（农产品加工及贮藏工程专业论文）乳糖酶的固定化技术及其在低乳糖乳中的应用.pdf

摘瓣 必了霞爨麴霉嚣赣酶逶予痰簿字嚣中戆嚣耱，这捌连续生产低魏藉巍戆彝 的，本论文霞绕乳糖酶酌因定纯和雷定纯辩生产低季i 糖巍的相关灌论与技术，对 固定化载体选择、固定化条 牛的优化、蹰定化酶的特憔以及低乳糖魏的生产进行 了系统研究。磷究结果表明： | ，牙发瑷想豹载体是霾定纯研究妁黧要课题之一。从四静糖脂中爨选出黑 曲箨来源孚l 糖酶啜辫效粟较好鹣载俸：阳离子交换褥麟d 1 5 1 。戳醋离子交换瓣 脂d 1 5 1 为载体。戊二醛为交联剂，对乳糖酶的吸附和变联条件进彳子了优化，结 果袭明：在经潋处理后的0 1g 阳离子交换树脂d 1 5 1 巾。加入用p h 4 0 0 3m o l l 醚羧缓穗滚稀释戆黪滚，擞酶蠹秀5 0u g 载嚣) ，在2 5 条箨下暇鼹2 4 囊露， 加入4 戊二醛，在3 0 条彳串下交联6 h ，获得的固定纯酶活力可达1 1 8 u g ( 载 体) ，固定化酶嘲收率为3 7 2 。 2 阖定化辩的基本酶学性质； 霾定纯酶骚逶馋羯涅度必国，魄游瓷酶甄l o ；热稳定馊毖游骞酶毒所 降低。嚣定强酶最遣侔餍p h 4 5 ，魄游离酶提赢了馥5 个荦位；嚣糟羧躐稳定幢 有较太差异。围定化酶较游黼酶而言，谯牛奶的天然p h ( 约为6 。s ) 条件下使用 慰为适宜。圊怒化酶对乳糖的k m 值为1 3 2 1m m o l l ，与游离酶k m 值相比稍 蠢舞蹇。n a + 、c a 2 + 、q 2 + 、z r l 2 + 辩游离鹜黟霾定馥酶拳麓鸯不嚣程度熬瓣秘终震； p b 轴、m 9 2 + 辩游离酶水解有柿制作用，憾对固定亿酶承解兵有激滔俸熠，其中 m g “作用更为鼹著；k + 、f e 2 + 、e d t a 瓣游离酶和固定化酶的本群必抑制翮激活 每周。固定能黪在4 冰箱内的贮存稳定性与游离酶相比稍有增强。在反藏后用 p h 4 。0 0 。2m o l l 醋酸缓冷滚洗涤霞定稼酶1 0 m i n 条终下，霹定豫黪涟续镁瘸筠 次麓其酶活力僚持在9 0 戳上。游离酶巍p h 6 5 、5 0 ( 2 条件下豹拳巍期仅先9d ； 而固定化酶在此条件下操作半袭期为2 4d 。 3 。对剃用嬲定他酶连续生产低乳糖嚣虢条 牛和使用稳定性进行研究发现： 在5 垂条俸下，孛魏戳空溺流速1 5k 1 藤赣滚速0 。5 3m l m i n 、保爨霹阕 4 0r a i n ) 通避壤究床式反瘦嚣连续生产低巍糖乳效果缀好，可获褥7 9 7 的巍糖 水解率，达鬻4 低乳糖乳的翳求。 固定纯酶装柱，牛乳以懋间流速1 5h 一，在5 0 条件下连续水解，每隔2 0h 翊p h 6 ，5 缓狰波潺洗厦应撞，匪定纯酶在1 0d 内酶活宠丧失1 2 ，就时乳糖水 解率为7 0 1 ，遮蘩低嚣耱巍鼢要求。溺定位嚣耱酶瀵续傻霞半装蠲绝交2 2d 。 芙键词：低乳糖乳：乳糖酶；固定化；树脂 i m m o b i l i z e dt e c h n i q u eo fl a c t a s ea n da p p l i c a t i o ni nl o w l a c t o s em i l k a u t h o r ：w a n gj i n g s u p e r v i s o r ：j i ay i n g - m l n m a j o r ：p r o c e s s i n ga n ds t o r a g eo f a g r i c u l t u r ep r o d u c t s a b s t r a c t f o rm a k i n gl a c t a s ef r o ma s p e r g i l l u sn i g e rb es u i t a b l ef o rh y d r o l y z i n gt h e l a e t o s eo fm i i ka n da c h i e v i n gt h ec o n t i n u o u sp r o d u c t i o no fl o w - l a c t o s om i l k ， s u r r o u n d i n gw i t ht h e o r i e sa n dt e e h n i q u e sr e l a t e dt oi m m o b i l i z a t i o no fl a c t a s ea n d p r o d u c t i o no fl o w - l a c t o s e 蕊汝酶i m m o b i l i z e de n z y m e ，t h ep a p e rs y s t e m a t i c a l t y s t u d i e dt h es e l e c t i o no fc a r r i e r , o p t i m i z a d o no fi m m o b i t i z a t i o n ，p r o p e r t i e so f i m m o b i l i z e de n z y m ea n dc o n t i n u o u sp r o d u c t i o no fl o w l a c t o s em i l k 。