（生物化学与分子生物学专业论文）壳寡糖与巨噬细胞结合特性的研究.pdf

塑垩查兰堡主兰垡堡奎 壳寡糖与巨噬细胞结合特性的研究 浙江大学湖滨校区生物化学与分子生物学专业 9 9 级硕士生余琦琦 导师赵鲁杭 摘要 景痧磊；( 自。，年第一届国际几丁质、壳聚糖专题学术研讨 会在美国召开以来，有关几丁质和壳聚糖的研究和开发在国内外得到了广泛 的重视。但由于几丁质和壳聚糖溶解性能差，大大限制了它们的应用。所以， 由几丁质壳聚糖降解制备水溶性的几丁寡糖( o l i g o c h i t i n ) 和壳寡糖 ( o l i g o c h i t o s a n ) 成为几丁质壳聚糖产品的开发和研究的一个重要方向。国 内外许多学者在这方面进行了多年的研究工作，并已使低聚产品产业化。 近年来，随着研究的深入，壳寡糖已被发现有许多独特的生理活性和功 能。如：( 1 ) 分子量较小，易溶于水，有良好的组织相容性。( 2 ) 可提高巨 噬细胞的吞噬功能，抑制肿瘤细胞的生长和转移。( 3 ) 在人体肠道内活化增 殖双歧杆菌、乳酸杆菌，调节肠道的微生物生态平衡。( 4 ) 在体外微酸环境 中具有较强的抑菌抗菌作用，并有显著的保湿、吸湿能力。( 5 ) 可作为植物 功能调节剂，刺激植物生长，增强植物对病虫害的防御能力等。壳寡糖具有 多种功能已被人们所普遍认同，但其确切的作用机制却并不十分清楚。 巨噬细胞( m a c r o p h a g e ) 既是免疫细胞，又是辅佐免疫应答细胞，可通 过吞噬、抗原呈递、分泌细胞因子、激活淋巴细胞和产生活性氧、n o 等作 用而行使抗蹙染、抗肿瘤、免疫应答和免疫调节作用，是机体免疫系统的重 要组成部分。广、r 一一一 l 塑垩盔堂堡主堂焦堡兰 一 本实验观察荧光标记壳寡糖在体外与小鼠腹腔巨噬细胞的结合情况，了 解巨噬细胞壳寡糖结合组分的糖结合特异壁? 并初步探讨壳寡糖与巨噬细胞 结合后的焦曼佳昱途盈通过本实验为进一步阐明壳寡糖对巨噬细胞的鱼鸯 调节枧粤和分离巨噬细胞壳寡糖结合组分提供一定的实验依据，为壳寡糖抗 肿瘤药物和功能食品的开发提供理论依据。这对于浙江省海洋资源的开发利 用具有重要的意义。以上实验内容在国内外的文献检索中未见类似研究报道。 ( 材料和方法1 n i h 小鼠腹腔巨噬细胞的制备：由n i h 小鼠的腹腔 冲洗液制备巨噬细胞。巨噬细胞浓度为l 1 0 6 i l l l 。2 丹磺酰肼标记壳寡糖： 1 6 0m g 壳寡糖溶于lm 1 水，2m l1 新鲜配制的丹磺酰肼，1m l3 三氯乙 酸，将上述三种物质混合，于真空离心机中干燥。3 丹磺酰肼标记的壳寡糖 与巨噬细胞的结合情况：实验组以3 7 5 m m o l l 丹磺酰肼标记的壳寡糖与巨噬 细胞共同培养1 、2 和2 4 小时；以处理过的丹磺酰肼作为对照组。冲洗后于 荧光倒置显微镜下观察实验组和对照组巨噬细胞的荧光强弱差异。4 d ( + ) 一甘露糖、i n v e r t a s e 、b 葡聚糖对丹磺酰肼标记壳寡糖与巨噬细胞结合的影响 作用：实验组先用d ( + ) 一甘露糖、i n v e r t a s e 或b - 葡聚糖作用2 0 分钟，加 入3 7 5 m m o l l 丹磺酰肼标记壳寡糖继续培养2 小时；对照组加入3 7 5 m m o l 1 丹磺酰肼标记壳寡糖，继续培养2 小时。冲洗后在荧光倒置显微镜下观察实 验组和对照组巨噬细胞的荧光强弱差异。5 2 氨基吖啶酮标记壳寡糖：取4 0 0 u l5m m o l l 壳寡糖于0 5m l e p p e n d o r f 管，离心冷冻干燥，加3 0 u l 3 4m m o l l2 一 氨基吖啶酮，1 0 0u l1 0m o l l 硼氢氰化钠，混匀，离心，置于4 5 水浴反 应5 小时，取出，离心冷冻干燥。6 2 氨基吖啶酮标记的壳寡糖与巨噬细胞 的结合情况：实验组以0 2 5 5m m o l l2 - 氨基吖啶酮标记的壳寡糖与巨噬细胞 共同培养2 分钟，5 分钟，3 0 分钟。另取处理过的2 氨基吖啶酮作为对照组。 冲洗后激光扫描共聚焦显微镜下观察实验组和对照组巨噬细胞的荧光强弱的 差异。7 d ( + ) 一甘露糖对2 - 氨基吖啶酮标记壳寡糖与巨噬细胞结合的影响 浙江大学硕士学位论文 作用：实验组先用4 m g m ld ( + ) - 甘露糖作用2 0 分钟，加入0 2 5 5 m m o l l2 一 氨基吖啶酮标记的壳寡糖继续培养3 0 分钟；对照加入0 2 5 5m m o l l2 - 氨基吖 啶酮标记的壳寡糖继续培养3 0 分钟。 