（环境科学专业论文）厌氧氨氧化微生物的培养、鉴定及其基质分解特性的研究.pdf

摘璺 三种不同种泥来源的厌氧氨氧化富集培养物对比研究显示这些影响因素对三种 厌氧氨氧化富集培养物的基质分解活性具有基本相同的影响。 采用r a p d p c r 技术对厌氧氨氧化富集培养过程中的微生物d n a 遗传多 样性的变化进行了研究。对比三种不同的种泥来源，从遗传的同源性来分析，硝 化污泥中的微生物菌群与厌氧氨氧化微生物菌群的遗传同源性最高，是启动厌氧 氨厌氧反应的适宜种泥。对以硝化污泥为种泥厌氧氨氧化培养驯化的不同阶段进 行了基因多态性分析，结果显示，取自污水处理厂的污泥在培养初期( 1 个月左 右) ，微生物群体聚为一个群系；在转为厌氧氨氧化培养后，微生物群体问的相 似性较转化前有所提高，经过长时间的厌氧氨氧化培养，系统稳定后，微生物自 成一个群系，但与转化为厌氧氨氧化培养初期的微生物聚为一大群系，说明了硝 化污泥的微生物与厌氧氨氧化富集培养物的微生物具有一定的同源性。 采用传统分离方法和分子生物学手段两种方法对厌氧氨氧化微生物进行了 分离和鉴定。对传统的分离方法进行了改进，培养得到了三种微生物，这三种微 生物均没能验证其厌氧氨氧化活性，原因有待进一步研究。对以硝化污泥为种泥 培养得到的厌氧氨氧化培养物的优势菌进行分子生物学鉴定，系统发育分析显示 与已报道的厌氧氨氧化微生物同属于浮游霉菌目，但相关性低于7 0 ，为一种 尚未报道过的新的厌氧氨氧化微生物。 分别以甲醇、乙酸盐、丙酸盐和葡萄糖为碳源，研究了在不同有机碳源条件 下厌氧氨氧化富集培养物的代谢途径。甲醇完全抑制了厌氧氨氧化活性；乙酸盐 和丙酸盐对n 0 2 - 的降解有促进作用；低浓度葡萄糖糖条件下对厌氧氨氧化反应 没有影响，高浓度时能促进n 0 2 - 的降解。n 0 2 相对于n h 4 + n 的过量降解，初步 认为是由厌氧氨氧化微生物在有机碳源存在时具有了反硝化代谢途径造成。 关键词：厌氧氨氧化，基质分解，基因多态性，1 6 s r r n a ， 代谢方式 徐听j 荣中山火学博一l 论义 t h es t u d yo nc u l t i v a t i o n ，i d e n t i f i c a t i o n d e g r a d a t i o n b a c t e r i a a n ds u b s t r a t e o fa n a m m o x m a j o r ：e n v i r o n m e n t a ls c i e n c e p h dc a n d i d a t e ：x i n r o n gx u s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rx i a o s h a nj i a a b s t r a c t a n a e r o b i ca m m o n i ao x i d a t i o ni san e wa n dp r o m i s i n gd e n i t r i f i c a t i o n b i o t e c h n o l o g y t h e n e w p r o c e s s o x i d i z e sa m m o n i u mu n d e ra n o x i c c o n d i t i o n sw i t hn i t r i t ea se l e c t r o na c c e p t o ra n dd i n i t r o g e ng a sa st h e p r o d u c t b a s e do n t h es u m m e r yo fp r e v i o u sr e s e a r c hr e s u l t s ，d e e p l y i n v e s t i g a t i o nh a sb e e nc a r r i e do u ti nt h i sp a p e r a n a m m o xc u l t u r e sf r o m d i f f e r e n ti n o c u l a t i o n s l u d g e w e r ee n r i c h e d ，t h ee f f e c t so fd i f f e r e n t i n f l u e n c ef a c t o r st ot h ea n a m m o xa c t i v i t yw e r ei n v e s t i g a t e d ，a n dt h e d i v e r s i t yo fb a c t e r i aw e r es t u d i e d an o v e lt y p eo fb a c t e r i u mr e s p o n s i b l e f o ra n a m m o xp r o c e s sw a si d e n t i f i e d t h r o u g h m o l e c u l a r b i o l o g i c a l m e t h o d s i nt h i sp