（环境科学专业论文）外源调控下白腐真菌处理染料废水关键酶活的研究.pdf

华东师范大学2 0 0 5 年申请硕士学位论文：外源调控下白腐真菌处理染料废水关键酶活的研究 4 染料调控对无填料曝气式反应器出水m n p 酶活及染料脱色降解效果影响研 究。选择的活性染料有活性黑k n b 、活性黄m - - 3 r e 、活性红m - - 3 b e 、活性 艳红m 2 b 四种( 均为双偶氮染料) ，浓度分别为5 0 m l 、1 0 0 m g l 、2 0 0 m g l ， 实验结果表明： 1 ) 染料浓度为2 0 0 m g l 时对p c 菌产生了明显的毒性抑制，表现在营养源同化利 用速度减缓、m n p 酶活下降、染料脱色降解效果降低。 2 ) 染料种类不同，其脱色降解效果也存在差异，脱色率从高到低依次为：活性黑 k n b 活性黄m 一3 r e 活性红m 一3 b e 活性艳红m 2 b 。 关键谣：黄孢原毫平革葛酞2 镁过氧化物薛酶浠：舛濂调控 热料降解管脱色； 鼹气式反应器 n 华东师范大学2 0 0 5 年申请硕士学位论文：外源调控下白腐真菌处理染料废水关键酶活的研究 a b s t r a c t s i n c e1 9 8 0 s ，w h i t er o tf u n g ie s p e c i a l l yp h a n e r o e h a e t ec h r y s o s p o r i u mh a sb e e n a p p l i e di nt r e a t m e n to fd e g r a d a t i n gr e f r a c t o r yi n d u s t r i a lw a s t e w a t e rs u c ha sp e s t i c i d e w a s t e w a t e r , o i lw a s t e w a t e r , a m m u n i t i o nw a s t e w a t e r , p a p e r m a k i n gw a s t e w a t e r , l i g n i np e r o x i d a s e ( l i p ) ，m a n g a n e s ep e r o x i d a s e ( m n e ) a n dl a c c a s e ( l a c ) a r et h ek e y e n z y m e s i nt h es y s t e m e n v i r o n m e n t a lc o n d i t i o n sa n de x t e r i o rr e g u l a t i o n sh a v eg r e a t e f f e c to ns y n t h e s i sa n da c t i v i t yo ft h ek e ye n z y m e so fw h i t er o tf u n g i ，a n dt h e ya f f e c t d e g r a d a t i n ge f f i c i e n c yo f p o l l u t a n t s i nt h i st h e s i s p h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u mi s a p p l i e dt o t r e a tw i 也t h ed y e w a s t e w a t e ru n d e re x t e r i o rr e g u l a t i o n si nt h et y p e sa n dc o n c e n t r a t i o n so fn u t r i t i o n s ， i n d u c e m e n t sa n dd y e s t h e s ei n f l u e n c et h ec h a n g eo fm n p a c t i v i t ya n dt h ee f f e c to f w a s t e w a t e rt r e a t m e n ti na e r a t i o nr e a c t o r t h ef o l l o w i n ga s p e c t sw e r es t u d i e di nt h i s t h e s i s ： 1 o p t i m i z a t i o n o fs o m e p r o d u c i n g c o n d i t i o n sf o rm r i p b y p h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u m t h ec u l t i v a t i o nw a sp e r f o r m e di n5 0 0 一m ls h a k ef l a s k s ( 1 2 0r m i n ) c o n t a i n i n g2 5 0 m lm e d i u m ( p h4 5 ) a t3 7 c ，a n dt h ei n o c u l u