冲洗后在激光扫描共聚焦显微镜下观 察实验组和对照组巨噬细胞的荧光强弱差异。结果采用t 检验。8 不同浓度 的壳寡糖对巨噬细胞胞浆游离钙离子浓度的影响：巨噬细胞子3 7 。c 、5 c 0 2 孵箱中培养2 4 小时，冲洗后加入1 0u m o l l f l u o 一3 a m1 0 0u l ，3 7 。c 避光孵 育4 0 分钟。冲洗后后置于激光扫描共聚焦显微镜下，首先测定静息状态下的 巨噬细胞胞浆游离钙水平，之后立即加入1 m g m l 或1 0 m g m l 壳寡糖，监测 不同浓度的壳寡糖对巨噬细胞胞浆游离钙离子浓度的影响。结果采用t 检验。 结果和讨论1 丹磺酰肼标记的壳寡糖与巨噬细胞的结合情况： 观察发现经丹磺酰肼标记的壳寡糖孵育1 、2 、2 4 小时的巨噬细胞，均呈均匀 的翠绿色荧光。实验组和对照组( 2 、2 4 小时) 显示了较大的差别。说明丹 磺酰肼标记的壳寡糖与巨噬细胞有结合，1 小时或更短的时间内进入巨噬细 胞。2 2 氨基吖啶酮标记的壳寡糖与巨噬细胞的结合情况：观察发现经2 一氨 基吖啶酮标记的壳寡糖孵育2 分钟的巨噬细胞，外周呈现一圈荧光且胞内有 少量荧光；孵育5 分钟，胞内荧光增强；孵育3 0 分钟，胞内荧光进一步增强， 细胞呈均匀荧光。对照组无荧光。说明2 氨基吖啶酮标记的壳寡糖可在极短 的时间内( 如2 分钟内) 与巨噬细胞膜有结合，并随时间的进展而展现了一 个内在化过程。丹磺酰肼标记壳寡糖需与巨噬细胞作用1 小时才能较清晰看 见荧光，而2 一氨基吖啶酮标记的壳寡糖只需几分钟，其差异由荧光倒置显微 镜和激光共聚焦显微镜的灵敏度不同造成。3 d ( + ) 甘露糖、i n v e r t a s e 、b 一葡聚糖对丹磺酰肼标记的壳寡糖与巨噬细胞结合的影响作用：观察发现实验 组和对照组巨噬细胞荧光强度无显著差异，即d ( + ) 甘露糖、l n v e r t a s e 、b 一葡聚糖对壳寡糖和巨噬细胞的结合无竞争效应。4 d ( + ) 甘露糖对2 氨基 吖啶酮标记的壳寡糖与巨噬细胞结合的影响作用：肉眼观察实验组和对照组 浙江大学硕士学位论文 巨噬细胞的荧光强度无明显差异。另由扫描数据结果显示：实验组单个巨噬 细胞的荧光强度数据为3 1 6 9 4 9 4 + 4 9 5 1 7 4 ，对照组为3 1 4 0 1 4 3 5 2 0 1 1 1 。经t 检验，p 0 0 5 ，实验组与对照组的荧光强度数据无显著差异，从数据上说明d ( + ) 一甘露糖对壳寡糖和巨噬细胞的结合无竞争效应。5 不同浓度壳寡糖对 巨噬细胞胞浆游离钙离子浓度的影响：肉眼观察，l m g m l 壳寡糖加入前后的 巨噬细胞的荧光强度无明显变化。另由扫描数据结果显示：1 m g m l 壳寡糖加 入前的单个巨噬细胞的荧光强度数据为7 5 6 6 9 2 7 3 4 6 ，加入后为7 40 5 0 2 2 9 5 9 ，经t 检验，p 0 0 5 。说明1 m g m l 壳寡糖加入前后巨噬细胞胞浆游离 钙离子浓度无显著差异；肉眼观察1 0 m g m l 壳寡糖加入后的巨噬细胞的荧光 强度较加入前臣噬细胞的荧光强度明显增强。另由扫描数据结果显示： 1 0 m g m l 壳寡糖加入前的单个巨噬细胞的荧光强度数据为4 2 8 5 8 3 0 6 8 ，加入 后为7 2 4 7 6 5 8 5 7 ，经t 检验，p 0 0 5 ，经d ( + ) 甘露糖处理实验组与对 照组的荧光强度数据无显著差异，即d ( + ) 一甘露糖对壳寡糖和巨噬细胞的 结合无竞争效应。 一一 塑坚奎兰堡主兰垡堡塞 ( 六) 不同浓度的壳寡糖对巨噬细胞胞浆游离钙离子浓度的影响： 图6 ： 塑坚盔堂堡主堂焦丝塞一 图7 ： 1m g m l 壳寡糖对巨噬细胞胞浆游离钙离子浓度的影响 注：图中各曲线代表各个细胞和背景的荧光强度 表3 ：1m g m l 壳寡糖对巨噬细胞胞浆游离钙离子浓度的影响的断层扫描数据 c e l l0 1c e l l0 2c e l l0 3c e l l0 4c e l l0 5 b a c k g r o u d s l i c e sl o c a t i o nc h a n1c h a n1c h a n1c h a n1c h a n1c h a n1 【# 】： 【s l u m ： 0o6 8 4 8 34 2 5 17 3 7 5 9 9 2 7 