t h em a i nr e s u l t s w e r ea sf o l l o w s ： l 。d e v e l o p i n ga ni d e a lc a r r i e ri so n eo ft h ei m p o r t a n tt o p i c so fi m m o b i l i z a t i o n s t u d y k a t i o n 。e x c h a n g er e s i nd 1 5 iw a ss e l e c t e df r o mf o u rk i n d so fr e s i n sa sg o o d c a r r i e rt oa b s c l r b1 a c t a s ef r o ma s p e r g i l l u sn i g e r t h eo p t i m a lc o n d i t i o n so fa b s o r p t i o n a n dc r o s s l i n k i n gw e r es t u d i e dw i t hg l u t a r a l d e h y d ea sc r o s s l i n k i n ga g e n ta n d k a t i o n - e x c h a n g er e s i nd 1 5 ta sc a r r i e r a f t e rh a v i n gb e e nd i l u m dw i t hp h 4 00 。3m 0 1 l a c e t i ca c i db u 煮b 乳l a e t a s ew a sa b s o r b e do nr e s i nd 1 5 1w i t hc o m p a r i s o no f5 0u e n z y m ep e rgw e tr e s i nf o r2 4ha t2 50 。t h e nl a c t a s ew a sc r o s s l i n k e dw i t h4 g l u t a r a l d e h y d cf o r6ha t3 0 翔ee n z y m ea c t i v i t yr e a c h e dn 8 u g ( c a r t i e r ) a n dt h e a c t i v i t yy i e l dw a s3 7 2 2 露l e 拇鲢o fi m m o b i t i z e de n z v m ei n d i c a r e dt h a 主t h eo p t i m a l 毒e m p e r a t u r eo ft h e i m m o b i l i z e de n z y m ew a s6 0 ，w h i c hw a sl o w e rt h a nt h a to ft h es o l u b l ee n z y m e 酶 1 0 t h e r m a ls t a b i l i t yo ft h el a c t a s ew a sr e d u c e db yi m m o b i l i z i n gt r e a t m e n t t h e o p t i m a lp ho fl a c t a s er e m o v e dt oa l k a l i n i t yb yi m m o b i l i z a t i o n 。t h e r ew a sg r e a t d i f f e r e n c eb e t w e e nt h ep hs t a b i l i t yo fs o l u b l ea n di m m o b i l i z e de n z y m e ，c o m p a r e d w i 攮t h es o l u b l ee n z y m e t h ei m m o b i l i z e de n z y m ew o r k e db e t t e ru n d e rt h ec o n d i t i o n o fp h 6 。5 t h ek mv a l t i eo fi m m o b i l i z e de n z v m ew a s1 3 2 1m m 0 1 lf o rl a c t o s e 。 w h i c hw a sal i 嘲eh i g h e rt h a us o l u b l ee n z y m e 1 m em e t a li o n sn a + 、c a z + 、c u “、z n ” h a dd i f f e r e n ti n 瓤b i t i o no ns o l u b l ea n di m m o b i l i z e de n z y m e 。