（环境科学专业论文）喹诺酮类抗生素生物残留的荧光分析法研究.pdf

多组分喳诺酮类药物含量的同时测定是药物残留分析工作中经常遇到的问 题。 本文以加替、 氧氟、 洛美和环丙沙星注射液构成的四组分体系和鸡蛋中的恩 诺和环丙沙星二组分体系为例， 研究了多元校正一荧光分光光度法在多组分沙星 同时测定中的应用。 本文采用的多元校正主要有多元线性回归 ( ml r ) , k - 矩阵和p 一 矩阵法，运 用这三种方法预测了同一组注射液样品中加替、氧氟、洛美和环丙沙星的含量。 研究发现 ml r法的预测结果不佳， k - 矩阵和 p - 矩阵法的预测结果比较令人满 意。四种沙星的k - 矩阵预测结果的回收率分别为:9 3 . 1 - 1 1 5 .0 % , 9 4 .7 - 1 0 5 .5 % , 9 3 .3 - 1 1 6 . 8 %, 9 1 .3 - 1 1 3 .7 %; p - 矩阵预测结果的回收率分别为:9 2 .3 - 1 1 3 . 8 %, 9 7 . 8 - - 1 1 7 .5 %, 9 3 .3 - - 1 1 6 .0 % , 9 6 .0 - 1 1 8 .7 %。 而后， 本文用这三种多元校正法预测 了同一组鸡蛋样品中恩诺沙星和环丙沙星的含量。 三种方法对样品中恩诺沙星预 测结果的回收率分别为:8 5 .0 % - 1 0 4 .5 %, 9 2 .0 %- 1 2 5 .5 %, 9 1 .5 % - 1 2 2 .5 %;环 丙沙星的预测结果的回收率分别为:8 0 .0 %- 1 1 4 .7 %, 9 5 . 2 %- 1 2 2 .4 %, 8 9 . 6 % - 1 1 6 .0 %。三种算法中，k - 矩阵和p 一 矩阵法的相对标准偏差较m l r法小，其结 果较 m l r法好。 用 多 元 校 正 法 进 行 预 测 时 ， 大 鼻 算 杂 的 矩 阵 运 算 不 可 避 免 。 为 此 ， 本 文 基 于 m a t l a b开发了多元校正辅助光谱分析软件。该软件运用图形用户界面设计 g u i ( g r a p h i c a l u s e r i n te r f a c e s ) 把 数 据 输 入输出 界 面 化， 从而 简 化了 使 用软 件的 操作。 本文探索了单组分和多组分哇诺酮类抗生素生物残留的荧光分析法。 本文研 究的 这些新方法灵敏度高、 操作简便， 成本低廉， 具有实际应用价值。 本文也对 新方法的作用机理进行了探讨。 关键词:荧光分光光度法; 胶束体系; 钱; 喳诺酮;沙星:多元校正;多元 线性回归;k - 矩阵;p - 矩阵 s t u d y o n f l u o r o s p e c t r o p h o t o m e t r y o f q u i n o l o n e s a n d t h e r e s i d u e a n a l y s i s ma j o r : e n v i r o n me n t a l s c i e n c e p o s t g r a d u a t e : h e y i t u t o r :us h u w e i q u i n o l o n e s i s a c o mmo n u s e d a n t i b i o t i c i n c l i n i c o n h u ma n a n d a n i ma l s . t h e m i s u n d e r s t a n d i n g i n a n t i b i o t i c u s e l e d t o t h e p r a c t i c a l a b u s e a n d t h e r e s i d u e i n a n i m a l o r i g i n a l p r o d u c t s , a s a r e s u l t o f t h e l a c k o f c h e c k u p o r g a n i z a t i o n , e q u i p m e n t s a n d p e r f e c t d e t e r m i n a t i o n s t a n d a r d . t h u s , i t i s n e c e s s a ry t o s e t u p a n e x a c t c o n v e n i e n t a n d h i g h d e l i c a t e s t a n d a r d . f l u o r e s c e n c e s p e c t r u m i s m o l e c u l a r e m i s s i o n s p e c t r u m o f h i g h d e l i c a c y , g o o d s e l e c t i v i t y , a n d c o n v e n i e n c e w i t h a g r e a t d e v e l o p m e n t i n r e c e n t y e a r s . t h e