（环境科学专业论文）叶酸及其部分代谢相关分子与人类遗传稳定性初探.pdf

云南师范火! 学硕士研究生毕业论文 摘要 叶酸是人体正常发育的重要微营养物质，其涉及d u m p 到d t m p 的合成， 同时通过同型半胱氨酸( h c ) 合成蛋氨酸( m e t ) 、s - 腺苷蛋氨酸( s a m ) 的生 化过程而影响d n a 甲基化。因此，叶酸、维生素b 1 2 ( b 1 2 ) 缺乏以及m e t s a m 合成受阻，可引起d u m p 积累并掺入d n a ，从而导致各种d n a 结构损伤：同 时可影响细胞尤其d n a 甲基化过程，从而影响基因表达、染色体分离。 本研究以胞质阻断微核分析( c b m n ) 研究了叶酸对维护乳腺癌患者及其 对照个体淋巴细胞基因组稳定性的作用及差异，并探讨了叶酸代谢途径中的重 要分子m e t 、b 1 2 缺乏对b r c a l 突变的乳腺癌患者成淋巴细胞株及正常人成淋 巴细胞株遗传毒性效应。 研究首先从2 4 例乳腺癌患者、3 0 例f 常人外周血中分离淋巴细胞，在含 3 0 n m 、1 2 0 n m 、2 4 0 n m 叶酸的r p m i 1 6 4 0 培养基中( 8 透析小牛血清、1 0 0 u 双抗、2 m m 谷氨酰胺、p h 7 0 ) 培养，第8 天以细胞松弛素b ( c b ) 阻断细胞 质分裂，2 8 小时后收获细胞，以c m b n 分析叶酸缺乏对人类淋巴细胞产生的遗 传毒性效应；为了证实m e t 、b 1 2 对叶酸代谢和遗传稳定性的影响，试验还以1 5 ，5 0 g m 的m e t 与7 5 1 2 0 0p m b 】2 组合的1 2 种r p m i 一1 6 4 0 培养基( 8 透析小牛血清、 1 0 0 u 双抗、2 m m 谷氨酰胺、p h 7 0 ) ，培养携带b r c a l 基因突变的乳腺癌患者 成淋巴细胞株g m l 3 7 0 5 和正常人成淋巴细胞株g m l 2 5 9 3 ，第8 天以细胞松弛素 b ( c b ) 阻断细胞质分裂，2 8 小时后收获细胞，以c m b n 分析m e t 、b 1 2 对人类 成淋巴细胞株基凶组稳定性的影响。 试验结果表明： 1 、在本试验浓度范围内，叶酸浓度与乳腺癌患者及其对照个体淋巴细胞遗传损 伤之间存在显著的负相关( f 一0 2 4 8 0 8 3 2 ，p 0 0 0 0 1 ) ；叶酸在3 0 n m 时，遗传 损伤均显著高于1 2 0 n m 及2 4 0 n m ( p o 0 0 1 0 0 5 ) ：而1 2 0 n m 及2 4 0 n m 两测试 组之间未观察到各指标问的统计学差异，当叶酸升至1 2 0 n m 时，遗传损伤降到 最低，提示在本试验条件下，1 2 0 n m 的叶酸是防范人类淋巴细胞遗传损伤的最 国家自然科学基金( n o ：3 0 1 6 0 0 3 8 ) 云南省国际合作计划( 2 0 0 1 g h l 5 ) 教育部重点项目基金 云南师范大学硕士研究生毕业论文 低浓度；试验同时发现乳腺癌患者淋巴细胞的双核细胞微核频率显著高于正常人 淋巴细胞的双核细胞微核频率( p 0 0 0 0 1 ) ；提示乳腺癌患者的基因组对叶酸缺 乏的胁迫作用敏感性高于正常个体细胞。 2 、在本试验浓度范围内，m e t - b 1 2 组合浓度与携带b r c a l 基因突变的乳腺 癌患者成淋巴细胞株及正常人成淋巴细胞株遗传损伤之间存在显著的负相关 ( r = 0 5 1 9 0 8 5 6 ，p 0 0 0 0 1 ) ，两细胞株均在1 5 州m e t 与b 1 2 的所有组合中， 出现遗传损伤显著高于5 0 r t m m e t 与b 1 2 的所有组合的趋势；在5 0 0 , m m e t 一6 0 0 p m b 1 2 组合时，正常人成淋巴细胞株和乳腺癌患者成淋巴细胞株双核细胞微核频率 均降至最低；在5 0 肛mm e t 与b 1 2 的更高浓度组问未在两细胞株中观察到双核细 胞微核频率问的统计学差异；试验同时发现乳腺癌患者成淋巴细胞株在所有 m e t - b 1 2 组合中，双核细胞微核频率显著高于相应m e t b 1 2 组合下的正常人成淋 巴细胞株( p o 0 0 0 1 ) ，提示具有b r c a l 突变的基因组对m e t b 挖缺乏的胁迫作 用敏感性高于正常人成淋巴细胞。 研究提示，叶酸缺乏导致乳腺癌患者淋巴细胞及正常人淋巴细胞遗传不稳 定性增加，但乳腺癌患者淋巴细胞对叶酸缺乏的敏感性高于正常个体，这与我 们利用乳腺癌患者成淋巴细胞株及正常人成淋巴细胞株离体研究的结果相吻 合；叶酸代谢中的一些关键小分子如b 1 2 、m e t 对人类成淋巴细胞株基因组的遗 传稳定性影响，提示了这二种微量营养素的适量补充有可能改善叶酸代谢，从 而对遗传物质发挥一定的保护作用。 