mc o n c e n t r a t i o nw a s1 3 10 6s p o r e s i m l t h eh i 曲e s tm n p a c t i v i t yw a s1 4 7 3 u li nt h i sc u l t i v a t i o n 2 s t u d yi nr e g u l a t i o no fn u t r i t i o n sa n dm n pa c t i v i t y i na e r a t i o nr e a c t o rw i t h c a r r i e r r e a c t i v eb l a c kk n bw a st h eb a s a ld y ea n dt h er e s u l t sw e r ea sf o l l o w s i ) l o g lg l u c o s ea n d0 2 la m m o n i u mt a r t a r w e r et h eo p t i m a lc o n d i t i o n st om n p a c t i v i t ya n dd e c o l o r i z a t i n gv o l e c i t yo f r e a c t i v eb l a c kk n b 2 ) i na e r a t i o nr e a c t o rt h e a d d i t i o no f d y es p u r r e dp h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u m t oe x c r e t em n pt or e s i s tb a d e n v i r o n m e n t w i t ht h ea c c u m u l a t i o no f d y et o x i c i t yi nc e l l s t h ea c t i v i t yo fm 1 1 pw a s r e s t r a i n e da n dw e n td o w n3 ) d e g r a d a t i o no f d y eb yp h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u m w a s c o m p l e t e di n7 2h o u r s a b s o r p t i o nw a s t h em a i nf u n c t i o nb e f o r ed e g r a d a t i n gf o r 2 4 h o u r s ，b u t a f t e r d e g r a d a t i n g f o r4 8 h o u r s ，d e g r a d a t i o nb yp h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u m w a st h em a i nr u c t i o na n dh a dn e wc o l o r e di n t e r m e d i a t e s 3 s t u d y i n r e g u l a t i o n o fi n d u c e m e n t sa n dm i 心a c t i v i t yi na e r a t i o nr e a c t o r w i t h o u tc a r r i e r r e a c t i v eb l a c kk n bw a st h eb a s a ld y ea n dt h er e s u l t sw e r ea sf o l l o w s 华末师范大学2 0 0 5 年申请硕士学位论文：外源调控下白腐真菌处理染料废水关键酶活的研究 1 ) m e t h y la l c o h o lh a di n d u c i n gf u n c t i o nt ot h es y n t h e s i so fm n pa n dt h eo p t i m a l c o n c e n t r a t i o nw a sa b o u t5 m m o l l t h eh i g h e s tm i l pa c t i v i t yw a s13 8 4 u l 2 ) t h e e x i s t a n c eo fm n ”h a d g r e a te f f e c to nm n pa c t i v i t y l o wc o n c e n t r a t i o no fm n 2 c o u l d i n d u c eh i g h e ra c t i v i t yo fm n pa n dt h eo p t i m a lc o n c e n t r a t i o nw a s0 2 m m o l l t h e h j g l l e s tm i l pa c t i v i t yw a s15 1u l 3 ) i th a d o b v i o u se f f i