（环境科学专业论文）分子发光光谱在重金属分析中的研究及其应用.pdf

荧光猝灭而a s ( v ) 与钼酸铵的加入使得罗丹明b 的荧光强度减弱并且a s ( v ) 的加入量与体系的f 。f 呈良好的线性关系，由此建立了一种新的测定痕量的 a s ( v ) 的方法。研究结果表明，a s ( v ) 的含量在0 0 2 1 0 m l 范围内与染料 的荧光强度减弱程度呈良好的线性关系，方法最低检出限为1 2 5 n g m l ；该法 用于合成样和食品中a s ( v ) 的测定，回收率为9 6 1 0 5 。 本文以曙红y 和罗丹明b 染料对的荧光共振能量转移现象为基础，在该体 系中加入汞离子，发现在加入汞离子后曙红y 和罗丹明b 的荧光强度都明显降 低，且汞离子的加入量与曙红y 和罗丹明b 体系的荧光猝灭程度呈良好的线性 关系据此提出了曙红y 和罗丹明b 能量转移体系测定汞离子的新方法。实验 表明，在入e x 入e l i l = 4 8 0 5 3 0l l m ，0 1 m o l l 的h c l 溶液存在下，曙红y 和罗 丹明b 能够发生有效的荧光共振能量转移。汞含量1 0 i - t g m l - - 4 0 p g m l 的范围 内与体系猝灭程度呈良好的线性关系，方法的最低检出限为9 8 n g m l 应用该 体系测定了含汞废水中的汞离子含量，回收率达到9 6 5 - - 1 0 4 。 本文采用共振光散射比浊法建立了测定痕量银离子的分析方法研究结果 表明，空白液本身共振光散射微弱，一旦形成氯化银胶体溶液，共振光散射强 度显著增加。在入e x = 入e m = 5 1 0n l t l 波长下，0 - - 1 4p g m l 范围内共振光散射强 度与银离子浓度呈线性关系，检出限为0 0 4p g m l 。由此本文建立了一种共振 光散射比浊法测定银离子的新方法，同时也从理论上探讨了无机难溶盐形成胶 体溶液产生r l s 现象的机理。 本文运用分子荧光光谱法的荧光猝灭理论初步探索了重金属离子与生物 大分子结合反应的化学机理，为金属毒理分析做了一些基础研究工作，为寻找 测定重金属离子的光谱探针提供了理论依据。同时本文还研究了荧光共振能量 转移光谱法和共振光散射光谱法在重金属测定中的应用，本文建立的这些新方 法灵敏度高、选择性好、简便快速，成本低廉，具有实际应用价值，同时也对 新方法的作用机理进行了探讨。 关键词：分子发光光谱；分子荧光光谱法；荧光猝灭；荧光共振能量转移 光谱法；共振光散射光谱法；共振光散射比浊法；荧光素；罗丹明b ；曙红y ； 牛血清白蛋白；铅；一汞；砷；银； s t u d ya n da p p l i c a t i o n o nm o l e c u l a rl u m i n e s c e n t s p e c t r o s c o p y i nh e a v ym e t a l a n a l y s i s m a j o r ：e n v i r o n m e n t a ls c i e n c e p o s t g r a d u a t e ：m il a n t u t o r ：l is h u w e i i nr e c e n ty e a r s ，t h ep r o b l e mo fh e a v ym e t a lp o l l u t i o nc a u s e dg r e a tc o n c e r ni n a l lc o u n t r i e si nt h ew o r l di nt h ef i e l do fe n v i r o n m e n t a ls c i e n c e ，a n dt h ee l i m i n a t i o n o fh e a v ym e t a lc o n t a m i n a t i o no ft h ei n c r e a s i n g l yi n - d e p t hr e s e a r c hw o r kc a r r i e d o u t s c i e n t i s t sa l lo v e rt h ew o r l da r ee x p l o r i n gv a r i o u sw a y st od e a lw i t has e r i e so f h e a v ym e t a lp o l l u t i o no f t h eh a z a r d s t h ec h e m i s t r ym e c h a n i s ma n dp r o c e s so ft h er e a c t i o nb e t w e e nt h eh e a v y m e t a li o na n db i o l o g i c a lm a c r o m o l e c u l e sw e r er e s e a r c h e dt h r o u g ht h r e ek i n d m o l e c u l a rl u m i n e s c e n c e s p e c t r a - 一m o l e c u l a r f l u o r e s c e n c e s p e c t r o s