（细胞生物学专业论文）鱼类白细胞介素4的基因克隆和表达分析.pdf

浙江大学硕士学位论文 中文摘要 白细胞介素4 ( i l - 4 ) 是t h 2 型免疫应答的关键细胞因子，对很多免疫细胞因 子具有调节作用，如y 干扰素，白细胞介素1 和a 肿瘤坏死因子等。目前对人类 和一些哺乳动物的，4 已开展了较多研究，但对鱼类i l 4 的研究尚未见报道。本 文成功克隆了河豚i l 4c d n a 全序列，并在毕赤酵母系统中诱导表达了重组儿_ 4 。 河豚i l 4c d n a 全长8 3 4 b p ，包括3 9 b d 的5 啡编码区( 5 u t r ) ，3 7 5 b p 的3 啡编码 区o a y r r ) 和4 2 0 b p 的开放阅读框架( o r f ) ，其翻译得到的多肽含1 3 9 + 氨基酸，预 测分子量约1 6 1 3 l k d a 。河豚i l 4 基因与已知的哺乳动物和鸟类有相同的结构， 即由四个外显子和三个内含子组成。它的编码蛋白与其他同源体有1 1 一1 6 的 同源相似性。用优化条件的r t - p c r 半定量估测i l 4 在河豚各个组织中的表达水 平，结果显示，i l - 4 在所选组织中均为组成性表达，包括头肾、脾脏、肝脏、大 脑、鳃、肌肉和心脏，其中头肾、脾脏和肝脏的表达量较低。i l 4 的组成性表达 与它对免疫细胞因子调节的潜在作用是相一致的。用2 | i g c o n a 、2 p g p h a 和2 ugp m a 的混合诱导剂刺激河豚，可以发现i l 广4 在以上所检测组织中的表达量显 著上升，这一结果也预示了有丝分裂原激活，4 的炎症免疫应答。此外，成功构 建了重组表达质粒p p i c 9 k i i a ，并将其重组整合入g s l l 5 毕赤酵母基因组，通过 组氨酸缺陷型培养基m d 和( 3 4 1 8 筛选获得含有多个拷贝的毕赤酵母转化子，经甲 醇诱导，在毕赤酵母表达系统中检测到约1 6 k d a 的条带，与预期的重组蛋白大小 相一致。这是关于鱼类i l 4 的克隆、鉴定和表达的首例报道。 关键词：河豚；白细胞介素4 ( i l 广4 ) ；克隆；鉴定；组织表达；t h 2 型细胞因子； 毕赤酵母表达；重组i l 4 蛋白 浙江大学硕士学位论文 a b s t r a c t i n t e r l e u k i n - 4 ( i “) i so o ft h ek e yc y t o k i n e si nt h 2m e d i a t e di m m u n er e s p o n s e s ，w h i c hh a s b e e ns h o w nt or e g u l a t et h er e s p o n s e so fm a n yi m m t t l l ec y t o k i n e s , s u c h 勰i n t e r f e r o n - g a m m a ( 蜊以i n t e r l e u k i n - 10 l - 1 ) a n dt n f - u m u c hw o r ko n 4h a sb e e nd o n ei nh u m a na n ds e v e r a l m a m m a ls p e c i e sw h i l et i t t l ei nf i s hi nt h i ss t u d y , w ch a v ec l o n e da n dc h a r a c t e r i z e dt h ef u u - l e n g t h c d n ao f 皿，4i nt e t r a o d o n a n do b t a i n e dr e c o m b i n a n ti l 4 ( r m - 4 ) e x p r e s s e di np i c h i ap a s t o r i s t h et e t r a o d o n 4c d n ai s8 3 4b pi nt e n g t ha n dc o n t a i n sas h o r t5 u t ro f3 9b p , a3 u t ro f 3 7 5b pa n da no p e nr e a d i n gf r a m eo f4 2 0b pt r a n s l a t i n gi n t oa p r o t e i no f1 3 9a aw i t hap r e d i c t e d m o l e c u l a rl n a s so f1 6 1 3 1k i ) a t h et e t r a o d o ni l - 4 - e n c o d i n gg e n ew i t ht h es a n l co r g a n i z a t i o na s t h em a m m a l i a n sa n db i r d sc o n s i s t so ff o u re x o o sa n dt h r e ei n t r o n s t h ee n c o d e dp r o