（环境科学专业论文）利用多种生物标志物识别海水有机磷农药初步研究.pdf

中国海洋大学硕士学位论文：利用多种生物标志物识别海水有机磷农药初步研究 了适于识别海水中o p s 种类的典型特征，只有甲基对硫磷和马拉硫磷浓度小于 1 0 0 i t g l ，毒死蜱浓度在3 0 0 3 5 0 p g l 之间，由于三种酶的活性抑制率之间无显 著差异，无法通过酶的响应值进行鉴别。其它浓度范围都可选择相应的生物标志 物对o p s 进行识别。通过制定的单一种类o p s 的识别路线，采用含有单一o p s 的模拟海水样品，对所制定的识别方法的有效性进行检验，正确识别率达到 7 3 3 。 综上所述，利用多种生物标志物的响应可以对海水中单一o p s 进行快速的 识别，且具有较高的正确识别率，生物标志物法有望为海水中o p s 的定性识别 提供一种简便、快捷的手段。 关键词：生物标志物；有机磷农药；海水；辨识 2 中国海洋大学硕士学位论文：利用多种生物标志物识别海水有机磷农药初步研究 t h ep r eiimin a r ys t u d yo fu sin gav a tie t yo f bio m a r k e r st oid e n tif yo p sint h es e a w a t e r a b s r a c t o r g a n o p h o s p h o r u sp e s t i c i d e s ( o p s ) h a v ec h a r a c t e r i s t i c so fi n s e c t i c i d a lr e s i l i e n ta n d aw i d er a n g eo fa p p l i c a t i o n sa n db e c o m eo n eo ft h em o s tw i d ei n s e c t i c i d e st h a tu s e d i na g r i c u l t u r e ，p e s t i c i d eu s i n gi nt h ep r o c e s s ，晰t l lt h ep r e c i p i t a t i o na n d i r r i g a t i o nw a t e r i nt h es u r f a c et h e yc a nr u no f fi n t or i v e r sa n dl a k e s ，a n de v e n t u a l l yi n t ot h e o c e a n t h e r e f o r e ，t h er a p i dd e v e l o p m e n to fs e n s i t i v ed e t e c t i o nt e c h n i q u ei sv e r y n e c e s s a r y b i o m a r k e ro w i n gt ot h ep r o d u c t i o no fl o wc o s t ，h i g l ls p e e da n a l y s i so ft h e a d v a n t a g e s ，i nt h e m a r i n eo p sa u t o m a t i c ，c o n t i n u o u s ，o n - l i n em e a s u r e m e n th a sa n i m p o r t a n tv a l u e ，m u c ha t t e n t i o n a tp r e s e n t ，b i o m a r k e r s s u c ha sc h o l i n e s t e r a s ei n a n i m a l s c o m m o n l y u s e dt od e s c r i b et h ee n v i r o n m e n to p s p o l l u t i o n l e v e l s h o w e v e r , i n s h o r ew a t e ro f t e nc o n t a i nm o r et h a no n eo ft h eo p s ，a c t i v i t yc h a n g e s o fb i o m a r k e r sr e f l e c tt h et o t a la m o u n to fp e s t i c i d e sa n dc o u l dn o te x p l a i nt h e e x i s t e n c eo fac e r t a i nk i n do fo p si nt h ee n v i r o n m e n t t ot h i se n d ，c o r r e c t l yi d e n t i f y t h et y p eo fo p si nt h es e a w a t e ri sp a r t i c u l a r l yi m p o r t a n t d i f f