0 21134 6 52 3 0 6 11 9 9 26 8 3 2 94 1 4 0 37 3 5 7 19 2 3 8 11 1 5 4 0 32 0 2 3 s l i c e sl o c a t i o n 滞】：【s u m ： 23 9 9 5 5 9 8 8 79 9 1 9 ，9 8 4 2 1 9 9 1 2 6 9 8 8 3 1 9 9 6 3 6 9 9 3 4 1 9 9 4 6 9 8 7 5 1 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0 2 9 1 6 6 2 9 3 7 2 9 1 3 1 8 8 9 6 5 2 9 2 3 4 3 9 3 0 6 3 8 9 6 4 1 9 1 2 0 2 9 1 2 8 5 9 0 1 4 1 9 2 2 1 2 9 3 4 1 9 8 9 8 2 1 9 1 6 9 4 9 0 8 7 4 9 1 4 9 2 9 3 7 8 3 9 1 0 9 1 c e l l0 5 c h a n1 1 1 3 3 4 7 1 1 6 9 2 1 1 1 2 9 9 3 1 1 3 1 5 2 1 1 2 5 3 1 1 1 4 6 9 3 1 1 4 5 7 1 1 1 5 5 2 5 1 1 0 6 8 6 1 1 3 8 3 8 1 1 5 3 0 7 1 1 2 1 0 2 1 1 1 5 7 4 1 1 4 2 0 5 1 1 0 5 7 8 1 1 2 3 0 7 1 1 1 6 2 7 1 1 3 4 6 5 1 1 0 3 1 7 1 1 3 9 4 1 1 1 1 2 6 7 1 1 7 3 8 9 1 1 3 7 3 6 1 2 07 2 9 b a c k g r o u d c h a n1 2 1 2 1 2 1 7 2 0 2 8 19 0 7 1 5 9 1 1 4 0 6 1 2 5 7 12 0 1 0 9 8 7 0 8 2 8 1 3 1 1 0 9 8 5 1 4 7 6 1 4 9 1 0 8 9 5 0 9 7 9 1 0 4 1 0 9 5 9 1 2 2 4 1 3 3 4 1 5 7 3 15 2 7 1 1 7 7 1 7 4 9佃”佗他似佰侣仃侣他寻纠挖孙抖拍 浙江大学硕士学位论文 c e l l0 1c e l l0 2e e l l0 3c e l l0 4 s l i c e sl o c a t i o nc h a n1c h a n1c h a n1c h a n1 【撑】：【s u m ： 2 61 2 1 9 9 56 5 8 9 44 2 9 2 67 0 3 2 8 9 1 3 8 6 2 71 2 6 9 9 26 7 3 4 54 1 3 0 56 9 8 7 29 0 9 3 2 2 813 1 9 8 96 6 9 6 84 1 3 6 26 9 2 2 78 9 5 2 913 6 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1 1 13 4 1 0 6 7 1 0 7 5 6 1 1 0 8 9 4 0 8 8 9 4 1 0 3 0 2 0 8 2 6 4 b a c k g r o u d c h a n1 1 0 8 2 1 1 9 0 9 6 4 0 8 9 5 0 9 7 2 1 0 7 7 o 9 5 6 08 7 4 1 1 0 3 0 9 4 9 1 0 0 8 0 9 3 6 1 0 6 9 1 0 2 6 1 0 4 9 1 2 1 3 0 9 6 7 0 9 0 7 1 0 3 1 1 0 9 在激光共聚焦显微镜下观察巨噬细胞的荧光强度：经肉眼观察，l m g m l 壳寡 糖加入前后的巨噬细胞的荧光强度( 呈翠绿色) 无明显变化。另由扫描数据 结果显示：1 m g m l 壳寡糖加入前的单个巨噬细胞的荧光强度数据为7 5 ，6 6 9 + 2 7 3 4 6 ，1 m g m l 壳寡糖加入后的单个巨噬细胞的荧光强度数据为7 4 0 5 0 _ + 2 2 9 5 9 ，经两个样本均数t 检验，p o 0 5 ，说明1 m g m l 壳寡糖加入前后巨噬 细胞胞浆游离钙离子浓度无显著差异。 