a n a l y t i c a l m e t h o d s o f f l u o r e s c e n c e s p e c t r a o n t h e s i n g l e o r s e v e r a l q u i n o l o n e s r e s i d u e h a v e b e e n s t u d i e d . t h e e x p e r i m e n t s h o w e d t h a t i n t e n s i t y o f fl u o r e s c e n c e o f e n o x a c i n ( e n x ) i n a n i o n i c s u r f a c t a n t s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e ( s d s ) m i c e ll a r s y s t e m w a s s t r o n g e r t h a n e n o x a c i n a l o n e , w h i c h c o u l d b e s e t u p a s a n e w w a y t o d e t e r m i n e t h e e n o x a c i n , a n d t h e p r i n c i p i u m o f s d s e n h a n c e m e n t w a s d i s c u s s e d . t h e e x p e r im e n t s s h o w e d t h a t s y s t e m a t i c fl u o r e s c e n c e i n t e n s i t y a n d c o n c e n t r a t i o n p re s e n t g o o d l i n e a r re l a t i o n s h i p , w h e n t h e c o n c e n t r a t i o n o f e n o x a c i n w a s 2 . 0 x 1 0 - 7 - 4 .o x 1 0 b m o l / l . t h e d e t e c t i o n l i m i t w a s 1 .4 x 1 0 -8 m o l/ l t h i s c h e c k u p d ir e c tl y e x a m i n e d t h e d e te r m in a t io n o f e n o x a c in in h u m a n u r i n e , w i t h a n a v e r a g e re c o v e ry w i t h i n t h e r a n g e o f 9 5 .0 - 1 0 5 .0 % a n d a r e l a t i v e s t a n d a r d d e v i a t i o n o f 1 . 8 - 2 . 5 %. a n d fl u o r e s c e n c e c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e c o m p l e x o f t e r b i u m ( m) 一 s p a r fl o x a c in h a v e b e e n s t u d i e d . e x p e r i m e n t s h o w e d t h a t t h e r e w a s e n e r g y t r a n s p o r t a t i o n b e t w e e n s p a r f l o x a c i n a n d t b 3 + , w h ic h e n h a n c e d th e p e a k b y 5 0 t im e s . a c c o r d i n g to th i s , a m e t h o d w a s s e t u p , in w h ic h t h e b e s t t e r m w a s p h 5 .6 , t 6 3 c o n c e n tr a ti o n o f 4 .0 x 1 0 -4 m o 1/ , m = 2 7 5 n m / 5 4 5 n m . t h e l in e a r r a n g e w a s 1 x 1 0 阮o l/ l - 1 .5 x 1 0 -5 m o l/ l w i th t h e d e t e c ti o n li m it o f 1 .2 x 1 0 -s m o l/ l . a n e w m e t h o d h a s b e e n d e v e l o p e d f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f s p a r fl o x a c i n i n h u m