e r e n tb i o l o g i c a ls o u r c e so fc h o l i n e s t e r a s ep u tu pd i f f e r e n c e ss e n s i t i v i t yt oo p s ， t h i ss t u d yu s e st h r e ed i f f e r e n ts o u r c e so fc h o l i n e s t e r a s e ( a c h ef r o me l e c t r o p h o r u s e l e c t r i c u sa n ds c o m b e r o m o r u sn i p h o n i u s ，b c h ef r o mh o r s es e r u m ) a sb i o m a r k e r sa n d c o m p a r e s t h es e n s i t i v i t i e so ft h e m t o m a l a t h i o n ，m e t h y l p a r a t h i o n a n d c h l o r p y r i f o s ，t h er e s u l t ss h o wt h a tt h es e n s i t i v i t i e so fa c h ef r o ms c o m b e r o m o r u s n i p h o n i u st oc h l o r p y r i f o sa n dm e t h y l - p a r a t h i o nh a v en oi n d i s c r i m i n a t i o n ，b u ts t r o n g e r t h a nt h es e n s i t i v i t i e st om a l a t h i o n ；t h es e n s i t i v i t i e so fa c h ef r o me l e c t r o p h o r u s e l e c t r i c u st om e t h y l - p a r a t h i o na n dm a l a t h i o na r es t r o n g e rt h a nc h l o r p y r i f o s ，b u tn o t m u c hb e l o w ；t h es e n s i t i v i t i e so fb c h et ot h r e eo p sa r ew e a k e r t h ee 妣e n to fc h o l i n e s t e r a s er e s p o n s et ot h eo p si sa f f e c t e db ym a n yn o n b i o l o g i c a l f a c t o r ( t h ew a t e rp h ，i n h i b i t i o no ft i m e ，t e m p e r a t u r e ，e t c ) i nt h i ss t u d y ，s e a w a t e ra st h e m a r x ，o x i d a t e sm e t h y lp a r a t h i o na n dm a l a t h i o nw i t hs o d i u mh y p o c h l o r i t e ( n a c i o ) t o e n h a n c ei t se f f e c to nt h eb c h ef r o mh o r s es e r u m ，o p t i m i z e st h ec o n d i t i o n so ft h r e e 3 中国海洋大学硕士学位论文：利用多种生物标志物识别海水有机磷农药初步研究 b i o m a k e r sr e s p o n s et ot h ed i f f e r e n to fo p s ，t h eg r e a t e s tr e a c t i o nc o n d i t i o n so fa c h e f r o me l e c t r o p h o r u se l e c t r i c u sa n ds c o m b e r o m o r u sn i p h o n i ur e s p o n s et ot h et h r e e p e s t i c i d e sa r ea sf l o w s ：t e m p e r a t u r ei s3 5 3 7 c ，p hv a l u ei s7t o8 , t h er e a c t i o nt i m ei s a tl e a s t3 0 m i n f o rt h eb c h ef r o mh o r s es e r u m ，t h eb e s tp ho fp r e - o x i d a t i o no