3 6 浙江大学硕士学位论文 图8 1 0 m g m l 壳寡糖加入后 3 7 塑垩盔堂堕主兰垡途苎 图9 l om m l 壳寡糖对巨噬细胞胞浆游离钙离子浓度的影响 注：图中各曲线代表各个细胞和背景的荧光强度 表4 ：1 0m m l 壳寡糖对巨噬细胞胞浆游离钙离子浓度影响的断层扫描数据 c e l l0 1c e l l0 2c e l l0 3c e l l0 4c e l l0 5b a c k g r o u d s l i c e sl o c a t i o nc h a n1c h a n1c h a n1c h a n1c h a n1 c h a n1 嗍：【s l u m ： 0 0 4 4 4 7 54 4 9 8 1 4 5 3 5 63 8 6 0 74 1 0 3 20 8 3 9 11 9 9 34 7 1 5 54 8 5 2 64 6 3 1 93 8 7 1 54 3 0 1 10 4 2 1 23 9 8 64 4 2 3 64 5 6 94 3 8 5 94 0 2 1 54 0 0 5 60 6 1 2 3 5 9 8 94 7 1 2 14 7 4 8 74 3 5 4 83 9 ，0 9 54 1 7 1 60 7 3 4 3 8 s l i c e s 【撑】： 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 l o c a t i o n 【s u m ： 7 9 9 2 9 9 8 5 2 1 9 9 2 2 6 9 8 9 3 1 9 9 6 3 6 9 9 3 4 1 9 9 1 4 6 9 8 8 5 1 9 9 5 5 6 9 9 2 6 1 9 8 9 6 6 9 8 7 7 1 9 9 4 7 6 9 9 1 8 1 9 9 8 8 6 9 8 5 9 1 9 9 2 9 6 9 9 1 0 1 9 9 7 1 0 6 9 8 4 1 1 1 9 9 1 1 1 6 9 8 8 1 2 1 9 9 6 1 2 6 9 8 3 1 3 2 c e lj0 1 c h a n1 4 7 2 9 4 5 8 1 8 5 5 4 0 7 5 2 8 4 2 5 3 7 9 1 5 4 0 7 1 6 0 3 3 3 6 1 4 6 8 6 5 6 8 6 6 2 9 7 0 2 4 2 6 7 9 9 7 7 0 3 6 8 8 7 5 6 9 4 2 8 6 9 5 8 2 7 1 7 8 5 7 1 3 0 6 7 2 5 4 2 6 8 9 1 9 7 2 0 9 1 7 3 4 6 5 7 2 7 4 1 浙江大学硕士学位论文 c e l l0 2 c h a n1 4 4 1 0 3 4 5 2 5 8 4 8 8 7 4 4 9 3 3 5 5 0 3 1 6 0 2 3 9 6 5 3 6 9 9 9 4 7 3 3 5 2 7 5 5 6 8 7 4 7 9 7 4 9 8 4 7 4 6 7 1 7 65 8 1 7 6 3 8 7 7 7 4 8 1 7 7 5 8 7 7 7 1 3 5 7 7 8 4 5 7 7 5 6 8 7 8 1 8 4 7 8 5 0 3 7 8 1 4 5 7 9 8 3 9 7 8 6 1 3 c e l j0 3 c h a n1 3 9 4 4 4 8 1 4 5 2 7 4 7 2 6 3 4 6 3 9 6 4 4 4 7 4 4 9 6 8 1 5 5 8 8 5 5 8 9 1 9 6 1 4 9 3 6 6 6 1 9 6 9 2 9 3 7 0 6 5 9 6 9 5 0 7 7 1 1 2 7 7 0 0 5 6 7 1 6 3 7 5 1 5 6 7 3 0 5 2 7 3 0 7 7 3 1 8 9 8 6 9 1 5 7 5 8 9 6 7 3 5 3 3 7 5 7 3 7 7 6 - 7 1 9 c e l j0 4 c e l l0 5 c h a n1c h a n1 3 7 9 53 9 9 5 4 4 0 6 2 8 3 9 6 0 3 3 9 9 5 9 4 1 7 6 9 4 8 2 6 4 5 7 2 8 5 6 4 6 5 3 6 7 5 2 1 7 1 0 3 7 7 1 1 7 4 7 5 5 0 8 7 4 7 6 4 7 8 3 9 7 7 8 0 2 9 8 05 7 9 7 9 9 4 6 7 8 6 9 4 7 8 4 7 9 8 1 2 5 2 7 9 0 4 1 7 8 7 9 3 8 0 1 6 9 8 1 4 5 7 9 5 4 5 4 3 0 6 7 3 6 8 6 3 3 