c o p y , f l u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e rs p e c t r o s c o p y , r e s o n a n c el i g h ts c a t t e r i n g s p e c t r o s c o p y ，t h et h e o r e t i c a ld a t ao ft h ec o m b i n a t i o nb e t w e e nh e a v ym e t a li o n sa n d p r o t e i nc a nb eo b t a i n e db yt h ee x p e r i m e n t s n e wa n a l y t i c a l m e t h o d sw a s e s t a b l i s h e dt h r o u g ht h eb i n d i n gp r o p e r t i e so ft h eh e a v ym e t a l sa n dm o l e c u l a r l u m i n e s c e n c es p e c t r ao ft h ep r o b e t h e s em e t h o d sa n dt h ee s t a b l i s h m e n to ft h e t h e o r e t i c a ls y s t e mw a si m p o r t a n td a t a sf o re n v i r o n m e n t a ls c i e n c ea n dt h es t u d yo f h e a v ym e t a lc o n t a m i n a t i o n ，s o m eb a s i cr e s e a r c hw o r kw a sd o n et h r o u g ht h e c r e a t i o no f n e wa n a l y t i c a lm e t h o d sf o re n v i r o n m e n t a lm o n i t o r i n go f h e a v ym e t a l s t h i sa r t i c l eh a ds t u d i e db i n d i n gf e a t u r eb e t w e e nt h eh e a v ym e t a ll e a di o na n d t h eb o v i n es e r u l na l b u m i n s b yf l u o r e s c e n c eq u e n c h i n gt h e o r yo f m o l e c u l a r f l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p y t h er e s u l ts h o wt h a ti th a sn of l u o r e s c e n c ew h e nl e a d i o ne x i s t sa l o n e l y b u tu n d e rb s ad e n s i t yc e r t a i nc o n d i t i o n ，a l o n gw i t hl e a di o n d e n s i t yi n c r e a s e ，t h ee n d o g e n o u sf l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo fb s ad e p r e s so r d e r l y , l e a di o na n db s af o r mt h ec o m p l e xt oc a u s et h ef l u o r e s c e n c eo fb s at oq u e n c h ， t h i sk i n do ff l u o r e s c e n c eq u e n c h i n gw h i c hl e a di o na n db s a b l i n dm u t u a l l yi st h e s o l ef l u o r e s c e n c es t a t i c q u e n c h i n gp r o c e s s a n dl e a di o nj o i n e dh a sc a u s e dt h e b s ac o n f o r m a t i o nc h a n g e t h eb i n d i n gn u m b e r ( n = 1 3 6 6 ) ，e q u i l i b r i u mc o n s t a n t ( k a 2 2 0 7 x 1 07 l m o l - 1 ) ，t h eb i n d i n gd i s t a n c e ( r - - 2 1l n m ) o fl e a di o nt ot h eb o v i n es e r u m a l b u m i n sw