关键词：叶酸；维生素b 1 2 ；蛋氨酸：s 腺苷蛋氨酸； 胞质阻断微核分 析；遗传损伤 云南师范大学硕士研究生毕业论文 a b s t r a c t al o to fs t u d yc o n f i r m e dt h a tf o l a t ei sa ni m p o r t a n tm i c r o n u t r i e n ti nh u m a nb o d y i ti s r e q u i r e df o r t h e s y n t h e s i so fd t m pf r o md u m p u n d e rc o n d i t i o no ff o l a t e d e f i c i e n c yd u m pa c c u m u l a t e s ，a n da sar e s u l t ，u r a c i li si n c o r p o r a t e d i n t od n a i n s t e a do ft h y m i n e 1 1 1 ee x c e s s i v ei n c o r p o r a t i o n o fu r a c i li nd n an o to n l yl e a d st o p o i n tm u t a t i o nb u ta l s or e s u l t si ns i n g l ea n dd o u b l es t r a n dd n ab r e a k ，c h r o m o s m e b r e a k a g ea n dm i c r o m u c l e u sf o r m a t i o n s - a d e n o s y l m e t h i o n i n ei st h ec o m m o nm e t h y l d o n o rr e q u i r e df o rt h em a i n t e n a n c eo fm e t h y l a t i o np a t t e r n si nd n at h a td e t e r m i n e g e n ee x p r e s s i o na n dd n ac o n f o r m a t i o n t h ee x p e r i m e n t a i m e dt oe v a l u a t et h e g e n o t o x i ce f f e c t so fm e ta n db 1 2d e f i c i e n c yi nh u m a nl y m p h o b l a s tc e l ll i n ec a r r y i n g b r c a lm u t a t i o n 3 0h e a l t ha n d2 4b r e a s tc a n c e rw o m e na g e d3 5 6 5y e a r sa n dn o tr e c e i v i n g a n t i f o l a t et h e r a p yo rc a n c e rt r e a t m e n tw e r er e c r u i t e df o rt h es t u d y p a t i e n t sd o n a t e da f a s t e db l o o ds a m p l e ( 5 m li nl i t h i u m h e p a i m f i n i z e dv a c u e t t e s ) l y m p h o c y t e sw e r e i s o l a t e du s i n gf i c o l l p a q u e l y p h o c y t ec u l t u r e sw e r ep r e p a r e da tac o n c e n t r a t i o no f o 5 x 1 0 6c e l l s m li nl m lr p m i1 6 4 0m e d i u mc o n t a i n i n g3 0 n m ，1 2 0 n m ，2 4 0 n mf a ， 8 d i a l y z e df e t a lb o v i n es e r u m ，1 0 u ，m li n t e r l u k i n 一2 ，2 m ml g l u t a m i n e ，1 0 0 u m l p e n i c i l l i n1 0 0 u g m ls t r e p t o m y c i n t h ec o n c e r t r a t i o no f f o l a t ec h o s e nw e r ei n t e n d e dt o i n c e s t i g a t ee f f e c t sw i t h i nt h ed e f i c i e n c ya n ds u f f i c i e n c yc o n c e n t r a t i o nr a n g ef o rw h i c h w eh a da l r e a d ys h o w nc l e a rd i f f i e r e n c ei n g e n o m i cs t a b i l i t y m i t o g e n e s i