ft h e t w oo p si s6 , a nf o rc h l o r p y r i f o st h a td o n to x i d a t e ，t h eb e s tp hv a l u ei s7 , t e m p e r a t u r e i s3 5 - 3 7 ，t h er e a c t i o nt i m ei sa tl e a s t3 0 m i n o nt h i sb a s i s ，t h ee l e c t i o no ft h et h r e e c o n d i t i o n sa r es u i t a b l e ( p h = 7 ；t e m p e r a t u r e ：73 5 * c ；t i m e ：3 0m i n ) ，u n d e rt h es a m e c o n d i t i o n s ，s t u d i e s0 1 1t h er e s p o n s e o ft h r e ec h et ot h e s i n g l e o p si nt h e s e a w a t e r w h e nt h ec o n c e n t r a t i o no fp e s t i c i d e si sf r o m10t o5 0 0 g l ，t h e a c t i v i t y i n h i b i t i o nr a t eo ft h et h r e ec h o l i n e s t e r a s ei n c r e a s ew i t ht h ec o n c e n t r a t i o no fp e s t i c i d e s i n c r e a s e d ，b u tt h er e s p o n s ee x i s t e n c e sa r ed i f f e r e n t t h u s ，f m dt h et y p i c a lc h a r a c t e r i s t i c s s u i t a b l ef o rr e c o g n i t i o nt h eo p s ，o n l ym e t h y l - p a r a t h i o na n dm a l a t h i o nc o n c e n t r a t i o n o fl e s st h a nl0 0 t g l ，c h l o r p y r i f o sc o n c e n t r a t i o n si si nt h e3 0 0 3 5 0 嵋几，b e c a u s et h r e e o ft h ei n h i b i t i o nr a t eo ft h ea c t i v i t yw a sn o ts i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n t , s ou n a b l et o i d e n t i f yb yt h er e s p o n s e o t h e rs c o p e o fc o n c e n t r a t i o n sc a ns e l e c tt h ea p p r o p r i a t e b i o m a r k e r st oi d e n t i f yt h eo p s t h r o u g ht h ee s t a b l i s h m e n tl i n eo fas i n g l et y p eo fo p s i d e n t i f i c a t i o n , u s i n gt h es i m u l a t i o ns e a w a t e rs a m p l et h a tc o n t a i n sas i n g l eo p s ，t e s t t h ee f f e c t i v e n e s so ft h ei d e n t i f i c a t i o nm e t h o d t h ec o r r e c ti d e n t i f i c a t i o nr a t ei s7 3 3 i ns h o r t , u s i n gav a r i e t yo fb i o m a r k e r so fr e s p o n s ec a ni d e n t i f yas i n g l eo p si nt h e s e a w a t e rr a p i d l y , a n dh a sah i 曲r a t eo fc o r r e c ti d e n t i f i c a t i o n ，b i o m a r k e r si se x p e c t e dt o b eas i m p l e ，e f f i c i e n tm e a n st oi d e n t i f yo p s q u a l i t