e r eo b t a i n e d an e wm e t h o df o rt h ed e t e r m i n a t i o no ft r a c ea s ( v ) w a sd e v e l o p e db yu s i n g e n e r g yt r a n s f e rf r o mf l u o r e s c e i nt or h o d a m i n eb i tw a sf o u n dt h a ta tt h e c o n d i t i o no f 沁x ) , e m = 4 5 0 n m 5 9 0 n ma n d1 0 m o l lh 2 s 0 4 ，t h ee f f e c t i v ee n e r g y t r a n s f e rc o u l do c c u rb e t w e e nf l u o r e s c e i na n dr h o d a m i nb t h ef l u o r e s c e n c e i n t e n s i t yo ff lw a sr e d u c e da n dr h bw a ss t r e n g t h e na tt h es a m et i m e b u ti fa d d t h ea s ( v ) t ot h i ss y s t e m ，b o t ht h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t i e so fr h bw a sr e d u c e d s o t h i s s y s t e mo ff l u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e rw a sa p p l i e dt ot h e d e t e r m i n a t i o no fa s ( v ) t h ed e t e c t i o nl i m i to ft h i sm e t h o dw a s1 2 5 n g m 1 t h e r a n g e o fd e t e r m i n a t i o nf o rn i t r i t ew a so 0 2 10 i _ t g m l t h er e c o v e r i e sw e r e 9 6 一10 5 t h em e t h o dh a sb e e na p p l i e dt ot h ed e t e r m i n a t i o no fa s ( v ) i nm i x e d s a m p l e sa n dt h ef o o dw i t hs a t i s f a c t o r yr e s u l t s b a s e do nt h ep h e n o m e n o no fe n e r g yt r a n s f e ro ft h ee o s i ny a n d r h o d a m i n eb ，i t w a sf o u n dt h a tb o t ho ft h ee ya n dr h b sf l u o r e s c e n c ei n t e n s i f i e sa p p a r 朗t l yf e l ld o w n a f t e ra d d i n gt h em e r c u r yi o ni n t ot h ee n e r g yt r a n s f e rs y s t e m ，a n dt h ea d d i t i o no f m e r c u r yi o nh a sa9 0 0 dl i n e a rr e l a t i o n s h i pw i t ht h es y s t e m sf l u o r e s c e n c eq u e n c h i n g d e g r e e ，w h i c hc o u l ds e tu pan e ww a yt od e t e r m i n et h em e r c u r yi o n i nt h ec o n d i t i o no f 沁x t t e m = 4 8 0 n m 5 3 0 n m ，0 1 m o l lh c l ，t h ee f f e c t i v ee n e r g yt r a n s f e rc a l lo c c u rb e t w e e n e ya n dr h b ，t h ee x p e r i m e n ts h o w e dt h a tt h em e r c u r yi o nh a sag o o dl i n e a r r e l a t i o n s h i pw i t hq u e n c h i n go ft h es y s t e mw h i l et h ec o n c e n t r a t i o no ft h em e r c u r yi o n w a s1 0 m g l t o4 0 m g l ，a n dt h el i m i