a n u r i n e , a n d t h e re c o v e r y w a s w i t h in t h e r a n g e o f 9 7 - - 1 0 1 % , a n d r e l a t i v e s t a n d a r d d e v i a t i o n 2 .4 - 3 .0 %. t h e p r i n c i p i u m o f t h e c o m p l e x e n h a n c e m e n t h a s a l s o b e e n s t u d i e d . t h e d e t e r m i n a t i o n o f s e v e r a l q u i n o l o n e s a t t h e s a m e t i me w a s t h e c o m m o n p r o b l e m , w h e n t h e r e m n a n t a n a l y s i s w a s a p p r o a c h i n g . t h e u s e o f m u l t i v a r i a t e c a l i b r a t i o n m e t h o d s a n d fl u o r o s p e c t r o p h o t o m e t ry i n q u i n o l o n e s a n a l y s i s h a s b e e n s t u d i e d t a k i n g f o u r b r a n c h e s s y s t e m o f g a t i fl o x a c i n , o fl o x a c i n , l o m e fl o x a c i n a n d c i p r o fl o x a c i n j e c t i o n s a n d t h e t o w b r a n c h e s s y s t e m o f e n r o fl o x a c i n a n d c i p r o fl o x a c i n i n e g g s a s e x a m p l e s . t h e m u l t i v a r i a t e c a l i b r a t i o n m e t h o d s m a i n l y a d o p t e d w a s m u l t i p l e l i n e a r r e g r e s s i o n ( m l r ) , k m e t r i c m e t h o d ( k ) a n d p m e t r i c m e t h o d ( p ) t o p r o g n o s t i c a t e t h e c o n c e n t r a t i o n o f g a t i fl o x a c i n , o fl o x a c i n , l o m e fl o x a c i n a n d c i p r o fl o x a c i n i n t h e s a m p l e s . t h e e x p e r i m e n t s h o w e d t h a t ml r w a s n o t f i n e , b u t k a n d p w i t h g o o d p r o g n o s t i c a t e d r e s u l t s .t h e r e c o v e r i e s o f t h e f o u r q u i n o l o n e s i n k w e r e w i th i n t h e r a n g e o f 9 3 . 1 - - 1 1 5 .0 % , 9 4 .7 - 1 0 5 .5 % , 9 3 .3 - 1 1 6 .8 % , 9 1 .3 - 1 1 3 . 7 % , a n d 9 2 .3 - 1 1 3 . 8 % , 9 7 . 8 - 1 1 7 . 5 % a , 9 3 . 3 - 1 1 6 . 0 %, 9 6 . 0- 1 1 8 . 7 % i n p . an d t h e n t h e t h r e e mu l t i v a r i a t e c a l ib r a t i o n m e t h o d s w e r e a d o p t e d i n t h e p r o g n o s t i c a t i o n o f t h e d e t e r m i n a t i o n o f e n r o fl o x a c i n a n d c i p r o fl o x a c i n i n t h e s a m e g r o u p o f e g g s . p r o g n o s t i c a t i o n r e c o v e r i e s o f t h e d e t e r m i n a t i o n o f e n r o fl o x a c i n i n t h e s a m p l e w e r e 8 5 .0 % - 1 0 4 .5 % , 9 2 .0 % - - 1 2 5 . 