杂体系的 组成信息，既有选择性好、种类多、测试费用低、适合联机化等优点，又有电分析化学 的不破坏测试体系、不受颜色影响、简便等特点，能广泛地应用于医疗、环境监测、工 业生产等领域。 1 1 3d n a 电化学生物传感器的制备 d n a 电化学生物传感器和其它生物传感器一样，包含两部分，即分子识别器件 2 硕上论文基于纳米聚苯胺的d n a 电化学生物传感的研究 ( d n a ) 和换能器( 电极) 。识别器件探针( s s d n a ) ，探针用来感知样品中是否含有 待测物质，它与待测样品靶( s s d n a ) 杂交，形成w a t s o n c r i c k 双链( d s d n a ) 。杂交 在电极上直接完成，根据杂交前后电化学信号的改变量推断出被检测的d n a 的量。由 此可以看出：d n a 电化学生物传感器的制备大体可分为两个步骤，即d n a 探针的固定 和实现测定信号的相互转换。 1 1 4d n a 电化学传感器的特征 与酶电极、免疫电极和微生物传感器相比，d n a 传感器研究的起步比较晚，直到 2 0 世纪9 0 年代中期后才有陆续报道。d n a 电化学传感器的特征一般可以归纳为以下几 点：( 1 ) 特异性好。d n a 分子双链间具有非常高的特异性识别能力；( 2 ) 稳定性好。虽 然各种d n a 酶( 内切酶或外切酶) 能够水解d n a 分子，但离体d n a 比多数蛋白质( 酶) 分子的热稳定性更好，所制成的传感器贮存时间比一般酶电极长；( 3 ) 制备简单。d n a 的获得比酶或抗体等蛋白质的获得要容易得多，既可以通过微生物大量表达，又可以用 仪器批量合成；( 4 ) d n a 的操作方法具有通用性，容易标准化；( 5 ) 结合芯片技术，容 易制备d n a 阵列，实现高通量测定；( 6 ) 灵敏度高；( 7 ) 用途极其广泛。 1 1 5d n a 电化学生物传感器的种类 根据电化学活性标识元素的不同，主要将电化学d n a 生物传感器分为以下三类： ( 1 ) 在寡聚核苷酸上标记电化学活性的官能团作为识别元素。合成带有电化学活 性基团的寡聚核苷酸与电极表面的靶基因选择性地进行杂交反应，在电极表面形成带有 电活性官能团的杂交分子，通过测定其电化学信号便可以识别和测定d n a 分子。瞅e n l ( a 等人【7 1 成功地在寡聚核苷酸的5 端磷酸基上标记具有电化学活性的羧酸二茂铁制成二茂 铁寡聚核苷酸。 ( 2 ) 利用酶的化学放大功能，在d n a 分子上标记酶作为识别元素。当标记酶的单 链d n a ( s s d n a ) 与电极表面的互补链s s d n a 发生杂交反应后，相当于在电极表面修 饰了一层酶，酶具有很强的催化功能，通过测定反应生成物的变化量便可以间接地测定 d n a 。 ( 3 ) 用具有电化学活性的杂交指示剂( h y b r i d i z a t i o ni n d i c a t o r ) 作为识别元素。具 有电化学活性的小分子物质，能与d n a 分子发生可逆相互作用，其中一些能够专一性 地嵌插到d s d n a 分子双螺旋结构的碱基对中，这类物质称为杂交指示剂。此类d n a 电 化学传感器的关键是，选择能够识别s s d n a 和d s d n a 而又不与d n a 链发生不可逆的 共价结合，同时又能给出电流、电位或电阻识别信号的杂交指示剂作为电极表面d n a 分子杂交与否的识别元素。用电化学方法测定其氧化还原的峰电流和峰电位，便可以 测定和识别d n a 分子。 方禹之【8 1 、刘盛辉【9 】、陈巾凡【1 0 1 等将人工合成的7 5 个碱基的s s d n a 共价固定在石墨 1 i 绪论 硕上论文 电极表面，在杂交缓冲溶液中用盐酸阿霉素( a d m ) 作为杂交指示剂进行杂交实验。 实验表明，盐酸阿霉素能够嵌插到d n a 分子双螺旋结构的碱基对之间，在电极表面形 成d s d n a a d m 层，采用循环伏安法( c v ) ，通过a d m 的氧化还原峰电流识别和测定了 溶液中互补链c d n a ，发现c d n a 的质量浓度在1 0 x 1 0 一- 5 0 x 1 0 。