to fd e t e r m i n a t i o ni s 9 8 n g m l t h em e r c u r y i o nc o n t e n th a sb e e nd e t e r m i n e db yt h i ss y s t e mi nt h em e r c u r yw a s t ew a t e r t h e r e c o v e r i e sw e r e9 6 5 10 4 t h i sa r t i c l ed e t e r m i n a t e ss i l v e ri o n sb yr e s o n a n c el i g h ts c a t t e r i n gt u r b i d i m e t r y i ti sf o u n dt h a tt h er e s o n a n c el i g h ts c a t t e r i n go ft h eb l a n ki s w e a k ，h o w e v e r , o n c ei t b e c o m e ss i l v e rc h l o r i d ec o l l o i dl i q u i d ，t h er e s o n a n c el i g h ts c a t t e r i n gi n c r e a s e e s o b v i o u s l y i nt h e c o n d i t i o no f x = k e m = 51 0 n m , 0 1 4l a g m l ，r e s o n a n c el i g h t s c a t t e r i n gi n t e n s i t yh a st h el i n e a rr e l a t i o n s h i pw i t ht h ec o n c e n t r a t i o no f s i l v e ri o n s a n dt h ed e t e c t i o nl i m i ti so 0 4l l g m 1 t h e r e f o r et h ea u t h o re s t a b l i s h e das y s t e mf o r d e t e r m i n i n gs i l v e ri o n sa n ds t u d yt h et h e o r yo fr l so nc o l l o i dl i q u i do fi n o r g a n i c i n s o l u a b l es a l t t h ec h e m i s t r ym e c h a n i s mo ft h er e a c t i o nb e t w e e nt h eh e a v ym e t a li o na n d b i o l o g i c a lm a c r o m o l e c u l e sw a si n s p e c t e db yf l u o r e s c e n c eq u e n c h i n gt h e o r yo f f l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p y , w h i c hi st h eb a s i c a lr e s e a r c ho ft h em e t a lt o x i c o l o g i c a l a n a l y s i sa n dt h et h e o r e t i c a lb a s i sf o rt h es p e c t r u mp r o b ed e t e r m i n e dt h eh e a v y m e t a li o n s i m u l t a n e o u s l y , t h ea r t i c l eh a da l s os t u d i e dt h es p e c t r o m e t r yo f f l u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g yt r a n f e ra n dt h er e s o n a t i n gl i g h ts c a t t e r i n gi nt h e h e a v ym e t a ld e t e r m i n a t i o na p p l i c a t i o n t h e s en e wm e t h o d sh a v et h ep r a c t i c a l a p p l i c a t i o nv a l u ew h i c ha l es e n s i t i v e ，w e l l s e l e c t i n g ，c o n v e n i e n t ，i n e x p e n s i v e t h e m e c h a n i s mo ft h en e wm e t h o d sw a sa l s os t u d i e d k e yw o r d s ：m o l e c u l a