9 0 9 1 3 8 3 4 7 4 4 4 8 8 7 4 5 1 2 1 8 5 4 7 0 9 5 5 7 8 6 5 6 1 9 3 5 8 3 7 2 5 9 6 3 2 6 0 ，4 1 8 6 0 4 7 4 6 1 4 4 6 5 9 6 4 6 5 9 3 9 6 6 1 3 5 1 6 2 4 3 5 6 3 3 4 7 6 1 4 8 8 6 3 9 3 3 6 4 3 3 3 6 2 5 5 4 c h a n1 0 9 3 7 0 ，8 7 8 04 4 5 0 4 6 9 0 5 4 0 8 3 3 1 5 7 9 2 3 6 1 2 2 5 1 2 8 1 8 2 7 5 2 2 6 3 3 1 4 9 3 3 5 5 3 7 1 3 3 4 7 5 3 6 4 8 3 4 8 7 3 2 1 5 3 3 6 1 3 1 8 5 3 3 7 9 3 8 2 7 3 7 2 8 3 2 9 9 3 9 6 0 6 6 1 1 7 7 侣竹侣仃侣伯加纠挖捣抖巧筋押捣 浙江大学硕士学位论文 s l i c e s 【# 】： l o c a t i o n 【s u m ： 1 3 6 9 8 7 1 4 1 9 9 4 1 4 6 9 9 2 1 5 1 9 8 9 1 5 6 9 9 6 1 6 1 9 9 3 1 6 6 9 9 1 7 1 9 8 7 1 7 6 9 9 5 1 8 1 9 9 2 1 8 6 9 8 9 1 9 1 9 8 6 1 9 6 9 9 3 2 0 1 9 9 1 2 0 6 9 9 8 2 1 1 9 8 5 2 1 6 9 9 2 c h a n1c h a n1c h a n1c h a n1c h a n1c h a n1 7 3 1 3 1 7 4 3 2 7 7 2 8 8 9 7 4 6 2 6 7 1 4 7 5 7 3 2 6 3 7 4 1 3 1 7 0 5 9 3 7 4 2 8 3 6 9 6 4 7 3 4 1 8 7 2 8 7 2 7 6 1 4 8 7 4 5 2 9 7 4 0 7 1 7 6 4 7 8 7 6 7 7 8 7 8 9 4 2 8 1 6 4 5 7 8 4 8 4 7 8 8 1 9 8 0 3 7 4 7 7 7 5 5 7 9 1 4 2 8 2 0 6 1 8 1 4 0 6 8 0 1 1 3 8 0 0 1 8 0 4 9 4 7 9 4 7 4 7 9 6 0 3 7 9 6 5 2 7 5 7 8 4 7 7 7 8 7 7 5 4 5 6 7 6 4 3 7 8 1 2 7 8 7 7 2 3 3 7 8 1 1 9 7 4 3 8 1 7 6 9 8 9 7 3 5 5 6 7 6 7 1 5 7 5 9 5 6 7 8 7 4 8 7 9 1 0 4 7 7 3 5 2 7 7 6 8 5 7 7 1 7 7 8 2 6 3 7 7 6 9 6 8 4 0 8 3 8 3 9 4 6 8 3 2 3 1 8 0 5 4 1 8 5 2 0 2 8 2 ，7 6 9 8 1 9 7 1 8 3 9 9 2 8 5 4 6 7 7 9 7 5 6 8 5 1 8 2 7 8 4 9 6 8 5 6 0 7 8 2 ，8 5 1 8 2 7 6 9 8 0 9 5 9 8 1 4 8 3 6 5 5 6 8 6 3 1 7 2 6 5 6 8 1 6 5 5 5 1 6 35 3 7 6 6 2 2 8 6 5 5 8 9 6 5 5 8 2 6 6 3 2 6 6 8 4 8 8 6 6 4 0 7 6 8 2 6 5 4 1 4 6 4 7 1 9 6 6 2 1 8 6 6 2 6 6 5 7 5 1 3 4 1 8 3 6 7 8 3 1 3 1 32 4 2 3 2 8 7 3 5 1 9 3 7 1 3 3 1 1 3 31 7 9 3 8 3 3 3 5 5 8 3 9 1 3 3 3 0 4 3 1 3 7 3 1 4 9 3 2 5 4 3 5 9 4 在激光共聚焦显微镜下观察巨噬细胞的荧光强度：肉眼观察 o m g m 壳寡糖 加入后的巨噬细胞的荧光强度较加入前的巨噬细胞的荧光强度明显增强。另 由扫描数据结果显示：l o m g m l 壳寡糖加入前的单个巨噬细胞的荧光强度数 据为4 2 8 5 8 _ + 3 0 6 8 ， o m g m 壳寡糖加入后的单个巨噬细胞的荧光强度数据为 7 2 4 7 6 5 8 5 7 ，经两个样本均数t 检验，p 0 0 5 ，经d ( + ) 甘露糖处理的实验组与对照组的荧光强度数据无显 著差异，即d ( + ) 甘露糖对壳寡糖和巨噬细胞的结合无竞争效应。