a t i v e l yi n t h es e a w a t e r k e y w o r d s ：bio m a r k e r s ： 0 r g a n o p h o s p h o r u s p e s ticid e s ： s e a w a t e r ： l d e n t i f i c a t i o r l 4 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 ( 注；如没直甚他盂要挂别直明数l 奎拦亘窒或其他教育机构的学位或证书使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：4 v 出9 签字日期：挑年b 月i o 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部门或机构( 如中国科学技术信息研究所等) 送交论文的复印件和磁 盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：九c j 廿 导师签字： 签字日期：渺譬年6 月i , oe t签字日期：弘牌6 月t 日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编 中国海洋大学硕士学位论文：利用多种生物标志物识别海水有机磷农药初步研究 1 引言 第一章文献综述 有机磷农药( o p s ) 是德国人于二十世纪三十年代首先合成和使用的一类杀 虫剂【1 1 。过去三十多年来，o p s 由于具有药效高、品种防治对象多、在环境中易 降解、残毒低等特点，而逐步取代曾经大量使用的有机氯农药，成为世界范围内 使用最为广泛的一类杀虫剂，也是目前我国最主要使用的农药之一 2 1 。已经开发 的o p s 有6 0 余种【3 】，其中我国可以生产3 0 多种，产量占全国农药总产量的4 0 以上f 4 】。在农业生产中使用的o p s 占农药总使用量的7 7 7 6 1 5 。 o p s 主要用作农业杀虫剂，少数品种用作杀菌剂、除草剂和脱叶剂1 6 1 。在我 国的渔业生产中，也常使用o p s 试剂( 辛硫磷、马拉硫磷和敌敌畏等) 杀灭水生 动物体外寄生虫等敌害生物。近年来，我国的农药品种结构很不合理，表现为杀 虫剂占农药总量的7 0 ，o p s 占杀虫剂总量的7 0 ，而甲胺磷、甲基对硫磷、对 硫磷、氧化乐果、久效磷等高毒杀虫剂又占o p s 7 0 ，这被称为农药品种结构不 合理的“3 个7 0 ”【7 1 。由于农药品种结构不合理，使用方法不当，以及对农药残留 监管不力，过多过滥使用农药，导致大量o p s 进入河流、湖泊、海洋等各种水体， 对人、动物和环境产生严重危害【8 】。据调查，农田中喷洒的o p s 只有1 0 0 0 - - 2 0 附 着在作物表面，大部分残留在土壤或漂浮在空气中，通过降雨、沉降和径流进入 河流湖泊，并最终汇入海洋，造成地表水的o p s 污染1 9 】。虽然o p s 的半衰期较短， 但是也会危害非靶生物，大多数水生生物对o p s 十分敏感【1 0 】，某些种类的o p s 降 解过程中还能产生毒性更大的产物【1 1 1 。最近二十年，近岸海域的o p s 污染造成鱼、 虾、贝大批死亡的事故频发，近岸养殖品种数量锐减甚至灭绝【1 2 1 ，威胁到海水 养殖业的可持续发展。o p s 不仅污染环境危及生物生长，最终也会通过食物链进 入人体，影响人类健康。 2 有机磷农药的性质及分类 o p s 化学性质一般不稳定，化学结构复杂多变，毒性差异大，易水解，在碱 性条件下易分解，因而不宜和碱性物质混合；易氧化，热分解，在自然环境中的 中国海洋大学硕士学位论文：利用多种生物标志物识别海水有机磷农药初步研究 2 s 、o ( s ) 式中，r l 和r 2 多为甲基和乙基，x 为烷氧基、芳香基、卤素或杂环取代基。 o p s 的毒性与其化学结构有关，大多数种类属于中等毒性和低毒类，少数属 于高毒类。按其化学结构可具体分为六大类【1 5 】，见表1 1 。 表1 - 1 有机磷农药的分类 t a b 1 - 1t h e c a t e g o r yo fo p s 3 有机磷农药的检测技术 2 中国海洋大学硕士学位论文：利用多种生物标志物识别海水有机磷农药初步研究 3 1 常规检测技术 为了减少o p s 污染对海水养殖业造成的损害，开发快速灵敏的监测技术十 分必要。当前针对o p s 的检测方法多种多样，主要分为化学分析法、生物化学 分析法和免疫学法。常规的方法有气相色谱及气质联用检测技术、高效液相色谱 及液质联用检测技术等【1 6 】。这些方法都是利用农药在不同载体中的分配系数不 同而得到分离，从而定性和定量测试农药种类及含量。近年来又出现了固相微萃 取一气相色谱质谱( s p m e g c m s ) 联用、超临界流体色谱( s f c ) 、毛细管区 带电泳( c z e ) 等更加精确的检测方法【1 7 , 1 9 。这些方法虽然具有灵敏度高、准确 性好、监测范围广，能进行农药残留的定性和定量检测等优势。