rl u m i n e s c e n ts p e c t r o s c o p y ；m o l e c u l a r f l u o r e s c e n c e s p e c t r o s c o p y ；f l u o r e s c e n c eq u e n c h i n g ；f l u o r e s c e n c e r e s o n a n c e e n e r g y t r a n s f e r s p e c t r o s c o p y ；r e s o n a t i n gl i g h ts c a t t e r i n g s p e c t r o s c o p y ；r e s o n a t i n gl i g h ts c a t t e r i n g t u r b i d i m e t r y ； flu o r e s c e i n ( f l ) ；r h o d a m i n eb ( r h b ) ；e o s i ny ( e ；b o v i n es e r u m a l b u m i n ( b s a ) ；l e a d ；m e r c u r y ；a r s e n i c ；s i l v e r 四川师范大学学位论文独创性及 使用授权声明 本人声明：所呈交学位论文，是本人在导师奎挝焦指导下，独立 进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何 其他个人或集体已经发表或撰写过的作品或成果。对本文的研究做出重要贡献 的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本人承诺：已提交的学位论文电子版与论文纸本的内容一致。如因不符而 引起的学术声誉上的损失由本人自负。 本人同意所撰写学位论文的使用授权遵照学校的管理规定： 学校作为申请学位的条件之一，学位论文著作权拥有者须授权所在大学拥 有学位论文的部分使用权，即：1 ) 已获学位的研究生必须按学校规定提交印 刷版和电子版学位论文，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库供 检索；2 ) 为教学、科研和学术交流目的，学校可以将公开的学位论文或解密 后的学位论文作为资料在图书馆、资料室等场所或在有关网络上供阅读、浏览。 论文作者签名：末兰 2 0 0 8 年4 月1 日 1 前言 人类已经发现的1 1 0 种化学元素中，金属元素占了8 0 余种，其中重金属 占有很大的比例。近年来，随着科技的进步和经济的发展，人类对自然金属资 源特别是重金属资源的需求日益增大，应用领域也不断扩大，重金属在我们的 日常生活中扮演着越来越重要的角色，同时也对人类赖以生存的环境带来了严 重的威胁，成为环境科学研究的重要内容。迄今为止，重金属尚没有严格的统 一定义，在环境科学领域重金属主要是指汞、镉、铅、铬以及砷等生物毒性显 著的元素。 随着人类对重金属的需求增大，重金属相关的开采、冶炼、加工及商业制 造活动相应增多，这势必造成不少重金属进入大气、水、土壤，引起严重的环 境污染。这些有毒的重金属不能被生物降解，相反却能在食物链的生物放大作 用下，成千百倍地富集，最后进入人体。重金属在人体内能和蛋白质及酶等发 生强烈的相互作用，使它们失去活性，也可能在人体的某些器官中累积，造成 慢性中毒。以不同的化学形态存在的重金属，进入水环境后的危害最为严重， 这些重金属元素在水体中存留、积累和迁移，对自然界的生物造成极大的危害。 例如随废水排出的重金属进入水体，即使其含量极低，也可在藻类和底泥中积 累，被鱼和贝类的体表吸附，产生食物链浓缩现象，最后进入人体，在人体的 某些器官中累积，造成慢性中毒，轻则发生j 陉病，重则引起死亡。五六十年代 发生在日本的水俣病和痛痛病就是典型的例子。 当今环境科学领域里对有毒重金属作用机理的研究日益深入，对于重金属 在人体中代谢作用的机理研究和毒理学研究近年来不断深入。研究重金属的危 害，就要研究重金属产生污染的原因，研究重金属污染过程中所表现出来的特 点，研究在人体的代谢过程，研究重金属对生物作用的毒理。以便我们在治理 重金属污染时“对症下药，重金属在污染过程中具有以下一些特点： ( 1 ) 重金属除被悬浮物带走以外，还会因吸附沉淀作用而富集于排污口附 近的底泥中，成为长期的次生污染源。 ( 2 ) 水中各种无机配位体( 氯离子、硫酸离子、氢氧离子等) 和有机配位体 ( 腐蚀质等) 会与重金属生成络合物或螯合物，导致重金属有更大的水溶解度而 使已进入底泥的重金属又可能重新释放出来。 ( 3 ) 重金属的价态不同，其活性与毒性不同。重金属的化学形态又随p h 和氧化还原条件变化而变化。 ( 4 ) 重金属在其危害环境方面的特点是：微量浓度的重金属即可产生毒性 ( 一般为1 1 0 毫克升，汞、镉为0 0 1 - - - 0 0 0 1 毫克升) ，某些重金属经微生 物作用会转化为毒性更强的有机金属化合物( 如甲基汞) ，这些毒物可被生物富 集，通过食物链进入人体，造成慢性中毒。亲硫重金属元素( 汞、镉、铅、锌、 硒、铜、砷等) 与人体组织某些酶的巯基( 一s h ) 有特别大的亲合力，能抑制酶的 活性。