综上， 壳寡糖与巨噬细胞的结合极可能是通过另外一种受体途径。 目前关于壳寡糖与巨噬细胞结合后，对巨噬细胞信号转导过程有何影响 的研究不够深入，其具体的机制也还不清楚。2 0 0 0 年，t a k e z a w ad 1 2 6 1 发现 壳寡糖可快速诱导小麦培养细胞的一种m r n a 的表达，它可编码分子量为 1 4 k d a 的钙结合蛋白( c c d 1 ) ，提示壳寡糖可能对细胞内的钙离子信号有一 定的诱发作用。几丁质寡聚糖可使转基因悬浮培养表达水母素的大豆细胞胞 浆钙离子升高口”。 巨噬细胞胞浆游离钙离子浓度的改变是细胞生理功能的重要物质基础。 钙离子是肌醇磷脂代谢途径中重要的第二信使，在细胞内信息传递及诱发一 系列功能形态和功能事件中其重要作用。 本实验采用钙离子脂化荧光探针f l u o 3 a m 。钙离子脂化荧光探针f l u o 3 是继第二代钙荧光探针f u r o 一2 之后出现的第三代新型波长荧光指示剂，较前 者f l u o 3 与钙离子结合力更强，而且避免了细胞自身荧光干扰，故被认为是 目前最佳的用于激光光源的荧光染料。f l u o 一3 的乙酰羟甲基酯( a m ) 形式无 荧光，游离态也无荧光，与钙结合后荧光增强5 0 1 0 0 倍，为所有钙荧光探针 中变化最大者，有利于观察钙峰，也不易发生钙缓冲但它与钙离子结合后没 有谱线偏移，因而不能象f u r o - 2 a m 那样获得两个荧光信号的比率而计算出 钙离子的实际浓度，本实验以巨噬细胞内荧光强弱的变化代表巨噬细胞胞浆 游离钙离子浓度的变化。 浙江大学硕士学位论文 现在我们用f l u o 3 a m 预先负载巨噬细胞，然后用不同浓度的壳寡糖作 用臣噬细胞，动态监测壳寡糖对小鼠巨噬细胞胞浆游离钙离子浓度的影响， 以探讨壳寡糖调节巨噬细胞第二信使钙离子的变化机制。 用l m g m l 壳寡糖刺激巨噬细胞时，在激光共聚焦显微镜下观察巨噬细 胞的荧光强度：经肉眼观察，壳寡糖加入前后的巨噬细胞的荧光强度无明显 变化。另由扫描数据结果显示：l m g m l 壳寡糖加入前的单个巨噬细胞的荧光 强度数据为7 5 6 6 9 _ _ _ 2 7 3 4 6 。l m g m l 壳寡糖加入后的单个巨噬细胞的荧光强度 数据为7 4 0 5 0 4 - 2 2 9 5 9 ，经两个样本均数t 检验，p 0 0 5 ，说明壳寡糖加入前 后巨噬细胞胞浆游离钙离子浓度无显著差异，即壳寡糖加入前后巨噬细胞胞 浆游离钙离子浓度无明显变化。用1 0 m g m l 壳寡糖刺激巨噬细胞时，在激光 共聚焦显微镜下观察巨噬细胞的荧光强度；经肉眼观察，壳寡糖加入前的巨 噬细胞的荧光强度较壳寡糖加入后的巨噬细胞的荧光强度明显增强。另由扫 描数据结果显示：壳寡糖加入前的单个巨噬细胞的荧光强度数据为4 2 8 5 8 + _ 3 0 6 8 ，壳寡糖加入后的单个巨噬细胞的荧光强度数据为7 2 4 7 6 _ + 5 8 5 7 ，经两 个样本均数t 检验，p 0 0 1 ，说明壳寡糖加入后巨噬细胞胞浆游离钙离子浓度 有显著差异，壳寡糖加入后巨噬细胞胞浆游离钙离子浓度明显增高( 升高6 9 左右) 。并且巨噬细胞胞浆游离钙离子在1 2 0 s 一1 4 0 s 之间达到高峰，并在接下 来的时间里一直维持在高峰水平。所以综上：不同浓度壳寡糖引起巨噬细胞 胞浆游离钙离子浓度变化的实验表明， 起巨噬细胞胞浆游离钙离子浓度升高， 响。 高浓度的壳寡糖( 1 0m g m 1 ) 可以引 而低浓度的壳寡糖( 1m g m 1 ) 无此影 巨噬细胞可应某些因素刺激而被激活，引起细胞内钙离子浓度迅速升高。 这可以促进p k c 对蛋白质进行磷酸化，调控基因表达和细胞代谢，从而起到 增强免疫，杀瘤灭菌的作用。这与壳寡糖可提高机体免疫功能、促进一些细 胞因子分泌的实验结果相一致。本实验通过壳寡糖引起小鼠腹腔巨噬细胞胞 塑垩盔兰堡主堂焦堡塞 一 浆游离钙离子浓度快速增高的现象，提示这很可能是壳寡糖产生作用的重要 信号转导途径，并直接证明了巨噬细胞是壳寡糖的靶细胞。 结论 1 壳寡糖与巨噬细胞膜有结合，并随时间逐步进入巨噬细胞内。2 d ( + ) - 甘 露糖、i n v e r t a s e 、b 。