a p e r , t h em e t a b o l i cp a t h w a yo fa n a m m o xb a c t e r i ao n t h eo r g a n i cc o m p o u n d sw a si n v e s t i g a t e d t h ea n a m m o xe n r i c h m e n tc u l t u r e sh a v eb e e na c q u i r e ds e e d i n gw i t h a e r o b i cs l u d g e ，a n o x i cs l u d g ea n da n a e r o b i cs l u d g e ，w h i c ha d o p t i n gt h e m e t h o do fc u l t i v a t i n gf i r s t l yn i t r i l y i n gc u l t u r e ，d e n i t r i f y i n gc u l t u r ea n d a n a e r o b i cm e t h a n o g e n i cc u l t u r es e p a r a t e l y i tw a ss h o w nt h a tn i t r i f y i n g c u l t u r ef r o ma e r o b i c s l u d g ew a st h eo p t i m a l i n o c u l u mf o ra n a m m o x c u l t i v a t i o n i n v e s t i g a t i o n o nt h ei n f l u e n c ef a c t o r so fa n a m m o x p r o c e s s ， i n c l u d i n gt e m p e r a t u r e ，p hv a l u e ，c o n c e n t r a t i o no fi n o r g a n i cc a r b o na n d e l e c t r o na c c e p t o r , w a sc o n d u c t e d t h eo p t i m a lc o n d i t i o nf o rt h ea n a m m o x r e a c t i o nw e r ea sf o l l o w s ：t e m p e r a t u r ef r o m3 0 。ct o3 5 。c ，p hv a l u ef r o m 7 0t o8 0 ，c o n c e n t r a t i o no fi n o r g a n i cc a r b o na b o u t5 0 0 m g l ( k h c 0 3 ) 摘要 n 0 2 一i st h ee l e c t r o na c c e p t o ro fa n a m m o xr e a c t i o n ，w h i l en 0 3 c a n n o tb e u s e da sa ne l e c t r o na c c e p t o r t h ed i v e r s i t ya n di d e n t i t yo fb a c t e r i a lc o m m u n i t yi nt h ep r o c e s so f a n a m m o xe n r i c h m e n tc u l t i v a t i o nw e r ea n a l y z e db yr a n d o ma m p l i f i e d p o l y m o r p h i s md n a ( r a p d ) m e t h o d t h er e s u l t sd i s p l a y e dt h a tg e n e t i c d i v e r s i t yw e r ed i f f e r e n td u r i n gt h ec u l t i v a t i o n t h ec o m p a r i s o no fg e n e t i c i d e n t i t yo f t h r e ed i f f e r e n ti n o c u l a t i n gs l u d g es h o w e dt h a tn i t r i f y i n gs l u d g e h a s h i g h e rs i m i l a r i t y w i t ha n a m m o xc u l t u r e st h a nt h a to ft h eo t h e r i n o c u l a t i n gs l u d g e t w om e t h o d sw h i c h c o n s i s t i n g o ft r a d i t i o n a l m i c r o b i o l o g i c a l p u r