c i e n c yo i ln u t r i t i o n su s a g ea n d d e c o t o r i z a t i n g e f f e c t b y p h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u m i n r e g u l a t i o n o f i n d u c e m e n t s 4 s t u d yi nr e g u l a t i o no fd y e sa n dm n pa c t i v i t yi na e r m i o nr e a c t o rw i t h o u tc a r r i e r f o u rk i n d so fa c t i v ed y ew e r es e l e c t e d t h e yw e r ea c t i v eb l a c kk n b ，a c t i v ey e l l o w m 一3 r e ，a c t i v er e dm 3 b ea n da c t i v ec o l o r f u lr e dm 2 b ，a n dt h e ya l la r es y m p l e t i c a z o t e d y e s ，t h r e e k i n d so fc o n c e n t r m i o nw e r es e l e c t e da n dt h e yw e r e 5 0 m g l ， 1 0 0 m i 影l a n d 2 0 0 m g lr e s p e c t i v e l y t h e r e s u l t sw e r ea sf o l l o w s 1 ) i nt h e c o n c e n t r a t i o no f2 0 0 m g lf o u rk i n d so f d y e h a do b v i o u s e f f e c t ，a n dh i g h e r c o n c e n t r a t i o no fd y e sh a dt o x i c i t yt op h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u m 2 ) d i f f e r e n t t y p e so fd y eh a dd i f f e r e n td e c o l o r i z a t i n ge f f e c t i nd e c o l o r i z a t i n gv o l e c i t y , i tw a s a c t i v eb l a c kk n bb e t t e rt h a na c t i v ey e l l o wm 3 r e ，b e a e rt h a na c t i v er e dm 一3 b ea n d b e t t e rt h a na c t i v ec o l o r f u lr e dm 2 b 一一。h_*-_。” 枷钠岫：。朋觏眺僦c h r y g o s p o r 自u m , m i l pa c t i v i t y , e x t e r i o rr e g u l a t i o n d y e 删静鲥a ；t 蟥t 4 缎婚鼬翻瞄固霹删；磷g 戳硫谶融辩 v 堂量硕士学位论文答辩委员会成员名单 姓名职称单位 备注 陈代杰研究员上海来益生物主席 药物研发中心 史家裸教授华东师范大学 朱文杰教授华东师范大学 黄民生教授华东师范大学 李秀艳副教授 华东师范大学 学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经 发表或撰写过的研究成果。对本文的研究骰出重要贡献的个人和集体，均已在 文中作了明确说明并表示谢意。 作者签名：缱日期：! 坚：! ：萝 学位论文使用授权声明 本人完全了解华东师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保 留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权 将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅。有 权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索。有权将学位论文的标题和摘要 汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。 学位论文作者签名：轶 疑 日期：尘! ! ：三：兰2 华东师范大学2 0 0 5 年申请硕士学位论文：外源调控下白腐真菌处理染料废水关键酶活的研究 第一章前言 1 1 研究背景 目前，世界每年生产的染料有1 0 0 ，0 0 0 种，产量为7 0 0 ，0 0 0 吨。中国是染料 生产大国，每年生产的染料达1 5 0 ，0 0 0 吨【2 l 。染料是一种人工合成的大分子芳香 烃化合物，品种繁多，结构复杂，在环境中能够长期稳定存在。