葡聚糖对壳寡糖和巨噬细胞的结合无竞争效应，提示巨 噬细胞壳寡糖结合组分并非甘露糖受体或c r 3 受体3 1 0 m g m l 壳寡糖可引起 小鼠腹腔巨噬细胞胞浆游离钙离子浓度快速增高，提示这很可能是壳寡糖产 生作用的重要信号转导途径，并直接证明了巨噬细胞是壳寡糖的靶细胞。 参考文献 1 顾其胜，侯春林第六生命要素上海：第二军医大学出版社第一版1 9 9 9 2 顾其胜，侯春林几丁质与医学上海：上海科学技术出版社第一版2 0 0 1 3 s u z u k i k ，t o k o r o a ，o k a w a - y ，s u z u k i s ，s u z u k i m e f f e c to fn a c e t y l c h i t o o l i g o s a c c h a r i d e s o na c t i v a t i o no fp h a g o c y t e s m i c r o b i o l i m m u n 0 1 19 8 6 ；3 0 ( 8 ) ：7 7 7 - 8 7 4 刘艳如，余萍水溶性壳聚糖对小鼠免疫功能与移植性肿瘤的影响福建师 范大学学报1 9 9 9 ；1 5 ( 4 ) ：6 6 - 7 0 5 v a l i s e n a s ，v a r a l d op e ，f o n t a n ar l y s o z y m ei n h i b i t o r s e n h a n c ei m m u n e r e s p o n s ei nm i c e n e wm i c r o b i o l o g i c a 1 9 9 6 ；1 9 ( 1 ) ：2 5 3 0 6 t o k o r o - a ，s u z u k i k ，m a t s u m o t o - t ，m i k a m i - t ，s u z u k i s ，s u z u k i m ， c h e m o t a c t i cr e s p o n s eo fh u m a nn e u t r o p h i l st on - a c e t y lc h i t o h e x a o s ei nv i t r o m i c r o b i o l i m m u n 0 1 1 9 8 8 ；3 2 ( 4 ) ：3 8 7 9 5 7 s u z u k i - k ，m i k a m i t o k a w a - y ，e t a 1 a n t i t u m o re f f e c to fh e x a - n 4 6 塑垩查堂堡! 兰垡笙奎 一 a c e t y l c h i t o h e x a o s e a n dc h i t o h e x a o s e c a r b o h y d r a t er e s e a r c h 1 9 8 6 ；1 5 1 ：4 0 3 4 0 8 8 t o k o r o a ，s u z u k i k ，m i k a m i t , e ta 1 g r o w t h i n h i b i t o r y e f f e c to fh e x a - n a c e t y l c h i t o h e x a o s e a n dc h i t o h e x a o s e a g a i n s t m e t h as o l i d t u m o r c h e m ，p h a r m b u l l1 9 8 8 ；3 6 ( 2 ) ：7 8 4 7 9 0 9 王芳宇，何淑雅，李邦良，费树荣水溶性壳聚糖抗肿瘤作用的实验研究 中国生化药物杂志2 0 0 1 ：2 2 ( 1 ) ：2 1 - 2 2 10 s e ow g ，p a eh o ，k i mn 、o hg s ，p a r ki s ，k i my h ，k i my m ，l e ey h ，j u n c d ，c h a n gh t s y n e r g i s t i cc o o p e r a t i o n b e t w e e nw a t e r - s o l u b l ec h i t o s a n o l i g o m e r sa n di n t e r f e r o n - g a m m af o r i n d u c t i o no fn