p b ”、m g z + h a d i n h i b i t i o no ns o l u b l ee n z y m e ，b u t 氆e yh a da c t i v a t i o no ni m m o b i l i z e de n z y m ei n w h i c ht h ee f f e c to fm g z + w a st h em o s to b v i o u s ，k + 、f 色”、e d t ah a dn oi n h i b i t i o na n d a c t i v a t i o no ns o l u b l ea n di m m o b i l i z e de n z y m e t h es t o r a g e s t a b i l i t yi n4 r e f r i g e r a t o rw a si m p r o v e da f t e ri m m o b i l i z a t i o n 黧他r e m a i na c t i v i t yw a sa b o v e9 0 a f t e rt h ei m m o b i l i z e de n 嬲m ew a s r e p e a t l yu s e d1 0t i m e su n d e rt h ec o n d i t i o no f u s i n g p h 4 00 2m o t 疋a c e t i ca c i db u f f e rt ow a s hi m l n o b i l i z e de n z y m ef o rl om i n u t e sa f t e r r e a c t i o n u n d e rt h ec o n d i t i o no fp h 6 5 、5 0 。t h eh a t f - l i f eo ft h es o l u b l ee n z y m ew a s o n l y9d a y s ，w h i l ei m m o b i l i z e de n z y m er e a c h e d2 4d a y s ， 3 。t h r o u g ht h er e s e a r c ho nt h ec o n d i t i o n sa n dt h eu s a g es t a b i l i t yo fp r o d u c t i o n l o w l a c t o s em i l k b yi m m o b i h z e de n z y m e 。t h er e s u l t si n d i e a t e d ：t h er e s u l to f c o n t i n u o u sp r o d u c t i o nl o w l a c t o s em i l ki nt h ef i l l 耐b e dr e a c t o rw a st h eb e s ti nt h e s p a c ev e l o c i t y o f l 5h “a t 5 0 c ( p r a c t i c a lv e l o c i t y 0 5 3 m l m i n 、s t a y i n g t i m e 4 0 m i n l a n dt h eh y d r o l y s i sr a t eo fl a c t o s er e a c h e d7 9 7 w h i c ha n s w e r e df o rt h er e q u e s to f l o w 1 a c t o s em i l k a f t e rc o n t i n u o u so p e r a t i o no ft h ec o l u m np a c k e dw i t hi m m o b i l i z e de n z y m ef o r l o d a y s i n t h es p a c e v e l o c i t y o f l 5 h 1a t 5 0 。1 2 o f i n i t i a le n z y m ea c t i v i t y w a s l o s tu n d e rt h ec o n d i t i o no f u s i n gp h 6 5b u f f e rt ow a s h c o l u m np e r2 0ha n dt h eh y d r o s i sr a t eo f l a c t o s ew a s7 0 1 w h i c ha c c o r d e dw i t ht h er e q u e s to f l o w 1 a c t o s em i l k t h eh a l f - l i f eo fi m m o b i l i z e de n z y m ew a sa b o u t2 2d a y s k e yw o r d s ：l o w l a c t o s em i l k ；l a c t a s e ；i m m o b i l i z a t i o n ；r e s i n 独创性声明 本人声明所慝交的学位论文是本人* 谯导师指导下进行的研究工作及取得的 礤究成果。