（环境科学专业论文）土壤四环素和金霉污染的分子毒理与环境质量基准研究.pdf

摘要 结合他人对人体毒理研究的部分成果，分析了四环素对人体的健康效应，并最 终根据毒理试验的数据推导出四环素和金霉素对蚯蚓的土壤环境质量基准推荐 值，分别为0 0 2 6m g k g 和0 2 8m g k g 。 关键词：四环素，金霉素，酶活性，d n a 损伤，基因表达 i i a b s t r a c t a b s t r a c t t e t r a c y c l i n e ( t c ) a n dc h l o r o t e t r a c y c l i n e ( c t c ) a r et w ob r o a ds p e c t r u ma n t i b i o t i c st h a t i t sa n di t sm e t a b o l i t e se x i s t si ne n v i r o n m e n tm e d i u mw i d e s p r e a db e c a u s eo ft h e p e r s o n a lc a r ea n dl i v e s t o c kf a r m i n gs y s t e m sa b u s e g r a d u a l l yt h et o x i ce f f e c t so n e n v i r o n m e n t a lb i o l o g yw e r ep r e s e n t e d ，a p p e a r i n gp o t e n t i a le c o l o g i c a lr i s k st oh u m a n b e i n g s t h r o u g ht h es t u d yo fm o l e c u l a rt o x i c i t yt ob i o l o g yi ns o i l ，o nt h eo n eh a n d ，i t w i l lh e l pu n d e r s t a n dt h ep o i s o nc o n c e n t r a t i o nl e v e lo fa n t i b i o t i c si n s o i l ，l a yt h e f o u n d a t i o nt oa s s e s st h ee c o l o g i c a lr i s k sa n dp r o v i d eb a s i cd a t af o rs o i le n v i r o n m e n t a l b e n c h m a r k o nt h eo t h e rh a n d ，i ti si m p o r t a n tt ob u i l dm o r ea c c u r a t ea n ds e n s i t i v e i n d e x e sa n dm e t h o d sf o rt i m e l ym o n i t o r i n gs o i le n v i r o n m e n t ，a v o i d i n go rr e d u c i n g t h ee n v i r o n m e n tc o n t a m i n a t i o n t h et o x i c i t yi nd i f f e r e n tl e v e lo ns o i lm o d e l o r g a n i s m se a r t h w o r me x p o s e dt ot w oa n t i b i o t i c sw e r ec o n s i d e r e di nt h i sr e s e a r c h s p e c i f i c a l l y , t h ee f f e c t so ft ca n dc t co nt h ea c u t ed e a t h ，a n t i o x i d a n te n z y m e s s y s t e m ，t h ed n ad a m a g ea n dt h ee x p r e s s i o no fs o m eg e n e sa se n d p o i n t sw e r es t u d i e d i nt h i s p a p e r t h er e s u l t sw e r es u m m a r i z e d a sf o l l o w s i nd i v i d u a l l e v e l ，n o e a r t h w o r m sa c u t el e t h a le f f e c tw a sp r o d u c e db yt ca n dc t ci nt h ec o n c e n t r a t i o n r a n g ew e c o n d u c t i ti n d i c a t e dt h a tt ca n dc t c b e l o n g st ol