染料在生产过程 中大约有1 0 1 5 会随废水的排放而流失【3 】，对生态环境及人类健康具有相当 大的危害性。 染料废水具有色度高、c o d 高、盐度高、毒性高、b c 低的“四高一低”基本 特点【4 8 】。因此，与许多其他有机工业废水相比，染料废水的处理难度更大。经 济有效地处理染料废水一直是国内外环保工作者的研究热点和急需攻克的难题 【5 9 2 1 。 染料废水的处理方法有物化法和生物法两大类。物化法主要有絮凝沉降、吸 附、化学氧化、辐照、离子交换和超滤膜过滤等，它们对染料废水具有良好的处 理效果，但往往存在处理费用较高及可能引起二次污染等问题。作为有机工业废 水处理的主流技术，生物法也被广泛地应用于染料废水处理。但生产实践表明， 常规生物法( 活性污泥法、生物膜法) 对染料废水的处理效果相当有限。研究并 应用对染料废水具有高效处理作用的功能性微生物被认为是解决这些问题的有 效途径之一。 目前发现能降解染料的微生物种类很多，主要有真菌、细菌和藻类三类f t 3 - 2 2 1 。 厌氧条件下许多细菌对染料具有部分或不完全的降解作用，生成的中间产物往往 毒性较大，使其应用受到限制。自腐真菌( w h i t er o tf u n g i ) 是以木质素降解系统 ( 木质素降解酶及其引发的自由基链式反应) 来降解复杂有机污染物的，具有广 谱( 高度非特异性) 、高效和彻底( 矿化) 等特点。合成染料都是以苯环为核心 的稠环、杂环分子，它们与白腐真菌的天然降解底物木质素在结构上有很大 的相似性【1 2 , 2 3 - 2 5 1 ，因此也是白腐真菌可以降解的对象。近年来国内外许多学者应 用多种白腐真菌开展了难降解有机污染物( 如多氯联苯、多环芳香烃、合成染料 及二恶英等) 的生物降解实验研究，结果表明，作为降解复杂有机污染物的特异 性功能微生物，白腐真菌在染料废水处理中具有良好的潜在应用前景1 2 6 - 2 9 1 。 本论文研究是国家自然科学基金项目白腐真菌生化反应器处理染料废 华东师范大学2 0 0 5 年申请硕士学位论文：外源调控下白腐真菌处理染料废水关键酶活的研究 水及调控( 5 0 2 7 8 0 3 4 ) 研究工作的一部分。 1 2 国内外研究概况 1 2 1 白腐真菌的生物学背景 木腐菌造成木材腐朽的现象早已 i 起林产学、生物学和环境学领域的广泛关 注，其实质是生物降解，即：着生于木材上的微生物( 特别是真菌及其近缘的植 物残体菌) 通过十分独特的机制分解木材中的木质素、纤维素等复杂有机物以获 得自身生长和繁殖的必要营养源与能量，并引起木材的特征性色、状腐朽 3 0 - 3 1 】。 木腐菌主要是真菌，同时也包括某些放线菌、细菌。其中能够分解木材中的木质 素使得腐朽后的木材呈现特征性白色的木腐真菌统称为白腐真菌，大多数白腐真 菌属于担子菌纲，少数为子囊菌纲，包括桦多孔菌、漏斗状侧耳、糙皮侧耳、粉 状侧孢霉、拟革盖菌等2 0 0 多个品系【3 2 1 。黄孢原毛平革菌( p h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u m ，简称p c 菌，下同) 是白腐真菌的代表种，是目前研究最多的一 种白腐真菌。它们普遍分布于北美，在我国尚未发现。在分类学上属于真菌门担 子菌纲( b a s i d i o m y c e t e s ) 同担子菌亚纲( h o m o b a s i d i o m y c e t i d a e ) 非褶菌目 ( a p h y l l o p h o r a l e s ) 丝核菌科( c o r t i c i a c e a e ) 。该菌的无性阶段产无色粉状分生 孢子，菌丝体成平伏状。 1 2 2 白腐真菌降解染料的机理 1 2 2 1 白腐真菌降解染料的相关酶系 白腐真菌降解染料的活动只发生在次生代谢阶段，其降解能力取决于木质素 降解系统，该系统只有在碳、氮等主要营养物质受限制时才能形成【3 3 _ 3 4 1 。当白腐 真菌被引入废水中，由于生物具有的应激性将对营养限制作出应答反应，形成一 套降解酶系统p ”，并引发自由基链式反应。 自2 0 世纪8 0 年代以来，人们相继从白腐真菌中分离出木质素降解酶。目前， 研究得较多，并认为最为重要的木质素降解酶有3 种，即木质素过氧化物酶 ( l i g n i np e r o x i d a s e ，简称l i p ，下同) 、锰依赖过氧化物酶( m a n g a n a s e p e r o x i d a s e ，简称m n p ，下同) 和漆酶( l a c c a s e ，简称l a c ，下同) ，分别代表 一系列的同功酶。不同白腐真菌其木质素降解酶系的组成有很大的差异，它们大 华东师范大学2 0 0 5 年申请硕士学位论文：外源调控下白瘸真菌处理染料废水关键酶活的研究 体可分为3 种类型【3 6 - 3 7 】：( 1 ) 木质素过氧化物酶一锰过氧化物酶，如p h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u m ：( 2 ) 漆酶一锰过氧化物酶，如l e n t i n u l ae d o d e s ，p a n u st i g r i l u s ；( 2 ) 木质素过氧化物酶一锰过氧化物酶一漆酶，如c o r i o l u sv e r s i c o l o r ，p h l e b i a v a d i a t a 。