据我聪翔，除了文中特尉加隧标_ i 雯秘致落的| 照方铃，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究戏果，也不包含为获得鎏鼗垒些表燮或其缝 教育枫构静学德竣证书蕊使鼷避瓣榜辩。与戳围互佟瓣蕊恚对本磷究所散的任 何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：王捂 签字日期：伽彩年届眵日 学位论文版权使用授权书 零学位论文馋者完全了解遗丝盛些基鲎有关僚黼、使嗣学彼论文熬 定，褥投保留并内謦家有关部门或机构送交论文豹复印 串濑磁盘，允谗论文被套 霜露僭阕。本a 授投基整盘堂蠢壁可叛褥攀位论文静全部或帮努肉察编入骞关 数据麾进行检索，可以采用影印、缩印或 搦描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文襁解密质适用本授权书) 学位论文作者签名：互崭 签字疆期：训颦歹胃廖强 学傻论文俸者毕业惹去褒： 工作荦位： 通讯地址： 氨圜 签字目翅：年月强 电话： 鼯编： 乳糖酶的固定化技术殷其在低嚣糖乳中的应用 1 1 本研究的目的和意义 1 引言 乳糖酶( l a c t a s e ) 静系统名为伊d 半乳糖菅半嚣糖瘩解酶( 争d - g a l a c t o s i d eg a l a c t o h y d r a s e ， e c3 2 ，1 2 3 ) ，或简称伊半乳糖萤酶( f l - g a l a c t o s i d a s e ) 。乳糖酶能够催化乳糖及其京p - 半乳糖 苷的水解反应，将一分子乳糖水解戒分子葡翡糖和一分子半乳糖；另外乳糖酶还能催化转半乳 糖糖苷反应合成半乳糖寡糖( g a l a c t o o l i g o s a c c h a r i d e ，o o s ) 。 乳糖酶在食品工业方面具有广泛的应用价值。中国食品添加剂标准化委员会第1 9 次年会予 t 9 9 8 年在漫苏雀靖江市召拜，会议讨论并通过了将巍糖酶列为食箍添加刘鞭照耪豹决定1 3 i ，为箕 在食品工业中的应用奠定了基础。 利用乳糖酶水解乳糖的能力，生产低乳精制品( 如乳糖水解乳、低乳糖奶粉等) ，可以有效 解决“巍糖不耐症”问题挎”，这是嗣前l 糖瓣在食品工业的最大用途之一。牛巍是一种重要的 饮食资源含有书富的优质蛋白质、脂肪、碳水化合物以及几乎所有已知的维生索和多种矿物质。 牛巍中钙含量高，约为1 i 0 1 2 0 毫竞1 0 0 壳，且钙磷比例逶当，易教人体消纯吸收。如果每天 饮用2 5 0 克牛乳就可以补充3 0 0 毫克左右的钙，达到推荐供给量的3 5 ，这对解决我国居民膳食 缺钙具有重要意义。此外，牛乳中还禽有免疫球蛋白等抗病因子，所以乳及乳制品有“近乎完善 的食物”的美称，是人类改善营养、增强体质不可缺少的理想食品。牛乳中的主要碳水化台物蹩 乳糖，在牛乳中的含量为4 5 4 7 ，占牛乳中总糖量的9 9 8 ，是牛乳能最的主要来源”。 牛巍营养丰富，辑修订的中国屠撼膳食指南”中明确要求中嚣居民应“每天吃奶类、豆类及 其制品”，强调“一人一天一杯奶”( 2 5 0m l ) 。世界卫生组织已把入均乳品消费量列为衡量一个 国家人民生活水平的主要指标”。我国已于2 0 0 0 年1 1 月1 5 日正式启动“学生饮用奶计划”， 碧在挺尚全民营莽状况、推动我国农业经济发震l l ”。2 0 0 4 年我国人均襄翻晶的年溃费爨为1 2 公 斤，与世界人均9 5 公斤、发达国家人均1 4 0 公斤的消费堂相比还有较大差距【1 6 j 。导致这一现象 的原因除了经济发展水平之外，还有就是中国人群中有缀犬一都分患有“乳糖不耐痉”。 据有关资料报道“7 - 1 9 1p 驻溯入口中约有7 0 的人患祷不同程度的“乳糖不耐症”。根据颜纪 贤等人i ”2 2 1 的研究报道，我国成年人饮用牛乳后乳糖吸收不良的发病率高达8 6 7 ，乳糖不耐受 指数为0 9 。所谓“巍糖不辩瘥”是指由手a 体小肠内睡乏分解乳耱的乳糖酶，饮恁簪乳或藐割 品后不能将乳糖消化吸收，乳糖就保留在肠腔中，造成等渗性水潴留和结肠细菌酵解乳糖产生多 种气体及短链脂肪酸，从嚣形成腹胀、排气增多、腹痛、腹泻等胃肠癌状吲。乳糖不耐症的长期 危害在j l 童中易表现为钙吸收不良、聩泻、软骨病、体熏低下及生长发育迟缓，在老年人尤其是 老年妇女中易表现为骨质疏松症状。患者除了出现腹泻、肠梗塞和胀气等现魏，还会造成肠道蠕 动搬抉，减少蛋自屡和无枫盐的营养吸收阱。“。由于“乳糖不耐痣”的普遍存在，使朝当一部分 人无法像正常人一样接受牛乳这一天然、具有良好平衡性的食品。这成为阻碍我国乳品工业发展 的主要原因之一。低乳糖牛乳即可解决“乳糖不耐症”的问题。低乳糖牛乳怒指乳糖含避低于正 常牛乳中孚l 耱含薰，通常为承解度达到7 0 9 0 的氍糖承解孕一。一般情况下低孚l 藉乳生产以 河l b 农业大学硬士学位论文 水解7 0 8 0 , 珞孚l 糖为最佳选择，它既可以解决乳糖不耐症的问题，同时另外2 0 3 0 的乳糖 可以发挥其原有的营养保健作用，即逶量鲍乳糖既可以促进肠道系统内乳酸藏的生长、抑制有害 菌豹繁殖，还能促进钙和氨基酸的吸收”。 目前。生产低乳糖乳的方式有四种：物理去除法、化学酸水解法、酶解法以及基因工程法。 