亲铁元素( 铁、镍) 可在人体的肾、脾、肝内累积，抑制精氨酶的活性。 六价铬可能是蛋白质和核酸的沉淀剂，可抑制细胞内谷胱甘肽还原酶，导致高 铁血红蛋白，可能致癌，过量的钒和锰( 亲岩元素) 则能损害神经系统的机能。 铅是一种广泛存在于生活环境的重金属，从开采到成品使用，与之相关的 应用领域非常广泛，含铅汽油、护肤美容品及建筑业中的油漆涂料和食品加工 业的防腐剂等方面也都使用铅。铅一般经呼吸道、消化道及皮肤进入人体，因 其对人体组织有广泛的亲和力，几乎可以损害所有的器官，其中大脑和肾脏受 害最重。此外，铅还可能是一种致癌物质，根据对铅的致癌性动物实验和人群 研究，美国环保局认为铅是“可能的人类致癌物。 铬是人体必需的微量元素，它与脂类代谢有密切联系，能增加人体内胆固 醇的分解和排泄，是机体内葡萄糖能量因子中的一个有效成分，能辅助胰岛素 利用葡萄糖。如食物不能提供足够的铬，人体会出现铬缺乏症，影响糖类及脂 类代谢，但大量的铬污染环境，则会危害人体健康。铬中毒主要是指六价铬， 是人们饮用被含铬工业废水污染了的水源从而大量摄入铬在体内造成明显的 蓄积。铬为皮肤变态反应原，可引起过敏性皮炎或湿疹，湿疹的特征多呈小块， 钱币状，以亚急表现为主，呈红斑、浸润、渗出、脱屑、病程长，久而不愈。 镉是一种毒性很大的重金属，其化合物也大都属毒性物质。极微量的镉就 可对人体造成伤害，1 9 9 3 年世界肿瘤研究机构( i a r c ) 将镉定义为人类致癌 物。目前镉对环境的污染己引起普遍关注。镉是一种银白色的金属，质地柔软， 富有延展性，抗腐蚀、耐磨，稍加热易挥发，镉属于稀有金属被广泛应用于电 镀、汽车及航空、颜料、油漆、印刷等行业，由于镉应用范围广，消费方式的 多样化，增加了对环境污染的机会，使控制镉污染成为全社会的综合问题。镉 2 中毒主要表现为肺水肿、肺气肿，呼吸困难，还可引起贫血以及致癌、致畸等， 骨软化、骨质疏松是其最显著的毒效应。资料表明，人体内镉的生物学半衰期 为2 0 - - 4 0 年，非常稳定，目前也没有特异药物清除体内的镉，镉中毒的治疗 极为困难。 汞是常温下惟一以液态形式存在的金属，由于它的特殊物理性质，表现 出易蒸发、吸附性强、容易被生物体吸收等特性。汞可能通过皮肤和呼吸道被 吸收进人体，对人体产生极大的危害，长期接触可导致中枢神经系统损伤，患 者大多会出现不同程度的神经衰弱症状，严重者可致性格改变、口腔炎和双手 震颤等症状。二十世纪5 0 年代，日本水俣市发生了震惊世界的水俣病事件， 使当地许多居民都患了运动失调、四肢麻木、疼痛、畸胎等症状，而且这种病 还能遗传给子女。 环境中的砷常以化合物形式存在，常见的有三氧化二砷，易溶于水，剧 毒。人类的活动和岩石的自然风化，使砷引入环境中。随着现代环境科学、毒 物学对砷的毒性研究的不断深入，人类对其危害的了解越来越多，对砷在环境 中的存在量以及污染源的管理和控制越来越重视。伴之而来的是对人类生活环 境和人类生产活动中的砷进行实时监测的要求越来越高。特别是食品和环境水 体中对砷含量的容许极限浓度做了严格规定，由食品卫生和环境监测部分负责 对各类食品、各种环境水体中砷的含量进行监测。水体中砷含量一旦超标，将 成为潜在的公共卫生问题。人群通过饮水、空气或食物长期摄入过量的砷而导 致的慢性中毒。中毒对人体的损害，除皮肤角化、肝脏受损外，还会造成肺、 肾、心血管、眼部等多脏器严重疾患。 国家环保总局将重金属的监测列为环境监测的重要项目“峭，对这些威胁 人类健康的有毒物质的排放作了严格的规定( g b t 1 8 9 1 8 ) ( 见下表) 表1 重金属排放量及中毒症状 重金属排放标准人体主要储存部位 中毒症状 缺铁性贫血、语言和听力障碍、呕吐、 p b 1 0 0 ( h n g k g 骨骼 腹痛等病症 腹部不适及腹泻、过敏性皮炎或湿疹、 c r 1 0 0 0 m g k g皮肤、肠胃 鼻炎、咽炎、支气管炎 3 血尿、骨质疏松、脱钙、骨质软化、肺 c d 2 0 m g k g 肾脏、骨骼 水肿、肺气肿、致癌、致畸 肝、肾、大脑；长时间 h g2 5 m g k g 呕吐、眩晕、心血管疾病、骨质疏松症 后还会进入骨头或牙齿 肺、肾、心血管、眼部等多脏器严重疾 a s7 5m g k g 肝、肾、皮肤 患、皮肤角化、肝脏受损 本论文的研究工作是使用多种分子发光光谱来表征重金属及其结合物的 特性，重点在于环境中的重金属残留的检测和体内的重金属与蛋白质的相互作 用机理这两方面。研究工作的意义在于，深入探讨重金属的毒理特征才能更好 的有效的破坏重金属与蛋白质的结合，使重金属中毒的危害达到最小。这是目 前环境分析化学必须着力解决的关键问题。同样重要的是提出痕量重金属的新 的检测方法。 分子发光光谱是- - i 1 发展迅速、应用广泛、多学科综合性的光谱技术，其 包括分子荧光、分子磷光、化学发光、生物发光等光谱技术。它在结构化学、 化学动力学、光化学、生命科学以及医学的研究和发展中起着重要作。在冶金 分析、生物工程、环境监测、食品检验、医学检测和药物分析等领域都有实际 的应用。八十年代以来，分子发光光谱发展非常迅速，因其具有灵敏度高、选 择性好、简便快速等优点已成为重要的分析手段。九十年代中期，荧光共振能 量转移光谱法、共振光散射光谱法相继被应用于环境分析中来，得到了很多污 染物质测定的重要方法。