5 %, 9 1 .5 %- -1 2 2 .5 %, a n d 8 0 .0 yo- 1 1 4 .7 %, 9 5 . 2 %- 1 2 2 .4 / o , 8 9 .6 %- 1 1 6 .0 % o f c ip r o fl o x a c i n . i n t h e t h r e e m e t h o d s t h e re l a t i v e s t a n d a r d d e v i a t i o n w a s s m a ll e r in k a n d p t h a n ml r . s o t h e r e s u l t i n k a n d p a r e b e t t e r . wh e n m u l t iv a r i a t e c a l i b r a t i o n m e t h o d s w a s a d o p t e d in t h e p r o g n o s t i c a t io n , t h e l a r g e a m o u n t o f c o m p li c a t e d m a t r i x o p e r a t i o n w a s i n e v i t a b l e . s o t h e s o f tw a r e o f mu l t i v a r i a t e c a l i b r a t i o n me t h o d s o n p h o t o m e t ry a n a l y s i s w a s d e v e l o p e d b a s e d o n m a t l a b , w h i c h i n t e r f a c e d t h e d a t a i n p u t a n d o u t p u t b y t a k i n g g u i ( g r a p h i c a l u s e r i n t e r f a c e s ) a n d w i t h a s i m p l i f i e d o p e r a t i o n . t h e a n a l y s i s m e t h o d s o f f l u o r e s c e n c e s p e c t r a o n t h e s i n g l e o r s e v e r a l q u i n o l o n e s r e s i d u e h a v e b e e n s t u d i e d . t h e m e t h o d s s t u d i e d h e r e a r e a l l o f h i g h d e l i c a c y , l o w d i c t a t i o n l i m i t , a n d l o w c o s t , a n d o f p r a c t i c a l u s e . t h e m e c h a n i s m o f t h e n e w m e t h o d s wa s a l s o s t u d i e d . k e y w o r d s : f l u o ros p e c t r o p h o t o m e t r y ; mi c e l l a r s y s t e m ; t e r b i u m ; q u i n o l o n e s ; f l o x a c i n ; mu l t i v a r i a t e c a l i b r a t i o n m e t h o d s ; mu l t i p l e l i n e a r r e g r e s s i o n ( ml r ) ; k m e t r i c m e t h o d ( k ) ; p m e t r i c m e t h o d ( p ) 哇诺酮类抗生素生物残留的荧光分析法研究 1前言 本研究工作涉及到的哇诺酮类药物是一类广谱抗生素。 目 前人类在使用抗生 素方面，由于一些错误的认识导致了抗生素的滥用。 滥用抗生素的后果十分严重 甚至有致命的威胁。目 前中国每年有 8 万人死于抗生素滥用。 我国己成为世界上 滥用抗生素最为严重的国 家之一i i i 。 抗生素的 副作用会使人体器官受损， 而且滥 用抗生素将会破坏人体正常菌群， 使病菌耐药性增强。 据报道， 1 9 9 3 - 1 9 9 4 年分 离的 革兰氏阴性杆菌对氧氟沙星的耐药率高达9 2 .6 8 % a z 1 。 由 病菌耐药性增强而导 致的疾病几乎无药可治。 喳诺酮类药物作为一类新型的抗生素， 由于其抗菌谱广， 抗菌活性强， 吸收迅速且完全等优点而被临床广泛使用。 因此研究此类药物在人 体组织和体液中的检测方法，对防止抗生素滥用有重要意义。 