i f i c a t i o n a n dm o l e c u l a rb i o l o g i c a l w a y sw e r e u s e dt oi s o l a t ea n d i d e n t i f ya n a m m o xb a c t e r i a f r o mt h ea n a m m o xc u l t u r e s ，t h r e eb a c t e r i a l s t r a i n sw e r ei s o l a t e dw i t ht r a d i t i o n a lp u r i f i c a t i o nm e t h o d h o w e v e r , a l lo f t h e mw e r en o ti n s p e c to fa n a m m o x a c t i v i t y t h er e a s o nw a su n c l e a ra n d s t i l ln e e dt ob ei n v e s t i g a t e di nt h ef u t u r e t h e1 6 sr r n as e q u e n c eo ft h e a n a m m o xo r g a n i s mw h i c hc u l t i v a t e df r o mn i t r i f y i n gs l u d g ew a sa l i g n e d a n da n a l y s e dp h y l o g e n e t i c a l l yw i t ho t h e rb a c t e r i a l1 6 s r r n as e q u e n c e s i n g e n b a n k ，a n dt h e a n a m m o xo r g a n i s mw a si d e n t i f i e da san e w p l a n c t o m y c e t e ，n a m e da sa 2 i nt h i ss t u d y ，t h ee f f e c t so fo r g a n i cc o m p o u n d so na n a m m o xb a c t e r i a w e r e i n v e s t i g a t e d i t w a ss h o w nt h a tm e t h a n o li n h i b i t e da n a m m o x b a c t e r i a c o m p l e t e l y ，w h i l e a c e t a t ea n d p r o p i o n a t e a c c e l e r a t e dt h e d e c o m p o s i t i o no fn 0 2 g l u c o s eh a dn oe f f e c t so nt h ea n a m m o xp r o c e s s o nl o wg l u c o s ec o n c e n t r a t i o n ，b u ta c c e l e r a t e dt h e d e c o m p o s i t i o no f n 0 2 o nh i g hg l u c o s ec o n c e n t r a t i o n t h i ss t u d ys h o w e dt h a ta n a m m o x b a c t e r i ac o u l dc a r r i e do u td e n i t r i f i c a t i o n k e yw o r d s ：a f l a m m o x ，i n f l u e n c ef a c t o r s ，r a p d ，1 6 s r r n a ，m e t a b o l i c p a t h w a y 徐听荣中山人学博上学位论文 1 1 水体的氮素污染 第一章前言 随着工农业的发展和人们生活水平的提高，使我国的水资源日趋短缺，并且 造成了水质的恶化。在对我国七大水系的调查研究发现，i 类、i i 类优质水资源 所占比例不到5 0 ，主要的水污染指标为高锰酸钾指数、氨氮、挥发酚等。水 资源紧缺的辽河、海河、黄河和淮河氨氮污染严重，松花江、长江和珠江水资源 相对要丰富，污染程度较轻。但随着经济的发展，水资源丰富的地区也出现了 可利用水资源短缺现象，例如对珠江流域的调查显示，珠江支流氨氮等污染严重， x 十珠江干流的水质造成影响f 2 】o 水体氮的污染越来越受到重视，氮的污染来源是 多方面的，主要由城市生活污水、工厂工业废水和农业污水三方面带入。 随着我国城市人口的增加和人口的进一步集中及人民生活水平的提高，城 市排放的垃圾量和污水量在逐步上升。在新鲜的生活污水中，有机氮约占6 0 ， 氨氮约占4 0 。城市生活污水中含有的有机氮和氨氮主要来源于人体食物中蛋白 质代谢的废弃物如粪便等。城市垃圾的渗滤液含有较高的氨氮，每吨垃圾约产生 o 0 7 2 2 t ，例如香港新界的垃圾渗滤液中含高达5 0 0 0 m g l 的氨氮【3 j 。 