o wt o x i c i t yc o n t a m i n a n t s i nt h es o i l d i s t i n g u i s h i n gr e s p o n s e so fa n t i o x i d a n te n z y m e sa c t i v i t i e sa n dt h e v a r i a t i o no ft h em d ac o n t e n tw e r ei n d u c e db yd i f f e r e n te x p o s u r et i m ea n dd i f f e r e n t d o s e st oe a r t h w o r m s b u tt h e r ei sn o to b v i o u sd o s e - d e p e n d e n tm a n n e r f r o mt h et c c o n c e n t r a t i o no f3 m g k g ，m d ac o n t e n t ，c a t a l a s e ( c a t ) a n ds u p e r o x i d e d i s m u t a s e ( s o d ) e n z y m ea c t i v i t ys t a r t e dt or e s p o n s e h o w e v e r , r e s p o n s eg r a d u a l l y d i s a p p e a r e da l o n gw i t ht h ei n c r e a s eo ft h ee x p o s u r et i m e n or e s p o n s ew a so b s e r v e d b yp e r o x i d a s e ( p o d ) a c t i v i t y t h es e n s i t i v i t yo ft h r e ee n z y m e sw e r e ，s o d c a t p o d f o rc t c ，p o de n z y m e si ne a r t h w o r me x p o s e df o r7d a y sh a v es i g n i f i c a n t i n h i b i t e d a n dw h e ne x p o s e df o r2 8d a y s ，c a te n z y m eb e g a nt ob ei n d u c e d t h e s e n s i t i v i t yo ft h r e ee n z y m e sw e r e ，c a t p o d s o d b o t ht ca n dc t ch a v ec e l l t o x i c i t yf o re a r t h w o r m s ，t h a tl o wc o n c e n t r a t i o n c a l lc a u s ed n ad a m a g et o c o e l o m o c y t ec e l l so fe a r t h w o r m s d n ad a m a g ew a sa g g r a v a t e da c c o r d i n g l ya l o n g i i i a b s t r a c t w i t hi n c r e a s e de x p o s u r ec o n c e n t r a t i o n a n dt h e r ei sas i g n i f i c a n td o s e - d e p e n d e n t r e l a t i o n sb e t w e e nd n a d a m a g ea n de x p o s u r ed o s e w ef i n dt h a tl a r g e rd a m a g ew a s i n d u c e db yc t ct h a nt c t h ed n a d a m a g eo nc o e l o m o c y t ec e l l so fe a r t h w o r m s h a v eas e n s i t i v er e s p o n s et ot ca n dc t c w ea l s oa n a l y z e dt h ei n f l u e n c eo fs o d m r n a ，c a tm r n aa n dh s p 7 0m r n ae x p r e s s i o ni ne a r t h w o r m se x p o s e dt ot c t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ，u n d e rt h ec o n d i t i o no fe x p o s u r et ot e t r a c y c l i n e ，t h es o