但是这种分法并非绝对，不同营养源和一些诱导物的加入等均会在3 种酶的产生上发生不同的扶抑作用。 除了上述3 种重要的酶外，其它如细胞内的葡萄糖氧化酶和细胞外的乙二醛 氧化酶，它们在分子氧的参与下氧化污染物并形成h 2 0 2 ，激活过氧化物酶而启 动酶的催化循环。此外，还有芳醇氧化酶、酚氧化酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氯 酶及还原酶、甲基化酶、蛋白酶等，这些酶也是白腐真菌降解系统的重要组成 3 8 1 。 1 2 2 2 自腐真菌木质素降解酶的结构和催化机理 以k i r k 领导的研究小组于1 9 8 3 年首次从黄孢原毛平革菌的胞外培养液中发 现一组过氧化物酶，由l i p 和m n p 组成口”。它们在细胞内合成后被分泌到胞外， 经h 2 0 ：启动一系列的自由基链式反应，依靠氧化还原反应降解各种染料。其中 非酚类芳香族化合物依赖于l i p ，而酚类、胺类及染料等依赖于m n p 3 7 。3 8 “们。 m n p 是一种糖蛋白，分子量约为4 6 0 0 0 ，由一个血红素基和一个m n 2 + 构成 了它的活性中心，另外还有两个起稳定结构作用的c a ”，其分子中有十条长的蛋 白质单链，一条短的单链，具体结构见图1l 。 图1 1 m n p 的结构 l i p 也是一种糖蛋白，分子量约4 1 0 0 0 ，它的活性中心与m n p 近似，但却不 含m n 2 + ，其分子中也有十条长的蛋白质单链，一条短的单链。其氨基酸顺序有 华东师范大学2 0 0 5 年申请硕士学位论文：外源调控下白腐真菌处理染料废水关键酶活的研究 4 3 与m n p 相同。两者的主要区别是：l i p 中c 端在血红素基的两个丙酸根之 间：丽m n p 的c 端却与血红素基分开。另外。m n p 有5 个二硫键，而l i p 有4 个二硫键，前4 个相同，m n p 的第5 个二硫键在蛋白质链的c 端，可能与m n 2 + 的活性中心有关f 4 0 】，具体结构见图1 2 。 图1 2 l i p 的结构 它们在反应中从苯酚或非酚类的苯环上夺取一个电子而使后者形成一个阳 离子基团，从而导致木质素分子中主要键的断裂。其反应历程如下【3 7 ： 过氧化物酶+ h 2 0 2 酶复合物i + h 2 0 酶复合物i + s h r s h + 酶复合物i i 酶复合物i i + s h r s h + 过氧化物酶 2s h - + 2 木质素2 木质素自由基+ 2s h 2 总反应：h 2 0 2 + 2 木质素2 木质素自由基+ h 2 0 其中s h 2 为对酶系专一的电子传递体，对于l i p ，藜芦醇( v e r a t r y la l c o h o l ，v a ) 是其中间电子传递体：而m n p 中，m n 2 + 是中间电子传递体。由于过氧化物酶只 提供电子的转移而不是直接与化合物结合，使该菌对污染物的降解呈现广谱特 性，而且不易受化合物毒性的影响。 漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，主要来源于生漆和真菌。其作用主要是催化 氧化还原反应。在植物体内。它催化本质素的聚合过程，使木质素沉积；而真菌 产生的漆酶则进行相反的过程，使木质索发生降解。 4 华东师范大学2 0 0 5 年申请硕士学位论文：外源调控下白腐真菌处理染料废水关键酶活的研究 由于漆酶的含糖量很高，难得到x 衍射结构分析用的漆酶单晶，它的三维 空间结构尚不清楚。但已经证实，漆酶中的铜离子在催化氧化反应中起决定作用。 根据磁学和光谱性质可将漆酶中的4 个铜离子分为3 类：i 型c u ”和i i 型c u n 各1 个，是单电子受体，呈顺磁性，可以用核磁共振检测；i i i 型c u h 2 个，是双 电子受体，呈反磁性，用核磁共振不能检测。i 型c u 2 + 呈蓝色，在波长6 1 4 n m 处有特征吸收峰，它是电子传递体；i l 型c u 2 + 为非蓝色，没有特征吸收峰，既 是电子传递体又是催化活性中心；i i i 型c u 4 + 是偶合的离子对，在波长3 3 0m 处 有宽的吸收峰【4 。】。具体结构见图l3 。 图l3l a c 的结构 漆酶作为一种多酚氧化酶，它可催化氧化酚类或芳胺类等多种底物，同时分 子氧棱还原为水。这一过程中，漆酶从氧化底物分子中提取一个电子，使之形成 自由基。该自由基不稳定，可进一步发生聚合或解聚反应 2 2 , 3 8 , 4 1 - 4 2 j 。 1 2 3 白腐真菌合成木质素降解酶的研究 1 2 3 1 培养基成分对产酶的影响 黄孢原毛平革菌一般需要在限氮或限碳培养基中才能合成木质素降解系统。 除了碳、氮源比例不同之外，这两种培养基的其它组成成分基本相同。常用的培 养基包括以下几个部分：碳氮源、缓冲液、宏量元素、微量元素、维生素。有的 为了提高木质素过氧化物酶的酶活还会加入藜芦醇和吐温等。 