采用物瑾法如超滤技术，虽然霹将巍糖从譬襞审除去或转化，僵阚疆楚维生素露矿物质也将和乳 糖一起损失掉，人们不得不在去除乳糖雁再将维嫩素和矿物质添加进去，造成在营养上有重要意 义的营养索的极大浪费”。酸水解法能在短时闻内快速分解l 糖，但因该方法会导致蛋白质变性、 引起褐变、产生副产物等不利因索，所以不能直接用于牟乳、乳清等乳制品的处理，两仅限于超 滤乳清的水解。酶水解法即利用外源性的乳糖酶将乳糖降解为易被人体吸收利用的单糖，该法水 解条佟湛鄹( p h 3 ，5 8 ，湿度5 6 0 ) 、产物篦单、不会破坏乳中的其它营养成分。较酸水 解法更为优越。随着基因工程技术的迅速发展，已经获得了转基因小鼠，在此小鼠体内已淘汰了 与乳糖合成有关联的a ，乳白凝自基因，纯合子动物完全不出现乳糖。针对d 一乳白蛋白的m r n a ， 用核酶编码的转基嗣，己获得明显减少的巍糖。就乳糖酶编码的一种转基因表达磊害，能明显减 少乳中乳糖的浓度。虽然这项技术的实用性尚待证明，但却不失为研究的一个新方向。因此到 嚣前为止，酶水解法是生产l 蕊乳糖乳的屉佳处理方法o l 。用乳糖酶农解牛乳或乳制品中的 l 耱 生产低乳糖制品( 如乳糖水解乳、低乳糖奶粉等) ，可以有效地消除人体对乳糖的不耐受症状， 对于发展我国乳晶工业。提i 断人们的健康水平具有十分重簧的意义p “”“】。 此外，零稠乳耱酶水解牛乳中孚l 糖生产低乳精l 在食品工业中还其有其他耀遗。 用低乳糖乳制造酸奶，可加速反应和提高发酵效率，使酸奶具备特有的乳番风味。由于发酵 效率离、p h 降低抉。可抑制有害细蘩，延长产品的赞架期。在奶酪生产中采用水解程度约为5 0 的水解乳，可使酸形成较快及脱水收缩较好，凝乳破碎或细璃较少，千醅形成抉而且产畿较高。 在浓缩乳及炼乳中采用低乳糖乳可使乳糖在浓缩时避免结晶，得到的产品口感细腻。香味十 足，稚度增加，蔗穰的用量减少，摊制缨蘸，从露改善了产晶品质。 用低乳糖乳进行喷雾干燥的奶粉口感好，风味浓郁，冲调性好，而且还具有适用人群广，奶 粉用途多等特点。在加工中进行喷雾干燥时应注意必须在略低于正常如目温度下收集。谮则千粉 会糖于罐艟。抉速冷却方法可抑翻美拉德反应。另外此种奶粉稍有碾进性，如果储存于阴凉的地 方封口气密性好，也可长期保存”“。 在乳味嚣包砖作中，添加低乳糖乳，能够增加薤包甜发，提亳酵姆菌产气爨，使蘸包更趣膨 胀，而且水解乳中的半乳糖有利于美拉德反应拶i 。 利用乳糖酶的催化水解能力，可以有效解决“乳糖不驸瘥”，推进政府实施“学生奶计划” 的大瑟靛攘广，提高人民健藤水平，增强民族体质；提高乳制品的质量，增加乳制品的消费薰和 经济效益，促进我国乳品工业发展。 1 2 国内外现状及研究进展 1 2 1 税糖酶研究现状与进展 2 乳糖酶的固定化技术及其在低乳糖乳中的应用 岛上世纪6 0 年妖以来，辩学家们相继发瑰人体中普遍缺乏乳糖酶。牛乳曾被推崇为天然完 全食品，但缺乏乳糖酶的人是不能消化吸收乳糖的，造成乳糖不耐受现象。这一发现受到全世界 许多酶学家、微生物学家、医学家以及食品科学家的重视。此后有关乳糖酶的研究进入了一个崭 新的酵代。1 9 7 2 年b o r g l u n 等人报道了丝状真蘑黄蘸霉产生斡乳糖酶，详细介绍了该酶豹活 力测定方法、纯化过程及酶学性质，随着酶的固定化技术的发展，在美国、日本和意大利等国已 工业纯生产霾定化的羁糖酶和功能性乳割品低乳糖制晶，并应用予致府寅施的“学生奶计划” 之中8 ”。 豳内对肛d 半乳糖苷酶的研究越步较晚，于2 0 世纪8 0 年代以后才开始对乳糖酶进行研究。 到目前为止，已经报道了一些孚l 糖酶产生菌株，并对酶的分离纯豫及酶学性质、诱交育种及产酶 优化、酶的固定化及工业廨用等方面进行了一定的研究【4 “。和其他生物学领域一样，近年来关 于乳糖酶分子生物学方巍的研究也缀多，基因工程技术的发展特别是真核表达系统的发展为 l 糖 酶的生产展示出广阔的前景，并且目前国内外均有工程菌闻世。目前国内和圈外还存在着很大的 差距，乳糖酶并束在中国食品工业( 特别是乳晶工业) 中得到广泛应用，低乳糖饮品在我国尚无 产品阳l 。髓羞我鞠嚣品工业的发展，慧需解决溃费者“ l 糖不稚瘙”勰题，鞠我开蓑乳糖酶在巍 品工业中的应用研究，对于推动我国乳品工业的发展具有重大意义。 ( 1 ) 产乳糖酶的微生物 乳糖酶的天然来源十分丰富，包括多种植物、动物和微生物珥5 。由于微生物的快速生长和 高效代谢的生物学特性使其成为工业化酶制剂的主要来源。许多霉菌、酵母菌和细菌均能产生 乳糖酶。有关乳糖酶的不豳来源见表l 。 