d ， c a ta n dh s p 7 0m r n ao fe a r t h w o r m se x p r e s s e dar e s p o n s e t h ee x p r e s s i o no fc a t m r n aw a si n d u c e do v e r a l lu n d e rs o m ee x p o s u r ed o s e s t h eg e n e r a lt r e n do fs o d m r n aa n dh s pm r n ae x p r e s s i o ni si n h i b i t i o n t h er e s p o n s eo fh s p 7 0m r n a e x p r e s s i o na sa ni n d i c a t o rt ot e t r a c y c l i n ew a sm o r es e n s i t i v e ，c o m p a r a b l y h o w e v e r , t h es o dm r n a ，c a tm r n aa n dh s p 7 0m r n ae x p r e s s i o ni ne a r t h w o r m sa n dt h e t e t r a c y c l i n e c o n c e n t r a t i o nd i dn o ts h o wc l e a rd o s e - e f f e c tr e l a t i o n su n d e rt h e e x p e r i m e n tc o n d i t i o n a tt h ef i n a l ，t h et e t r a c y c l i n ee f f e c t s t oh u m a nh e a l t hw e r e s u m m a r i z e db yc o n s u l t i n gh ea c h i e v e m e n t so fo t h e r so nt h ea r e ao fh e a l t ht o x i c o l o g y a n d e v e n t u a l l y , t h es o i le n v i r o n m e n t a lq u a l i t ys t a n d a r d sr e c o m m e n dv a l u eo ft ca n d c t cw e r ed e r i v e d ，w h i c hi sa c c o r d i n gt ot h et o x i c o l o g i c a lt e s td a t ao ft h ee a r t h w o r m s ， a n dt h er e s u l t sw e r eo 0 2 6m g k ga n d0 2 8m g k g k e yw o r d s ：t e t r a c y c l i n e ，c h l o r o t e t r a c y c l i n e ，e n z y m ea c t i v i t y ，d n ad a m a g e ，g e n e e x p r e s s i o n i v 第一章引言 第一章引言 近年来，用以治疗人类和动物疾病的抗生素的使用量迅速增加【l 】。全球每年 至少一半的抗生素用于养殖业，主要是以添加到饲料中的形式来预防动物疾病， 并促其生长，或在水产业中用于控制细菌 2 3 】。其中四环素、土霉素和金霉素应 用最广泛使用量最大【4 】。但是由于早期缺乏完善配套的环境检测监测体系与相应 的法律法规监管制度，在发现其对生态环境和人类健康具有潜在有害影响时， 这类化合物已经通过多种途径进入环境。抗生素作为环境外源性污染物，可通 过食物链影响植物、动物和微生物的正常生命活动，对生态系统产生副作用， 并可能对人类的健康造成未知影响【5 】。其环境污染及生态毒理效应现己成为我国 乃至全球亟待解决的重大环境问题之一，是国内外科学工作者研究的热点内容。 因此，建立精确、敏感的生态毒理指标和方法，对土壤环境中低浓度长期暴露 的典型抗生素的分子毒性进行诊断十分必要【6 ，为评估抗生素的生态风险，制定 土壤环境质量基准提供科学依据。本文主要以四环素与金霉素为研究对象。 1 1 1 理化性质 第一节四环素和金霉素的基本情况 四环素和金霉素具有极为相似的化学结构，但是取代基有所不同。两种抗生素 均含有酰氨基，二甲胺基，酚羟基 7 】等功能团。两种抗生素通常在实际应用中使 用其盐酸盐形式。据报道，此类化合物的盐酸盐在水溶液中溶解度很大【8 】，能够 与重金属阳离子，如c a 2 + ，m 9 2 + ，a 1 3 十，f e 3 十形成稳定的2 ：1 型复合物【9 】。 通常条件下，四环素类抗生素不易被生物降解，因此土壤中微生物并不能有效 地减少土壤环境中四环素和金霉素的残留。而非生物降解主要取决于氧化还原 状况、d h 值和光照【1 2 】，所以该抗生素的降解情况依不同的土壤环境而定。