许多工业废水( 如制革废水、食品加工废水、炼焦废水、合成氨废水) 含 有氮素污染物，污染物的种类和浓度因行业而异，变化较大。产生高浓度含氮废 水的工厂，大致可分为两大类型，一类是含氮产品的工厂，另一类含氮产品的使 用和加工厂。人工合成的含氮化肥是水体中氨氮营养元素的主要来源。据统计目 前我国的氮肥产量居世界首他，我国大、中、小型氮肥厂近千家，每生产1 吨合 成氨向水体中排放的氨氮分别为1 8 7 k g 、2 4 7 k g 和1 4 5 2 k g 3 1 。排放含有机氮废 水的工厂主要有：有机原料厂、合成材料厂、染料厂和农药厂等。 农业污水包括农业灌溉污水和禽畜养殖污水。氮肥施入土壤后，般认为 被当季植物吸收的量不超过5 0 可被后季植物所利用的量约为2 5 3 5 ，而损 失到大气或随水流失的部分可达总量的2 0 以上。含有机氮的农药有：氨基甲酸 酯类、酰胺类、脲类、磺酰胺类、杂环胺类等，仅有1 0 2 0 的农药吸附在作 物上，有8 0 9 0 的农药会流失在土壤里，会随雨水冲淋、农业排水和地表径 第一章前言 流流入河道等水体之中，由施用农药而排入水体的有机氮也相当可观。此外，畜 禽养殖污水( 农业污水) 也含有大量的氮素污染物，据统【4 】，1 9 9 9 年我国排放畜 禽养殖污水超过2 0 0 亿吨，氮污染负荷高达1 5 9 7 万吨。 各种形式的含氮化合物排入水中引起了严重的水体氮素污染，水体氮素污染 造成的环境危害日益严重，主要有以下几个方面：( 1 ) 水体中所含的氨氮特别 是封闭水体中的氨氮会造成水体富营养化，我国广东珠江沿海、厦门沿海、长江 口近海域，渤海湾曾多次发生藻类过度繁殖引起赤潮，造成鱼类等水产物大量的 死亡，造成海洋渔业资源的破坏，经济损失严重；( 2 ) 引起水体缺氧并对水生生 物产生毒害，氨是硝化细菌的能源，硝化作用会消耗大量的氧气，通常l m g 氨氮 氧化成硝态氮需消耗4 6 m g 溶解氧，水体中的氨态氮越多，耗去的溶解氧也越多， 会使水体缺氧； ( 3 ) 影响人类健康，人体若饮用t n 0 2 n 1 0 m g l 或n 0 3 - n 5 0 m g , l 的水，则使人体正常的血红蛋白氧化成高铁血红蛋白，失去血红蛋白在体内 输送氧气的能力，出现缺氧的症状。亚硝酸盐若长时间作用于人体可引起致癌， 亚硝酸盐经水煮沸后还可造成浓缩，其危害程度更大。 1 2 生物脱氮 随着环境污染日益严重，富营养污染问题突出。世界各国都制订了严格的氮 素排放标准，例如1 9 7 4 年意大利规定排入城市污水管网的氨氮为5 6 m l 以下吲； 8 0 年代英国的氮素排放标准为低于1 0 m “3 j ；1 9 8 3 年美国e p a ：在其颁布的工业废 水污染物最大允许排放浓度中规定，氨氮不得超过l o m g l 1 3 l ；1 9 9 8 年荷兰也将含 氮化合物的出水标准从2 0 m g t k n l 降至1 0 m g 总氮几【5 】。我国也不断严格了氨氮的 出水排放标准，1 9 9 8 年制定的污水综合排放标准中氨氮的最高容许排放标准： 一级排放标准为15 m g l ，二级排放标准为2 5 m g l “。 废水中氨氮的处理方法有物化脱氮法和生物脱氮法两种。物化脱氮法主要包 括：空气吹脱法、和蒸汽气提法、超重力脱氮法、化学中和法、化学沉淀法、折 点氯化法、离子交换法。而生物脱氮法作为一种经济、节能、二次污染小的脱氮 方法一直被公认为是一种经济、有效和最有发展前途的方法之一。 2 徐昕荣中山大学博l 学位论文 1 2 1 传统的生物脱氮过程 传统的生物脱氮过程主要包括氨化、硝化和反硝化作用三部分。废水中的有 机氮化合物在微生物( 氨化细菌) 的作用下，分解产生氨的过程即脱氨基作用， 常称氨化反应。硝化反应是将氨氮转化为硝态氮的过程，它包括两个基本反应步 骤：一是将氨氮转化为亚硝酸盐的反应，一是将亚硝酸盐进一步氧化为硝酸盐的 反应。 1 2 1 1 氨化作用 氨化作用是通过微生物胞外蛋白酶的水解作用使含氮有机物转化为氨基酸 之后进入体内脱氨基酸产生氨的过程，主要发生如下反应： h h r c i c 。h 骂r 一5 一c 。佣+ m n 臣 o h h i + 百1 。2 r c c o o h - 三斗r c c o o h + n 强 l| | n h 2 o h 此过程可在好氧或厌氧条件下进行见好氧条件下参与脱氨基酸的微生物主 要有枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、荧光假单胞菌等，厌氧条件下的微生物主要有腐 败梭菌、兼性大肠杆菌、酵母菌、变形杆菌等。 1 2 1 2 硝化作用 化能无机自养菌将氨氮氧化为硝酸盐的过程称为硝化作用( n i t r i f i c a t i o n ) 。 早在1 8 7 7 年，施来兴【8 肄人就通过实验证明了这一生物学过程的存在。1 8 9 0 年维 诺格拉斯基【8 】利用含氨盐的无机硅胶培养基首次对硝化细菌进行了研究，证明硝 化过程包括两个连续而又独立的阶段：氨氧化亚硝酸盐的过程、亚硝酸盐氧化为 硝酸盐的过程，参与这两个过程的微生物同属于硝化杆菌亚群i 8 1 。 