s w a s s t i m u l a t e db yt h ea d d i t i o no fp h y t o h a e m a g g l u t i n i n ( 4 5 u g m l ，p h a ) a n dc u l t u r e sw e r e i n c u b a t e da t3 7 0 ca n d5 c 0 2i nah u m i d i f i e di n c u b a t o r a f t e r3d a y s ，t h ec u l t u r e s w e r ec o n t i n u e di n0 8 m lf e s hm e d i u ma n d0 2 m l “c o n d i t i o n e d ”m e d i u mf r o mt h e p r e v i o u s3d a yc u l t u r e t h ec o m p o n e n t so fm e d i u mw e r es a m ea sa b o v eb u tw i t h o u t p h a t h i sp r o c e s so fc o u n t i n ga n dr e c u l t u r i n gc e l l sw a sr e p e a t e d6d a y sp o s t p h a t r e a t m e n t a t8d a y sp o s t p h at r e a t m e n t ，t w o7 5 0 u la l i q u o t so fe a c hc u l t u r ew e r e t r a n s f e r r e dt o6 m lc u l t u r et u b e sf o rt h ec b m n a s s a yt om e a s u r ec h r o m o s o m ed a m a g e c y t o c h a l a s i nb ( 4 5 u g m 1 ) w a sa d d e dt oe a c ht u b ea n da p p r o x i m a t e l y2 8 hl a t e rc e l l s w e r eh a r v e s t e do n t om i c r o s c o p es l i d e su s i n gac y t o - c e n t r i f u g e s l i d e sw e r et h e na i r d r i e d ，f i x e da n ds t a i n e dw i t hd m s o c o d e ds l i d e sw e r es c o r e df o rt h ef r e q u e n c yo f m n e db n c s ，m n e dm o n o s ，n b u d s ，n p b s 1 0 0 0 一1 5 0 0b n c sw e r es c o r e dp e r c u l t u r et od e m i n ef r e q u e n c yo fm n e db n c s ，n p b sa n dn b u d s m n e dm o n o sc e l l f r e q u e n c yw a sd e t e r m i n e db ys c o r i n g5 0 0m o n o c e l l s t h es c o r i n gc r i t e r i au s e d 4 云南师范大学硕士研究生毕业论文 w e r et h o s ed e s c r i b e db yf e n c h ， h o w e v e rt h el y m p h o b l a s tc e l l s ( g m l 3 7 0 5 ，曰r c ，m u t a t i o n ，g m l 2 5 9 3 ) w e r e c u l t u r e du n d e r1 2c o m b i n a t i o n so fd e f i c i e n c ya n ds u f f i c i e n c yo fv i t a m i nb i 2 ( 7 5 1 2 0 0p m ) a n dm e t h i o n i n e ( 1 5 ，5 0g m ) m e d i u mf o r9d a y s ，c o m m o nr p m i1 6 4 0 c u l t u r ew a ss e ta st h ec o n t r 0 1 t h em e t h o do fc u l t u r ea n ds c o r i n gm e t h o da st h e p r e v i o u s t h er e s u l ts h o w e dt h a t ： 1 、f o l i ca c i dc o n c e n t r a t i o nc o r r e l a t e d s i g