在过 去的研究中表明，与其他抗生素相比，四环素类抗生素在土壤中是不易降解的 【”】，因此，此类抗生素将更容易在土壤环境中累积，形成假持续状态。 第一章引言 1 1 2 四环素和金霉素的污染来源 四环素和金霉素能够通过多种途径进入土壤环境，其主要途径为以下几个 方面。 第一，农用抗生素一般是土壤环境污染的主要来源。抗生素作为促生长剂 被动物摄入后并不完全被吸收【l4 1 ，除少量残留在动物体内，大部分则以原形或 代谢物的形式随畜禽粪便排泄出来。据统计，对畜禽使用的抗生素有四分之一 至四分之三的比例以原形药物的形式排泄出【1 5 。1 7 】，有些抗生素水溶性较好，在 排出物中原形药物的比例甚至能超过九成 18 1 。研究中发现，幼公牛能够够将金 霉素添加量的1 7 7 5 排出体外 1 9 】。美国每年用约1 万吨以上的抗生素，从 养殖业流入环境的就占大半【2 0 1 。 我国是养殖大国，畜禽粪便的产出量相当可观。四环素和金霉素的水溶性 好，水产养殖用药的大部分也都随饲料或粪便进入水体或沉入底泥 2 1 1 。 第二，医用抗生素是另一个污染源。据统计，1 9 9 9 年欧盟医用抗生素消耗 将近8 7 0 0 吨。我国患者抗生素药物使用率远远高于国际水平。据r o m a n 等【2 2 】 报道，四环素类抗生素被人服用后排出物中原形形式的四环素和金霉素占比例 分别均大于7 0 。 由于大量抗生素通过各种途径持续进入土壤，很容易在土壤中累积，所以 四环素和金霉素的土壤残留情况非常值得引起重视。 1 1 3 四环素和金霉素的环境污染水平 目前在土壤、水体等环境介质中被检测到的四环素和金霉素残留浓度从微 克级到克级不等。a g a 等【2 3 】将粪便肥料施入土壤若干天后发现表层土壤中四环 素及总含量约为2 8 0m g a g 。h a m s c h e r 等【2 4 】报道，类似的，土壤表层用动物排泄 物施肥后检测到金霉素残留量已达到几十m g k g 2 5 j 。h a m s c h e r 还研究了土壤长 期施用养猪场的猪粪尿后，含四环素和金霉素的情况，四环素在土壤表层0 1 0 c m 中含量为8 6 21 a g k g ，1 0 - - 2 0c m 为1 9 8 7i t g k g ，2 0 3 0c r n 为1 7 1 7p g k g ， 不同深度土壤中四环素的含量差别较大，而金霉素在这三层土壤中的浓度分别 为4 6 7 3 t g k g ；德国土壤中检测到四环素类的抗生素如四环素和金霉素的含 量约为9 0 0f t g k g 【26 i 。 近年针对北京和天津近郊的研究发现，一些用生活废水、猪粪肥和污泥灌 2 第一章引言 溉的农用土壤中四环素的浓度达到了1 1 9 3 0 7m g k g 27 1 。我国禽畜粪便中检测到 的四环素浓度平均为1 9 3 4m g k g ，处于较高水平，这可能与此类抗生素的使用 量大、使用范围广有密切的关系。 第二节四环素和金霉素的毒性效应 如前所述，施用促长剂以及动物粪时，其所含的抗生素随之转移到环境介 质中，可能通过食物链对对环境中的生物或人类健康所造成危害，因此有必要 研究抗生素的毒性效应。然而目前国际上对这方面的研究报导不多，尤其对土 壤环境，可利用的生态毒性数据较少【2 8 】。 1 2 1 四环素和金霉素对生物个体水平的毒性 一般来讲，污染物对动物个体水平的影响主要有个体死亡、繁殖下降、生 长抑制和代谢变化等几个方面。个体水平毒性测试最常用的参数有半数致死剂 量或浓度l d 5 0 、l c 5 0 ，半数效应浓度e c 5 0 ，半数抑制浓度i c 5 0 ，最高无效应浓 度n o e c 等。 b a c k h a u s 等 2 9 研究了常用抗生素对费氏弧菌的长期生物发光抑制的影响， 发现盐酸四环素对该类细菌具有较强毒性，能够干扰其蛋白质以及d n a r n a 的合成，e c 5 0 小于lm g l 。其e c 9 0 、e c 5 0 、e c l o 分别为0 0 7 3 8m g l 、0 0 2 5 1 m g l 和0 0 0 4 6m g l 。h o l t e n 等【3 0 】发现，铜绿微囊藻对四环素类药物的敏感性相 比绿藻要高，其中金霉素对铜绿微囊藻和绿藻的e c 5 0 分别为o 0 5m g l 和3 1 m g l ；四环素则为0 0 9m g l 和2 2m g l 。主要是因为铜绿微囊藻属于较易抑制 其蛋白质合成的原核生物；而绿藻属于组成复杂的真核生物，较高浓度的抗生 素才能产生抑制作用。f e r r e i r a 等【3 1 】依据藻类生长抑制测试中的推荐方法， 研究了扁藻受到四环素胁迫后的生长效应。通过9 6h 暴露，在四环素浓度大于5 3 m g l 的溶液中扁藻的生长抑制显著，最高无效应浓度值为3 6m g l - 1 , 最低效应 浓度值为5 3m g l 一，7 2h 及9 6h 的i c 5 0 值分别为1 3 1 6m g l q 和1 1 1 8m g l 。 很明显，对水生藻类植物来说，四环素属于较强毒性的污染物。一般抗生素对 水生甲壳动物产生毒性的浓度要比细菌和藻类高几个数量级。