第一章前言 f 1 ) 硝化作用原理 首先在氨氧化菌( 又称亚硝化菌) 作用下将氨氮转化为亚硝酸氮，然后再由硝 酸菌将亚硝酸氮氧化成硝酸氮。氨氧化菌和亚硝酸氧化菌都是自养菌，它们利用 废水中的碳源，通过与n h 4 + 的氧化还原反应获得能量。 其反应方程式为： 2 m + + 3 。2 磐2 n 0 2 + 矾。+ 4 h + 一g g = - 2 7 8 4 2 k l( 1 1 ) 2 + 3 0 2 塑写2 n o ；一矗g厶g ：7 2 2 7 l d ( t - 2 ) 总反应方程式( 不考虑硝化菌的生长) n 酊+ 2 。2 型缉 鼢+ b 。+ 2 h + 一ga g = - 3 5 1 1 d( 1 3 ) 若用c 5 h 7 n 0 2 表示硝化细胞的化学组成，则反应方程式如下： t q h + + 1 8 3 0 】+ 1 9 8 h c 0 3 + o0 2 c 5 h 7 l q ( b + 10 4 强o + 09 8 n 0 3 。+ 1 8 8 i 五c 0 3 ( 1 4 ) f 2 ) 硝化细菌种类及生理学特征 在伯杰氏系统细菌学手册第一版1 9 i 中，氨氧化细菌被划分为五个属，即 亚硝化单胞菌属( n i t r o s o m o n a s ) 、亚硝化球菌届( n i t r o s o c o c c u s ) 硝化螺菌属 ( n i t r o s o s p i r a ) 、亚硝化弧菌属( n i t r o s o v i s i i o ) 和亚硝化页菌属( i 虹o s o l o b u s ) ，各属 氨氧化细菌的主要形态特征见表1 - 1 。 氨氧化细菌的主要菌群是自养型氨氧化细菌，其都是革兰氏阴性细菌，自养 生长时，以氨为唯一能源，以c 0 2 为唯一碳源；混合培养时可同化有机物质。 适合大多数氨氧化细菌生长的条件为：温度2 5 3 0 。c ，p h 7 5 8 0 ，氨浓度2 1 0 m m o l l ，倍增时间8 小时至数天1 4 1 。 表i 1 各属氨氧化细菌的形态特征 f i 9 1 - 1 t h e c h a r a c t e r i s t i c so f a m m o n i u m o x i d i z i n g b a c t e r i a 徐听荣中山人学博仁学位论文 根据菌体形态和细胞内膜的排列方式，伯杰氏系统细菌学手册第一版将 亚硝酸盐氧化细菌划分为叫个属，即硝化杆菌属( n i t r o b a c t e r ) 、硝化球菌属( n i t r o c o c c u s ) 、硝化刺菌属( n “r o s p i n a ) 和硝化螺菌属( n i t r o s p i r a ) 。各属亚硝酸盐氧化细 菌的主要形态特征见表1 2 。 亚硝酸盐氧化细菌( 硝酸细菌) 为革兰氏阴性细菌，自养生长时以亚硝酸盐 为唯一能源，以c 0 2 为唯一碳源；混养生长时，可同化有机物质适合大多数亚硝 酸盐氧化细菌生长的条件为：温度2 5 3 0 。c ，p h 范围7 5 8 0 ，亚硝态氮浓度2 - - 3 0m m o l l ，倍增时问1 0 小时至数天【4 l 。 ( 3 1 硝化过程的生化反应 从生物化学的角度看，硝化过程并非仅仅是氨氧化细菌将氨氧化成亚硝酸、 亚硝酸氧化细菌将哑硝酸进一步氧化成硝酸。它涉及多种酶和多种中间产物，并 伴随着复杂的电子( 能量) 传递。在氨氧化为亚硝酸的过程中存在两个非常关键的 酶一氨单加氧酶( a m m o n i am o n o o x u g e n a s e ，a m o ) 和羟胺氧化还原酶( h y d r o x y l a m i n eo x i d o r e d u c t a s e ，h a o ) ，它们在氨的氧化过程中负责能量的转化和电子的 传递。催化亚硝酸盐转化为硝酸盐的酶为亚硝酸氧化还原酶( n i t r i t e o x i d o r e d u c t a s e ，n o r ) 。在专性自养硝化过程中，氨氧化细菌进行的氨的氧化是 限速步骤。 氨氧化菌对氨的转化过程为： 氨单相氧酶羟胺氧化酶羟胺氧化酶 n 氏_ n 岛0 h q 0 ) _ +n 0 2 其生化反应可表示为： 第一章前言 氨转化为羟胺：n 玛+ 0 2 + 2 王王】n i - l o l 4 + 岛o( 1 - 5 ) 羟胺氧化为亚硝酸： e + n i 壬o h e n o + + 3 王王+ 4 e e n o + + h 2 0 + e + n o f + 弭+ n 凰o h + 珏2 0 _ n o , 一+ 3 h + + 4 c ( 1 - 0 在亚硝酸氧化为硝酸的过程中，诸多实验表明未检出任何中间产物，因此一 般认为它是一步完成的，结合进硝酸的氧来自水，即： n o f + 岛o _ n o i + 翻f + 2 e 一 ( 1 - 7 ) 催化氨转化为羟氨的是氨单加氧酶，氨单加氧酶a m o 是膜内酶，关于其结构、 催化活性和作用机理的资料，都是通过间接试验而间接获得的。h y m a n 1 0 l 等研究 发现a m o 含铜，对硫脉等金属鳌合剂敏感。