喳诺酮类抗生素除广泛用于人医临床外， 部分产品已进入兽用领域。 如恩诺 沙星 ( e n r o fl o x a c i n ) 、单诺沙星 ( d a n o fl o x a c i n )和沙拉沙星 ( s a r a fl o x a c i n ) 作 为畜禽专用药在国内外得到了广泛应用。 动物使用哇诺酮类药物后， 一部分药物 残留于动物体内， 造成动物和动物源食品的药物残留; 另一部分药物则以药物原 形或代谢产物的形式随粪便、 尿液等排泄物排出到环境中， 绝大多数喳诺酮类药 物排出到环境中仍具有活性， 可直接污染土壤、 水源、 饲料、 饲草及动物生活环 境， 并 通过食物 链再次 进入 动物体内， 造成动物性食品的 污染与 残留 3 。 我国 动 物源食品中兽药残留己 成为人们普遍关注的关于食品安全的一个社会热点问 题。 它不仅对人民的身体健康造成严重的危害， 还影响我国养殖业的发展和走向国际 市场。2 0 0 3年7月3日，日本以查出 “ 恩诺沙星”残留超标为由，宜布对我国 生产的烤鳗实行“ 命令检查” ， 导致福建烤鳗出口 受阻， 出口 量比2 0 0 2 年同期下 降近五成。 造成哇诺酮类抗生素残留的原因来自 很多方面， 包括缺乏此类药物残 留 必 要 的 检 测 设 备 和 完 善 的 检 测 标 准 4 。 为 此 ， 1 9 9 8 年 农 业 部 发 布了 关 于 开 展 兽药残留检测工作的通知 。 通知 特别要求， 为保证兽药残留检验工作的开展， 各级兽药饲料监察所必须尽快建立完善的兽药残留 检测实验室， 利用现有条件、 设备积极开展兽药残留 监测工作。 此后， 农牧发 ( 1 9 9 9 ) 8 号文发布了 中华人 民 共和国动物及动物源食品中残留 物质监控计划和 官方取样程序 :农牧发 ( 1 9 9 9 ) 1 7 号文发布了 动物性食品中兽药最高残留限量 ， 确定了 动物性食品 中残留最高限量:农牧发 ( 2 0 0 1 ) 2 0 号文发布了 饲料药物添加剂使用规范 ， 哇诺酮类抗生素生物残留的荧光分析法研究 规定了饲料中允许使用的药物添加剂和使用规范: 农牧发 ( 2 0 0 2 ) 1 号文发布了 食品动物禁用的兽药及其他化合物清单 。目 前， 农业部正着手建立兽药安全 体系， 动物源食品中的兽药残留监控是其中一项重要内容。 因此， 建立一种准确、 简便、高灵敏度的喳诺酮类药物的动物和动物源食品残留的检测方法非常必要。 此外，北京大学庄乾坤教授在2 0 0 3 年全国分析化学学科中青年学者研讨会 上作了题为“ 国家自 然科学基金委化学科学部分析化学学科发展战略及优先资助 领域” 的报告。 庄教授在报告中指出分析化学的发展要与国家安全、 国家需求紧 密结合。 其中重要的一项是要加强食品安全与检测的基础研究， 关注滥用药物的 检测与 分析。 喳诺酮类抗生素近年来使用日 益广泛， 用于分析此类药物残留的方法也相继 建 立， 这些方 法主要有荧光分析 法5 1 、 紫 外分光 光度法16 1 、 高效 液相色谱法 h p l c ) 71 等。 其中 荧光分 析法具 有灵敏 度高、 选 择性好、 简便快 速的 优点， 因 此发 展迅 速 。 本课题研究的喳诺酮类抗生素生物残留的荧光分析法正是在这样的背景下 提出的。 本文的研究目的有两个。 第一， 建立一种灵敏度高、可靠性好的喳诺酮 类抗生素检测方法， 以满足生物体内或自 然环境中低含量的此类药物的分析测定 要求: 第二， 建立一种能够同时测定多组分喳诺酮类药物的检测方法，以满足在 实际分析工作中 经常遇到的， 几种喳诺酮类药物同时存在于同一样品中的分析要 求。为了实现以上述两个目 标，本文作了如下研究。 本文首先研究了s d s胶束一依诺沙星体系和试 ( ii i )一司帕沙星体系的荧 光性质。研究发现，由于 s d s和稀土试 ( i i i )的加入，两体系的荧光强度较单 纯哇诺酮体系大幅增加， 据此建立了胶束和稀土增敏哇诺酮荧光分析法， 并成功 应用此二种方法测定了尿样中依诺沙星和司帕沙星的含量。 这两种方法均降低了 喳诺酮类药物的检出限，提高了荧光法在此类药物分析中的灵敏度。 其次， 本文将多元校正与荧光法结合， 实现了多组分哇诺酮类药物白色体系 不经分离同时测定， 并成功测定了 鸡蛋中恩诺沙星和环丙沙星的残留。 但是， 由 于多元校正的计算量巨大，会阻碍此法的推广应用，因此本研究开发了基于 m a t l a b的多元校正辅助光谱分析软件。该软件界面友好，操作简便，极大地 减少了数据处理的工作量，为该法的推广创造了条件。 哇诺酮类抗生素生物残留的荧光分析法研究 本文研究的喳诺酮类抗生素生物残留的 检测方法对防治抗生素污染， 保障人 民群众身体健康， 促进我国养殖业的发展， 确保动物性食品进出口贸易的正常进 行， 突破发达国家对我设置的贸易技术壁垒， 都具有直接的经济效益和广泛的社 会影响。 本研究同时也为人体及动物性食品中喳诺酮类抗生素的检测标准的制定 和完善提供了实验依据。 喳诺酮类抗生素生物残留的荧光分析法研究 2哇诺酮类药物及其分析方法概述 2 . 1喳诺酮类药物概述 喳诺酮类药物 ( q u i n o l o n e s ) ， 属化学合成抗菌药物。