w o l l e n b e r g e r 等【3 j 研究了四环素对渔场中淡水甲壳动物大型蚤的急慢性毒性。结果显示，四环素 3 第一章引言 对母体动物繁殖产量的无效应浓度为3 4 0m g l 。而四环素的慢性毒性e c 5 0 值约 为4 5m g l 。 四环素和金霉素对植物的生长也可能会产生不利影响。b a t c h e l d e r 3 3 】发现砂 壤中四环素能够降低斑豆产量；杂色豆的生长也明显受到了金霉素的干扰，植 株的鲜重、对钙钾镁的吸收均受到不同程度的影响【34 1 。通过研究还发现，四环 素类抗生素根据介质的不同而体现出不同的毒性。一般在溶液条件下，较低的 抗生素浓度就能够对植物产生毒害作用。鲍艳宇等【35 】报道四环素在水溶液中对 小麦根伸长的i c 5 0 值为5 8 3 9m g l ( g ，而在土壤中四环素对小麦根伸长的i c 5 0 值 约为1 2 7g a g 。在相似的研究中，b a t c h e l d e r 3 6 】研究了金霉素分别对生长不同介 质中的植物表现出的不同毒性作用。研究发现金霉素营养液以1 6 0m g l 的浓度 处理时，红扁豆即全部死亡，对金霉素很敏感；低浓度处理时，根生长和植株 干重也明显降低。但是，在土壤中对其进行相应浓度的处理则没有产生明显的 毒性效应，只有很高浓度的金霉素才会对植物产生毒害作用。目前的研究主要 集中于水生生物生态毒性，对于土壤生物的研究不多。土壤环境较水体环境要 复杂得多，四环素和金霉素的吸附解吸作用明显，土壤环境虽然有一定的缓冲 作用，弱化了污染物的毒性效应，但容易被忽略的是，没有肉眼可见的生物个 体伤害并不代表该污染物对生物体没有毒性效应。同时，污染物的环境化学行 为不易控制，土壤环境参数的改变可能导致其化学形态的变化，待出现群落和 种群水平的毒性效应时说明污染已经非常严重，可能对生态环境已造成了不可 逆的损害，所以需要建立更敏感的测试指标来预警陆地生态危害的发生。 1 2 2 四环素和金霉素的生物分子毒性 从已有文献来看，国内外大部分对于四环素和金霉素的毒理效应研究都还 处在个体水平，并利用急性毒性试验的生物检测指标来判断污染物的毒性效应。 实践表明，急性毒性实验更适用于高污染介质的毒性评价，对于低水平持续的环 境污染评价则显得无能为力。因此，需要建立更精确、敏感的生态毒理指标和 方法，来对土壤环境抗生素的生态毒性效应及危害的进行诊断【3 7 】。 1 2 2 1 分子标记物 生物标志物可以灵敏地检测到环境中一种或多种潜在低剂量污染物的暴 露，在不同水平上指示剂量效应关系，可用作污染的早期预警3 8 3 9 】。虽然生态 4 第一章引言 系统各生物组分对污染物能从不同水平上进行响应，但现在研究普遍认为，污染 物对生态系统的早期影响必然是从分子水平上开始，接着逐步向更高水平蔓延， 从细胞、器官、个体、种群甚至生态系统等多水平上反映【4 0 1 。一般把可检测的 蛋白质和核酸水平的标记物称为分子标记物( m o l e c u l a rm a r k e r ) 。分子标记物比 一般生物标志物更加敏感，可探讨并预测更低剂量的污染物对机体的长期影响 和潜在危害，从而防止慢性毒作用的发生。如很多污染物会导致代谢酶活性大 幅变化，d n a 损伤，基因表达异常这些分子毒性机制的发生【4 1 1 。显然，提前掌 握生物标记物的状况具有重要意义。 1 2 2 2 代谢水平毒性 酶在生物机体的生化过程起着重要的作用，是构成生命活动的基础。污染 物进入机体后，产生的自由基一方面导致酶活性改变，另一方面在酶的催化作用 下进行代谢转化。许多污染物的毒作用就是与酶分子相互作用影响其表达量和 活性，引发体内一系列生化变化，从而引起毒性效应，如抗氧化防御系统各种酶 活性的变化。细胞色素p 4 5 0 酶系、生物转化酶如谷胱甘肽硫转移酶( g s t ) 等都 对污染物的毒理过程发挥重要作用，早期的生化反应是评估环境的潜在危害相 当重要的信息。因此，可以将这些生物分子的响应作为污染物暴露的生物标志 物。 有研究发现，将含有金霉素的牲畜粪便作为鱼饲料投喂后，可以诱导鲤鱼 肝脏内s o d 活性 4 2 】。种在金霉素处理过的土壤上的玉米，其g s t 和过氧化物酶 ( p o d ) 活性都呈明显增高趋势。b r a d e l 掣4 3 】研究表明，四环素的含量达到o 0 0 9 m g k g - - o 0 1 2m g l ( g 时，猩猩木( e u p h o r b i a p u l c h e r r i m a ) 体内的酶活性即会受到抑 制。通过m i g l i o r e 等的研究结果发现，植物积累抗生素的主要部位是根部。 四环素能够抑制紫花苜蓿的叶绿体翻译活性及叶绿体合酶的活性【4 孓4 6 1 。b a b i n 等 【4 7 】在研究一系列浓度梯度的四环素对鱼的毒性时设置了e r o d 活性、1 3 半乳糖 苷酶活性作为毒性端点。结果观察到四环素能够对酶活性产生抑制，其中e r o d 的i c s o 为1 6 7 6 3m g l ，苷酶的i c s o 则达到8 4 5 9m e , l 。 一般情况下，脂质过氧化程度通过测定脂质过氧化最终产物丙二醛( m d a ) 的含量来确定。