他们还发现用“c = “c 培养 n i t r o s o m o n s h r 叩p 可使1 4 c 共价结合至一个分子量为2 8 k d 的膜内多肽上。这 个被标的多肽可能是a m o 的活性部位，因为它被乙炔共价修饰的程度越高，保 留氨氧化活性越低；反之，当a m o 的氨氧化活性完全丧失时，被1 4 c ；1 4 c 标记的 多肽也不再增多。a m o 能催化多种基质。除氨以外，n e u r o p a e a 还可甲烷氧化成 甲醇，乙烯转化成环氧丙烷，环己烷转化为环己醇，苯转化为苯酚，c o 转化为c 0 2 ， 酚转化为醌l 1 。这些基质既可与氨竞争a m o 的活性部位，也可与氨竞争还原剂， 因而对氨的生物氧化有抑制作用。乙炔是一种自杀性基质，可被a m o 转化为不 饱和的环氧化物；这种环氧化物作用于一个或多个与铜结合的氨基酸侧链，可致 使a m o 结构破坏而永久失活。a m o 是由3 个不同亚基组成的三聚体膜结合蛋白 【1 2 】，3 个亚基的分子量m r 分别为2 7 x1 0 3 ( a m o a ) ，3 8 1 0 3 ( a m o 脚和3 1 4 1 0 3 ( a m o c ) 。a m o 只能催化非离子氨氧化( n h 3 ) 氧化，而不能催化离子氨( n h 4 + ) 氧化，而在环境o i l n h 4 + 与n h 3 的动态平衡中，倾向于n i l 4 + 的方向，使得n h 3 的浓 度很低，这就是在硝化过程中氨的氧化成为限速步骤的原因。 催化羟氨转化为亚硝酸盐的酶是羟氨氧化还原酶( i t a o ) ，h a o 是一种有相 同亚基( m r = 6 4 x 1 0 3 ) 构成的三聚体细胞周质蛋白，它可以氧化羟氨，并释放出 2 对电子，其中一对直接用于n h ，的氧化过程，另一对用于细胞物质的合成以及 a t p 的产生。 亚硝酸氧化还原酶( n o r ) ，即可催化亚硝酸盐氧化成硝酸盐，也可催化硝 酸盐还原成哑硝酸盐，并由此的明。在n i t r o b a c t e r 菌株中，n o r 是一种诱导酶， 徐听荣中山大学博 学位论文 只有在以亚硝酸盐为能源进行的自养生长或以硝酸盐为电予受体进行异氧生长 的条件下，n o r 才能合成。n o r 也是由3 个不同亚基组成的三聚体膜结合蛋白复 合体f 1 3 j ，3 个亚基的m f 分别为1 1 6 x 1 0 3 ( n o r a ) ，6 5 1 0 3 ( r b ) 和3 2 x 1 0 3 ( n o r x ) ，n o r 复合体还含有铁、钼、硫和铜离子，是直径为9 5 _ + 3 0 u 的颗粒。 1 2 1 3 反硝化作用 反硝化作用实质上是一个硝酸盐的生物还原过程。硝酸盐还原可区分为同化 性硝酸盐还原( a s s i m i l a t o r yn i t r a t er e d u c t i o n ) 和异化性硝酸盐还原( d i s s i m i l a t o r y n i t r a r er e d u c t i o n ) ，反应过程见图1 1 。 硝酸盐 附黜还原洲糍盐还原 亚硝酸盐，异化还原为氮 摔 一孰氮 羟胺 一翠| 化虱 jj 氨 一氧化二氮 jj 有干几氮 氮气 同化途径：植物、真菌、细菌 异化途径：大多数为细菌 图1 - 1 硝酸盐同化与异化过程的比较 f i g1 - ic o m p a r i s o no f n i t r a t ea s s i l i m a t i o nw i t hc a t a b o l i s m 在同化性硝酸盐还原中，产物( 氨) 被用于合成细胞物质；而在异化性硝酸 盐还原中，产物( 氨或氮气) 不被用于合成细胞物质。异化性硝酸盐还原有两条 途径：是把硝酸盐还原成氨；是把硝酸盐还原成气态氮化合物( 主要是氮气) 。 人们把第二条途径称为反硝化作用( d e n i t r i f i c a t i o n ) ，在此途径中非气态氮化合 物被转化为气态氮化物而逸至大气，因此这条途径又被称为生物脱氮。 ( 1 ) 反硝化作用原理 在反硝化细菌的作用下，将硝酸盐和亚硝酸盐还原成氮气的生物反应，称为 第一章前言 反硝化作用，反硝化菌分布在众多细菌属中，主要为异养菌，也有一部分是自养 菌。反硝化过程中所利用的电子供体可以是有机物或还原性无机物质( 如氢、硫 和硫化物等) ，大多数反硝化细菌可以利用有机物质作为能源，以甲醇作为碳源 为例，其反应式为： n 0 3 + 1 0 8 c i 玉o h + 0 2 4 乩c 0 3 _ o0 5 6 c 3 h 7 0 2 n + 0 4 7 n 2f + 16 8 1 - 1 2 0 + h c 0 3 。( 1 - 印 n 0 2 。+ 06 7 c 1 o h + 05 3 岛c 0 3 00 4 c _ 5 h t 0 2 n + 0 4 8 n 2t + 1 2 3 i - 1 2 0 + h c 0 3 0 - 9 ) ( 2 1 反硝化细菌的种类和特性 反硝化细菌在分类学上没有专门的类群，它们分散于原核生物的众多属中， 这些包含反硝化细菌的属绝大多数分布于细菌界，少数分布于古生界【9 j 0 在古生 菌界，反硝化细菌的种类不多，主要分布在盐杆菌纲。