n i f i c a n t l yp 0 0 0 0 1 ) a n dn e g a t i v e l y f f 一02 4 8 - - 0 8 3 2 ) w i t ha l lm a r k e r so fc h r o m o s o m ed a m a g e ；t h em a r k e r so f c h r o m o s o m ed a m a g ei n3 0 n mf o l i ca c i d g r o u p s w e r es i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e d c o m p a r i n gw i t h1 2 0 n m ，2 4 0 n mo ff o l i ca c i dp o 0 0 0 1 ) ；n os i g n i f i c a n td i f f e r e n c e s w e r ef o u n da m o n gt h o s et w og r o u p s w h i c hw e r em i n i m i z e da t1 2 0 n mf o l i ca c i d m u c hg r e a t e rt h a tc o n c e n t r a t i o n sa s s u m e d n o r m a l ”b u tn e c e s s a r i l yo p t i m a li np l a s m a c o n c l u s i o n ：12 0 n mo ff o l i ca c i dw a sa b l et om i n i m i z eg e n e t i c d a m a g eo ft h e l y m p h o b l a s tc e l lu n d e rt h ec u r r e n te x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n 2 、m e t b 1 2c o n c e n t r a t i o nc o r r e l a t e ds i g n i f i c a n t l yp o 0 0 0 1 ) a n dn e g a t i v e l y ( f - 0 5 1 9 - - 0 8 5 6 ) w i t ha l lm a r k e r so fc h r o m o s o m ed a m a g eo ft w ot e s t e dc e l ll i n e s ； a l lm a r k e r so fc h r o m o s o m ed a m a g ei nb o t hc e l ll i n e sw e r es i g n i f i c a n t l yh i g h e ri n 1 5 9 mo f m e tc o m b i n e dw i t ha l lc o n c e n t r a t i o n so f b t zt h a nt h a to f 5 0g mo f m e tw i t h a l lc o n c e n t r a t i o n so fb 1 2 ( p ( o ，0 5 ) t h ef r e q u e n c i e so fm n b no f n o r m a la n db r e a s t c a n c e rc e l ll i n ew e r er e m a r k a b l yr e d u c e dw h e n5 0 9 mo fm e ta n d6 0 0 p mo fb t 2w e r e u s e d ；i ns a m ec o n c e n t r a t i o no fm e t b 1 2t h eg e n o m ew i t hb r c a lm u t a t i o nc e l ll i n e m a yb em o r es e n s i t i v et ot h es t r e s so fbt 2d e f i c i e n c yt h a nn o r m a lc e l ll i n e c o n c l u s i o n ：w ec o n c l u d et h a t5 0l l mo fm e ta n d6 0 0p mo fb j 2a r eo p t i m a l c o m b i n a t i o nf o rs t a b i l i z i n gt h eg e n o m eo f t h et e s tc e l ll i n e t h i sp r e l i m i n a r yi n v e s t i g a t i o ns u g g e s t sm e ta n db 1 2d e f i c i e n c yc a u s e sg e n o m i c i n s t a b i l i t y i ti sc o n