裘1 乳糖翡的主要来源 t a b l elm a i ns o u l c e t so 够g a l a e t o s i d a s e 主要来源名称 檀物 动物 细菌 酵母菌 霉菌 鸯、挑、嘲哮、曹蘑、芝麻、玉米、大豆、磨嘴豆等 脑、肠、皮肤组织 犬肠杆菌( e s c h e r c h i ac o l i ) 、嗜热脂肪芽孢杆菌( b a c i l l u ss t e a r o t h e r m o p h i l u s ) 、巨大芽饱杆菌 ( b a c i l l u sm e g a t e r i u m ) 、德氏乳轩菌僳拥剩亚亚种( l a c t o b a c i l l u sd e l b r u e c k i ls u b s p b u l g a r i c u s ) 、 嗜热链球菌( s t r e p t o c o c c u st h e r m o p h i l u s ) 、瑞士乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sh e l v e t i c u s ) 等 乳羧克鲁维酵母( k l u y e r o m y c e sl a c t i s ) 、臆壁竟簧维酵母( k l u y v e r o m y c e sf r a g g 打) 、热带假丝 酵母( c a n d t d a p s e u d o t r o p i c a l i s ) 黑曲霉( a s p e r g i l l u s n i g e r ) 、米曲霉“甲# 憎f s o r y z a e ) 、黄曲霉( a s p e r g i l l u s ，k v u s ) 、亮自曲霉 ( a s p e r g i u u s c a n d l d u s ) 、麦穗霉( a s p e r g i l l u s f o e t i d u s ) 、米攫霉( r h i z o p u s o r y z a e ) 、镦小罨霉( m u c o r p u s i l l u s ) 、产黄青霉( p e n i c i l l i u mc h r y s o g e n u m ) 等 由于乳糖酶主要用于与人体健康有关的食品、医药工业等方面，所以生产上使用的菌株必矮 是无毒的安全菌株，即必缬具有g r a s ( g e n e r a l l y r e c o g n i z e d a ss a f e ) 资格。由于黑曲霉、米曲 霉、羲酸克鲁维酵母、脆壤毙鲁维酵母罄经历过多次试验，在历史皇尚未发生过孛毒琥象，所以 它们是公认的安全菌株，普遍作为工业化生产的酶源。目前商业用酶源一般认为酵母最为安全， 3 河j b 农业大学硕士学位论文 另一种为黑曲霉t 乳5 2 1 。大扬杆营的乳糖酶主要用于生化和分析试剂”。 和其他生物学领域一样，近年米关于乳糖酶分子生物学方面的研究也很多，基因工程技术的 发展特剐是寞棱袭迭系统驰发展为襞耱酶的生产展示出广耀戆前景，并且裔工程蘑闷 鹭。b c r k a 克隆了米曲霉突变株c c c l 6 1 ( a m c c 7 4 2 8 5 ) 的乳糖酶慕因，并以该突变株为受体菌，将自身的 多拷贝基因置于g a l a 启动子之下搏入其中，阳性克隆予的乳糖酶蛋白表达赣为lm g m l 发酵 液，乳糖酶活性达5 0 0 u m l 以上，比原始萤挝离了1 0 0 倍l 。中翻农业科学院生物技术研究所 的张伟博士等人从产乳糖酶的亮白曲霉( a s p e r g i l l u sc a n d i d u s ) 中首次获得该酶基因，并对基因 组d n a 序列做了分析，利用基因工程技寒构建熬效表达、毒效分泌乳穆酶的耋维毕赤酵母( p i c h i a p a s t o r i s ) 的“真核生物反波器”。酶活力为36 0 0u m l ，高于目前国外产乳糖酶的“工程米曲 霉”好几倍m 】：陈卫、张灏将来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的耐热乳糖酶基因克隆至大肠杆菌中并得 到高效表达，酶溱力提高了5 0 多倍搿l 。健由于乳糖酶主要应用予食品、医药方面，对转基因食 品可能存在的潜在危害，备国政府的态度不一，正处在实验室规模中。 ( 2 ) 关于分离、纯化及酶学性震的研究 乳糖酶的酶学性质包括酶的基本性质、催化特性及酶的底物特异性和反应机制几个方面。不 同微生物来源的乳糖酶酶学性质差异很大，如；鼹适温度、最适p h 及其稳定性各不相同嘲。如 表2 所暴。 表2 不掏微生物来溅的鞋糖酶的特性 t a b l e 2 p r o p e r t i e s o f l a c t a s c f r o m d i f f e r e n t m i c r o b i a ls o a r c g s 名称最适温度( ) 最适p hp h 稳定范围分子量( 1 ( d )活化离子 太脑抒蘸4 07 2 7 。0 - 7 。35 4 0n a + 、k + 乳酸克鲁维酵母3 56 9 7 37 , 0 7 51 3 5 m r l 2 + 、k + 脆壁克鲁维酵母3 76 5 6 5 7 52 0 1 m 一+ 、n a + 蒜曲霉5 5 - 6 03 ，0 - 4 02 , 5 8 1 2 4无 米曲霉5 0 - 5 5 5 03 8 。859 0 无 细菌产生的乳糖酶是胞内酶，在培养过程中不能分泌到培养基中，需破整才能分离、提取。 最适作用温度较低通常在4 0 。c 左右。为常温乳糖酶。但耐热细菌乳糖酶的作用温度摄高，最高 温度可选9 0 ( 2 。大酝杼菡产生豹乳耱酶研究的最透彻，并已大量应用于生纯分析中，因其产量低 及可能存在的毒性问题，迄今未用于工业化生产【6 。 