1 9 9 9 年本实验室结合比浊法和共振光散射光谱法的 基本原理，提出了一种用共振光散射技术作为检测手段的新光谱分析方法一共 振光散射比浊法，丰富了分子发光光谱的研究内容。 本课题将分子发光光谱法用于重金属与蛋白质的结合反应机理和重金属 检测的研究就是在这样的背景下提出来的。本文的研究目的有四个：第一，探 索重金属离子与生物大分子结合反应的作用机理，探索重金属元素在人体代谢 过程的作用机理，为重金属的毒理作用进行一些基础研究。第二，寻找追踪重 金属离子在生物体内活动的生物探针，为重金属离子的测定方法提供一些理论 依据。第三，筛选并建立新的由荧光给体和荧光受体组成的荧光共振能量转移 4 对，利用现有的有机染料试剂的化学特性，拓展荧光共振能量转移光谱法的应 用范围并将其用于重金属的测定。第四，扩大共振光散射光谱法的应用领域， 寻找新的共振光散射光谱探针，用该技术建立可行的新方法并将新方法用于重 金属分析中。为了实现以上四个目标，本文作了如下研究工作。 本文研究了重金属铅离子与牛血清白蛋白( b s a ) 之间的结合反应，讨论 了铅离子的加入使b s a 荧光猝灭的机理，研究了b s a 构象的变化，得到了b s a 与铅离子的结合数、平衡常数、结合位点、作用距离等数据，为探寻重金属离 子在生物体内的毒理过程提供了一定的理论依据。 其次，筛选了新的荧光共振能量转移染料对荧光素一罗丹明b 和曙红y 一 罗丹明b ，使用这些染料对分别建立了测定痕量的a s ( v ) 和痕量汞离子的新方 法。尽管目前测定砷和汞的方法很多，例如紫外可见分光光度法、色谱法、原 子吸收法、极谱法等。应用荧光共振能量转移体系来测定砷和汞仍具有灵敏度 高、选择性好、简便快速的优点。 本文还采用共振光散射比浊法测定了痕量银离子，同时也从理论上探讨了 无机难溶盐形成胶体溶液产生r l s 现象的机理，这种方法大大降低了重金属银 的检出限，提高了荧光法在重金属分析中的灵敏度。 本课题将分子发光光谱的几种手段应用到生物分析和环境分析领域，解决 了一些重要的分析中的问题，展现了良好的发展前景。 5 2 概述 2 1 重金属污染与检测技术概述 2 1 1 重金属概述及其分析检测技术概况 2 1 1 1 重金属概述 化学科学中的重金属通常指比重大于4 或5 的金属，约有4 5 种，如铜、 铅、锌、铁、钻、镍、锰、镉、汞、钨、铝、金、银等。有些重金属是生命活 动所需要的微量元素，但是大部分重金属如汞、铅、镉等并非生命活动所必须， 而且所有重金属超过一定浓度都对人体有毒害作用。 2 1 1 2 重金属分析监测技术发展概述 痕量铬的测定：铬一直是环境监测的一项重要指标，水环境中铬的浓度一 般在瞻几级甚至更低。六价铬具有毒性，对人体健康有明显危害，被毒理学 家公认为致癌物，因此建立具有较高灵敏度和较好选择性的分析方法具有现实 意义。到目前为止，已报道了许多测定c r ( v i ) 的方法，主要有共振光散射 光谱法 4 - 1 f l 、化学发光法n 纠舶。动力学光度法n 蛐妇等，但上述方法中有的灵 敏度不高；有的试剂选择性较差；有的所需仪器设备复杂。 痕量汞的测定：汞及其化合物属于剧毒的环境污染物质，可以通过食物链 在人体内蓄积。进入人体的无机汞可转变为毒性更大的有机汞，引起全身中毒， 天然水中含汞极少，一般不超过0 1 p g l 。仪表厂、食盐电解、贵金属冶炼等 废水中可能存在汞，汞对人体产生的危害是不容忽视的，因此汞是环境监测 中的一项重要指标瞄引。目前用于汞的测定方法主要有原子吸收法“p 趵、原子 荧光法2 副、动力学光度法泓喇1 等。前两种方法测定的精密度较差，且需要 专门的仪器；双硫腙分光光度法的试剂配制复杂，且需要进行萃取，手续繁琐， 干扰较多。 痕量镉的测定：镉是重要的工业和环境污染物，主要来源于锌、铜、铅矿 的冶炼及其电镀、蓄电池、合金、油漆和塑料等工业生产，具有致癌、致畸和 致突变作用副。因此，镉的分析监控十分重要。目前，痕量镉的分析方法主要 有：原子吸收分光光度法铲。、原子荧光光度法曲“。剐和共振光散射光谱法 6 l 5 5 - 5 7 j ，但这些方法的灵敏度和精密度都不是很高，建立新的分析方法自然是该 领域内的重要研究课题。 痕量铅的测定：铅是一种具有强神经毒性的重金属元素，并且对人体健康 有害，也是造成环境污染的重要的污染物。目前测量微量铅的方法很多：原子 吸收法勰6 ，双硫腙分光光度法6 2 瑚3 ，电位滴定法睁70 | ，化学动力学分析法 口、共振散光射光谱法口h 制，同样这些方法需要专门的仪器而且灵敏度和精 密度都不高。 2 1 2 重金属对自然环境的影响 重金属元素由于某些原因未经处理就被排入河流、湖泊或海洋，或者进入 了土壤中，使得这些河流、湖泊、海洋和土壤受到污染。它们不能被生物降解， 相反却能在食物链的生物放大作用下，成千百倍地富集，如鱼类或贝类积累重 金属，或者重金属被稻谷、小麦等农作物所吸收，最后进入人体。 重金属在人体内能和蛋白质及酶等发生强烈的相互作用，使它们失去活 性，也可能在人体的某些器官中累积，造成慢性中毒，轻则发生怪病，重者就 会死亡。 大多数重金属对水生生物有毒效作用，有些水生生物能富集重金属，人类 如长期食用这类富集重金属的水产品，将引发各种疾病。全世界有名的“公害 病水俣病和痛痛病，就是分别由汞和镉引起的。 日本的水俣病，产生于烧碱制造工业排放的废水中含有的汞，在经生物作 用之后，这些无机汞变成有机汞后造成的。