但是，监测过程 中需要对样品进行提取、净化和浓缩，定性与定量则需要昂贵的仪器设备、专门 的操作人员以及严格的操作环境，样品前处理复杂、周期比较长、监测成本高， 不适于进行现场检测，只能在仪器设备齐全的实验室中进行。因此，寻找一种简 便、快速、灵敏、可靠、实用的方法对海水o p s 进行检测非常必要。 3 2 生物标志物法在有机磷农药检测方面的应用 生物标志物( b i o m a r k e r ) 是生物体暴露于亚致死剂量的有毒化合物时，在 分子、细胞、个体等水平上发生异常化的信号指标【1 9 】。这种变化往往先于个体 水平上的严重伤害，适于确定生物体所处的污染状态及潜在危害，为严重毒性伤 害提供早期警报。它克服了常规检测方法的缺点，可以准确快速检i 贝l j o p s 的污染 状况。将生物酶作为生物标志物是目前研究最多且相对成熟的一种对部分农药残 留进行快速监测的技术，也是国内多 b o p s 监测的常用方法。目前，用于o p s 检测 的生物标志物主要有乙酰胆碱酯酶、丁酰胆碱酯酶、抗氧化防御系统、水解酶、 腺苷三磷酸酶等。 3 2 1 乙酰胆碱酯酶 ( 1 ) 分布、结构与功能 乙酰胆碱酯酶( a c l l e ，e c 3 1 1 7 ) 是生物神经传导中的一种关键性的酶， 主要分布于脑、神经细胞和肌肉等组织中【2 啦! 1 。以脑组织中的含量最为丰富。 a c h e 的活性中心由3 个主要区域组成：( 1 ) 酯解部位：含丝氨酸和组氨酸，能与 3 中国海洋大学硕士学位论文：利用多种生物标志物识别海水有机磷农药初步研究 乙酰胆碱的羰基c 原子结合；( 2 ) 阴离子部位：至少含一个羰基，可能来自谷氨 酸，能以静电吸引乙酰胆碱的季铵阳离子基团；( 3 ) 疏水性区域：能与酯解和季 铵基团结合部位连接，由色氨酸或酪氨酸等芳香族氨基酸组成，在与芳香基底物 的结合中起重要作用 2 2 1 。另外，立体结构分析显示，a c h e 最突出的结构特点是 有一深而窄的峡谷，它的活性基团即位于此【2 3 1 。a c h e 主要位于突触后膜，邻近 胆碱受体，能降解乙酰胆碱，终止神经递质对后膜的刺激作用，保证神经冲动在 突触间正常传导【2 0 j 。 一 ( 2 ) 与o p s 的作用机理 o p s 分子中具有亲电子的p 原子和带正电荷部分，当o p s 作用于神经突触中的 a c h e 时，其正电荷部分与a c h e 的负矩部分( 氨基酸残基的侧链羟基) 相结合， 亲电子的p 原子则与酶活性中心丝氨酸残基上的羧基相结合，使丝氨酸发生磷酸 化，生成不可逆的磷酰化酶，阻碍a c h e 对底物乙酰胆碱的催化水解作用，造成 神经递质乙酰胆碱在突触中的积累，随之产生突触后膜去极化，使神经传导不能 进行，最终导致神经传导功能的紊乱 2 4 2 5 1 。 ( 3 ) 对o p s 的响应性能 很多水生生物的a c h e 对o p s 能够产生响应，表现为酶的活性受到抑制( 表 1 2 ) ，一定范围内的o p s 浓度与a c h e 活性抑制程度之间具有良好的线性关系【3 6 】。 这是a c h e 可作为环境中o p s 生物标志物的主要原因。 不同动物的a c h e 活性中心区的阴离子部位与酯解部位的间距不一致，导致 酶的阴离子部位对有机磷化合物的附着能力不同，因而其对o p s 的敏感性存在 差异【3 刀。例如，在相同条件下( 表1 2 ) ，欧洲龙虾( h o m a r u s g a m m a r u s ) 的a c h e 对敌敌畏的敏感性大于菲律宾蛤仔( r u d i t a p e s p h i l i p p i n a r u m ) 。 o p s 与a c h e 的反应时间也会影响酶活抑制率。在一定范围内，随作用时间 延长，酶活抑制率显著上升。例如，相同条件下，电鳗鱼( e l e c t r o p h o r u se l e c t r i c u s ) 的a c h e 与对氧磷作用l o 和3 0m i n 后，酶活抑制率分别为2 5 和7 0 t 3 6 1 。一般 认为，o p s 与a c h e 作用4 0m i n 后，抑制程度即可达到稳定【3 8 】。 4 中国海洋大学硕士学位论文：利用多种生物标志物识别海水有机磷农药初步研究 表1 _ 2 某些种类的o p s 对海洋动物a c h e 的抑制率 t a b 1 2p e r c e n ti n h i b i t i o no f a c h ea c t i v i t yf r o mm a r i n ea n i m a l sb yo p s 3 2 2 丁酰胆碱酯酶 ( 1 ) 分布、结构与功能 丁酰胆碱酯酶( b c h e ，e c3 1 1 8 ) 又称假性胆碱酯酶，属于丝氨酸酯酶家 族，主要分布于血清及肝脏中，肌肉和脑组织中也有少量存在。b c h e 的分子结 构与a c h e 相似，均有一活性中心，包括阴离子部位和酯解部位，酯解部位含有 丝氨酸羟基和组氨酸咪唑基，能催化底物中酯键的水解，形成丁酰胆碱酯酶共价 中间物，然后再释放出游离的胆碱酯酶，从而完成整个催化过程【3 9 1 。