酵母蔼乳糖酶通常是胞内酶，分离提取器破碎细胞f ”。酶的最适作用温度报低，般3 7 c ， 生产中容易污染杂菌：该酶对酸、热不稳定，当存在某些激活离子时，才有最太酶活力。但是， 酵母菌容易培养液态深层培养条件下可产生犬璺乳糖酶。同时，酵母乳糖酶的最适作用p h 近 于中性，与牛乳的天然p 玉接近。这些优点豫补? 它静不足，使得熬霉乳糖酶褥毅成功穗开发。 乳酸克锝维酵母和脆壁克鲁维酵母是目前生产乳糖酶的主要酵母菌种。 霉蒴产生的乳糖酶是胞外酶，既可以采用固态培养也可以采用液态深层培养来生产，在发酵 过程中酶分泌至8 培养基中，发酵成本低、分离提取较为方便。霉菌乳糖酶是高温乳糖酶，最适作 用温度较高，一般猩5 0 ( 2 以上，生产中能够有效防止杂菌污染：对热和酸的稳定性较好，不需要 4 乳糖酶的固定化技术及其在低乳糖乳中的应用 活纯离予和穗定齐i ，毙酵母襞糖酶更遽予强定化酶薛制造。匪裁应用较多躲霉蒴乳塘酶产生蘸是 黑瞌霉和米曲霉”。 关予乳糖酶的水解作用机制，w a l l e n f e l s 等人5 7 】研究表明，利用争半乳糖督酶水解乳糖，最 少包括三个步骤。最后一步是现水解或转移活性。步骤如下： 酶+ 乳糖卜酶一乳糖； 酶一乳耱卜半乳糖基一酶+ 葡莓糖； 半乳糖基一酶+ 受体卜半乳糖基一受体+ 酶。 w a l l e n f e l s 和w e i l t 5 8 1 根据多年的研究推测了乳糖的水解机制，如图1 所示。 圈1 乳糖酶的水辫作用机制 f i g 1t h e h y d r o l y s l s m e e h a n l s m f o r t h ea c t i o n o f l a e t a s eo n l a c t o s e 多半乳糖营酶的活性位点有两个功能团：巯基和睬嚏基。其中魏基可作为广义酸使半乳糖 苷的氧原子质子化，咪唑基可作为亲核试剂进攻半乳糖分子的第一个碳原子上的亲和中心。当半 乳糖苷的受体是水时，发生的是水解；如果受体是糖时，则可以生成三糖以上的低聚半乳糖。 謦前的研究熟点在转移反应的机制和底物作用特异性上。不同来源的莪糖酶转糖营反应的键 特异性整异很大。s t e p h a nr e u t e r 研究发现，米曲霉乳糖酶在a - ( 1 6 ) 键和肛( 1 4 ) 键连接中，更青 昧- y - # ( 1 ，6 ) 键豹连接”】。在动力学模型方嚣，举围蓥提的转移能力淌有特于深入研究。 ( 3 ) 乳糖酶固定化及在生产上的应用 由于固定化酶具有可以反复使用、易与底物分离、能实现连续反应等优点，故人们对乳糖酶 豹固定纯进行了大量翡研究王作，国外跫使用图定纯酶生产功能性擎l 捌品低擎l 糖制晶，并应 用于政府实施的“学生奶计划”之中。国外固定化酶水解乳糖的现状，如表3 所示唧】。 5 河北农业大学硕士学位论文 表3 固定化酶水解孚l 糖的现状 t a b l e3t h ea c t u a ls t a t eo f h y d r o l y s i so fi m m o b i l i z e dl a c t a s e 系统 应用 纤维包埋酵母乳糖酶水解牛乳中的乳糖，分批处理 吸附到玻璃珠的黑曲霉乳糖酶处理酸乳清 吸附多孔氧化铝的黑曲霉乳糖酶处理乳清 吸附于苯甲醛树脂上的黑曲霉乳糖酶处理乳清 固定化m a x i l a c t 酶处理牛乳 米曲霉乳糖酶麸价结合p l e x a z y m l a - 1 处理酸乳清和牛乳 米曲霉乳糖酶共价结合于大孔离子交换树脂处理乳清和牛乳 米曲霉乳糖酶麸价结合于微孔p v c s i l i c a 处理乳清 工业化( 意大利) 半工业化( 法、美) 中试( 美国) 工业化( 芬兰) 中试( 荷兰) 中试( 德国) 中试( 日本) 中试( 美国) 中国对于乳糖酶的固定化研究起步较晚，与世界的研究水平还有很大差距m j 。到目前为止， 利用固定化乳糖酶工业化生产低乳糖乳制品在中国还未见产品【4 。李文英等人”将米曲霉来源 的乳糖酶成功地固定在丙烯酰胺凝胶中，在5 0 c 、2h 条件下将脱脂乳中的乳糖水解4 7 ，且乳 的甜味明显增加，这种水解乳适用于制作酸奶。采用聚丙烯酰胺凝胶包埋米曲霉乳糖酶，当聚丙 烯酰胺单体浓度为2 0 时，酶活力与机械强度都比较理想。固定化酶的稳定范围扩大，热稳定性 提高。底物乳糖在凝胶中扩散不影响固定化酶的反应墨度。使用该固定化酶处理脱脂牛奶，可以 在保持原有风味的条件下，增加甜度，使得饮用时蔗糖用量减少。经固定化乳糖酶处理过的脱脂 牛奶用来制作酸奶时，可节省1 3 时间，在需要添加8 蔗糖的酸乳制作中，可节省5 1 0 蔗 糖用量。潘道东、骆承庠1 6 2 1 用卡拉胶包埋法制备固定化脆壁酵母口半乳糖苷酶，活力回收率可达 8 3 。可以在实验室条件下有效地水解乳清、脱脂乳和全乳中的乳糖，在4 5 下，水解乳糖的半 衰期均在1 6 9 2 0 0h 之间。但是卡拉胶的机械强度差，不适合工业化使用。孙淑芳等人1 6 ”以戊 二醛为交联剂将伊半乳糖苷酶固定在d 2 0 2 载体上，制各的固定化酶与游离酶相比，具有更宽 的p h 适应范围，反应动力学参数e a 变大、k m 和v m a x 变小并具有去除牛乳中乳糖的特点。 事实上，e a 增大不利于反应进行。