m g m l 范围内，与a d m 的氧化还原峰电流呈良好的线性关系，检测限为1 0 x 1 0 m g m i 。 w e i 等【l l 】研究了小分子药物盐酸异丙嗪( p z h ) 与d n a 之间的相互作用，结果发 现盐酸异丙嗪( p z h ) 与s s d n a 发生静电作用，而与d s d n a 发生嵌插作用，通过p z h 的氧化还原峰电流识别和测定了溶液中互补链s s d n a ，互补链s s d n a 的物质的量浓度 在5 0 1 0 。7 2 o 1 0 母m o l l 范围内，与p z h 的氧化还原峰电流呈良好的线性关系，检测 限为3 8 x1 0 1 0 m o l l 。 1 1 6d n a 在电极上的固定化方法 d n a 在传感器电极表面的固定可以采取多种方法，各种方法的特点见表1 1 。其中 采用最多的是末端修饰( 如巯基或氨基) ，其最大的优点是能够很容易地实现定向固定。 表1 1d n a 的固定方法 1 1 7d n a 分子杂交技术 对特定序列的f i 标基因进行检测，一般需要借助分子杂交技术。所谓分子杂交技术， 是指核酸分子间通过碱基互补配对( a = t ，g = c ) 的原则产生相互作用而形成杂交分子， 用单原子、功能基团或长侧链修饰过的核苷酸也可以进行碱基配对，并且换能器能将杂 4 硕十论文基于纳米聚苯胺的d n a 电化学生物传感的研究 交前后所产生的变化转变成可直接测量的信号。基因传感器一般有1 0 3 0 个核苷酸的单 链核酸分子( 探针) ，能够专一地与特定的靶序列进行杂交从而检测出特定的目标核酸 分子。杂交一般在电极表面完成。d n a 的杂交过程如图1 2 所示。 彳= 亍亍彳彳彳，t 1 r _ t r - r 囊atacc 搬钟固定 下1 丁 r t l m 盥 嚣物：融交 图1 2d n a 的杂交过程 目前，人们对于核酸探针与目标核酸杂交的理论了解得并不多，但是了解影响杂交 分子稳定性和杂交的动力学参数对于更好地进行杂交实验具有很大的意义，有助于寻找 杂交的最佳条件。 1 2 纳米材料在d n a 电化学生物传感器中的应用 纳米材料是指三维空间尺度至少有一维处于纳米量级( 1 1 0 0n m ) 的材料，它是由 尺寸介于原子、分子和宏观体系之间的纳米粒子所组成的新一代材料，具有比表面积大， 光、电、磁、热性能好，力学性能( 如强度和韧性等) 强等特点。纳米技术的引入，提 高了生物传感器的检测性能，促进了新型生物传感器的研制。 1 2 1 纳米颗粒在电化学生物传感器中的应用 纳米颗粒在生物传感器中的应用最为广泛，大致可以分为三类：纳米颗粒标记、纳 米颗粒用作固定载体和智能纳米颗粒。将电子性质的、光学性质的或磁性的功能纳米颗 粒固定在生物大分子( 如多肽、蛋白、核酸) 上，可以制成用于生物信号检测、信号转 换和放大的传感器，即可成为声波、磁学、光学和电化学等种类的生物传感器。最常见 的代表有纳米金、纳米免疫磁性颗粒和量子点。 纳米金可以用来标记生物分子，从而实现信号的放大，一直以来被广泛地应用于试 纸条显色、s e m 、t e m 表征等。c a i 等人【2 1 1 把胶体金纳米颗粒固定在胱氨酸修饰的金电 极表面上，大大增加了有效固定面积，使得可以结合的单链s s d n a 的量增多，检测下 限延长。g o n z 等人用纳米金标记，结合电化学法来研究生物素亲和素之间的作用，首 先把生物素化的白蛋白吸附在电极表面，然后与直径为1 0 n m 的胶体金标记的亲和素反 应，由纳米金引起的电流响应和亲和素的浓度呈线性关系。( 纳米金增强电极信号原理 见图1 3 ) 。 纳米免疫磁性颗粒是以磁性材料为固相载体，在其表面引入氨基、羧基、羟基、醛 基等活性基团，通过偶联反应将抗体、酶等物质结合在载体上，既保留了大分子的生物 1 绪论 硕上论文 活性，在外加磁场的作用下又可以定向移动，在蛋白质、核酸、细胞的分离，微生物检 测、肿瘤诊断、药物靶向治疗中发挥了重大的作用。