b c h e 能与 有机磷毒剂或杀虫剂结合，并能水解许多酯类、肽类及酰胺类化合物，并参与某 些药物的代谢过程，还有促进细胞生长的作用【4 0 】。 ( 2 ) 对o p s 的响应性能 脊椎动物体内主要有两种类型的胆碱酯酶，一种是a c h e ，另一种就是b c h e ， 两者都会受至u o p s 的抑制作用，因此被广泛应用于o p s 的监测。有研究表明，b c h e 对o p s 的敏感性比a c h e 更高【4 。a b d e l h a l i m 等【4 2 1 对埃及杜姆亚特省农药厂排水 渠附近海洋环境中o p s 的分布情况及其对海洋鱼类a c h e 和b c h e 活性的影响进 行了研究，结果表明，1 9 9 9 年春天和2 0 0 0 年秋天海水o p s 总浓度分别为6 7 5 5 p g l 5 中国海洋大学硕士学位论文：利用多种生物标志物识别海水有机磷农药初步研究 和3 0 3 8 “g l ，在这两个季节中鱼体内a c h e 和b c h e 的活性受到了抑制，a c h e 活 性分别为对照组的7 7 1 8 和7 8 6 2 ，而b c h e 活性分别为对照组的5 9 6 7 和 8 5 8 0 ，因此鱼体内两种胆碱酯酶的活性高低与o p s 浓度有直接关系。 3 2 3 抗氧化防御系统 ( 1 ) 组成与功能 抗氧化防御系统是需氧生物在长期进化过程中发展起来的防御过氧化损害 的系统( a n t i o x i d a n td e f e n s e ) ，其组成包括超氧化物歧化酶( s o d )、过氧化 氢酶( c a t ) 、谷胱甘肽过氧化酶( g p x ) 、谷胱甘肽硫转移酶( g s t s ) 等 抗氧化酶和谷胱甘肽( g s h ) 、维生素c 等抗氧化剂【4 3 1 。当生物体内活性氧自 由基生成量增加时，抗氧化酶的活性和部分抗氧化剂的合成随即增加m 4 5 1 。正常 生理条件下，动物体内代谢产生的活性氧可被抗氧化防御系统有效清除h 6 ，4 刀。 s o d ( e c1 11 1 9 ) 能催化生物体内的超氧自由基( 0 2 一) 发生歧化反应， 生成h 2 0 2 与0 2 ，是机体内0 2 一的天然消除剂，对机体细胞起保护作用【4 8 1 。c a t ( e c1 1 1 1 6 ) 的主要功能是清除生物体内的h 2 0 2 ，使其催化分解生成氧和水， 避免h 2 0 2 与0 2 - 在铁螯合物作用下反应生成非常有害的o h l 4 9 , 5 0 ，以此减轻h 2 0 2 对细胞的氧化损伤。g p x ( e c1 1 1 1 9 ) 既可清除有机的过氧化物也可以清除无 机的过氧化物，期间需要消耗谷胱甘肽，谷胱甘肽主要以还原形式( g s h ) 存在， 能够清除亲电子性物质( 如细胞色素p - 4 5 0 系统的代谢产物) ，在g p x 催化作 用下还原型谷胱甘肽( g s h ) 转化为氧化型谷胱甘肽( g s s g ) ，同时将h 2 0 2 转化成h 2 0 ，保护细胞免受氧化损伤，只有g s h 得到源源不断的补充，g p x 的 清除作用才能得到发挥【5 1 1 。g s t s 在哺乳类动物各器官中均有分布，以肝脏中含 量最高，能催化还原型谷胱甘肽( g s h ) 的s h 基结合到疏水化合物上，使亲电 子的化合物变成亲水物质，从而将体内各种有毒物质及亲脂性化合物降解并通过 胆汁或尿液排出【5 2 】。例如，在g s t s 的作用下，二甲基磷酸酯类o p s 脱去一个甲 基，生成甲基谷胱甘肽和相应的脱甲基磷硫化合物【5 3 】。 ( 2 ) 对o p s 的响应性能 水生生物体内抗氧化酶活性和抗氧化剂含量与水体o p s 污染程度有关。o p s 能够诱导促氧化剂产生，使抗氧化酶活性增加，这是一种适应性反应。但是，当 6 中国海洋大学硕士学位论文：利用多种生物标志物识别海水有机磷农药初步研究 o p s 浓度较高时，会对机体产生毒性，抑制酶的活性。m o n t e i r o 等1 5 4 l 通过实验发 现，暴露于浓度2 m g l 的甲基对硫磷9 6 h 后，巴西缺帘鱼( b r y c o nc e p h a l u s ) 体 内不同器官的s o d 、c a t 、g p x 、g s t 和g s h 活性与对照组存在明显差异，其 中，肝脏s o d 、c a t 、g s t 和g s h 分别升高3 4 、1 0 1 、3 4 和4 3 ，肌肉 s o d 、c a t 、g s t 和g s h 分别升高3 8 、1 5 4 、5 7 和5 0 ，鳃的s o d 、c a t 、 g s t 和g s h 分别升高2 8 、3 4 、3 8 和5 0 ；与此相反，肝脏和肌肉中的g p x 活性却分别降低3 0 和3 6 ，鳃的g p x 活性则没有明显变化。o r u c 等【5 5 】在进行 低剂量二嗪哝对鲤鱼( c y p r i n u sc a r p i o ) 体外抑制试验时发现，痕量的二嗪哝均 造成不同器官的s o d 和g p x 活性上升，而且上升幅度一般高于a c h e 活性下降 幅度( 表1 3 ) 。