t e i ns h o w s 1 1 - 1 6 i d e n t i f i e st oo t h e rh o m o l o g u e s r t - p c rw a so p t i m i z e dt oe s t i m a t et h ee x p r e s s i o nl e v e lo l i l _ 4i nt e t r a o d o n t h er e s u l t ss h o w e dt h a ti l 4i sc o n s t i t u t i v e l ye x p r e s s e di na l ls e l e c t e dt i s s u e s , i n c l u d i n gh e a dk i d n e y ，s p l e e n , l i v e r , b i 也g i l l , m u s c l ea n dh e a r t , a l t h o u g hl o wl e v e l sw o l f e o b s e r v e di nh e a dk i d n e y , s p l e e n a n dl i v e r t h eu b i q u i t o u se x p r e s s i o no fi l 4i sc o n s i s t e n tw i ma p o s t u l a t e dr o l ei ni m m u n ec y t o k i n e sr e g u l a t i o n s t i m u l a t i n gt h ef i s hw i t ham i x e ds t i m u l a n tt h a t c o n t a i n e d2 腭c o n & 2 飕p h a , a n d2 腭p m a , s i g n i f i c a n t l yu p - r e g u l a t e dt h ee x p r e s s i o no f i nm o s tt i s s u e se x a m i n e d , w h i c hp o t e n t i a l l yi n d i c a t e dt h a tl l 4w a si n v o l v e di nt h ei j m l n u n c i n f l a m m a t o r yr e s p o n s e st r i g g e r e db ym i t o g e n s r e c o m b i n a n te x p r e s s i o np l a s m i dp p i c 9 k - i l 4w a s s u c c e s s f u l i yc o n s t r u c t e d , a n dt r a n s f o r m e di n t o 只p a s t o r s $ u a i ng s l l 5 t r a n s f o r m a n t sw 讹 s c r e e n e dw i t ha u x o t r o p h i cm e d i u mm da n dg 4 1 8 i n d u c e dw i t hm e t h a n o l , t h ep r e d i c t e d e x p r e s s i o no fr l l 4w a sd e t e c t e d t h i si st h e f i r s tr e p o r to fc l o n i n g , c h a r a c t e r i z a t i o na n d e x p r e s s i o no f i nf i s h k e y w o r d s ：t e t r a o d o nn i g r o v i r i d i s ；i l - 4 ；c l o n i n g ；c h a r a c t e r i z a t i o n ；t i s s u e e x p r e s s i o n ；t h 2 - t y p ec y t o k i n e ；p c h a p a s t o r s ；r l l - 4e x p r e s s i o n 浙江大学硕士学位论文 第一部分文献综述 白细胞介素4 的研究进展 摘要：白细胞介素是具有广泛生物学活性的小分子多肽，是一组多效细胞因子。 白细胞介素4 ( i n t e r l e u k i n , 4 ) 是白细胞介素家族中最主要的成员之一。它主要 由t h 2 细胞亚群产生，是关键的免疫调节因子，能够影响t h l t h 2 细胞的平衡， 与某些过敏性疾病、传染病和自身免疫性疾病密切相关。鉴于儿4 在免疫系统 中占有的重要地位，研究者们一直对它密切关注。到目前为止，关于人类和哺乳 动物皿4 的相关研究已经积累了一定的成果。下面本综述将简要介绍自细胞介 素家族，并对m _ 4 的来源、结构、功能及其受体复合物、信号转导通路等进行 较为详细的阐述。 