细菌界的反硝化细菌，大 多数被确认的反硝化细菌集中分布在p r o t e o b a c t e r 门，其中a - - p r o t e o b a c t e r 、b p r o t e o b a c t e r 、y - - p r o t e o b a c t e r 和- - p r o t e o b a c t e r 都包含反硝化细菌；在非 p r o t e o b a c t e r 门之外，也存在众多反硝化细菌。 反硝化细菌的能源很广，光能和化学能均可以作为其能源，在化学能中， 可以是无机物质，也可以是有机物质；在有机物质中，可以是简单的小分子， 也可以是复杂的大分子。其中有机物质是许多反硝化菌属以及自然界一些优势反 硝化菌群的主要能源。 大多数反硝化细菌是兼性厌氧细菌，能够利用氧或硝酸盐作为最终电子受 体。只有当氧受限制时，硝酸盐才能取代氧进行厌氧呼吸。虽然硝酸盐和氧一样， 从呼吸链中获得电子，当以硝酸盐作为电子受体时，基质释放的能量降低。 ( 3 ) 反硝化过程的生化反应 从微生物学的角度看，反硝化作用主要是反硝化细菌的厌氧呼吸过程，硝酸 盐是电子受体，氮气是代谢产物。整个反应中涉及到四秘酶：硝酸盐还原酶( n a t ) 、 亚硝酸盐还原酶( n i r ) 、n o 还原酶( n o r ) 和n 2 0 还原酶( n o s ) 。反硝化菌 的反硝硝化过程如图l 一2 所示： 徐听荣中1 1 1 人学1 尊士学位论文 n 暖n o fn on 2 0 n 2 图1 - 2 细苗的反硝化过程 f i g1 - 2d e n i t r i f i c a f i o np a t h w a y 硝酸盐还原成亚硝酸盐是反硝化过程的第一步反应，该反应由硝酸盐还原酶 催化。p a y n e i ”】系统地回顾了具有反硝化能力的废水中的微生物，指出有些类群 只具有硝酸盐还原酶，故只能将n 0 3 - 还原至n 0 2 ，如无色杆菌属、放线杆菌属、 气单胞菌属、琼脂杆菌属、芽抱杆菌属等；而其他类群由于具有反硝化中的全部 酶系，因此能将n 0 3 - 还原成n 2 ，如微球菌属、丙酸杆菌属、螺菌属等。 硝酸盐还原酶有两种存在形态，一种镶嵌于细胞膜内，称为膜内硝酸盐还原 酶；另一种游离于细胞膜外周质中，称为膜外硝酸盐还原酶。膜内硝酸盐还原酶 的生理功能是进行硝酸盐呼吸，膜外硝酸盐还原酶的生理功能至今还不清楚。据 报道，在e c o l i 中，硝酸盐还原酶是一种膜结合蛋白，由o2 1 32 y4 复合物组成， a 、0 、y 亚基的分子量分别为1 5 0 k d 、6 0 k d 、2 0 k d 。亚单位。含有m o 原子 和一个 4 f e 一4 s l 。实验证实m o 原子和4 f e 一4 s q 。心与硝酸盐还原活性有关，推测 该酶的催化中心位于亚单位。上1 1 6 】；亚单位6 含有几个 4 f e 一4 s 1 中心和一个 3 f e 4 s 1 中心；亚单位y 含有细胞色素b 。硝酸盐还原酶的催化反硝化时的电子转 移过程为：d a a h 2 一f a d 一醌一细胞色素b m o n 0 3 一。 首先黄素蛋白( f a d 或f m n ) 接受从还原型烟酰胺嘌呤二核苷酸( n a d i l 2 ) 柬 的电子，并将它转移给醌和细胞色素b ，然后将电子转移给含钼的硝酸盐还原酶， 使m o “还原为m o ”，后者将电子再转移给n 0 3 ，使它还原成n 0 2 一。 从融o d o p s e u d o m o n a ss p h a e r o i d e s 分离的膜外硝酸盐还原酶由两个弧单位组 成，小的亚单位含有一个c 型细胞色素；大的亚单位含有一个m o 原子1 1 ”。从 t h i o s p h a e r ap a n t o t r o p h a 分离的膜外硝酸盐还原酶也由两个亚单位组成，小的亚 单位含有两个c 型血红素；大的亚单位含有f 4 f e 4 s 1 中心【1 8 】。对分离自a t c a t i g e n e s 第一蕈前言 e u t r o p h u s 的膜外硝酸盐还原酶所做的序列分析发现，小的亚单位上有两个c 型血 红素的结合部位，大的亚单位上则有m o 辅因子和【4 f c 4 s 】中心的结合部位 1 9 】。对 于c 型血红素和 4 f e 4 s l 中心的功能，现在还不清楚。 n 0 2 - 一n 0 的还原反应由亚硝酸盐还原酶催化。目前已报道的亚硝酸盐还 原酶主要有三种：c y tc d l 型亚硝酸盐还原酶，c u 型亚硝酸盐还原酶和细胞色素c 型亚硝酸盐还原酶。 c y tc d l 型亚硝酸盐还原酶由两个相同的6 0 k d 哑单位组成，每个亚单位含有一 个与多肽链共价联接的血红素c 辅基和一个非共价联接的血红素d l 【2 0 j 。血红素c 配为体位于蛋白的n 端可控制c 和d 1 问的电子传输速率【2 1 l ，电子由血红素c 进入， 然后传递给向红素d l 2 2 1 ，亚硝酸盐结合在d 1 血红素的f e ”l ，d lj 0 1 r 素是基质结 合和催化中心 2 3 】。