丙二醛可与不饱和脂肪酸、蛋白质和氨基酸等生物大分子发生 反应，破坏硫氢基，并生成具有共轭双键的s c i f f 碱基( n = c c = c n ) ，阻止脂 类的合成。m d a 也逐渐被广泛地作为标记物参与毒理学的研究。 5 第一章引言 1 2 2 3 生物大分子水平的毒性 蛋白质中许多氨基酸带有如羟基，胍基，氨基等的活性基团，在维持酶催 化活性和蛋白质构型中起重要作用。但同时污染物也易与这些活性基团发生反 应，引起一系列的生物学后果，如导致蛋白质或细胞膜化学损伤，最终可导致 细胞死亡和组织坏死。 d n a 分子可以受到不同途径的损伤，如正常细胞活动中的损伤，外源化合 物及其活性代谢产物与d n a 结合等。外源污染物导致的d n a 损伤反映了污染 物在组织中的分布、代谢，同时提供了作用于d n a 的综合效应等信息。 有研究报道，四环素可对小麦根尖细胞引起染色体畸变效应，对植物存在 遗传毒性。四环素类抗生素还能造成鱼类较严重的d n a 损伤【4 8 1 。也有研究结果 显示，曲甍甍等【4 9 研究过四环素类抗生素中土霉素的毒性，其中土霉素能造成 蚯蚓体腔细胞的d n a 损伤。而四环素和金霉素对d n a 的损伤尚无人研究。 1 2 2 4 基因表达水平的毒性 基因表达水平的分子标记物是指转录过程中m r n a 的表达变化f 表达的诱 导或抑制以及上调或下调) 。现在也有许多研究报道，它的表达异常可能与环境 污染有关。当摇蚊暴露在1 3 0 “g 剂量的芬苯达唑下，c y p 4 5 0 、h s p 4 0 和h s p 9 0 的基因表达均呈明显上升状态。由于c y p 4 5 0 是外源物质去毒作用最重要的酶系 之一，它的表达异常说明这种暴露打乱了摇蚊体内系统的平甜5 0 】。有研究指出， 甲萘醌可快速对鼠类体内肝细胞的金属硫蛋白m r n a 产生诱导作用【5 。多项研 究表明，青霉素可以作用于抗生素特殊受体，通过持续的蛋白合成来促进 c y p l a l 基因的表达 5 2 】。以上例子说明某些基因的表达变化也能指示环境污染。 但是四环素对生物机体基因表达水平的影响研究非常有限。 第三节四环素和金霉素的人体健康效应 四环素和金霉素作为广谱杀菌剂用于人体服用或兽用来抑菌。由于对人体 的滥用，还有动物用药不遵守休药期等原因，造成该类药物及其降解产物残留 于动物组织及畜产品中，人类食用后必然会给健康带来潜在影响。 四环素类抗生素在人体内部分肝代谢，部分以原型肾排，5 5 四环素尿路排 泄，胆汁浓度高。 6 第一章引言 已有研究发现，四环素类抗生素对人体健康具有一定的副作用，能够影响 肾功能。其机制有几方面：能抑制细胞内蛋白质的合成，使氨基酸的利用减少，血 尿素上升，导致肾小球滤过率下降；使肌醉廓清率降低及尿浓缩力受损。有时 还会出现全身中毒症状，最常见的是消化道症状，可引起消化道溃疡。也可引 起多种皮肤损害，眼灼痛，口唇干裂，舌炎等。四环素还能引起的主要不良反 应为永久着色的四环素牙。 很多学者对四环素的动物研究实验中发现四环素还有致畸作用。动物试验 研究亦肯定地证实四环素族对人体的致氮质血症作用以及能够诱导兔胸膜粘连 及纤维化等。也有研究用1 0m g 或2 0m g 四环素注入输卵管或输精管内，均能 起到阻塞作用而使大鼠不能生育。从病理形态学的研究可见，四环素可引起输 精管上皮细胞发生变性坏死，上皮细胞明显增生呈复层致使管腔完全堵塞。个 别动物还可见固有膜内有疤痕形成，这些结果与国外报道基本一致【5 3 5 5 】。比较 了四环素与金霉素对大鼠输精管的闭塞作用，后者也有与四环素类似作用，但 其效力比四环素差。敖林等【5 6 】的模型研究显示，四环素引起实验组小鼠体重下 降、肝脏和血液生化指标改变。四环素能致急性肝损伤【57 】通过环境和生态食物 链研究四环素类抗生素对人体健康的影响及流行病学调查研究相对较少。加强 四环素和金霉素在各级生物链暴露的研究，探讨暴露与效应的关系，有助于找 出疾病发生发展的标志物，提前预警污染物的健康风险。 第四节新型有机污染物的土壤环境质量基准研究 环境中有害物质的量超过阈值时，就可导致人或生物产生不良或有害效应， 因此制定相关的环境基准【5 8 】。在我国关于环境质量基准的研究，早期就提出了 参考土壤环境背景值和食品卫生基准等指标反推求得土壤环境质量基准的赋值 研究【5 9 】。另外还开展了复合污染的土壤环境质量基准研究更能反映我国的实际 情况【6 0 1 。但是我国土壤环境基准关于生态毒理方面的基础数据十分匮乏，严重 影响了我国制定准确、科学的土壤环境标准【6 1 | 。 目前确立的土壤环境质量基准一般根据不同的观测或保护对象，得到不同 的基准值。选用多组典型的观测生物使受保护对象能够最大限度地被包括。因 此，环境质量基准不仅是最大单一无作用剂量，而是一个针对多种保护对象的 范围值 6 2 。 7 第一章引言 制订毒性物质基准时应考虑包括对人体健康造成危害的可能途径【6 引。根据 有机物对土壤的污染途径不同，需要考虑以下情况：有机物可通过吸收作用进 入土壤生长作物的可食部位；经人体皮肤接触、经口摄入或吸入的直接接触。 另外还需考虑不同地区的土壤差异，我国不同地区气候特征及地质条件差别都 很大，不同地区有机物的暴露和迁移转化规律也有不同。