关键词：自细胞介素、i l - 4 、i l - - 4 r 、信号转导、t h 2 型免疫 引言 白细胞介素( i n t e r l e u k i n s ，m ) 是主要参与白细胞间相互作用的一组多肽类 细胞因子，在免疫系统中起重要的调控作用。白细胞介素通过结合于免疫细胞表 面的白细胞介素受体，对免疫细胞的活化、增殖、分化和行使功能起调控作用， 在某些条件下，白细胞介素还参与机体的病理过程。白细胞介素的研究将有助于 阐明分子水平的免疫调节机理，有助于一些疾病的预防、诊断和治疗，特别是应 用白细胞介素治疗肿瘤、感染、自身免疫病、免疫缺陷等己收到初步疗效，具有 非常广阔的应用前景。 自1 9 7 9 年第一个白细胞介素被命名后，鉴定与克隆新的白细胞介素并对其 结构、功能及临床效用进行研究一直是国际免疫学研究的热点。，4 是t h 2 型 免疫应答中最关键的细胞因子，由于l l 4 在适应性免疫中的重要性，其研究一 直受到密切关注。广4 是t h 2 型细胞的自分泌生长因子，可促进细胞的发育、 增殖，抑制t h l 细胞增殖，从而降低t h l 细胞产生细胞因子的能力，破坏体内 1 1 i l ，1 1 1 2 的平衡。正常情况下t h l t h 2 处于相对平衡状态，t h l t h 2 亚群的失衡可 能是多种疾病发病的主要机制。不同疾病可引起t h l t h 2 偏移，而t h v i h 2 漂移 又返过来影响疾病本身进展。因此许多疾病如哮喘，类风湿关节炎，溃疡性结肠 炎，季节性接触性皮炎，银屑病，白塞病等，都与l i 广4 有着密切的联系。1 1 4 对免疫应答的影响主要是抑制细胞免疫，促进体液免疫( 特别是i g e 反应1 。在所 浙江大学硕士学位论文 有的动物中，如果广4 基因缺失，或i l 4 的活性消除，t h 2 型细胞的增殖和i g e 的合成将会停止。同时4 还促进活化b 细胞增殖，促进肥大细胞增殖、增强 巨噬细胞功能、协同集落刺激因子( c s f ) 刺激。在促炎抗炎方面，i l 4 通过抑 制i f n q 的生成，下调i d l ，i l - 6 ，耵q f - a 等炎症细胞因子水平，使炎症缓解。 1 白细胞介素家族简介 白细胞介素( i n t e d e u k i n ，i l ) 是具有介导白细胞间相互作用的一组多肽类 细胞因子，在免疫系统中具有重要的生理功能。1 9 6 0 年就发现，经抗原或分裂 素活化的t 淋巴细胞能产生可溶性因子，促进b 淋巴细胞的活化和抗体产生。 以后这类影响免疫应答的细胞因子不断发现，由于命名混乱，在1 9 7 9 年第二届 国际淋巴因予专题讨论会上将来自单核巨噬细胞、t 淋巴细胞所分泌的某些非 特异性发挥免疫调节和在炎症反应中起作用的因子统一命名为白细胞介素 ( i n t e r l e u k i n ，几) ，以阿拉伯数字表示不同的因子，至今已经有三十余种白细胞 介素被命名。目前已知许多白细胞介素是来自单核巨噬细胞和淋巴细胞以外的 其它细胞，而且随着对白细胞介素研究的深入，发现白细胞介素不仅介导白细胞 间的相互作用，还参与其他细胞，如造血细胞、血管内皮细胞、纤维母细胞、神 经细胞等的相互作用，因此白细胞介素一名并不能完全反映这类细胞因子的作用 范围。但由于历史的原因，这一名称已被公认并广泛应用。 自细胞介素在功能上是多效应的。每种白细胞介素能与多种免疫细胞相互作 用，还能与非免疫系统的细胞相互作用。同时，每种免疫细胞又可受多种白细胞 介素的调控，不同白细胞介素之间有协同或制约的作用，由此构成错综复杂的细 胞因子网络。例如，过去认为i l - 2 只是t 细胞生长因子( t c g f ) ，现发现它同时 也是b 细胞生长因子，还能增强天然杀伤细胞的功能，并控制神经胶质细胞的 生长。i i 广4 最初定名为b 细胞刺激因子i ( b s f - 1 ) ，现在发现它又是一种强力的t 细胞刺激剂，并控制一些造血细胞的分化和增殖。i l - 1 除作用于淋巴细胞外，还 是表皮角质细胞、软骨细胞、纤维母细胞的刺激剂，并抑制乳癌细胞的生长。在 b 细胞增殖、分化和产生抗体的过程中，至少有i l - 1 、i l - 2 、i i 广4 、i l - 5 、i d 6 、 i l - 7 参与调节。 白细胞介素通过与细胞表面特异性的白细胞介素受体发挥效应，除少数白细 胞介素受体如i l - 1 受体属免疫球蛋白超家族外，多数白细胞介素受体属造血因子 受体超家族，它们具有结构上的同源性，如保守的半胱氨酸残基、“w s x w s ” 顺序、2 1 0 氨基酸同源区等( m i y a z a k ic la 1 ，1 9 9 1 ) ，因此可能由同一原始基因进 化而来。白细胞介素由它的产生细胞分泌后，一般只作用于它周围的细胞或产生 它的自身细胞，这就是旁分泌或自分泌作用方式，不同于激素的内分泌作用方式。 2 浙江大学硕士学位论文 白细胞介素多为1 0 0 个氨基酸左右的低分子量蛋白质，多有糖基化。除i d 5 外均为单链结构，带有链内二硫键。不同白细胞介素问的氨基酸序列差异很大。 过去只能从细胞体外培养中提取有限的白细胞介素进行结构和功能研究，这样做 成本高，产量低，纯度也不易保证。