i t r i co x i d e s y n t h e s i s a n d t u m o r i c i d a l a c t i v i t y i nm u r i n e p e r i t o n e a lm a c r o p h a g e s c a n c e r l e t t e r s 2 0 0 0 ；15 9 ( 2 ) ：18 9 - 9 5 11 杜光，张铭俊，张虎，白雪芳海洋寡糖工程药物壳寡糖制备分离新 工艺及其抗癌活性研究中国微生物学杂志2 0 0 1 ；1 3 ( 1 ) ：5 - 7 1 2 t s u k a d ak ，m a t s u m o t ot , a i z a w ak ，t o k o r oa ，n a r u s er ，s u z u k is ，s u z u k im a n t i m e t a s t a t i ca n dg r o w t h - i n h i b i t o r ye f f e c t so fn a c e t y l c h i t o h e x a o s ei nm i c e b e a r i n g l e w i s l u n gc a r c i n o m a j a p a n e s e j o u r n a lo fc a n c e rr e s e a r c h 1 9 9 0 ； 8 1 ( 3 ) ：2 5 9 - 6 5 1 3 l a i b l e n j ，g e r m a i n e g r b a c t e r i c i d a l a c t i v i t y o fh u m a n l y s o z y m e ， m u r a m i d a s e i n a c t i v el y s o z y m e ，a n dc a t i o n i cp o l y p e p t i d e sa g a i n s ts t r e p t o c o c c u s s a n g u i s a n d s t r e p t o c o c c u s f a e c a l i s ：i n h i b i t i o n b y c h i t i n o l i g o s a c c h a r i d e s 1 n f e c t i o n & l m m u n i t y 1 9 8 5 ；4 8 ( 3 ) ：7 2 0 - 8 1 4 t u k o r o a ，k o b a y a s h i m ，t a t e w a k i n ，s u z u k i - k ，o k a w a - ym i k a m i - t s u z u k i s ， s u z u k i m p r o t e c t i v ee f f e c to f n - a c e t y l c h i t o h e x a o s eo nl i s t e r i a m o n o c y t o g e n e si n f e c t i o ni nm i c e m i c r o b i o l i m m u n 0 1 1 9 8 9 ；3 3 ( 4 ) ：3 5 7 6 7 1 5 h o f f m a n 。j ，j o h a n s e n - a ，s t e i r o k ，g i l d b e r g - a ，s t e n b e r g e ，b o g w a l d - j 4 7 浙江大学硕上学位论文 c h i t o o l i g o s a c c h a r i d e ss t i m u l a t ea t l a n t i cs a l m o n ，s a l m os a l a rl ，h e a dk i d n e yl - e u k o c y t e s t oe n h a n c e ds u p e r o x i d ea n i o n p r o d u c t i o ni nv i t r o c o m p b i o c h e m p h y s i o l b b i o c h e m m o l b i 0 1 1 9 9 7 ；1 1 8 ( 1 1 ：1 0 5 一1 5 16 s t e v e nr h