由三分之二的脱氮菌含有细胞色素c d l 型亚硝酸盐还原酶，已 h 心a r a c o c c l l sd e n i t r i f i c a n s ( t h i o s p h a e r ap a n t o t r o p h a ) p s e u d o m o n a ss t u t a e r i , a l e a 一 i g i n e sc u t r o p h u s , p s e u d m o n a sa e r a g i n o s a , p a r a c o c c u sh a l o d e n i t r i f i c a n s , t h i o b a c i l l u s d e n i t r i f i c a n s 中分离出细胞色素c d l 型亚硝酸还原酶，并且目前已获得p a r a c o c c u s d e n i t r i f i c a n s ( t h i o s p h a e r ap a n t o t r o p h a ) 和p s e u d m o n a sa e r a g i n o s a d ? c d i 型亚硝酸 还原酶的高清晰度架构图【2 禾吲。 c u 型亚硝酸盐还原酶是一个三聚体，每个亚基含有两个铜原子，分子量为 3 6 k d 。每个单位的两个铜原子，一个构成i 型( 蓝色) 铜活性中心，另一个构成 l i 型( 非蓝色) 铜活性中6 t 2 6 。2 ”，i 型铜与亚单位内的基团结合，i i f , g 铜与三聚体 中二个亚单位的基团结合【1 3 l 。i 型铜被认为是电子由供体流向亚硝酸盐还原酶的 入口，i i 型铜则被认为活性中心1 2 8 。2 引。目前已从a c h r o m d b a c t e rc y c l o l a c t e s , a l c a l i g i n e se u t r u p h u s , r h o d o b a c t e rs p h a e r o i d e s , h a l o f e r a xd e n i t r i f i c a n s 分离出含 铜型亚硝酸还原酶。 n o 还原为n 2 0 由一氧化氮还原酶催化完成，r h o d o b a c t e rc a p s u l a t u s p a r a c o c c u u sd e n i tr i f i c a n s 和p s e u d o m o n a ss t u t z e r i 的一氧化氮还原酶己被分离纯 出来【3 0 。2 1 ，酶大部分存在于膜组分中。对p s e u d o m o n a ss t 纰t r ，n 0 还原酶基因 所做的克隆实验证明，n o 还原酶由两个亚单位组成，它们的分子量分别为5 3 k d a 和1 6 5 k d a l 3 3 】。大亚单位呈疏水性，具有1 2 个跨膜的。螺旋体，其中含有能与b 型血红素配位结合的组氢酸；小亚单位与c 型血红素结合。化学实验证实，n o 还 徐昕荣中山火学博，l 学位论义 原酶含有非血红素铁1 3 2 1 。 n 2 0 至n 2 的还原反应由n 2 0 还原酶催化。p a r a c o c c u sd e n ir i f i c a n s ，p s e u d o m ， o n a ss t u t z e r i 辆l r h o d o b a c t e rs p h a e r o i d e s ，s p d e n # r i f t p r 的一氧化二氮还原酶是 一种周质性的含铜酶【3 4 l 。已知的一氧化二氮还原酶都表现出相似的光谱学性质， 据此可将它们划分成单独的一类铜蛋白，但是它们的分子性质却不完全一致，在 分子量、亚单位组成及铜含量等方面均有差异。 1 2 2 新型生物脱氮技术 1 2 2 1 同时硝化反硝化 传统的观点认为硝化要在好氧条件下，反硝化则要在厌氧条件下才熊完成， 而近年来一系列新的发现【3 5 _ 3 9 唆破了这一传统的认识，使得同时硝化反硝化成为 可能。同时异养硝化菌、好氧反硝化菌和异养硝化一好氧反硝化菌的发现以及一 些新的研究进展，奠定了同时硝化反硝化生物脱氮的理论基础。 f 1 ) 异养硝化 异养硝化作用( h e t e r o t r o p h i cn i t r i f i c a t i o n ) 是指异养微生物在好氧条件下将 氨铵氮或三负价态的有机态氮氧化为羟胺亚硝酸盐氮和硝酸盐氮的过程。不同 于传统的自养硝化作用，异养硝化作用的底物可以是无机态氮也可以是有机态 氮。目前对异养硝化菌的研究中，真菌被认为是数量最大、效率最高的异养硝化 菌，如青霉菌和香曲霉菌轮枝菌等等。此外，某些放线菌细菌甚至藻类在自然界 或实验室的纯培养中，也被确定为具有硝化能力的异养微生物。 异养微生物可以利用的基质很丰富，可以是无机氮也可以是有机氮，有关硝 化作用的底物及其代谢途径至今还不是很清楚4 1 4 2 1 。n 1 5 同位素示踪实验| 4 3 i 发现 异养菌对n h 4 + 没有作用，但是能将有机氮直接氧化为硝酸盐氮而跨过有机氮分 解为氨氮再氧化为亚硝酸盐氮两步；而有些实验