随着基因工程技术的进展，已对各种白细胞 介素的基因结构和蛋白质结构进行了精确分析，并成功地制成多种白介素基因工 程产品( 又称重组自介素) ，从而使白细胞介素的结构、功能研究及临床实验研 究进入新阶段。某些疾病会出现白细胞介素的缺陷或异常现象，利用基因工程制 备的重组白细胞介素有可能治疗这类疾病。可以预测，m 作为一种新型的生物 应答调节剂( b r m ) 将有广阔的临床应用前景。 2 i l 4 的产生、结构和功能 1 9 8 2 年h o w a r d 发现t 细胞培养上清中有一种促进b 细胞增殖的因子，起 初命名为b 细胞生长因子1 ( bc e l lg r o w t hf a c t o r - 1 ，b c g f - 1 ) 。有的实验室称为b 细胞刺激因子1 ( bc e l ls t i m u l a t i n gf a c t o r - 1 ，b s f - 1 ) 、t 细胞生长因子2c l rc e l l g r o w t hf a c t o r - 2 ，t c g f - 2 xh o w a r de ta 1 ，1 9 8 2 ；v i t e t t ac ta 1 ，1 9 8 5 ) 。1 9 8 6 年基因克 隆成功，国际统一命名为白细胞介素4 ( i n t e r l e u k i n4 ，i l 广钔。 i l 4 的产生：i l 4 是t h 2 细胞的自分泌生长因子，它主要由t h 2 型细胞产 生( h a l ie ta 1 2 0 0 1 ) ，也有少量来源于n k 细胞，嗜酸粒细胞，嗜碱粒细胞和肥 大细胞( p l a u tc ta 1 ，1 9 8 9 ；s e d e rc ta 1 ，1 9 9 1 ) 。 i l 4 的分子结构和基因：小鼠i l 4 基因长约6 k b ，成熟i l 4 分子由1 2 0 氨 基酸残基组成，裸肽分子量为1 4 k d a ，有3 个糖基化点，经糖基化后i i ，4 分子 量为3 0 k d a 。人m - 4 基因定位于第5 号染色体，由4 个外显子和3 个内含子组 成，约1 0 k b ，是现知淋巴因子基因中较大的一个。成熟人4 分子由1 2 9 氨基 酸残基组成，1 5 k d a ，有2 个糖基化点，含有6 个半胱氨酸，参与分子内二硫键 的组成。人与鼠l l 4 d n a 水平上有7 0 同源性，i l 4 前体蛋白从n 端到9 1 位 氨基酸以及c 端到1 2 8 位氨基酸人和小鼠之间在氨基酸水平上有7 0 同源性， 前体蛋白9 1 至1 2 8 位氨基酸之间很少有同源性，这可能与i l 4 种属作用特异性 有关，如人、鼠i l 4 生物学作用上没有交叉反应。 i l 4 受体：i l 4 受体( i l - 4 r ) 由8 0 0 氨基酸残基组成，分子量为1 4 0 k d a ，胞 膜外区2 0 7 个氨基酸，跨膜区2 4 个氨基酸，胞浆区5 6 9 个氨基酸，与小鼠r - 4 r 有5 3 同源性，属于造血因子受体超家族成员，最近命名为c d w l 2 4 。在小鼠， t 细胞、b 细胞、胸腺细胞、骨髓细胞、巨噬细胞和肥大细胞表面都有i l - 4 r ， 每个细胞受体数目在1 0 0 2 0 0 0 左右，其亲和力k d 在1 0 1 0 1 0 1 1 m ，1 5 x 1 0 4 2 m 3 浙江大学硕士学位论文 浓度的n 广4 可使b 细胞增殖f 砸t d r 掺入率) 达到最大值的5 0 。l p s 对b 细 胞i l - 4 r 表达有正调节作用，受体数量可增加5 1 0 倍。i l - 4 r 胞浆区富含脯氨 酸和丝氨酸，p t k 和p k c 参与受体介导的信号传递，i p 3 和q 离子浓度升高。 在小鼠已发现有不同剪接形式m r n a 所翻译的分泌型( 可溶性) i l - 4 r ( s l l - 4 r ) 。 s i l - 4 r 与膜型n _ 4 9 ( m i l - - 4 r ) 同配体i l 4 结合时具有相同的亲和力。s l l - 4 r 可能 是几4 保护性载体，或调节4 的生物学活性。 i i 广4 与受体结合后，以s t a t 6 信号通路传递信号，穿越细胞核调节靶基因的 表达。，4 对于b 细胞、t 细胞、肥大细胞、巨噬细胞和造血细胞都有免疫调节 作用。4 能维持t 细胞的增殖，参与促进t 细胞从原始t h 0 细胞向t h 2 细胞 分化，并促进t h 2 细胞的发育，从而促进i l 4 ，i l - 5 和i l - 1 3 等t h 2 型细胞因子 的增殖。除了这些基本功能，i l 广4 还能显著促进b 细胞分化和免疫球蛋白向i g e 转换，并抑制i f n y ，l 和t n f - a 等炎症应答的重要相关因子的产生。除了 对t 细胞和b 细胞的影响，广4 还能在l a k 细胞( 淋巴因子激活的杀伤细胞) 中抑制i d 2 诱导的细胞毒性。 i i 广4 的生物学活性具体包括： ( 1 ) b 细胞：促进s a c 或抗l g m 预先刺激b 细胞的增殖，这一生物学功能 已被用来作为检测i i ，4 的生物学活性。