李绪渊等人旧1 将来源于鹰嘴豆伊半乳糖菅酶固定在聚丙烯酰 胺凝胶上，活性回收率为7 2 。制各的固定化酶与游离酶相比，具有更宽的p h 范围和更好的热 稳定性；冻干固定化酶室温保存6 0 d ，仍具有较高活力；重复使用8 次后酶活力没有损失。从 鹰嘴豆中提取的游离月半乳糖苷酶经固定化后，动力学参数分析表明具有水解牛乳中乳糖的应用 前景，但是聚丙烯酰胺凝胶强度差，不能用于填充柱式反应器而且它的单体具有毒性，不适合 用于食品工业。 当前研究热点是使用固定化酶处理乳清生产功能性低聚糖低聚半乳糖，对此国内投入 了大量的人力物力，以求取得高的g o s 得率。王筱兰等人翻固定了米曲霉来源的口半乳糖苷酶， 在纤维床反应器中连续生产半乳糖寡糖，在最佳工艺条件下连续反应3 6h 时，流加1 5 的d 半乳糖，半乳糖寡糖的得率达到6 6 2 ，固定化反应器能基本稳定地操作9 6h 。秦燕等人”8 l 利用 聚丙烯酰胺包埋米曲霉来源的乳糖酶，当a r c ：b i s - - 2 0 ：1 、胶浓度为1 2 ，5 时，取得最佳包埋效果。 当乳糖浓度为4 0 ，反应停留4 0 m i n ，g o s 得率可达4 0 。在填充床反应器中连续反应2 4h 后， 6 乳糖酶的固定化技术及其在低乳糖莪中豹应用 包埋在凝胶中的酶与糖结合使酶发生可逆性失活，催化效攀降低，慑每反应2 4h 詹，用p h 5 5 的醋酸缓冲液海洗床体。将耱洗出看可以恢复部分活力。敖海荚晰l 到用海藻酸钙凝胶包壤法霾定 米曲罐来源乳糖酶，得到的固定化酶活力为1 5 tu g 温酶粒，酶活力回收率为8 0 。固定化酶以 乳糖为底物合戒低浆半乳糖，c o s 樽率可以达到4 1 4 ：固定他酶以乳清为底物合成低聚半乳糟 低聚糖得率理论值可以达到2 8 9 ，经过验证实验得出g o s 得率为2 9 1 ，与理论值致，l 升 的放大实验串g o s 褥率为2 8 3 ，可班使餍这种嚣定他酶处理乳涛生产羝聚半乳糖。该固定化 酶以摹b 穗为赢物台成g o s 时的得率离子以乳瀵为底物时的g o s 得率。 虽然我国对于乳糖酶的固定化及应用研究作了一定的工作，但成功的例子较少，闽定化乳糖 酶还束缚到工业纯应用，与些国家的差距还很大。随着我国乳晶工业的发展，需要解决消费者 “乳耱不耐症”问越，因此开展固定化乳糖酶在乳品工业的应用性研究，对于推动我国乳品工业 的发展其有重大惹义。圈定化载体和潮定纯方法的选择蛊接影响了固定化乳糖酶的实际应用，霓 其是工鼗化规模的应罔娜l 。髅此，当前开发价格低廉、性质稳定、食晶土应用安全的裁体以及半 衰期较长、固定化酶活力较高的固定化方法成为了研究重点。 1 2 2 圈定化酶磷究避展 酶的固定纯( 搬曲i l i z a 蛀o no fe n z y m e s ，i m m o b i l i z e de n z y m e s ) 是指通过某些方式将酶帮载 体相结合酶被载体材料束缚或限制于定区域内进行其特有的继纯反应，并1 可回收及羲复使用 的一类技术。翠在1 9 1 6 年n e l s o n 和g r i f f i n 嶷先发现了酶的固定他现象后，人们就开始了固定化 酶的研究工 乍，但是壹到2 0 世纪6 0 年代以前关于固定化簿的报道尚不足l o 篇，而在6 0 年代姓 后k a t z i r k a 蛐a l s 蛐等教授为首的科学家对酶固定化方法和固定化酶性质进行了大量研究。1 9 6 9 年日本的千烟一郎博士酋先将匿定化酶应蔼予王业生产，开创了匿定化酶应丽的新纪元。j 匏矗 该术语在1 9 7 1 年第一属酶工程会议上技提议确定，露定俄酶及其瘦厣研究开始在憾界范围内迅 猛发展，研究领域涉及到生物工程、医药工稷、食器工程、生命科学、亮分子材料、化学工程等 许多相关学科坤“”j 。 ( 1 ) 固定化酶的特点 6 6 - 7 ” 与游离酶楱比，固定优酶在保持其离效、专一及温耱约酶疆化反应特性的磷黠，还垦现稳定 性高，对掷弗i 赉j 豹敏感饿降低，毒躺酶具有了抗虽鑫酶分解豹特性；酶与产物的分离匣收容易、 可多次重复使用；可以对反应进行精确控制，反应可随时扇动、中止，恒态反应可保证产品的质 量稳定：适应多酶系同时反盘或继时连续反应；连续操作及宜动纯控制；工艺简便；且产品中不 会带避酶蛋白或细胞；提嵩酶的利用效率；降低生产成本等一系列优点。它在应用上和理论上的 重大潜力吸；| 了诸多领域蚋科研搦| 构及企业科技部门磷究人员的注意力，戎为现代酶工穗颁域的 研究热点，在露定能载搏与固定化方法麴磁究上都取褥t 诸多避嶷。灌定他酶的种类氇目簸扩硬。 固定化酶也有其局限性；增加了固定化的成本；固定化时酶活力有一定损失：适宜于溶解性 底物和小分子戚物反应。对不溶性底物和大分子底物丽害较难达到理想的效巢。 酶或多酶反应体系固定化后常常会引起酶性质的改变酗“，这主要是由于固定化后酶活 性中心的氨基酸残基、空间结构和电葡状态发生改变；载体的理位性质对固定化酶周围微环 境产生影响，如形成对底物传递产生影响的扩教层或静电作用、载体的空间障碍以及多孔类载 7 河北农业大学硕士学位论文 体的内扩散限制等。这些影响主要表现在底物专一性的改变，p h 及温度稳定性，最适条件的改 变，动力学常数的改变等。因此固定化后必须研究酶的这然特性