由于该类药物中均具有 喳诺酮的基本结构，故由此而得名，如图2 - 1 所示。 孰江 cooh ! r 图2 - 1 哇诺酮的基本结构 本类药物发展至今共经历了四代。1 9 6 2年合成的第一个喳诺酮类药物蔡吮 酸 ( n a l i d i x i c a c i d )为第一代。1 9 7 4年合成了第二代喳诺酮类代表药毗呱酸 ( p i p e m i d i c a c i d ) . 1 9 7 9年合成第一个第三代哇诺酮类药物 诺氟 沙星 ( n o r f l o c a c i n ,氟呱酸) 。 第三代哇诺酮类药物按照药物中 所含氟基团的 数量可 分三类: ( 1 ) 单氟化物:诺氟沙星、环丙沙星、 依诺沙星、氧氟沙星、恩诺沙星等; ( 2 ) 双氟化物:洛美沙星; ( 3 ) 三氟化物:氟罗沙星、托氟沙星。 第三代哇诺酮类药物在结构上的 共同 特征是: 禁咤环的6 位处引入了氟原子， 因而又统称氟喳诺酮类。 并因此结构提高了抗菌活性， 增宽了抗菌谱， 而且使用 方便，成本低廉， 疗效显著， 几乎适用于临床常见的各种细菌感染性疾病。 按国 际非专用药名 ( i n n )命名原则，对该类新药均采用 “ - o x a c i n ” 来定名，以 表示 它们在药理方面的相似性及组群关系。该构词成份在我国音译为 “ 沙星” 此后， 哇诺酮类药物构效关系的 研究进一步展开， 发展到了 第四 代 新喳 诺酮类药物。目前用于临床的第四代哇诺酮类药物主要有:格帕沙星 ( g r e p a fl o x a c i n ) 、曲 伐沙星( t r o v a f l o x a c i n ) 和阿拉曲 沙星( a l a t r a fl o x a c i n ) 、 克 林沙星 ( c l i n a fl o x a c i n ) 、加替沙星 ( g a t i fl o x a c i n ) 等。与前三代相比，第四代哇 唆诺酮类抗生索生物残留的荧光分析法研究 诺酮类药物在抗菌活性、 抗菌范围、 药代动力学性质和血浆半衰期上都有明 显改 变。新的氟喳诺酮类药物已成为一个十分活跃的研究领域。 喳诺酮类药物的作用机制为抑制细菌的d n a旋转酶，影响 d n a的正常形 态与功能， 阻碍d n a的正常复制、 转录、 转运与重组， 从而产生快速杀菌作用。 目 前， 本类药成为化学合成抗感染药物中 发展最为迅速的一类， 并且成为临床治 疗细 菌 感染 性 疾病的 主 要 化 疗 药 物 8 - 1 1 2 . 1 . 1哇诺酮类药物在人体中的不良 反应 随着氟哇诺酮类药物的广泛应用， 细菌耐药和不良 反应也相继发生。 新上市 氟 哇 诺 酮类 如替 马 沙 星 ( t e m a fl o x a c in ) 1 9 9 2 年在 英国 上 市 仅1 5 周 后， 因 发 现 有过 敏、溢血、肾 衰等不良 反应而停用。本类药物可引起中枢神经系统、关节病变、 皮肤及光毒性、胃 肠道反应、 血液系统毒性等副作用 1 2 - i s 2 . 1 .2哇诺酮类药物的动物残留及其对自然环境的影响 近年来， 因哇诺酮类药物在临床及兽医临床大量使用， 尤其是作为添加剂在 饲料中应用越来越多。 哇诺酮类药物进入畜禽体内后: 一部分以原型留在动物体 内造成抗生素残留， 另一部分同 样以原型或代谢物形式经粪便、 尿等排泄到外界 环境， 造成环境污染。 例如， 恩诺沙星在猪体内有5 0 % 转化为环丙沙星; 诺氟沙 星在肉鸡体内有4 种代谢产物，即乙基诺氟沙星、甲酞诺氟沙星、 氨基诺氟沙星 和去乙基诺氟沙星。 当这些抗生素超过环境自 净能力时， 就会对生态环境中的微 生物产生影响。 一方面， 动物排泄物中的这类抗生素， 可以 通过食物链作用于人 体， 使得人体内 耐药菌增加。 另一方面， 这些抗生素随畜禽粪、 尿排泄到环境中， 能长时间保存， 可使环境中的细菌和寄生虫产生耐药性。 这些由动物排泄物所引 起的环境耐药菌，对生活在这一环境中的人类构成极大的威胁。 2 . 1 . 3 本文 所研究的 哇诺酮类 药物简介 本文主要研究了7 种现在广泛用于人医及兽医临床的第三代、 第四代氟哇诺 酮类抗菌药物的荧光特性。 这7 种沙星分别是: 依诺沙星、 司帕沙星、 加替沙星、 氧氟沙星、 洛美沙星、 环丙沙星和恩诺沙星。 其中恩诺沙星是专用兽药， 其它六 哇诺酮类抗生素生物残留的荧光分析法研究 种沙星广泛地用于临 床治疗由 葡萄球菌、 链球菌、 志贺杆菌、 克雷白 杆菌、 大肠 杆菌、 沙雷杆菌、变形杆菌、绿脓杆菌及其他假单胞菌、流感杆菌、不动杆菌、 淋球菌、螺旋杆菌等敏感菌所致的咽喉、 支气管、 肺、 尿路、 前列腺、 胆囊、 肠 道、中耳、 副鼻窦等部位感染，也用于脓皮病及软组织感染。 这7 种沙星的化学 名、分子式、结构式和相对分子量列于表2 - 1 中。 表 2 - 1 药物名化学名 本文所研究的七种沙星简介 分子式结构式相对分子量 依诺沙星 en o x a c i n 1 一 乙 基一 6 氟- 1 , 4 一 二氢 c 1 5 h - 4 - 氧代一 7 - ( 1 - 呢4 f n 4 0 3 基) 1 , 8 - 蔡咤- 3 -酸 n n /、 w. , n, :, i 尸 、子 护 f 一 c 001 1 3 1 9 . 