i l 4 促进b 细胞m h c i i 类抗原、 f c e r | | c d 2 3 和c d 4 0 的表达，并增强b 细胞提呈抗原能力，使免疫系统对小量 抗原刺激发生免疫应答。增加f c e ri i c d 2 3 0 9 ef c 段低亲和力受体1 的表达， 并释放可溶性c d 2 3 ( s c d 2 3 ) i g e 结合因子( i g e b f ) ，与m l g e 阳性细胞结合并诱 导其分化，可能与促进b 细胞l e e 的产生有关。广4 提高l p s 刺激小鼠b 细胞 i g g l 、i g e 产生水平分别为8 1 0 倍和1 0 1 0 0 倍，但对l g g 3 分泌降低6 1 0 倍，i g g 2 a 、i g g 2 b 和i g m 有不同程度下降，对i g a 产生无明显影响。i l 4 增强 i g g l 和i g e 水平的机理可能是：使选择性刺激定向产生i g g l 或i g e 的b 细胞 的增殖和分化；增加特异的重链稳定区培类的转换使印s v x 结合，促进i g g l 合成和分泌。i f n - - 对i l 4 上述生物学功能有明显抑制作用。而i l 4 则可抑制 i f n - y m r n a 的转录和抑制i f n - y 诱导b 细胞产生l g g 2 a 。寄生虫感染时血清i g g l 和i g e 水平升高。此外，4 还可促进休止期b 细胞的早期活化，从g o 期进入 g 1 期，细胞体积增大，并表达c d 2 5 。 ( 2 细胞：i l 4 是t 细胞自身分泌的生长因子，n 4 可单独维持t h 2 细胞 的增殖，抗，4m c a b ( 1 1 8 1 1 ) 可抑制i l 4 刺激t h 2 细胞的增殖作用。纯化后的 t 细胞( c d 4 阳性或c d 8 阳性亚群1 对i d 4 的增殖反应还需要i l - i ( 或p m a ) 的协 同作用。高剂量广4 能诱导c d 4 - c d 8 + 或c i m + c d 8 或c d 4 - c d 8 胸腺细胞的增 殖。n ，4 增强p h a 刺激t 细胞释放g m c s f 和g c s f 。在小鼠实验系统中， 4 浙江大学硕士学位论文 多数情况下4 对c t l 和l a k 细胞的分化有正调节作用；而对人的杀伤细胞 则有时表现为负调节作用，如在人m l c 中n 4 选择性地促进t h 增殖，同时伴 有c t l 、n k 和l a k 功能的降低。此外i l 4 还能抑制i l - 2 所诱导的n k 白血病 细胞l a k 活性。最近发现，用4 与t 细胞或b 细胞温育，可降低高亲和力 i l - 2 r 位点数，但不影响低亲和力i l - 2 r 的数量。皿4 还可刺激c d 3 阴性n k 细 胞克隆的生长。 ( 3 ) 刺激肥大细胞增殖，并与i l - 3 有协同作用，尤其对于粘膜和结缔组织型 肥大细胞体外生长是必需的。 ( 4 ) 促进巨噬细胞提呈抗原和杀伤肿瘤细胞的功能，可能与调节m h c i i 类抗 原和f c r 表达有关。n 4 与g m c s f 、i l - 3 和l p s 有协同作用。i l 广4 可诱导外 周血单核细胞分泌g c s f 和m c s f ，增强中性粒细胞介导的吞噬、杀伤活性和 a d c c 作用。4 是小鼠巨噬细胞趋化因子，并促进i l - l r a 产生，但抑制单核 细胞i l - 1 、t n f 和i l 6 的产生。 ( 5 ) 协同c s f 刺激造血细胞的增殖，与g c s f 协同增强粒细胞集落形成，协 同红细胞生成素( e p 增强b f u e 的形成。 目前1 i - 4 作为肿瘤免疫调节剂已进入期临床试验。此外，还开始进行治疗 免疫缺陷症的临床试验。由于体内、体外均证实m - 4 可以抑制i l l 、i l - 6 和t n f 分泌，并促进1 l - l r a 产生，因此应用，4 可能为治疗败血症休克提供一种新的方 法。 3 i i a 一受体复合物和信号转导机制 n ，4 是一种多效性细胞因子，能影响基因表达和一些细胞的增殖、分化 ( f i n k d m a ne ta 1 ，1 9 9 0 ；s c o t t ，1 9 9 3 ) ，在免疫应答过程中起着关键作用。，4 的作 用通过结合到造血细胞和非造血细胞表面的高亲和受体形成复合体而产生。这些 受体分子在可溶状态下能够调节i l 4 的作用。下面将总结概括目前i l 4 受体复 合体在分子结构上的已知内容及广4 导致细胞增殖和基因活化的信号转导机制。 i i ，4 属于四螺旋束细胞因子家族成员。该家族细胞因子尽管序列同源性低， 但都是由四螺旋束通过独特的u p - u p - d o w n d o w n 螺旋拓扑学的方式组成 ( r o z w a r s k ie ta 1 ，1 9 9 4 ) 。i l 4 的三维结构通过核磁共振分光检定法( p o w e r se ta 1 ， 1 9 9 2 ；s m i t he ta 1 ，1 9 9 2 ) 和x 射线结晶照相术( w a l t e rc ta 1 ，1 9 9 2 ；w l o d a w e re ta 1 ， 1 9 9 2 ) 得到。