因此，可以考虑对主 要参数的参考值加以调整，确定出具有区域特征的环境基准。 第五节研究目的、意义和研究内容 1 4 1 研究目的和意义 在国际上，研究者们对四环素类抗生素对水生生物的毒性以及土壤成分对 其的吸附解吸作用研究较多，可参考的数据也多。四环素等对土壤生物分子水 平所产生的毒作用还未引起关注，较少有人研究，需要进一步推进土壤动物系 统污染生态学研究向微观方向发展。 利用分子生物技术诊断环境污染状况，研究生物体早期毒效应以及其适应、 耐性等过程的分子机制，能够对灵敏准确预测污染物对环境的影响起到积极作 用。因此本文的目的是研究土壤中四环素和金霉素对土壤生物的各水平尤其是 分子水平的毒作用，在此基础上探讨了此类抗生素对蚯蚓以及土壤生态系统的 毒性。 本课题的研究的意义在于，通过四环素等抗生素对土壤生物的微观分子毒 性研究，一方面有助于了解抗生素对土壤生物产生毒作用的浓度水平，为评估 抗生素的生态风险奠定基础，为土壤环境质量基准的制定提供基础数据；另一 方面，建立更为精确和敏感的生态毒理指标和方法，进行环境亚致死含量抗生 素的生态毒性效应及危害的诊断，对及时监测土壤环境，减轻或避免环境污染 起着重要作用，同时为治理此类抗生素在环境中的污染奠定良好的基础。 1 4 2 主要研究内容 本试验所用土壤为天津开发区森林公园无污染的表层土壤，主要测试污染 物为我国土壤环境中新型有机污染物四环素和金霉素，选取赤子爱胜蚓为受体， 8 第一章引言 对其开展个体及细胞、分子水平上的毒理试验研究，主要包括急性毒性试验、 抗氧化酶活性试验、d n a 损伤试验和特定基因表达的荧光定量试验，根据得 到的毒性阈值试验数据，探讨了分子水平上生物体早期适应、毒害过程的分子 机制，评价污染物的毒性作用及分子标记物的可利用性。 因此本课题主要研究内容如下： ( 1 ) 对陆生典型动物蚯蚓进行急性和慢性毒性暴露后，开展基于亚分子及分子等 不同水平上的生态毒理效应研究： ( 2 ) 探讨不同污染物浓度水平，不同暴露时间，污染物单一和混合污染情况下， 对蚯蚓的毒性效应变化研究，探讨分子标记物的实用性； ( 3 ) 以本文毒理学试验数据为基础，尝试进行新型有机物的土壤环境质量基准研 究，将生态毒理学和环境毒理学指标建立初步联系。 9 第二章四环素和金霉素对蚯蚓滤纸接触急性毒性效应 第二章四环素和金霉素对蚯蚓滤纸接触急性毒性效应 第一节概述 蚯蚓生态种群的安全是整个生态系统生物安全的基础，同时，其与土壤中 污染物接触密切，对环境有害物质敏感。基于这些特点，目前国际上对于土壤 介质的毒理学方法中公认的受试生物是赤子爱胜蚓( e i s e n i af e t i d a ) 6 4 石6 1 ，其被视 为土壤区系的指示生物来评价土壤生态安全。 本章主要研究了四环素和金霉素对赤子爱胜蚓的滤纸接触急性毒性致死效 应。 2 2 1 受试生物 第二节试验材料与方法 赤子爱胜蚂l ( e i s e n i af o e t i d a ) ，购于天津市芦台蚯蚓养殖场，于实验室驯养一 个月，以牛粪为食物定期喂食。试验选择个体大小较一致，体重3 5 0m g 左右， 有明显生殖环带的健康成蚓为实验个体 2 2 2 试验药品和仪器 盐酸四环素( t e t r a c y c l i n e ) 、金霉素( c h l o r o t e t r a c y c l i n e ) 均由北京鼎国生物有限 公司提供，纯度9 8 。所用仪器：h d l a p p a r a t u s 气候培养箱。 2 2 3 试验方法 按照o e c d ( 19 8 4 ) 推荐的标准方法进行蚯蚓急性滤纸毒性试验。根据预试验 结果在药品溶解度内设定试验浓度梯度。按照实际情况，剪裁大小适中的中性 滤纸衬铺在直径3c m 、长8c m 的玻璃管内壁上，滤纸上缘与玻璃管上缘齐平， 尽量保证滤纸接合处无重叠，无缝隙。向玻璃管内加入1m l 受试物溶液，冷风 吹干后再加1m l 去离子水以湿润滤纸。每管1 条蚯蚓，封口，扎小孔透气。浓 1 2 第二章四环素和金霉素对蚯蚓滤纸接触急性毒性效应 度设置为四环素：0 ，1 0 0 ，2 0 0 ，5 0 0 ，1 0 0 0 ，2 0 0 0 ，3 0 0 0m g k g ；金霉素：0 ， 1 0 0 ，2 0 0 ，5 0 0 ，1 0 0 0 ，2 0 0 0 ，3 0 0 0m g k g 。每个剂量组1 0 个重复。加入去离子 水的处理组为空白对照组。为了按照蚯蚓习性使蚯蚓处于有染毒溶液的滤纸上， 将玻璃管放倒置于恒温培养箱内，( 2 0 4 - 1 ) 无光照培养。污染暴露4 8h 后查看 各处理的蚯蚓死亡数，死亡以蚯蚓对机械刺激无反应为标准。 2 2 4 数据处理 数据的统计分析采用s p s s1 1 5 软件。 第三节结果与讨论 两种抗生素对蚯蚓的急性致死试验结果显示，在该试验条件下，蚯蚓未出 现死亡现象，利用滤纸接触法抗生素对蚯蚓的l c 5 0 3 9 8x1 0 m g c m ，换算为 实际染毒溶液浓度则半致死浓度均大于3 0 0 0m g l ( 此后浓度均以染毒溶液浓度 m g l 来表示) 。 