s a r a 等人1 2 2 】用磁性材料标记分子， 在磁场梯度下实现了样品的分离和检测。r i c h 等人【2 3 j 通过磁免疫分析技术，用磁力计数 器检测了磁性标记分子。纳米免疫磁性颗粒用于分离作用示意图如图1 4 所示。 量子点是一种半导体晶体材料的纳米颗粒，直径在1 0n n l 以内，较普通细胞的体积 小数千倍，具有吸收波长范围宽和发射波长范围窄的特点，不同材料的量子点可以发出 不同的荧光。 l 一鞯警e 图1 3 纳米金增强电极信号作用示意图 f = 邕刁 l 棒l 幽 图1 4 纳米免疫磁性颗粒用于分离作用示意图 1 2 2 多孔纳米结构在电化学生物传感器中的应用 近年来，由于纳米技术的引入，电化学生物传感器得到了进一步的发展。虽然微管 和多孔结构可以保持生物分子的活性和提高分子的固定效率，然而由于纳米技术的引 入，可以采用尺寸更小、比表面积更大的纳米微结构，因此能够进一步改善生物传感器 的性能。 纳米管有着良好的电学性能和优异的表面化学性能，是制作生物传感器的理想材料 之一。m i a o 等人【2 4 】介绍了一种新的固定化方法聚吡咯纳米微管固定法。聚吡咯微管是 基于模板合成方法而得到的一种纳米微管，也就是利用化学或电化学方法使吡咯单体在 模板孔隙中生长，得到与模板相应结构的纳米管。这种微管具有直径统一、上下连通、 管壁多孔的特点，具有较大的比表面积，能够容纳大量的酶分子，并能减少反应物和产 6 硕上论文 皋于纳米聚苯胺的d n a 电化学生物传感的研究 物的扩散障碍，有效地提高了酶电极的性能。 多孑l 硅材料具有室温可见发光的特性，吸引了很多研究者开拓其在生物传感器领域 中的应用。同时它还具有比表面积高和与现有硅加工技术相容的优点，前者增加了可固 定的敏感分子的数量，提高了灵敏度，后者则便于各种形式的微加工和大规模生产。l i n 等人【2 5 】在多孔硅的表面固定抗体和d n a 等敏感分子，通过检测折射率和光干涉的变化， 构建了一种新型的免标记型生物传感器，灵敏度达到1 9 4 2f i n o l l 。 1 2 3 导电聚苯胺纳米材料在电化学生物传感器中的应用 近年来，纳米技术的发展为纳米材料在生物传感器领域中的发展和应用开辟了新的 方向。具有微米或纳米级的纤维、微球、微管等特殊结构的纳米导电高分子材料【2 6 , 2 7 1 成为大量学者研究的热点。导电高分子材料如聚苯胺( p a n i ) 、聚吡咯( p p y ) 、聚噻吩 ( p t h ) 等具有导电性能高、循环寿命长、使用温度范围宽及成本低等优点，使得它们 在电子学、光学、磁学及相关的纳米材料等领域得到了广泛的应用【2 引。导电高分子材料 如聚苯胺因有着较好的稳定性、良好的机械弹性、高的比表面积、良好的化学性能和可 调控的导电性，且原料廉价易得，合成方法简便，是制备高灵敏度的生物和化学纳米传 感器的有着良好前景的材料 2 9 , 3 0 , 3 1 】。有关采用导电聚苯胺纳米材料来制备电化学生物传 感器的报道已有不少。 k a v i t a a r o r a 等【3 2 】在p t 电极上用电化学法聚合了抗生物素蛋白修饰的聚苯胺，固定 b d e 作为探针来检测e s c h e r i c h i ac o l i ，检测互补链的最低浓度为0 0 0 9n g 卜t l 。h a i x i n c h a n g 等【3 3 j 在石墨电极上利用模板合成聚苯胺纳米管阵列，通过共价键作用固定单链 d n a ，对d n a 的检测限达到3 7 5 9 f m 。n i r m a lp r a b h a k a r 等【3 4 j 利用恒电流法制备小牛胸 腺d n a 修饰聚乙烯磺酸掺杂的聚苯胺来检测有机磷农药，小牛胸腺d n a 是在聚合溶 液中与聚乙烯磺酸共同掺杂的。k n o l l 3 5 j 通过逐层修饰的方法将聚苯胺和外面自组装了 含巯基的丁二酸的纳米金( m s a g n p ) 修饰在电极上。