人i l 4 在溶液中的三维构象和晶体三维构象都已经确定。四螺旋束 中螺旋a b 和螺旋c d 连接处具有短b 片层结构。用苏氨酸替代人i l 4 中的半胱 氨酸，发现位于第4 6 和9 9 位的半胱氨酸二硫键结构对i l 4 功能性折叠起着根本作 用，不过位于2 4 6 5 和3 1 2 7 位的另两个半胱氨酸二硫键没有这样的重要性。 浙江大学硕士学位论文 人i l 4 的两个功能性位点，位点1 位于螺旋a 的第9 位氨基酸谷氨酸和螺 旋c 的第韶位氨基酸精氨酸。两者位置交换会引起广4 变异，造成与4 受 体( i l - 4 r ) 胞外区结合缺陷。这种变异体浓缩1 0 0 0 倍方能像正常4 一样诱 导t 细胞增殖和b 细胞c d 2 3 的表达。位点2 位于螺旋d 的第1 2 1 ，1 2 4 ，1 2 5 位的氨基酸，分别为精氨酸，酪氨酸和丝氨酸。广4 的位点2 变异体显示出对t 细胞增殖的部分活性，但是仍然能与4 r 胞外区高亲和的结合。4 结合i l - 4 r 胞外区的功能通过位点1 达成，而位点2 则与识别yc 、激活受体系统、产生跨 膜信号有关。 i l - 4 r 是一个8 0 0 氨基酸的细胞表面糖蛋白，胞外区2 0 7 个氨基酸，跨膜区2 4 个氨基酸，胞内区5 6 9 个氨基酸( g a t i 翻e ta 1 ，1 9 9 0 ) 。它属于造血因子受体超家 族( b a z a n ，1 9 9 0 ) 。i l - 4 r 结合到广4 是高亲和性的，1 1 4 r 的可溶性部分( si l - 4 r ) 仅包括胞外区( m o s l e y e ta 1 ，1 9 8 9 ；i d z e r d ae ta 1 ，1 9 9 0 ) 。i l - 4 r 胞内区保守的蛋白 酪氨酸残基磷酸化是，4 发挥作用的基础。n 4 的突变分析表明，4 只有一个和 4 r 结合的位点( k r u s ce ta 1 ，1 9 9 3 ) 。 4 还与另外一个第二受体分子( 低亲和性受体) 之间存在相互作用，1 l - 2 受体y 链( k o n d oe ta 1 ，1 9 9 3 ；r u s s e l le ta 1 ，1 9 9 3 ) ，也是造血因子受体超家族的成 员之一。这个分子与某些受体复合物有关，如i l - 2 ，皿4 ，i l - 7 ( t a k e s h i t ac ta 1 ， 1 9 9 2 ；k o n d oe ta 1 ，1 9 9 3 ；n o g u c h ie ta 1 ，1 9 9 3 ；r u s s e l le ta 1 ，1 9 9 3 ) ，可能与i l - 9 ， h 一- 1 5 ( b o u l a ya n dp a u l ，1 9 9 3 ；z u r a w s k ie ta 1 ，1 9 9 3 ；g r a b s t e i ne ta 1 ，1 9 9 4 ) 也相关。 这个分子普遍的被称为y 链或yc ，因为它与多个白介素受体复合物相关，类似 于1 3c 受体与i l - 3 ，i l - 5 等多个受体复合物相关。 通过人类生长因子( h g h ) 和它的受体( h g h r ) 的晶体结构作为起始模型， i l 4 与高亲和受体( 特异性受体4 r ) 及低亲和受体( 公共受体i l - 2 ryc ) 结 合的三维结构模型已经建立。这一模型建立在i l 4 及其受体的序列保守性和细 胞因子受体的预测结构的基础上，并假设配基结合模式是相似的。i l 4 和两种受 体分子的结合界面分析揭示了氨基酸残基对复合体形成的重要性。建模过程显示 要用h g h - - h g h r 复合体的相似模式维持i l 4 和它的两种受体分子的合理结构 没有大的问题。同时建模中发现，很多残基在4 和受体结合的过程中表现出 重要的作用。受体c 末端的芳香族结构和带电残基在h g h h g h r 复合体和1 1 4 复合体结构模型中都是高度保守的。 通过凝胶电泳和凝胶过滤技术研究发现，i l 4 和两个已知受体( i l 广4 r 和y c ) 结合模型中，s l l - 4 r 和i l 广4 复合物以1 ：1 的状态紧密结合( h o f f r a a ne ta 1 ，1 9 9 4 ； n e i d h a r d tc ta 1 ，1 9 9 5 ) 。人类生长激素：生长激素受体( h g h ：h g h r ) 复合物晶 体结构中发生的受体同源二聚体现象( d e v o se ta 1 ，1 9 9 2 ) 在i l 4 ：i l - 4 r 体系中 6 浙江大学硕士学位论文 并没有发现。而且，广4 和两个可溶性受体形成的三元络合物以m _ 4 ：r , - 4 r ： y c = 1 ：1 ：1 的形式存在，i l - 4 r 结合到i l 4 的位点1 ，y c 结合到m _ 4 的位点 2 ( g u s t c h i n ae ta 1 ，1 9 9 5 ) 。yc 与i l 4 i l 广4 r 复合物的结合常数在毫摩尔水平。该 三聚体复合物是我们研究其晶体结构的重要基础。 