表2 1 两种抗生素对蚯蚓的急性毒性 试剂48hlc50 染毒溶液浓度( m g l )滤纸接触法结果( m g c m ) 本试验利用滤纸接触法得到的2 种抗生素的急性半数致死浓度范围己远超 过实际环境浓度。试验结果说明四环素和金霉素都是毒性较低的污染物，不易 引起生物个体直接死亡等严重后果。曲甍甍等也利用该方法研究过阿散酸和土 霉素的毒性，土霉素与四环素和金霉素同属四环素类抗生素。其研究显示，土 霉素在其溶解度内未引起蚯蚓死亡，接触急性毒性较低，与本实验结果一致。 但是应该考虑到，国内土壤种类众多，土壤组分复杂多样，理化性质差异很大， 生态条件或因子较为多变，四环素和金霉素对于不同环境的迁移归趋规律不同， 对生物系统的不良影响常常不容易通过短期急性暴露，或通过生物个体或群落 水平的不良状态而观察到的。另外，土壤环境并不是受到单一污染源的影响， 基本是同时存在多种化学物，各污染物的相互作用机理的研究还不多，实际情 1 3 第二章四环素和金霉素对蚯蚓滤纸接触急性毒性效应 况中可能发生的化学反应及其程度不易估计，这也成为评估化学物毒性的难点。 再次，可以发现o e c d 推荐的标准方法，对低毒污染物的急性毒性评价作用有 限，尤其是接触毒性不大的污染物，无法得到针对特定生物的急性l c 5 0 值，若 染毒时间较长又会因为受试生物无食物导致试验结果受影响。 1 4 第三章四环素和金霉素对蚯蚓抗氧化酶系的毒性效应 第三章四环素和金霉素对蚯蚓抗氧化酶系的毒性效应 第一节概述 抗氧化防御系统可以控制正常代谢所产生的活性氧。当某些污染物在机体 内进行生物转化时，会产生大量的活性氧和自由基代谢物，一旦体内抗氧化系统 不能消除这些活性氧，就会出现氧毒性，导致各种亚细胞结构的损伤，如细胞 膜通透性和流动性改变，多种与脂蛋白结合的酶活性降低或消失，导致多烯脂 肪酸的迅速降解引起脂质过氧化，造成d n a 链断裂等效应。暴露在污染中的生 物在生长受到影响之前会通过调节其内部生化反应来降低外源污染物的毒性影 响。早期的生化反应是评估环境的潜在危害相当重要的信息。在抗氧化防御系 统中，s o d 酶具有特殊的生理活性，它可对抗阻断氧自由基，及时修复受损细 胞，是生物体内清除自由基的首要物质。c a t 是去毒作用和细胞抗氧化机制的 重要酶系。c a t 的变化意味着化学物暴露使细胞受到损害。p o d 分布于液泡、 细胞壁、细胞液及胞外组织中，可以以愈创木酚或抗坏血酸等为电子供体氧化 其他底物产生h 2 0 ，也可以清除h 2 0 2 ，具有比c a t 更高的h 2 0 2 亲和力。s o d 的含量和活性也可指示污染物暴露情况。虽然酶活性增高可抵御外源污染物的 危害，但是长期处于诱导应激状态，将损害生物体内抗氧化系统，造成机体细胞 损伤。国内外关于四环素和金霉素对水生动物抗氧化酶系统的研究较多。但是 土壤介质中的研究较少。 3 2 1 土壤 第二节试验材料与方法 供试土壤采白天津郊区森林公园，为去除了表层杂质的o 4 0c m 表层土壤 样品。土壤样品自然风干，过2m i l l 筛备用。供试土壤的理化性质见表3 1 。 1 5 第三章四环素和金霉素对蚯蚓抗氧化酶系的毒性效应 3 2 2 受试生物 同2 2 1 。 3 2 3 试验药品与仪器 药品：盐酸四环素、金霉素、三羟甲基氨基甲烷、牛血清蛋白、考马斯亮 蓝、蔗糖、愈创木酚、乙二胺四乙酸、邻苯三酚、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠等。 仪n - h d l a p p a r a t u s 气候培养箱，电子天平，恒温水浴锅，p b 一1 0p h 计， t u 1 9 0 1 双光束紫外分光光度仪，h e t t i c h3 2 r 冰冻离心机。 3 2 4 染毒试验 根据a n 【6 1 7 1 ，使用土壤微宇宙方法进行蚯蚓毒性实验。由于预实验中，该污 染物溶解度浓度条件下未能引起蚯蚓死亡，考虑到该物质为低毒物质，所以依 据现已知实际土壤环境中该污染物的污染水平设置正式试验浓度，其中四环素 浓度设为o 3m g k g 、3m g k g 、3 0m g k g 、10 0m g k g 、3 0 0m g k g ：金霉素也设 为0 3m g , x g 、3m g k g 、3 0m g , x g 、10 0m g k g 、3 0 0m g k g ，并设置对照组。具 体试验方法如下：称取已过筛备用的干土样品5 0 0g ，置于1 0 0 0ml 烧杯中，将 污染物溶液均匀滴入，并调整水含量为土壤最大持水量的6 0 ，然后迅速用保 鲜膜封口，防止水分蒸发。待避光平衡2 4h 后，溶液下渗彻底，再将土拌匀， 这个过程也需避光。将提前清肠2 4h 的蚯蚓放入烧杯，每杯1 0 条，封口，扎 孔，将其置于( 2 0 1 ) 的生化培养箱中避光培养。每处理重复3 次，分别于7 天，1 4 天，2 8 天取蚯蚓样品进行测试。 3 2 5 蚯蚓抗氧化酶试验 3 2 5 1 粗酶液的提取 1 6 第三章四环素和金霉素对蚯蚓抗氧化酶系的毒性效应 将从烧杯中取出的蚯蚓冲洗干净后，用滤纸吸干，置于液氮中冷冻，如不 马上提取酶液，可放入冰箱保存。若需马上提取酶液，则将蚯蚓置于预冷研钵 中，再用预冷的5 0m m