研究表明聚苯胺可以有效地附着 在m s a g n p 上，并且借助m s a g n p 可以使聚苯胺在中性溶液中保持电活性。该复合 膜可以有效地催化n a d h 的氧化，并且通过电化学方法与表面荧光光谱法来检测d n a 的杂交。z o u 等人【3 6 】采用层离吸附和原位聚合相结合的方法合成了聚苯胺氧化石墨复 合材料( p a n g o ) 并以单链小牛胸腺d n a ( c t s s d n a ) 和双链小牛胸腺d n a ( c t d s d n a ) 为研究对象，初步探讨了采用p a n g o 修饰炭糊电极识别不同类型生物d n a 的可能性， 试图为p a n g o 的应用开辟新的途径。 1 2 4 纳米器件在电化学生物传感器中的应用 纳米科技在生物传感器中发展的最终期望是能够制造出智能型纳米机器，集测试功 能于一体。纳米导线、光纤纳米生物传感器和纳米微加工等技术所制备出的纳米器件为 生物传感器的进一步发展提供了可能。 7 i 绪论 硕i ：论文 科学家通过在d n a 的表面覆盖纳米金属颗粒的方法，合成了导电的d n a 链。然 而由于d n a 完全被金属覆盖，失去了其特异性结合能力。后来研究发现锌、镍、钴等 离子能够并入d n a 链的双螺旋结构的中心，在高p h 等基本条件下，可以稳定d n a 含 有金属离子的状态，获得导电的d n a 链。并且此类金属化的d n a 仍然保持选择性结 合其它分子的能力，利用该特点可以开发遗传畸变探测生物传感器。在此传感器上装配 上所要探测的特制d n a 序列，d n a 的杂交所引起的变化，阻碍了电流的相应信号，通 过测量电导的变化，能够识别d n a 的异常。这种生物传感器还能用于鉴别混合物，如： 毒品、蛋白质、环境毒素等，当这类分子结合到金属d n a 上，将把会属离子排斥出来， 导致电流的减弱或中断。金属d n a 还可以用于筛选结合于d n a 的抗肿瘤药物，用作 微细半导体线路的导线等。 1 2 5 纳米材料在电极表面的组装方法 纳米材料在电极表面的组装方式决定着生物传感器的性能。目前，纳米材料在电极 表面的固定化方法主要有以下几种： ( 1 ) 直接滴涂法 直接滴涂法是将纳米粒子的胶体溶液直接滴涂于基底电极表面，胶体在一定的条件 下有自组织或自组装成有序结构的能力，待溶剂挥发后在基底表面形成一层生物相容性 好的纳米薄膜，这种方法简便、快速、应用较广。 ( 2 ) 碳糊混合法 碳纳米管最初在电化学中的应用是将碳纳米管和石蜡油按一定的比例混合后制成 碳纳米管糊电极。h e 3 7 j 等在碳纳米管糊电极上利用吸附溶出伏安法测定了栎精。 ( 3 ) 电位沉积法 电位沉积法即通过恒电位沉积或循环伏安电沉积的方法在电极表面直接形成一层 纳米粒子薄膜，然后用于生物分子的固定。 f 4 ) 自组装法 由于分子的自组装有较高的密度和有序度，而且表层可以形成各种均匀的活性基 团，在这基础上进行纳米粒子的自组装自然是既简便又有效。自组装的分子一般为双官 能团分子即分子的两端各有一特定功能的活性基团，一端键合在基质上，另一端与纳米 粒子键合。袁若等先在金电极上自组装上巯基乙胺，再浸入纳米金胶中将纳米金自组 装到巯基乙胺的氨基上，然后分别用恒电位吸附上s s d n a 和d s d n a ，用c o ( b p y ) 3 3 + 作 为指示剂表征了电极表面的变化。 ( 5 ) 其它组装方法 除了以上几种方法外，还有静电作用、l b 膜、外加限制力等方法。 1 2 6 电信号转换 8 硕十论文基于纳米聚苯胺的d n a 电化学生物传感的研究 电信号转换是将目标d n a 分子的存在转变为电信号，通过电信号的变化来判断杂 交反应发生的程度。电信号的转换一般是通过在d n a 分子上标记活性基团或使用电活 性杂交指示剂，这叫做标记检测；另一种是无指示剂标记检测，这种检测是用鸟苷代替 探针中的鸟嘌呤，由于鸟苷和鸟嘌呤的电活性不同，可以通过检测靶中鸟嘌呤的氧化信 号来检测杂交。 1 2 6 1 标记检测 ( 1 ) 用具有电活性的杂交指示剂作为识别元素 电活性杂交指示剂是一类能与单链d n a ( s s d n a ) 和双链d n a ( d s d n a ) 以不同 方式相互作用的电活性物质。