i l 4 受体活性的发挥是通过激活胞质内多种非受体型蛋白酪氨酸激酶( p r k 3 而进一步启动多种信号转导途径的。它主要的信号转导途径包括p i 3 l ，邋径、 i r s 1 2 途径、j a k - s t a t 途径以及r a s m a p i 醴径等( n e l m sk e ta 1 1 9 9 9 ；w u r s t e r a le ta 1 ，2 0 0 2 ) 。 ( 1 ) j a k ，s t a l 途径：n ，4 与受体结合后，i l 4 r 的链与ye 链二聚化激活胞质 内z f k ，继而进一步使底物磷酸化。i l - 4 r q 与y c 链均不具有内源性激酶活性， 因而它们需要与相关的激酶发生作用来启动信号转导途径。j a k 家族在其中发挥 了重要的作用。当4 与受体n 链结合后诱导了a 链与yc 链的异体二聚化，这 种二聚体激活j a k 家族蛋白，i l - 4 r 与j a k l 连接，i l - 4 r y c 与j a k 3 相连接，进而 也活化了，4 r q 胞内区中的蛋白酪氨酸残基磷酸化( k e l l y w e l c h a e e t a l 。 2 0 0 3 ) ，这些磷酸化的酪氨酸残基于是成为含有酪氨酸结合区域( p t b ) 或s h 2 结构域的信号转导分子的结合位点。 ( 2 ) 胰岛素受体底物1 2 ( i r s 1 2 ) - p i 3 k 途径：i l 4 可以诱导i r s 家族的活化， 包括瓜s 一1 、i r s 2 、i r s 3 、i r s - 4 都能与i l 广4 ra 相互发生作用，但i r s 2 是造血 细胞中表达的最重要的成分。胰岛素受体( 瓜) 与i l - 4 ra 中均含有n p x y 序列， 该序列对i r s 家族很重要。在i l - 4 r a 中，n i x y 序列包含在一个命名为1 4 r 的基 序中。i r s 蛋白中含有蛋白酪氨酸结合区( m ) 和其它如丝氨酸、苏氨酸和酪 氨酸磷酸化位点。i r s 蛋白通过位于1 4 r 共同基序中第一个胞内酪氨酸残基( y 1 ) 与，4 rn 结合( b l a e s e rfe ta 1 ，2 1 3 0 3 ) 。1 4 r 的磷酸化导致细胞骨架重排，介导 i r s l 2 的f i b 与i l - 4 r a 中的1 4 r 结合，于是i r s l 2 的酪氨酸残基磷酸化，为p i 3 k 提供了结合位点，形成i r s p i - 3 k 复合体，进一步激活下游相关激酶，引发生理反 应。 ( 3 ) p k c - n f - kb 途径：最近通过对缺乏酪氨酸残基的i l - 4 ra 的研究显示： 单纯给予，4 处理的静止t 细胞不能诱导s t a t 6 的表达，而活化t 细胞内，4 r a 依赖的s t a t 6 的诱导仍可以实现，这一过程需要蛋白激酶c ( p l ( c ) 和钙离子导 入剂激活的t 细胞接受广4 的刺激，仅给予p k c 激动p m a 也能达到同样的效果， 并且这一过程依赖于n f - xb r e l 蛋白的表达和活化( m o r a a l e ta 1 2 0 0 3 ) 。这表 明无胞内酪氨酸残基的1 l - 4 r n 也能通过t 细胞的活化或p k c 激动剂的信号途径 诱导s t a t 6 的转录活性。 酪氨酸磷酸化、信号蛋白之间的相互作用是信号转导途径中的基础反应，故 7 浙江大学硕士学位论文 而酪氨酸磷酸酶在其中起着反馈调节作用。含s h 2 区域的磷酸酶s h e l 2 、s h i p 在信号转导途径中发挥着重要的作用( k a s h i w a d am e ta 1 ，2 0 0 1 ) 。j a k s t a t 信号途 径的调节因子为一系列只有在细胞因子诱导s t a l 撒活后才表达的s h 2 区域包含 蛋白，分别为c i s 、s o c s 1 、s o c s 2 、s o c s - 3 、s o c s - 5 、s o c s - 6 、j a b 等。4 可以特异性诱导造血细胞表达c i s 和s o c s 2 ，j a b 可以减弱j a k l 、j a k 2 、j a k 3 的 激酶活性。s o c s 1 能抑$ l j i l - 4 诱导的j a k l 和s t a t 6 的活化并因此有效地抑制4 的信号传递( b o r i s hl ca n ds t e i n k ej w ，2 0 0 3 ；y o h i c h ise ta 1 ，2 0 0 2 ) 4 i l 4 与t h 2 型免疫 在抗原刺激反应时，原始t h 0 细胞分化成为至少两种类型的细胞因子，由 他们特异性的细胞因子表达和他们不同的免疫应答反应来定义( 九ka b b a se ta l ， 1 9 9 6 ；t r m o s m a n na n dr lc o f f m a n 1 9 8 9 ；w e p a u la n dr as e a l e r , 1 9 9 4 ) 。