痛痛病，则是由含镉的矿山废水污 染了河水及河两岸的土壤、粮食、牧草、通过食物链进入人体而慢慢积累在肾 脏和骨骼中，取代骨中钙，使骨骼严重软化，骨头寸断。除此之外，还有其他 的重金属中毒，如铬中毒主要是指六价铬，饮用被含铬工业废水污染的水，可 致腹部不适及腹泻等中毒症状。铬为皮肤变态反应原，引起过敏性皮炎或湿疹， 久而不愈，损害了人体健康。生产和回收铅酸蓄电池中涉及大量的铅，铅通过 血液循环进入肝、肾、大脑等处的软组织并被接收，长时间后还会进入骨头或 牙齿中。首先，小孩的智商会变低，脑部的工作能力降低。而且小孩会直接在 母亲怀孕期间就从母体吸收铅，出生之后也会从母亲受奶而累积体内铅的含 7 量。对成人而言，铅会造成血压比正常人高、容易罹患心脏血管方面的疾病， 还会引起骨质疏松症等。砷广泛分布于自然界中，环境中的砷常以化合物形式 存在，常见的有三氧化二砷，易溶于水，剧毒。人群通过饮水、空气或食物长 期摄入过量的砷而导致的慢性中毒称为地方性砷中毒。如果人体对砷的化合物 的摄入量超过排泄量，如饮用水含砷量较高，长期饮用，则会引起慢性中毒。 砷及其化合物进入人体，蓄积于肝、肾、肺、骨髂等部位，特别是在毛发、指 甲中贮存，砷在体内的毒作用主要是与细胞中的酶系统结合，使许多酶的生物 作用受到抑制失去活性，造成代谢障碍。长期摄入低剂量的砷，经过十几年甚 至几十年的体内蓄积才发病甚至造成死亡。 2 2 分子发光光谱法概述 2 2 1 分子荧光光谱法概述 2 2 1 1 分子荧光产生的机理 分子发光分析是受激物质分子或原子以发射辐射的形式释放能量，测量的 是物质分子或原子自身发射辐射的强度，属于发射光谱法。分子发光光谱法包 括分子荧光分析法，分子磷光分析法，化学发光分析法。也包括由分子荧光光 谱法衍生出来的共振光散射光谱法和荧光共振能量转移光谱法。分子发光光谱 法是指分子吸收了光能被激发到较高能态，在返回基态时，发射出与吸收光波 长相等或不等的辐射，这种现象称为光致发光。 物质的基态分子受一激发光源的照射，被激发至激发态后，在返回基态时 发射出波长与入射光相同或较长的光，称为分子荧光。一种物质分子能否发射 出荧光取决于它本身的分子结构和它所在的环境条件。通常所指的荧光是指 紫外一可见光荧光，即利用某些物质受到紫外一可见光照射后，发射出比吸收的 紫外一可见光波长更长或相等的紫外一可见光荧光。通过测定物质分子产生的荧 光强度进行分析的方法称为分子荧光分析。荧光分析可应用于物质的定性及 定量，由于物质结构不同，所能吸收的紫外一可见光波长不同，所发射的荧光 波长也不同，利用这个性质可鉴别物质。对于同一物质的稀溶液，其产生的荧 光强度与浓度呈线性关系，利用这个性质可以进行定量测定。 当处于基态单重态( s o ) 的分子吸收波长为入l 和入2 的辐射后，分别被激 8 发到第一激发单重态( s 1 木) 和第二激发单重态( s 2 木) 的任意振动能级上，而后 发生以下去活化过程m 1 ： 传递途径 圆_ _ 圃 ? 圆圆圈圆圆圈圆 能 量 图2 - 1分子去活化过程图 巍 j l： jl v l l c 1r v r jl l t ， l ha 2 f 1 r 1r 1r 1r 图2 - 2 分子吸收与荧光光谱辐射跃迂示意图 a l ，a 2 吸收e 荧光 i c 内转化v r 振动松弛 荧光寿命：1 0 9 1 0 7s ；磷光寿命：1 0 一 - 1 0s 9 ( 1 ) 非辐射能量传递过程 振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振动 能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间1 0 q 2s 。 内转换：相同多重态电子能级中，等能级间的无辐射能级交换。通过内转换 和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态( 三重态) 的最低 振动能级。 外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐 射跃迁；外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭 。 系间跨越：不同多重态，有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。改变电子自 旋，禁阻跃迁，通过自旋一轨道耦合进行。 ( 2 ) 辐射能量传递过程 荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级一基态( 多为s 一岛 跃迁) ，发射波长为x 2 的荧光。由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的 能量小，波长长；a 2 a2 允1 ； 磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级一基态( t 1 一岛跃迁) ； 电子由进入死的可能过程：( 岛_ 乃禁阻跃迁) s o 一激发一振动弛豫一 内转移一系间跨越一振动弛豫一乃。磷光发光速度很慢，光照停止后，可 持续一段时间。 2 2 1 2 分子荧光激发光谱和发射光谱 任何荧光物质都具有两个特征光谱，即分子激发光谱和分子发射光谱