3 7 ( e nx) 。鳅甘 帆扒.下 ;01、 司帕沙星 s p a r fl o - xacm ( s p f x) c , 9 h 22 f z n 4 0 3 i c 石 3 9 2 . 3 1 加替沙星 ga t i fl o - xaci n ( g f l x ) 氧氟沙星 ofl o x a c i n ( o f l x ) 5 一 氨 基 一 1 一 环 丙 基 - 7 - ( )p 式 一 3 , 5 一 二甲 基 - 1 - 呱啧 基- 6 , 8 一 二氟 - 1 , 4 一 二氢-4 - 氧哇诺 琳- 3 - 梭酸 ( 幼 - 1 一 环丙基一 6 - 氟- 8 - 甲氧基一 7 - ( 3 一 甲基一 1 - pr 14 基- 1 , 4 一 二 氢 -4 - 氧代一哇琳接酸 ( 幼 - 9 - 氟- 2 , 3 一 二氢- 3 - 甲基- 1 0 - ( 4 一 甲基- 1 - 呱啧基)- 7 - 氧代一 7 h - n v e 并 l , 2 , 3 - d e - l . 4 苯并嗯嚓 一 狡酸 c i g h 2 2 1 n3 0 4 3 7 5 . 4 0 c 1 8 h 2 o f n3 氏 厂一 h 3c - 气了 cooh 尸飞 3 6 1 . 3 7 哇诺酮类抗生素生物残留的荧光分析法研究 洛美沙星 l o me fl o - xa cl n ( l mx ) 环丙沙星 c i p r o fl o - xac m ( c p f x ) 恩诺沙星 e n r o fl o - xac m ( e n r ) 1 一 乙 基一 6 , 8 一 二氟 - 1 , 4 一 二氢- 7 - ( 3 一 甲基一 1 - 呱啧基) 一氧代一 3 - 哇 啦狡酸 1 一 环丙基一 6氟- 1 , 4 - 二氢- 4 - 氧代- 7 - ( 1 - fr 唉基) 一喳琳狡酸 c 1 7 h1 9 f 2 n3 0 3 必冷 令 cooh 卜 c , h , 3 8 7 . 8 1 c 1 7 h 1 负 高 压 加 。 研究还发现，s d s浓度对 e n x / s d s体系荧光强度有显著影响。随着 s d s 浓 度 增 加， 体 系 荧 光强 度 逐 渐 增 大， 当s d s 浓 度 达 到8 .0 x 1 0 -3 - 1 .0 x 1 护m o l/ l 时 最强， 当s d s 浓度大于1 . 0 x 1 0 z m o l/ l 时， 荧光强 度迅速下降， 如图3 - 4 所示。 这可能是由 于当s d s 达到c m c ( 8 .0 x 1 0 3 m o 1 / l ) 时开始形成胶束 n 1 ，使e n x 的 荧光 强度增强。 本实 验 选择1 .0 x 1 0 -2 m o l/ l s d s 为 最佳使用浓度。 f 1 3 1 2 :; 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 s d s ( 1 0 -3 m o l/ l ) 图3 - 4 s d s浓度的影响 哇诺酮类抗生素生物残留的荧光分析法研究 3 .2 .4标准曲 线 在 最 佳试 验条 件下， 按实 验方 法 测定， 在2 .0 x 1 0 - - 4 .0 x 1 0 一。 呱范围内 ， e n x的浓度与荧光强度呈良 好的线性关系，其线性回归方程为e =0 .9 7 5 c e n x 0 . 2 2 3 , r = 0 . 9 9 9 2 , ( c e n x 单 位1 0 - m o l / l ) 。 在所选的 最 佳实验条件下， 取 1 1 份 空白液， 在x e m = 4 0 5 n m处测定其荧光强度， 如表3 - 3 所示。 计算其标准偏差a, 按 式3 - 1 计 算 其 检出 限 为1 .4 x 1 0 $ m o l/ l . c l = 3 0 / s ( 3 - 1 ) 其中， c l 为 检出 限， 单 位: m o 呱; s为e n x线性回归方 程的 针率; s 为空白 的 标准 偏差 表3 - 3 1 1 份空白溶液的荧光强度 3 .2 .5合成尿样e n x回收率试验 据文献报道，血中 e n x 的半衰期为 3 一6 .7 h ，正常人单次口服剂量为 2 0 0 - 6 0 0 m g 时 ， 1 - 2 小 时 血 浆药 物峰 浓 度可 达1 -4 ,u g /- l ， 据 此 浓 度配 制 合 成 尿 样。 取5 .o m l 1 .0 x 1 0 m o l / l 依诺沙星于5 0 m l 容量瓶中， 用尿液定容， 制成1 .0 x 1 0 - b m o t几的合成尿样。取此合成尿样5 .o m l于l o m l比色管中，按工作曲 线 操作步骤进行， 平行测定5 次， 测定的结果代入线性回归方程中计算尿样中e n x 的含量，同时进行标准回收实验，测定结果见表3 - 4 0 表 3 - 4e n x的测定结果 ( n = 5 ) 本底值加入量测得值平均回收率相对标准偏 样品，、二 _ _ 、， _ 、， _、 ( 1 0 -6 m o 1/l ) ( l 0 -6 m o 1/ l ) ( l e m o l/l )( % )差 ( 肠 2 一 1 ( 1 ) 5 . 