对于c a t ，除了在0 0 1 8 u g l 浓度下暴露5 d 时鳃的c a t 活性 升高5 1 0 9 外，其余器官c a t 均无明显变化。因此，s o d 和g p x 可以作为低 剂量o p s 的敏感生物标志物。 表1 - 3 二嗪哝对鲤鱼不同器官抗氧化酶和乙酰胆碱酯酶的影响 t a b 1 - 3o x i d a t i v eb t r c s sa n da c h ei n h i b i t i o ni nd i f f e r e n tt i s s u e so f c y p r i n u sc a r p i o 下表示活性升高；j ，表示活性抑制。 。 t h es y m b o l1 i n d i c a t e st h a tt h ee n z y m ea c t i v i t yi n c r e a s e s ；l i n d i e a t e st h a tt h ea c t i v i t yi si n h i b i t e d 7 中国海洋大学硕士学位论文：利用多种生物标志物识别海水有机磷农药初步研究 遗憾的是，目前有关o p s 对离体的抗氧化酶或抗氧化剂影响的研究报道不 多。虽然有研究表明，农药在体外代谢过程中，只有在较高浓度时才会对抗氧化 防御系统产生抑制作用，但为了采用敏感的生物标志物更准确地指示o p s 污染状 况，今后应注重加强低浓度o p s 对离体的抗氧化防御系统影响的研究工作。 3 2 4 水解酶 ( 1 ) 分布与功能 在已有的报道中，涉及o p s 的水解酶主要有羧酸酯酶( c a e ) 和磷酸酶两类。 c a e 属于丝氨酸酯酶，主要存在于肝脏中，可以水解羧酸酯键、酰胺键和硫酯键 【5 6 1 。磷酸酯类农药可以直接和c a e 共价结合使其磷酰化；硫代磷酸酯类农药( 马 拉硫磷等) 则需被混合功能氧化酶( m f o ) 氧化脱硫后才能与c a e 结合【5 3 】。磷酸 酶是生物体内重要的解毒酶系，能催化含磷有机化合物的水解。根据发生催化作 用所需的最适p h 值，可分为碱性磷酸酶和酸性磷酸酶两类。 ( 2 ) 对o p s 的响应性能 闰建国等5 6 1 采用急性毒性实验方法研究了久效磷对黄鳝( m o n o p t e r u sa l b u s ) 肝脏、肾脏中羧酸酯酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶以及脑a c h e 的活性影响。结 果表明：暴露于不同浓度的久效磷9 6h 后，肝脏、肾的酸性磷酸酶和肝脏的碱 性磷酸酶活性均升高；肾的碱性磷酸酶活性降低；肝、肾的c a e 活性均受到明 显抑制。在低剂量o 2 5m g l 处理组中，肝和肾的c a e 活性抑制率分别为4 1 1 5 和4 7 8 9 ；而脑a c h e 的活性抑制率仅为1 6 1 6 。可见，鱼类c a e 对o p s 的敏 感性高于a c h e 。这是因为，与一般的脱毒酶( 如o p s 水解酶等) 所具有的对农 药亲和力低、水解能力高的特点不同，c a e 对o p s 的亲和力高、水解能力低， 当o p s 竞争性地与c a e 发生不可逆结合后，其它种类的酶( a c h e 等) 则可免 遭攻击5 7 1 。 3 2 5 腺苷三磷酸酶( n a + l c a t p a s e ) ( 1 ) 分布与功能 n a + k + a t p a s e 几乎存在于所有动物的细胞膜上，是细胞内外n 矿、k + 跨膜转 运体系中的重要酶类。它与其它a t p 酶共同完成细胞内外的离子转运与交换，旨 8 中国海洋大学硕士学位论文：利用多种生物标志物识别海水有机磷农药初步研究 在保持细胞内相对稳定的离子浓度f 5 3 1 。许多研究表明，o p s 可抑制鱼类或甲壳类 动物的a t p 酶活性，并且具有时间和剂量效应关系。 ( 2 ) 对o p s 的响应性能 s a n c h o 等【5 9 】将欧洲鳗鲡( a n g u i l l aa n g u i l l a ) 暴露在含2 0 “g l 的杀螟硫磷体 系中，5 6h 后n a + k + - a t p a s e 的活性降低7 5 ；o l u c 等【5 5 】将鲤鱼( o 矿切淞c a r p i o ) 在二嗪哝中暴露5d ，不同器官的n a + k + a t p a s e 活性变化存在差异，在高浓度 ( 0 0 18 g l ) 下，鳃中n a + k + - a t p a s e 的活性降低4 0 4 ，低浓度( o 0 0 3 6i - t g l ) 下活性升高7 2 2 ，但是肌肉的酶活性在两种情况下仅降低1 2 0 , r 2 3 1 6 。其它 o p s 对鱼鳃的n a + k + - a t p a s e 也存在抑制作用，如乐果可抑制胡鲇( c l a r i a sl a z e r a ) 鳃的n a + k + - a t p a s e 活性，敌百虫可抑制鲤鱼( c y p r i n u sc a r p i o ) 鳃n a w a t p a s e 活性删。