我国学者李越中等1 4 叫曾对黄孢原毛平革菌合成木质素过氧化物酶的营养调 华东师范大学2 0 0 5 年申请硕士学位论文：外源调控下白腐真菌处理染料废水关键酶活的研究 控进行较为详细的研究报道，他们的研究表明：糊精是最优碳源，且混合糖源比 单独糖源好。酒石酸铵为最优氮源，其菌丝体的产酶效率( 酶活m g 菌丝) 最高。 他们还发现提高磷酸二氢钾、硫酸镁和微量元素的浓度均显著提高酶活。 k i r k 等人1 4 4 j 发现在4 种不同的缓冲液( 琥珀酸、酒石酸、顺乌头酸、邻苯 二甲酸) 中除了琥珀酸会被黄孢原毛平革菌生长所利用，其余三种缓冲液都可用， 且以邻苯二甲酸对降解最有利。培养的最佳p h 是4 5 。并证实了v b 一是菌体生 长和合成木质素降解体系所必需的唯一维生素。 丁佐龙1 4 5 1 等人研究了在以0 4 微晶纤维素为碳源、2 0 m m o l l 的铵离子 ( n h 4 + ) 为氮源的富碳富氮液体振荡培养条件下，木质素过氧化物酶与起始p h 值、诱导剂、孢子年龄等的关系。他们在此过程中发现：不同碳源同时加入，或 分段加入，会引发“暂时性低碳”，多次刺激导致更多的木质素过氧化物酶的台成。 另外，人们普遍认为，木质素降解酶产生于白腐真菌细胞内( 胞内酶) 并扩散 到细胞外( 胞外酶) 。邓振旭等【4 6 】通过比较发现，毛栓菌( t r a m e t e sg a l l i c a ) 胞外 酶和胞内酶活性在不同的碳源存在时都有较大差别，但就某一碳源而言，若胞外 酶活性较高，其胞内酶活性一般也较高。这说明碳源对胞外酶和胞内酶的影响趋 势是基本平衡的，说明各碳源并不能单独影响酶类由胞内分泌到胞外，或者说这 种影响在各碳源间差别不大。氮源的影响情况与碳源基本相同。 1 2 3 2 诱导物对产酶的影响 诱导物的有无及浓度高低对白腐真菌木质素降解酶的合成有着重要的影响。 诱导物因酶的种类而异：漆酶的产生与c u 2 + 有关，锰过氧化物酶依赖于m n 2 + 的 产生，藜芦醇是木质素过氧化物酶的良好诱导物。一些诱导物在诱导合成关键酶 的同时，还可能起到分散剂、保护剂的作用。 肖亚中等1 4 7 1 研究白腐真菌a h 2 8 2 菌株时发现，发酵培养基中不添加c u 2 + 时，漆酶活力极低；在0 5 9 m o l l 范围内，酶活水平随c u 2 + 浓度的增加迅速提 高，在c u ”浓度为5 斗m o l l 时漆酶活性达到峰值；当c u 2 + 浓度大于1 0 9 m o l l 时， 漆酶活性反而降低。有学者认为可能是漆酶基因转录合成漆酶蛋白时需要铜离 子，缺铜和限铜均不利于漆酶合成。说明漆酶作为一种含铜的多酚氧化酶，培养 基中含有适量的c u 2 + 对漆酶合成及酶活表达是必不可少的，但过多的c u 2 + 又抑 华东师范大学2 0 0 5 年申请硕士学位论文：外源调控下白腐真菌处理染料废水关键酶活的研究 制菌株漆酶的合成和表达。 在合成m n p 过程中，m n ”的作用至关重要，m n 2 + 同时也是该酶的底物。l i 等发现m n p 的合成是由m n 2 + 诱导的，m n 2 + 的存在增加了m n pr n r n a 的合成 量，提高了m n p 基因的转译，所以培养基中缺乏m n ”时就不能合成m n p 。 b o n n a r m e 等人【4 9 1 研究了m n 2 + 对m n p 合成的调节作用，也发现黄孢原毛平革菌 培养基中不加m n ”几乎不会合成m n p ：m n ”的浓度在0 4 0 m g l 之间时，浓度 越高越有利于m n p 的合成，但当m n ”浓度超过2 0 0 m g l 后m n p 的酶活便开始 缓慢下降。 m n 2 + 对l i p 合成的影响比较复杂。李华钟等 5 0 - 5 3 1 在对黄孢原毛平革菌的研究 中发现，培养基中只有添加适合浓度的m n 2 + ，在培养至3 5 天左右培养液才会开 始变黄，随后菌丝球慢慢变成褐色，并且颜色逐渐加深，此时开始测到l i p 的活 力，菌丝球上沉积的褐色物质经证实为m n 0 2 ，它可以催化h 2 0 2 的分解，保护 l i p 不受h 2 0 2 的毒害，故适量的m n ”可以提高l i p 的活力；当培养基缺乏m n 2 + 时，黄孢原毛平革菌可以合成藜芦醇( 内源产生) ，藜芦醇既是合成l i p 的诱导物， 同时又能保护l i p 不因h 2 0 2 的浓度过高而失活( 自我保护机制或对环境条件变化 的应激反应) ；当培养基中只有微量的m n 2 + 时，无m n 0 2 形成，同时细胞也不能 合成藜芦醇来诱导l i p 的合成；而在高浓度m n 2 + 的条件下，大量的m n 2 + 在m 1 1 p 的作用下被氧化成m n ”，培养液呈橙红色，过量的m n 3 + 也无法转化成m n 0 2 ， 从而使l i p 的表达受到了抑制。 m n 2 + 对漆酶的影响也是显著的【1 9 】：不添加m n 2 + 可使a g a r i c u sc a m p e s t r i s 的 l a c 活性显著降低，但m n 2 + 对其影响是以c u 2 + 的存在为前提，如果没有c u 2 + 存 在，那么l a c 的活性则与m n 2 + 浓度无关且酶活性始终很低。 结构和木质素有关的低分子芳香化合物或木质素降解的碎片化合物，可诱导 l a c 产生并提高其酶产量，这类化合物如草酸、藜芦醇、愈创木酚、吐温、甲苯 胺等。 