s i d e r a b l et os u p p l ys o m ea d e q u a t ea m o u n to fm e ta n db 1 2t ok e e p g e n o m es t a b i l i t y k e y w o r d ：f o l l i c a c i d ( f a ) ； v i t a m i n e b 1 2 ( b 1 2 ) ；m e t h i o n i n e ( m e t ) ； c y t o k i n e s i s b l o c k m i c r o n u c l e u s a s s a y ( c b m n ) ； m i c r o n u c l e a t e d b i n u c l e a t e d c e l i ( m n b n ) ；n u c l e o p l a s m i eb r i d g e f n p b ) ；n u c l e a rb u d d i n g ( n b u d ) ；m n e d m o n o n u c l e a t e dc e l l ( m n e dm o n o ) ；c h r o m o s o m ed a m a g e 5 云南师范大学硕士研究生毕业论文 前言 微量营养素包括某些矿物质、维生素，它们在营养素大家族中，是种类既多， 作用又非常活跃的成分，在人体内各有其不同的生理生化作用，愈来愈成为现代 营养学的研究热点。 遗传学和营养学的资料表明，不同人群或同一人群不同个体所有基因的结构 和功能存在差异，即人群中存在遗传多态性。而基因结构和功能的多态性将影响 生命个体对营养物质的需求或耐受，即一个人携带的独特遗传因子，决定了其基 础代谢、营养需求和对环境的敏感性。微量营养素作为有关遗传代谢的底物或辅 助因子，必须维持在适当浓度范围，当微量营养素摄入不足时，将可损伤关键酶 的活性而影响基因组的稳定住。基因组稳定性也受外在环境的影响，而微量营养 素是其决定的一一个关键因素。营养素的直接作用大约有8 0 出现在转录水平，而 营养素的见解作用( 能量和氨基酸的供应) 则出现在基因表达的所有水平。 微量营养素有助于克服维持d n a 稳定性的某些遗传代谢障碍，在微量营养 素对d n a 影响作用的研究领域里，基因型和膳食的相互作用对于患病危险度的 调节效应正h 益受到关注。微量营养素缺乏可出现类似辐射和化学物质对 d n a 的损伤作用，即导致d n a 单链或双链断裂、氧化损伤等，而染色体畸变如 双链断裂时人类肿瘤发生的一个重要征兆。 叶酸在保持基冈组稳定性中起着重要的作用，其涉及尿嘧啶脱氧核苷酸 ( d e o x y t h y m i d i n e ，d u m p ) 到胸腺嘧啶脱氧核苷酸( d e o x y t h y m i d i n e d t m p ) 的合 成，并通过同型半胱氨酸( t i o m o c y s t e i n e ，h c ) 合成蛋氨酸( m e t h i o n i n e ，m e t ) 、 s 一腺苷蛋氨酸( s - a d e n o s y lm e t h i o n i n e ，s a m ) 的生化过程而影响d n a 甲基化 1 2 3 j 。 b 1 2 、m e t 亦通过参与时酸代谢，涉及核苷酸的合成与d n a 甲基化反应( 图1 ) 。 6 云南师范大学硕士研究生毕业论文 m 。t d n 以a + p r o t e i n h c m e t h y l a t i o n 器a 酸 m s ，b 1 2 5 i m 孟c 缸y l e n c d h f ? 5 - m c n i y l 删p i d n a 斟n 目h c s i s 盘他_ ；r 叶酸代谢示意图 f i g u r e1 t h em a i nm e t a b o l i cp a t h w a y so ff o l a t e 注：d h f , d i h d r o f o l a t e ( 二氢叶酸) ；t h f , t e t r a h y d r o f o l a t e ( 四氢叶酸) ；5 m e t h l t h f , 5 m e t h y l t r a h y d r o f o l a t e( 5 - 甲基四氢叶酸) ； 5 ，1 0 - m e t h y l e n et h f , 5 , 1 0 m e t h y l e n e t e t r a h y d r o f o l a t e ( 5 1 0 甲基四氢叶酸) ；s a m , s - a d e n o s y lm e t h i o n i n e ( s - 腺苷甲硫 氨酸) ；s a h ，s - a d e n o s y lh o m o e y s t e i n e ( s 腺苷高胱氨酸) ：d t m p ：脱氧胸腺嘧啶核苷酸； d u m p ：脱氧尿嘧啶核苷酸；f a d ；黄素腺嘌呤二核苷酸：m t h f r ：亚甲基四氢叶酸还 原酶。 