因此，鱼鳃的n a + k + - a t p a s e 可以作为o p s 亚致死效应的标志物，用于 o p s 污染的早期监测。 3 2 6 植物酯酶 近年来，部分学者研究发现，o p s 对植物酯酶也会产生抑制作用。其原理也 是利用显色反应中颜色的变化来判断o p s 的污染程度，这种酶来源广泛，价格低 廉，而且具有与胆碱酯酶和o p s 水解酶相似的灵敏度和检测刚6 1 】，适用于快速定 性和半定量监测水中的o p s 残留，对控制污染、预报突发性污染事件有重要意义 和实用价值【6 2 】。但是利用植物酯酶检；! 煲1 o p s 也存在着一定的缺点：测定过程中干 扰因素多、重复性差，植物的组织液、次生物质、叶绿素、花青素等与底物或显 色剂起反应；在没有酶存在时，植物提取液中的吸光度也会随着时间变化，因此 对检测结果产生了很大影响【6 3 , 6 4 。 通过上述几种生物标志物的结构和功能以及其对o p s 响应可以看出，不同种 生物标志物对o p s 的响应存在很大区别，即使是同一种生物标志物来自动物不同 的组织，o p s 对其抑制程度也有差异，很多研究也得出同样的结果，这主要与生 物标志物的分子结构、抑制剂的结构及其空间构象、外界环境等因素有关【6 5 】。 总体上看，国内外生物标志物法检测农药残留所用的生物标志物主要是胆碱 酯酶，因为胆碱酯酶测定方法相对简单，测定条件比其它几种生物标志物容易控 9 中国海洋大学硕士学位论文：利用多种生物标志物识别海水有机磷农药初步研究 制。基于o p s 对胆碱酯酶产生抑制这一原理，目前已开发了o p s 速测卡【6 6 l 、农 残快速检测仪【6 7 1 、生物传感器等快速检测技术6 引。其中，生物传感器大多数以 胆碱酯酶( a c h e 和b c h e ) 为分子识别元件 6 9 , 7 0 。我国农业部和卫生部则将a c h e 和b c h e 规定为o p s 监测的标准酶【7 1 , 7 2 】。 3 3 生物标志物法检测海水有机磷农药存在的问题 目前，利用生物标志物法主要是对o p s 进行定量检测，比较常见的是通过实 验室模拟实验将活体生物暴露于含一定浓度o p s 水样中，测定不同时间生物体内 酶活性变化情况或生物体死亡情况得出半数致死浓度l c 5 0 2 8 , 7 3 】，另外一种方法是 利用在线监测不同季节，不同水域活体生物内各种生物标志物的变化来判断某一 海域一段时间i 为o p s 的污染水平【7 4 1 。生物标志物法对o p s 的定性和识别研究目前 还很少见，利用生物标志物法对o p s 的定量检测对于控制一类o p s 污染具有十分 重要的应用价值，但是判断是何种o p s 污染的最为严重，从源头上控制这种o p s 的排放还存在一定的缺陷。 4 研究目的和主要内容 4 1 研究目的 a c h e 等生物标志物虽然能够对环境中的o p s 产生灵敏快速的响应，但是同 时存在选择性不高的问题。近岸海水中常常含有一种以上的o p s 。由于大多数种 类的o p s 对生物标志物具有抑制作用，生物标志物所体现的活性变化实际上反映 了这一类农药的总量，并不能说明环境中是否存在某一种o p s 。这将限制生物标 志物法的应用范围。为此，正确识别海水中o p s 的种类尤为重要。 长期的研究发现，同一种o p s 对不同种类生物标志物的抑制程度不同，如果 将多种生物标志物同时暴露于组成复杂的海水样品，这些生物标志物应该能够显 示出不同的响应信息，由此可能判断出样品中存在的o p s 种类。基于这种考虑， 本研究拟以不同来源的胆碱酯酶作为生物标志物，在优化多种o p s 对酶活的抑制 条件基础上，获得它们对不同种o p s 的响应特征，进而判断海水中o p s 的种类， 为将生物标志物应用于o p s 快速定性分析提供理论依据。 l o 中国海洋大学硕士学位论文：利用多种生物标志物识别海水有机磷农药初步研究 为了达到上述目的，首先必须确定在同样的条件下哪些胆碱酯酶对o p s 是敏 感的，即使只对一种o p s 敏感也是可取的；然后，优化各种来源的胆碱酯酶工作 条件；最后，在共同的适宜条件下考察这些胆碱酯酶对o p s 的响应特征，并检验 这些特征的实用效果。 4 2 研究内容 ( 1 ) 初步比较不同来源的胆碱酯酶( 鲅鱼a c h e 、电鳗a c h e 、马血清b c l l e ) 对三种o p s ( 甲基对硫磷、马拉硫磷、毒死蜱) 的敏感性，以期寻找更多的敏感 酶用于海水o p s 的快速检测。 ( 2 ) 三种o p s 对不同来源的胆碱酯酶的最佳抑制条件( 抑制时间、温度、 p h 值) 优化。 ( 3 ) 在优化的条件下，研究了三种o p s 对多种胆碱酯酶的抑制效应，得出 响应特征曲线，提取可用于o p s 种类识别的有用信息。 ( 4 ) 配制一定浓度的三种o p s ，利用三种胆碱酯酶的抑制率对其进行识别， 根据所得结果与上述响应规律进行比较，判断是何种o p s ，检验多种胆碱酯酶识 别海水中o p s 的准确性。 参考文献 【l 】于丽娜，汪东风，苏琳食品中有机磷农药残留的快速检测方法们粮油食品科 技，2 0 0 5 ，13 ( 2 )