0 1 .0 5 .8 9 6 2 . 4 97103 哇诺酮类抗生素生物残留的荧光分析法研究 3 .3 s d s 增敏e n x荧光机理初探 e n x自身能发射荧光，加入适量的s d s 后其荧光激发和发射光谱均显著增 强。 这可能是由于s d s胶束的形成， 对分散和粘接到胶束集的e n x分子起了遮 蔽作用，一方面，减少了碰撞的能量损失，另一方面，可以保护e n x不受溶解 氧的荧光碎灭效应的影响。 同时e n x分子处于更有序的微环境里， 便减小了e n x 分子非辐射去活化过程及荧光碎灭过程的速率， 从而提高荧光量子效率和荧光寿 命， 最终导致荧光增强 1 6 1 唆诺酮类抗生素生物残留的 荧光分析法研究 4诫一司帕沙星体系的荧光特性研究及司帕沙星的测定 目 前 测定司帕 沙星的 方 法已 见 报道的主 要有紫外分 光光度法 1 6 3 1 ， 高 效液相色 谱 法 6 4 1 ， 非 水 滴定 法6 5 1等。 司 帕 沙星 可以 发 射 荧光， 但很 微弱，因 此寻找司 帕 沙星的荧光增敏体系对其分析测定具有重要意义。 稀土离子.1 .b 3 + 已 被广泛用于荧光探针， 这是由 于其 4 f 层电 子的跃迁能发射 线状光谱。当它与适当的有机配体结合后， 其发光强度会大大增强。 本实验研究 了s p f x与t b 3 + 络合体系的 荧光特性， 发现s p f x与th3 + 离子能形成稳定的 络合 物，并出 现t v+ 的强荧光峰，由 此确定了 一个新的 测定s p f x的 方法。 4 . 1实验部分 4 . 1 . 1仪器与试剂 wg y - 1 0型荧光分光光度计 ( 天津港东公司) ，光源为脉冲式氨灯;p h s - 2 5 型自 动电位滴定仪 ( 上海雷磁仪器厂) 。 司帕沙星对照品由中国药品生物制品检定所提供，于1 0 5 干燥至恒重，用 二次 亚 沸蒸 馏 水溶解并加 适量冰醋酸配 成1 .0 x 1 0 3 m o 呱 的 储备 液， 使用时 逐级 稀释至所需浓度。 .h 3 + 储 备 液 ( 4 .0 x 1 0 2 m o 叫: 准 确 称 取9 3 4 .5 m g t b 4 0 7 ( 北 京 方 正 稀 土 科 技 研 究 所有限 公 司 提 供 ) 粉 末于 烧 杯中， 加 入1 5 m l 浓h c l ， 于 沸 水 浴中 加热 至 溶 解， 并将溶液蒸发至近干， 任其自 然冷却至结晶析出， 再用二次去离子水将结晶溶解， 转移至5 0 0 m l 容量瓶中定容至刻度，放在冰箱中保存，用时稀释至所需浓度。 缓冲溶液: 用0 .2 m o u l 的c h 3 0 0 0 h储备液和0 .2 m o l / l的c h 3 0 0 0 n a 溶 液 配 制p h 5 .6 的h a c - n a a c 缓 冲 溶 液。 c h 3 0 0 0 h , c h 3 0 0 0 n a , n a o h , n h 4 c 1 , n a c l , k c i , m9 c 1 2 , z n ( n 0 3 ) 2 1 f e c l : 均为分析纯试剂，实验用水均为二次亚沸蒸馏水。 4 . 1 .2实验方法 于l o m l比 色管中 依次加入s p f x溶液，1 .o m l 4 .0 x 1 0 3 m o l/ l的.h3 + 标准 溶 液， l .o m l p h 5 .6 的h a c - n a a c 缓冲 溶 液， 用 水 稀 释 至 刻 度后 摇 匀， 放 置5 m i n , 在室温条件下于l c m石英比色皿中进行荧光测定. 哇诺酮类抗生素生物残留的荧光分析法研究 4 .2结果与讨论 4 . 2 . 1荧光激发和发射光谱 按照实验方法分别测定s p f x和t b 3 + - s p f x体系的荧光光谱。 测定激发光谱 时s p f x的a e m为5 6 0 n m , t b 3 + - s p f x的x e m为5 4 5 n m ,测定发射光谱时2, e x 均为2 7 5 n m。两体系的激发和发射光谱图如图4 - 1 所示。 可见， 两个体系的激发 光谱基本一致， 最佳激发波长均为2 7 5 n m。 但它们的发射光谱则完全不同， s p f x 的 最大发射波长为5 6 0 n m : t b 3 + g u 发射4 8 7 , 5 4 5 , 5 8 7 , 6 2 0 n m的特征荧光，分 别 对 应于.1 .b 3 十 的s d a 7 f n ( n = 6 , 5 , 4 , 3 ) 跃 迁， 但很 微 弱， 而t .b 3 + - s p f x体 系 出 现t b 3 + 强 特征 荧光 峰， 尤以 试5 4 5 n m的 峰 为 强。 比 较 单一.1 .b 3 + 和.1 .b 3 + - s p f x 体系在5 4 5 n m处的荧光强度，如表4 - 1 所示。可见，后者比前者增强了5 0 倍。 这说明在