在对黄孢原毛平革菌的研究中，k i r k 等 5 5 1 发现在限碳培养基中添加 o 4 m m o l l 的藜芦醇后所获得的l i p 酶活是不添加时的2 1 倍。藜芦醇是木质素 降解过程中非常重要的次生产物，作为l i p 的诱导剂有极其重要的作用。藜芦醇 可以由木质素降解体系内源产生，也可以通过外源投加。j a g e r 等人口6 】通过添加 华东师范大学2 0 0 5 年申请硕士学位论文：外源调控下白腐真菌处理染料废水关键酶活的研究 表面活性剂吐温成功解除了振荡培养对黄孢原毛平革菌l i p 活性的抑制，吐温的 最佳浓度是0 0 5 n 0 1 。吐温增加了细胞膜的通透性，从而解除了已合成的 酶在胞内的积累所产生的抑制作用。但吐温投加量过大将导致泡沫问题，影响处 理装置的正常运行。 1 2 3 3 氧浓度对产酶的影响 d o s o r e t z 等人【5 7 】考察了限氮浸没培养条件下通氧和通空气对黄孢原毛平革 菌两种过氧化物酶( l i p 、m n p ) 合成的影响，他们研究了5 种通氧和4 种通空 气的情况，发现通气条件对酶的合成有很大影响。通空气条件下菌丝不合成l i p ， 能合成m 1 1 p 但酶活低于通氧条件。连续通氧比周期性通氧增加了葡萄糖的消耗， 产生较多的蛋白酶和多糖。其中蛋白酶对l i p 和m n p 有破坏作用，而多糖将影 响传质、传氧，最终使酶活下降。因此得到的两种过氧化物酶酶活相应较低，且 酶活通过峰值后下降也越快。b a r l e v 等 58 i 研究了浅层静置限氮培养条件下氧浓 度对黄孢原毛平革菌木质素降解酶的影响，也得出高氧环境有利于木质素降解酶 系的合成的结论。张朝晖等i s 9 研究了限碳培养时氧浓度的影响，结果表明在通 空气条件下黄孢原毛平革菌能够产酶，无须通纯氧。 1 2 3 4 其它因素对产酶的影响 影响黄孢原毛平革菌木质素降解酶合成及活性的还有一些其他因素，如培养 温度、转速、接种量乃至环境湿度等。a s t h e r 等人1 6 0 j 研究了温度对黄孢原毛平革 菌木质素过氧化物酶合成的影响。一般来说生长结束后降低温度有利于次级代谢 物的启动，因此可以把培养温度分为两阶段控制：第一阶段是菌体生长阶段。第 二阶段是过氧化物酶合成阶段。如果菌体生长温度为3 7 ，酶合成期温度降为 3 0 ，这种方式培养所得的最高酶活与温度恒定在3 7 。c 培养相比，要高1 倍多。 菌丝球大小和结构也是影响黄孢原毛平革菌产酶的重要因素。李华钟等1 6 1 证实，限氮培养条件下随着氮源浓度升高，菌丝球逐渐变大，且颜色有明显变化。 当酒石酸铵浓度大于1 4 m m o l l 时，培养液粘稠。由于氧气在萤垫中的穿透能力 不强，在菌垫厚1 5 m m o l l 处溶氧已接近零，厚2 m m o l l 处则完全测不到溶氧， 即菌丝球的厚度一旦超过3 m m o | l ，菌丝球中心的细胞会缺氧，严重时引起自溶， 华东师范大学2 0 0 5 年申请硕士学位论文：外源调控下白腐真菌处理染料废水关键酶活的研究 释放出胞内物质。经测定使培养液粘稠的物质为多糖物质。菌丝球变大不利于传 质、传氧，而多糖物质的存在进一步引起了传质、传氧效率的下降，使菌体生长 和产酶受到了影响。 1 2 3 5 台成l i p 和m n p 的反应器研究 为了扩大合成酶的规模，人们尝试了多种生物反应器。m i c h e l 等人 6 2 在o 5 l 的搅拌罐中用黄孢原毛平革菌成功合成l i p ，最高酶活约1 8 0 u l 。j o n e s 等人【6 m 在2 5 l 的转盘反应器中( 转速为lr m i n ) 得到黄孢原毛平革菌l i p 的最大酶活 为1 3 0u l 。v e n k a t a d r i m j 在2 l 的膜反应器中得到最离l i p 酶活为2 0 3u l ，反 应器可连续产酶5 周以上。此外，b o n n a r r n e 等【6 5 1 还比较了搅拌式反应器、鼓泡 式反应器和气升式反应器对黄孢原毛平革菌产酶的影响，发现气升式反应器对产 酶最为有利，鼓泡式反应器次之。l i n k o 6 6 1 用尼龙网固定黄孢原毛平革菌在1 0 升的发酵罐中限碳培养生产l i p ，生长期通空气，产酶期通纯氧，氧分压维持在 5 0 7 0 。第三天当酶活开始出现后，多次加入1 9 l 的葡萄糖刺激酶活的增 加，最高酶活可以达到7 3 0 u l 。国内张朝晖等人 6 7 l 结合固定化载体的性质，选 用三相流化床反应器进行固定化培养生产木质素过氧化物酶，能大大减少有害的 剪切力，促进三相间的物质传递，有利于产酶。在通气量为1 v v m 时，最大木质 素过氧化物酶酶活达到3 6 7u l ，在招同的培养基和相同的固定化载体单位体积 用量下，与摇瓶培养相比，酶活分别增大了1 倍和1 2 倍。李华钟等【6 8 】在研究比 较黄孢原毛平革菌在三种生物反应器中( 搅拌式反应器、鼓泡式反应器、曝气式 反应器) 合成l i p 和m n p 的差异时发现曝气式反应器对酶的合成( 尤其是l i p ) 最为有利，且曝气式反应器中半连续培养方式下培养体系能长时间保持较高酶 活，置换比例为1 2 时染料废水可连续脱色5 批，脱色率达到9 0 以上，而连续 培养条件下酶很快失活，废水的脱色率迅速下降。 