它的电活性可以使检测的信号增大，提高检测的灵敏度。 当杂交发生时，随着指示剂的浓度在电极表面增加，电化学反应增强，因此，它可以有 效地区别s s d n a 和d s d n a 。目前，使用的杂交指示剂包括亚甲基蓝、麦尔多拉蓝、道 诺霉素和金属配合物等。 亚甲基蓝【3 9 l 属于酚噻嗪类，由于它与鸟嘌呤有明显的反应，所以它可以作为一种很 好的杂交指示剂。a r z h i t ie r d e m 等以亚甲基蓝为指示剂对短链肝炎b 病毒基因进行了检 测。麦尔多拉蓝是一种有效的电子接受体，它的酚噻嗪结构能够使电子在双核苷酸和电 极表面穿梭，它嵌插到d s d n a 中，没有封闭它的电活性，所以它可以作为一种杂交指 示剂。k a r a 等【4 0 】曾以麦尔多拉蓝为指示剂对孢疹病毒i 和i i 进行区分。道诺霉素是一种 葸环类化合物，具有平面分子结构，可以插入d s d n a 相邻碱基对之间并与d s d n a 的双 螺旋产生强烈作用，这使它成为众多抗癌药物中应用较多的一种，尤其用于对急性白血 病的治疗。b a r t o n 等1 4 l 】证明道诺霉素是一种插入式氧化还原杂交指示剂。对金属配合物 【4 2 】，主要是利用它的氧化还原电位，能与d n a 有强烈的亲合作用，并具有化学稳定性。 通过它在电极表面的反应电流或电位的强弱来判断杂交。b a o k a n gj i n 等曾用c o ( p h e n ) 3 3 + 为指示剂在金电极上对d n a 进行杂交检测。 ( 2 ) 核苷酸与电活性官能团相连，以电活性官能团作为识别元素 合成标记核苷酸与电极表面的靶基因选择性地进行杂交反应，在电极表面形成带有 电活性官能团的杂交分子，通过测定其电信号可以识别和检测d n a 分子。h a f s a k o r r i y o u s s o u f i 等【4 3 j 用二茂铁吡咯和羧酸吡咯聚合，与二茂铁相连的吡咯有一个易离去 的脂基，用氨基标记探针代替这个脂基，通过检n - 茂铁的氧化还原信号来判断杂交是 否发生；k e r m a n 掣删曾将d n a 探针连于生物磁性珠上，与错配靶杂交，再用金纳米粒 子标记的核苷酸检测错配基，通过电化学方法对单碱基多态性进行解译。为了提高电流 的响应值，可以通过将银纳米粒子沉积到金纳米粒子上的方法1 4 5 j 来检测杂交。c a ih 等 曾用金纳米粒子标记靶与探针进行杂交，然后在金纳米粒子上沉积一层银纳米颗粒，通 过微分脉冲伏安法检测银纳米颗粒的电信号来检测杂交，这种检测比用金纳米颗粒标记 检测的灵敏度要高9 0 多倍。 9 l 绪论 硕上论文 1 2 6 2 无指示剂检测 无指示剂法已得到了广泛的关注，并且是d n a 杂交检测的发展趋向。无指示剂法 检测是通过控制杂交中电化学参数的变化来完成的。这种传感器方便简单，因为它不用 指示剂，检测安全，指示剂引起的毒性污染作用被消除，而且还避免了与致癌性物质的 接触。第一个无指示剂杂交的方案由w a n g 提出【4 6 1 ，通过用鸟苷【4 5 郴j 来代替鸟嘌呤，鸟 苷也能与胞嘧啶形成具体的碱基对，但它的电活性比鸟嘌呤低三个数量级。用鸟苷代替 鸟嘌呤的探针与正常靶进行杂交检测，通过计时电位法对靶中鸟嘌呤氧化检测，靶的检 出限可达0 1 2m g l 。1 f 4 7 1 。l u c a r e l l i 等【4 9 】利用这样的一个传感器对人血p c r 真实样品的 d n a 阿朴蛋白e 进行了基因检测。 1 3d n a 电化学生物传感器的应用及其发展趋势 近年来，将各种纳米颗粒应用于电化学生物传感器的研究，正引起人们极大的兴趣， 并使传感器技术获得了巨大的进步。初步的实验结果表明，纳米颗粒以其吸附能力强、 催化效率高、生物兼容性好等优良性质，在生物标记、信号放大、干扰消除和多种酶的 固定化技术中得到了广泛地应用，大幅度地提高了检测的灵敏度，缩短了响应时间，实 现了目标物的实时检测，延长了一些