蛋氨酸合成酶( m c t h i o n i n cs y n t h a s e ，m s ) 以b 1 2 为辅酶，将同型半胱氨酸 ( h o m o c y s t e i n e ，h c ) 转化为蛋氨酸( m e t h i o n i n e ，m e t ) 。在b 1 2 缺乏或m s 缺 陷时，h c 循环和m e t s a m 合成受阻、5 一甲基四氢叶酸积累，最终有可能导致尿 嘧啶脱氧核苷酸( d e o x y t h y m i d i n e ，d u m p ) 积累并掺入d n a 。大量的d u m p 掺 入d n a ，可在继后的d n a 复制和修复过程中诱发基因突变、d n a 单双链断裂、 染色体的断裂等基因组稳定性下降事件 4 】；s a m 合成受阻可降低整体d n a 甲基 化程度，甚至改变细胞中的特异性甲基化模式，从而改变基因表达方式；d n a 甲基化水平的降低还可导致近着丝粒异染色质凝聚水平下降，从而在有丝分裂过 程中引起某些染色体分离异常1 5 , 6 】。 有关叶酸缺乏，与非整倍体的发生、癌症病变之间的关系还不明确，有待进 一步的研究，从营养学的角度，根锯正常的生理需要，通过饮食摄入调节提高基 因组稳定性，降低基因组合中环境易感成分的敏感性，这一课题是当今研究的热 点之一。本课题的研究者与c s i r o 阿得雷德营养健康科学中心合作开展研究， 云南师范大学硕士研究生毕业论文 从人体叶酸水平及相关代谢环节入手，探讨叶酸代谢与人类基因组稳定性之间的 关系，探讨叶酸代谢与非整倍体发生，乳腺癌病变之间关系，确定维护遗传稳定 性的最低叶酸、维生素b 1 2 浓度等方面的研究，在国内文献中未见报道。 本研究采用细胞胞质阻滞微核分析的实验方法。胞质阻滞微核( c y t o k i n e s i s b l o c km i c r o n u c l e u s ，c b m n ) 是生物体在染色体或分子水平检测基因组稳定性变 化的最好方案。在离体或活体实验中，它已成为进行评价人类外周血淋巴细胞 染色体损伤和丢失的最通用方法。f r e n c h 和m o r l e y 从1 9 8 5 年首次叙述了该方 法 2 4 , 2 5 , 2 7 , 3 0 】。许多研究人员都运用此方法研究和评估人类外周血淋巴细胞染色体 的损伤【2 8 l 。到现在为止这个方法已成为一个综合的方法，使用这个方法进行实 验可以获得以下基因突变( 染色体的断裂、染色体重组、染色体丢失、染色体 不分离、基因扩增、细胞坏死和细胞的凋亡) 各指标。本研究在以往工作的基 础上，确定了叶酸对维护人类淋巴细胞基因组稳定性的作用，并立足于叶酸代 谢中若干影响因素b 1 2 、m e t 缺乏对受试细胞株基因组稳定性的影响研究， 评价了m e t 及b 1 2 缺乏对b r c a 基因突变及正常人成淋巴细胞株遗传毒性效应。 此项研究对于理解饮食、微量营养素( m i c r o n u t r i e n t ) 与基因的相互作用模式、 建立科学的叶酸、b 1 2 与m e t 叶崖荐f = _ i 摄取量”( r e c o m m e n d e dd i e t a r ya l l o w a n c e s ) ， 通过饮食摄入环节提高基因组稳定性具有积极意义 1 6 。7 1 。 其中遗传损伤包括双核细胞微核( m n b n ) 、核质桥叫p b ) 、核芽( n b u d ) 和单核细胞微核( m n e dm o n o ) 。g i s s e l s o n 最近研究表明：( 1 ) n p b 、m n b n 、 n b u d 是癌细胞变化的常用指标：( 2 ) 这些异常核结构是由肿瘤细胞中的不稳 定双着丝粒或环状染色体形成。因此，n p b 、m n b n 、n b u d 、m n e dm o n o 等 异常的核形态是细胞基因组不稳定的重要指标。我们利用这些生物指标可以综 合确定叶酸、b 1 2 、m e t 缺乏对人类外周血淋巴细胞及人类成细胞株遗传稳定性 的影响。 m n b n 是由断裂的染色体片段或整条染色体在核分裂的后期滞后形成的 2 4 , 2 5 , 3 1 1 。对于遗传毒理学实验来说，m n b n 己成为检测某些化学试剂对人类细胞 遗传毒性的一个重要指标。培养中的细胞在加入胞质抑制剂细胞松弛素b ( c y t o c h a l a s i nb ，c b ) 后可使分裂中的细胞停留在双核阶段，这样可以防止细胞 分裂完成后，由于微核的丢失所导致假阴性结果，可提高实验的可靠性和灵敏性， 云南师范大学硕士研究生毕业论文 如图( c ，g ，i ) 所示。 n p b 是由于染色体重组形成的，所以在c b m n 实验中，双核细胞的n p b 也 应被记数。在细胞分裂的过程中，染色体发生异常重组，形成具有双着丝粒的染 色体。n p b 发生在细胞分裂后期双着丝粒染色体的着丝粒被拉向相反的两极时。 一般细胞很快通过后期和末期，从而完成有丝分裂，所以在核膜没有形成前一般 很少观察到双着丝粒染色体后期的桥，最终当子细胞形成，n p b 的桥也断裂了。 