1 2 4 木质素降解酶降解染料的研究 国内外研究者探索了黄孢原毛平革菌对各种染料的降解能力。b u m p u s | 6 9 1 和 g o s z c y n s k i l 7 0 l 等人分别利用黄孢原毛平革菌降解结晶紫和自制磺化偶氮染料，获 得了良好的效果。y a n g 7 1 1 等人在固定薄膜反应器中使用固定化黄孢原毛平革菌 处理分散红5 3 3 ，使用这种系统，每次脱色的过程可连续地进行l o 2 0 天或者 9 华东师范大学2 0 0 5 年申请硕士学位论文：外源调控下白腐真菌处理染料废水关键酶活的研究 更长时间，而且脱色率保持在8 0 以上( 最初染料浓度为1 0 0 2 5 0 m g l ) 。 在染料的脱色过程中，尽管菌丝体的吸附脱色、木质素降解酶的降解脱色同 时存在，但许多实验研究结果表明：菌丝体吸附作用去除的染料色度仅占有很小 的一部分，黄孢原毛平革菌对染料的降解主要是靠木质素降解酶的降解作用完成 的。虽然l i p 和m n p 都可以对染料进行脱色，但这两种酶的脱色性能有所差异。 p a s t i i ”】分别测定了黄孢原毛平革菌产生的l i p 和m n p 对2 2 种偶氮染料的降解速 率，发现针对不同染料两者的降解能力各有优劣。大多报道认为染料的脱色是多 种酶共同作用的结果，l i p 和m n p 所代表的是一系列的同功酶。在c r i p p s 等f 7 3 1 的实验里也发现，当分别用黄孢原毛平革菌的培养液和纯l i p 的粗酶液对染料脱 色时，培养液的脱色效果明显好于粗酶液，说明染料脱色过程中木质素降解系统 的其它酶也起到了降解作用。 一般来说，限氮培养有利于染料脱色。c r i p p s 7 3 1 发现限氮培养的脱色速度明 显比富氮培养快。而且菌种本身对染料的脱色效果有很大影响。k n a p p 等 7 4 1 用黄 孢原毛平革菌的7 株不同菌株对多种染料进行脱色，发现不同菌株对同种染料的 脱色能力不同。 国内对黄孢原毛平革菌处理染料废水的研究还处于起步阶段。唐婉莹等 7 5 】 用黄孢原毛平革菌处理分散染料废水，发现该菌对染料废水的水质变化适应能力 强，脱色效果好，但对c o d 的去除率不高，所以还需与絮凝等物化方法相结合。 何德文等【7 6 悛现黄孢原毛平革菌在处理分散染料废水时c o d 呈波浪式下降，推 测是因为废水中含多种芳香族化合物，不能被完全氧化丽显示出较低的c o d 值， 随着生化降解逐步进行，大分子蒽醌开环、断链生成易被氧化的链状物质，测得 的c o d 值升高，接着链状物质逐渐被氧化，测得的c o d 值也随之下降。张朝 晖 6 7 1 用含有本质素过氧化物酶的酶液进行酶降解酸性卡布龙红的动力学研究， 推导出酶降解卡布龙红的反应速率方程式为有底物抑制的双底物乒乓动力学方 程，同时证明菌丝体也有一定的脱色能力。李慧蓉等 2 4 , 7 8 1 研究了黄孢原毛平革菌 对多种染料的降解，考察了各种培养参数对染料的脱色和降解的影响，包括菌种、 培养方式、染料类型、缓冲液种类和藜芦酵浓度等。并且观察到染料降解过程中 培养液的最大吸收波长向短波方向显著移动，说明有新的有色中间产物形成。 华东师范大学2 0 0 5 年申请硕士学位论文：外源调控下白腐真菌处理染料废水关键酶括的研究 1 3 自腐真菌降解染料的优势 首先，木质素降解酶的大量产生是发生在营养被消耗的次级代谢过程中，也 就是说白腐真菌合成木质素降解系统的活动只有在主要营养物质，如碳、氮、硫 等受到限制时才能启动。因此，白腐真菌利用较低成本的营养源就可以建立起有 效的降解体系。其次，白腐真菌的最佳生长p h 值较低，呈酸性，生长温度较高， 而且产酶培养基需要限制营养源，这些条件不利于其它微生物的生长，能使其在 培养过程中具有竞争优势，不易染菌。再次，木质素降解酶皆为胞外酶，降解作 用发生在胞外，这使得白腐真菌在有效降解污染物的同时却不构成对细胞的毒害 作用，对毒性较大的污染物有很强的耐受力，可以忍受较高浓度的染料废水。最 后，白腐真菌的降解体系反应是一系列的自由基链反应，这种反应是高度非特异 性和无立体选择性的，使得木质素降解酶与降解底物之间并非一一对应关系，故 对污染物的降解呈现广谱特性，能使染料废水的处理效率更高。 1 4 木质素降解酶的应用进展 多年来，人们将木质素降解酶用于污染治理、环境修复及清洁生产领域，取 得了长足进展： 1 ) 造纸工业【7 8 _ 7 9 1 主要包括生物制浆、生物漂白和造纸废水处理。研究表明： 用白腐真菌及其关键酶对造纸原料进行发酵预处理可降低4 7 的制浆能耗并提 高了纸浆纤维的张力，但生物制浆的处理时间较长，距大规模推广应用尚有一定 的距离；用白腐真菌及其关键酶处理造纸废水( 包括黑液及白水) ，可以显著降低 废水的c o d 浓度、色度和毒性。 2 ) 饲料工业f 8 0 - 8 q 利用白腐真菌及其关键酶对有机饲料进行预处理可提高动物 对饲料的消化率，在应用中可以突破秸秆仅用于反刍动物饲料的禁地，目前已有 报道饲养猪、鸡的实验效果，将术素酶、纤维素酶和植酸酶等添加到饲料中生产 多酶复合饲料已达到商品化的程度，应用后还可以明显控制畜禽粪便的恶臭污 染。 3 ) 食品工业【”。4