t h l 细胞主要分泌丫干扰素( i f n q ) 、t n f - q 和i l - 2 等，主要促进细胞介导的免疫； 而t h 2 细胞主要分泌儿4 、i l - 5 、i l - 1 0 和i l - 1 3 等，刺激活化i g e 和嗜酸性细 胞反应，主要介导体液免疫。t h l 和t h 2 细胞互为重要的调节细胞，t h l 细胞分 泌的i f n - y 可抑制t h 2 细胞的分化和功能，t h 2 细胞分泌的4 、i l - 1 0 又可抑 制t h l 细胞的分化和功能。区分t h l 和t h 2 细胞严格依赖于i f n y 与4 的分 泌，t h l 细胞分泌i f n - y 而不分泌i i 广4 ，t h 2 细胞则正相反，即1 f n - y 与i l 广4 分别是t h l 和t h 2 型细胞的代表性细胞因子。 近期的研究证明，原始t h 0 细胞向t h 2 型细胞发展的过程与，4 基因的开 放有关( a n s e le ta 1 2 0 0 3 ；g r o g a na n dl o c k s l e y2 0 0 2 ；m u r p h ya n dr e i n e r2 0 0 2a n d s m a l ea n df i s h e r2 0 0 2 ) 。在t h 2 型细胞中具有4 基因独特的d n a 酶i 超敏位 点，而在t h l 型细胞中从未发现。这些保守非编码序列( c n s ) 1 区域分别位 于4 和i l - 1 3 基因之间、n 4 启动子( h s d 、几4 基因的第二个内含子( h s i i 和 h s i i i ) 及3 端的第四个外显子( h s v ) ( t d o t se ta 1 2 0 0 0 ；m o h r se ta 1 2 0 0 1 ； t a k e m o t oe ta 1 1 9 9 8 ：t a k e m o t oe ta 1 2 0 0 0 ) 。当t h 2 型细胞被t 细胞受体刺激时， 临近h s v 的位点v a 也能对d n a 酶i 短时超敏( a g a r w ae ta i ，2 0 0 0 ) 。在t h 2 分化的过程中，i l 4 基因表现出广泛的c p g s 脱甲基化，脱甲基区域包括c n s l ， 第一个内含子，第二个内含子以及3 端的第四个外显子。 t h l 型细胞因子和t h 2 型细胞因子分别与t h l 型免疫应答和t h 2 型免疫应 答相关。t h l 型免疫反应由i l - 2 和i f n l , 的表达定义，以延时型过敏反应和炎症 刺激原引起的细胞介导的免疫应答为特征。相对的，t h 2 型免疫反应由l l 4 、i l - 5 、 i l - 1 0 、i l - 1 3 的产生定义，以病原体入侵和寄生虫感染产生的体液免疫介导的寄 主反应为特征，以过敏症如哮喘为典型。 8 浙江大学硕士学位论文 免疫系统在病原体入侵的压力下，能触发一系列不同或者相似的功能因子。 这种不同基因的功能重叠已经在基因敲除小鼠实验体系分析中得到证明。通常单 个基因缺失不会导致可见的表型和生物功能的不同，除非该基因家族成员全部缺 失。在免疫系统中，免疫反应过程分泌的细胞因子具有高度互补的途径。t h 2 来 源的细胞因子，如m _ 4 、i l - 5 、i l - 1 0 、i l - 1 3 都与哮喘，过敏，寄生虫感染和自 身免疫等疾病密切相关，但是由于t h 2 型细胞因子的功能普遍存在高度的重复 性，他们在特定疾病状态下的相对重要性仍然很难琢磨( f i n k e l m a ne t a 1 1 9 9 7 a n dh o l g a t e1 9 9 9 ) 。因此，通过抑制某个t h 2 型细胞因子( 例如通过抑制i l - 5 的 水平治疗哮喘症) 建立的治疗方案是无效的( l e c k i ee ta 1 ，2 0 0 0 ) 。为了合理设计 成功的t h 2 型细胞因子干涉治疗法，我们必须知道免疫反应中的每个白细胞介 素的相对重要性以及他们的功能重叠。 目前的研究结果已经证明，i l - 5 ，i l - 1 0 ，i l - 1 3 能够加速和扩大免疫反应， 但是即使在i l - 5 ，i l - 1 0 ，i l - 1 3 联合缺失的情况下，4 仍然能激活t h 2 型免疫 应答，即单独的4 已经能够达到了t h 2 型因子功能的阈值。这表明，4 可以 补偿i l - 5 ，i l - 1 0 ，i l - 1 3 的作用，而i l - 5 ，i l - 1 0 ，i l - 1 3 产生功能需要，4 的协 同。因此，作为最重要的t h 2 型细胞因子，4 是t h 2 型免疫应答发生发展和 免疫球蛋白类型转换的主要影响因素。在对抗胞外病原体和肠道寄生虫方面，它 能促进抗体产生，与抗原交联反应时，m 4 结合到肥大细胞，嗜酸粒细胞和嗜碱 粒细胞表面的高亲和受体上，引起脱粒和促进相关炎症介质及细胞因子的产生， 从而形成免疫炎症应答，肥大细胞随后产生的i l 广4 能够延长t h 2 型免疫应答反 应。另外，广4 作为一个免疫调节基因，在过敏性炎症应答过程中起着关键的作 用。它与过敏症、哮喘和其他特异性反应疾病也密切相关，是t h l t