然而在c b m n 实验中，有丝分裂被抑制，核膜最终围绕在染色体上形成n p b ， 这样双核细胞中的n p b 可以计数下来。u m e g a k i ，k 在把人类w l l 2 - n s 细胞用 过氧化氢处理的实验中，就是将n p b 作为d n a 损伤生物标记物口o 】，如图( b ，h ) 所示。 n b u d 是由于基因的扩增而形成的【3 2 1 。s h i m i z u 的研究表明细胞核自主将扩 增的多余d n a 集中在细胞核边缘的某个点，然后以出泡外吐的形式形成一个包 裹扩增的多余d n a 的小核，最终排除细胞。n b u d 形成在细胞分裂的s 期，除 了与主核有狭窄的柄联系外，它和微核具有相同的形态【3 0 一”，如图( e ，0 所示。 de b 9 f 云南师范大学硕士研究生毕业论文 g hi 在一般的遗传毒性实验中对于问期细胞的制备或中期染色体分析，需要对 细胞迸行低渗处理，本实验没有采用常规的低渗方法，而是采用d m s o 低渗及 涂片的方法，来确保细胞遗传损伤时的各种形态。这些细胞形态的准确判定对遗 传损伤结果的确定具有非常重要的意义，他们可以精确的反映出细胞对化学物质 或辐射的反应和检测机理。 各个指标的形态学记数标准在f e n e c h 的文章中已做了详细的描述【弘矗3 ”。 本研究分为两部分：第一部分为叶酸缺乏诱发人类淋巴细胞遗传损伤；第二 部分为维生素b 1 2 与蛋氨酸缺乏诱发人类成淋巴细胞株遗传损伤的探索。 1 0 云南师范人学硕士研究生毕业论文 第一部分：叶酸缺乏诱发人类淋巴细胞遗传损伤 一、材料与方法 1 试验材料： 2 0 0 4 年6 月- 2 0 0 5 年1 月在昆明医学院第二附属医院胸心外科收治的，经病理检 查确诊为乳腺癌的患者共2 4 例，性别：均为女性，年龄为3 5 6 5 岁，未经化疗， 未额外补充叶酸；同时以该年龄段3 0 例正常女性为对照，血样取自昆明医学院 第二附属医院胸心外科收治经病理检查确诊为非乳腺癌患者及昆明市中心血站 正常自愿献血者。 2 试验试剂及配置： 叶酸、无叶酸r p m i 1 6 4 0 培养基、l 谷氨酰胺、细胞松弛素b 等购自s i g m a ( 目 录号分别为f 7 8 7 6 ，r 1 1 4 5 ，g 3 1 2 6 ，c 6 7 6 2 ) ，青霉素和链霉素( 哈药集团制药 总厂) 购自s i g m a ，常规r p m l l 6 4 0 购自g i b c o ，新生小牛血清购自杭州四季青 生物工程材料有限公司，透析小牛血清购自h y c l o n e ( s h 3 0 0 7 9 0 2 ) ，淋巴细胞 分离液购自上海华精生物高科技有限公司，白介素一i i ( 深圳新吉尔制药厂) ，肝 素( 1 2 5 0 0 单位) 购自上海生物化学制剂厂。 试剂配置： ( 1 ) r p m i 1 6 4 0 培养液 ( 2 ) 双抗 ( 3 ) 细胞松弛素b ( c b ) 配制 ( 4 ) p h a 储备液 ( 5 ) 白介素i i ( i l 一2 ，2 0 万单位) 储备液 ( 6 ) 肝素( 1 2 5 0 0 单位) ( 7 ) h a n k s 平衡液( h b s s ) 一 ( 8 ) 其他染料或试剂苔酚兰( o 4 ) ，g i e m m s a 染液( 7 ) ，磷酸缓冲液，甲醇 冰醋酸( 3 ：1 ) 固定液，树胶，二甲苯，淋巴细胞分离液 3 主要仪器设备 ( 1 ) m c o 一1 5 a c 型二氧化碳培养箱，上海三洋 ( 2 ) n i k o n 光学显微镜，江南光学仪器公司日本n i k o n 显微镜中国代理 ( 3 ) s w c j 医用型洁净工作台，中日合资苏州安泰空气技术有限公司制造 云南师范大学硕十研究生毕业论文 4 m a r k e r 终浓度 u 1 0 m l所需储备液的量 配制体积( m 1 )6 0 无叶酸r p m i1 6 4 0 培养液( m 1 ) 透析小 青( m 1 ) l 一锌氮酰胺储备液浓度：2 0 0 r a m 终浓度：0 3 m g m l 双抗储备液浓度1 0 0 0 0 0 u m l 终浓度：1 0 0 u m l i l r 一2 纰斋液浓度1 0 0 0 0 u m 1 终浓度：i o u m l 5 7 3 0 6 0 0 6 0 0 6 第二天 4 3 淋巴细胞分离方法 ( 1 )耿血样：取6 毫升人静脉血于干净无菌有肝素的试管中，从中分出l 毫升 留做抽d n a 。 ( 2 )稀释血样：5 毫升人静脉血加等量的h b s s 液混合均匀。 ( 3 )分离淋巴细胞：另取两干净无菌的离心管，每管加入2 毫升淋巴细胞分离 液，将5 毫升稀释血样用吸管沿离心管壁缓慢的加入铺在淋巴细胞分离液 表面，使血液与淋巴细胞分离液形成明显的分离界面，盖紧离心盖( 淋巴 细胞分离液体积；稀释血样体积= l ：2 5 ) 。 2 云南师范大学硕士研究生毕业论文 ( 4 )离心：平衡离心管，2 0 0 0 r m i n ，离t l , 3 0 分钟，离一1 1 , 完小一1 1 , 的取出离- 1 1 , 管。 ( 5 )转移细胞：用t i p 轻轻的伸入淋巴细胞分离液层面将细胞液吸出，移入另 一离心管中。 ( 6 )离心i 室温下加入细胞液体积3 倍的h b s s ，混匀，1 0 0 0r m i n ，1 0 m i n ， 弃上清。 ( 7 )清洗离心：再加入细胞液体积2 倍的h b s s ，混匀，1 0 0 0r r a i n ，1 0 m i n ，弃 上清。 ( 8 )细胞记数：弃上清，往沉淀中加入0 3 m l 的无叶酸的r p m i 1 6 4 0 培养基， 混匀根据记数结果来确定细胞培养体积( 通常淋巴细胞培养需要的淋巴细胞的浓 度为o 5 x 1 0 6 c e l l m 1 ) 将细胞混合液平分到三个培养瓶中。然后加入所需各自叶 酸浓度的培养液。 细胞记数方法：2 0 u l 的细胞悬浮液转入0 5 m l e p 管中，再取2 0 u l 的o 4 苔酚兰 加至e p 管中放置2 分钟，取2 0 u l 的混合液滴加到血球记数板与盖片之间的缝隙 中，让细胞自由扩散进去，显微镜下记数，一般记数5 个中格的活细胞数( 死细 胞己染成兰色，活细胞不着色) 细胞总数= 5 x 2 5 x 2 x 1 0 4 x v ( v e p 管中细胞悬浮液的体积) 活细胞率b = a 中活细胞数a e p 管中活细胞总数= b x 细胞总数 记录数据 4 4 细胞培养 ( 1 )加p h a ：根据细胞培养瓶中培养基的体积分别加入p h a ( 1 0 u l m 1 ) 。 ( 2 )细胞培养：5 c 0 2 ，3 7 0 c ，恒湿，培养瓶的盖子拧松。 第四天和第七天 4 5 记数 将培养瓶中的细胞液混匀，吸取1 0 u l 细胞混合液，和前面的记数方法样。 4 6 换培养基 ( 1 ) 将培养瓶中的细胞转移至干净的离心管中，混匀，1 0 0 0 r p m ，离心1 0 m i n ， 取原培养液体积的5 加入原培养瓶中，弃上清。根据记数结果，按照 o 5 x 1 0 6 c e l l m l 的比例加入新鲜培养液，将细胞转移至原培养瓶中继续培养。 云南师范大学硕士研究生毕业论文 ( 2 )在第七天时和第四天一样的方法换培养基，第四天要向培养基中重新加入 白介素i i ，而第七天不加。 第九天 4 7 准备c b 4 8 将各培养瓶中加入c b ，使终浓度为4 5 u g m l 。 第十天 4 9c b 培养2 8 小时，收获细胞。 操作方法： ( 1 ) 配制：配制含有7 的d m s o ( 不含d m s o 的体积) 的5 0 0 u l 小牛血清。 ( 2 ) 离一队将培养好的各管细胞转移至离一心管中混匀，1 0 0 0 p r m ，5 r a i n 的条件下 离心，弃上清液，根据细胞沉淀量加2 0 3 0 u l 小牛血清。 ( 3 ) 静置：混匀细胞液，室温下放置5 m i n 。 ( 4 ) 涂片：吸取5 u l 的细胞液于干净的载玻片上进行涂片。 ( 5 )干燥：涂片后的载玻片在2 5 0 c 下干燥2 h 。 ( 6 ) 固定：将载玻片进行固定，将片子放入甲醇：冰醋酸( 体积比为3 ：1 ) 固 定2 0 m i n ，空气干燥。 ( 7 ) 染色：干燥的片子放入5 g i m m s a 染液中染色。 ( 8 ) 透明：干燥的片子用二甲苯透明处理5 m i n ，然后利用中性树脂封片。 ( 9 ) 显微镜1 0 0 倍镜下进行c b m n 各项指标记数。 c 1 3 m na s s a y 03689 一d a y 5 试验指标 计数1 0 0 0 1 5 0 0 个双核细胞中的m n b n 、n p b 、n b u d 细胞，每一浓度不少于 5 0 0 0 个双核细胞，分析m n b n 、n p b 、n b u d 频率；计数5 0 0 个单核细胞中的 微核细胞，分析m n e dm o n o 频率。 6 统计学方法 不同浓度之间各项指标问的比较选用s p s s l 2 0 ，a s o v a ， 4 云南师范大学硕士研究生毕业论文 c o r r e l a t e ，i n d e p e n d e n t s a m p l e stt e s t 统计学方法，作图选用s p s s l 2 0 s i g m a p l o t 8 0 。 1 5 云南师范大学硕士研究生毕业论文 二、试验结果 试验结果见表一至十，图一至十二 1 叶酸缺乏诱发正常人淋巴细胞遗传损伤： ( 1 )叶酸浓度在3 0 n m 时，m n b n 显著高于1 2 0 n m 及2 4 0n m ( 口 o 0 0 1 ) ；n p b 显著高于1 2 0 n m 及2 4 0 n m ( p 0 0 0 1 ) ；n b u d 显著高于1 2 0 n m 及2 4 0 n m ( p 0 0 0 1 ) ；m n e di l l o n o 显著高于1 2 0 n m 及2 4 0 n m ( p 0 0 0 1 0 0 5 ) ，而1 2 0 n m 及2 4 0 n m 两测试组之间各指标均具有一定差异但无统计学意义，在本试验条件 下，1 2 0 n m 的叶酸是正常人类淋巴细胞防范遗传损伤的最低浓度。 ( 2 )叶酸浓度与正常对照个体淋巴细胞遗传损伤之间存在显著的负相关 ( f 0 2 4