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上海海洋大学硕士学位论文 基因工程菌高密度培养的补料控制系统研究 摘要 近年来随着基因工程技术的飞速发展，重组蛋白和生物酶的商业化生产逐步 地形成和完善。目前生物制药行业成为我国重点扶持发展的高科技行业之一而 外源重组蛋白表达量偏低，成为制约基因工程菌株应用的关键因素。重组蛋白生 产能力的不足会导致生产成本的提高，在一定程度上制约了生物制药行业的产业 化程度。高密度培养技术就是为提高重组蛋白的生产能力而发展起来的一门新兴 技术。而高密度培养的核心技术就是如何在控制代谢副产物的积累下，让菌体以 最佳的比生长速率增长。而避免代谢副产物积累的重要途径之一就是寻求最优的 补料控制策略，设计性能最佳的补料控制系统。因此，在基因工程菌高密度培养 过程中营养物质的流加控制策略及相应控制系统的研究就显得非常重要。 针对基因工程菌的高密度培养，a k e s s o nm 等人提出了脉冲补料控制策略，即 利用补料速率的脉冲增加或脉冲减小来识别基因工程菌的比摄糖速率与临界值之 间的关系，进而达到在避免副代谢产物积累的同时提高基因工程菌培养密度的目 的。由于对脉冲补料控制策略认识的不足，国内对该补料控制策略的研究几乎为 零，更没有基于脉冲补料控制策略的补料控制系统。本论文主要研究脉冲补料控 制策略在基因工程菌高密度培养过程中的应用，并设计实现基于脉冲补料控制策 略的补料控制系统。 为了研究脉冲补料控制策略，本文首先利用m a t l a b 软件构建了基因工程菌 的动力学模型，并对脉冲补料控制策略的原理、算法进行了深入的分析及研究。 利用m a t l a b 软件结合已构建的基因工程菌动力学模型，本文对脉冲补料控制策 略进行了软件仿真。通过仿真优化确定了脉冲补料控制策略中的一些关键性参数， 为脉冲补料控制策略的实际应用奠定了理论基础。 同时本文基于脉冲补料控制策略设计实现了基因工程茵高密度培养的补料控 制系统。补料控制硬件系统以p c i 8 0 2 型数据采集卡为核心，还包括用于控制搅拌 上海海洋大学硕士学位论文 器转速的直流无刷电机控制器和用于控制蠕动泵转速的步进电机控制器。该补料 控制系统可以独立于原有的自动化控制系统，使用方便，具有良好的实用性。补 料控制系统的上位机软件是基于l a b v i e w 和m a t l a b 的混合编程开发的。 l a b v i e w 作为实验室虚拟仪器开发的主要应用软件，被广泛的应用在工业测控领 域。l a b v i e w 软件主要完成发酵过程中相关过程参数的采集、搅拌器转速和蠕动 泵转速的控制等，而脉冲补料控制算法有m a t l a b 软件实现。利用i a b v i e w 软 件开发的上位机控制软件具有良好的交互性。 本文详细的分析了脉冲补料控制策略，并利用m a t l a b 软件构建了基因工程 菌的动力学模型，然后基于该动力学模型对脉冲补料控制策略进行了软件仿真。 最后基于脉冲补料控制策略设计实现了基因工程菌高密度培养的补料控制系统。 该补料控制系统软件基于l a b v i e w 模块化设计，具有良好的扩展性，在该补料控 制系统的基础上可以迅速的实现其他补料控制策略。该补料控制系统的设计和实 现为今后基因工程茵高密度培养的研究奠定了基础，并提供了硬件保障，具有十 分重要的学术意义和应用价值。 关键词：基因工程菌，脉冲补料，控制系统，l a b v i e w ，m a t l a b n 上海海洋大学硕士学位论文 t h er e s e a r c ho nf e e d i n gc o n t r o ls y s t e mf o r t h eh i g h - d e n s i t y c u l t i v a t i o no fg e n ee n g i n e e r i n gb a c t e r i a i nr e c e n ty e a r s ，w i t ht h er a p i dd e v e l o p m e n to fg e n e t i ce n g i n e e r i n gt e c h n o l o g y , t h e c o m m e r c i a lp r o d u c t i o no fr e c o m b i n a n tp r o t e i na n db i o l o g ye n z y m ei sg r a d u a l l yf o r m e d a n dp e r f e c t a tp r e s e n tb i o l o g i c a lp h a r m a c e u t i c a li n d u s t r yi so n eo fh i i g h - t e c hi n d u s t r y w h i c ha r es u p p o r t e db yt h ec h i n ag o v e r n m e n t b u te x o g e n o u sr e c o m b i n a n tp r o t e i n e x p r e s s i o nv o l u m ei sl o w a n dt h i si st h ek e y f a c t o rw h i c hc o n s t r a i n st h ea p p l i c a t i o no f e n ee n g i n e e r i n gb a c t e r i a t h ed e f i c i e n c yo fr e c o m b i n a n tp r o t e i np r o d u c t i o nc a p a c i t yw i l l l e a dt h ep r o d u c t i o nc o s tt oi n c r e a s e a n dh i g h p r o d u c t i o nc o s t w i l lr e s t r i c tt h e i n d u s t r i a l i z a t i o nl e v e lo fp h a r m a c e u t i c a li n d u s t r yi nac e r t a i ne x t e n t h i g hd e n s i t y c u l t u r et e c h n o l o g yi san e wt e c h n o l o g yw h i c hc o u l di m p r o v et h ep r o d u c t i o nc a p a c i t yo f r e c o m b i n a n tp r o t e i n a n dh i g hd e n s i t yc u l t u r et e c h n o l o g yi sh o wt oc o n t r o lt h e p r o d u c t i o no fb y p r o d u c t s ，a v o i dt h ea c c u m u l a t i o no fb y - p r o d u c t s ，a n dl e tb a c t e r i ag r o w i l lt h eb e s ts p e c i f i cg r o w t hr a t e o n eo ft h ei m p o r t a n tw a y si st os e e ko p t i m a lf e e d i n g c o n t r o ls t r a t e g ya n dd e s i g nt h ef e e d i n gc o n t r o ls y s t e mw i t ht h e b e s tp e r f o r m a n c e t h e r e f o r e ，i ti sv e r yi m p o r t a n tt or e s e a r c ho nt h ef e e d i n gc o n t r o ls t r a t e g yi nt h ep r o c e s s o fg e n ee n g i n e e r i n gb a c t e r i u mh i g h d e n s i t yc u l t i v a t i o na n df e e d i n gc o n t r o ls y s t e m a k e s s o nmh a dp u tf o r w a r dt h ep r o b i n gf e e d i n gc o n t r o ls t r a t e g y f o rt h e h i g h d e n s i t yc u l t u r eo fg e n ee n g i n e e r i n gb a c t e r i u m t h es t r a t e g yi su s i n g t h ei n c r e a s eo r d e c r e a s ep u l s eo ff e e d i n gr a t et oi d e n t i f yt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e ns p e c i f i cg l u c o s e u p t a k er a t ea n dt h ec r i t i c a lv a l u e ，t oa v o i dt h ea c c u m u l a t i o no fb y p r o d u c t s ，a n dt o i n c r e a s eg e n ee n g i n e e r i n gb a c t e r i u mc u l t i v a t i o nd e n s i t y b e c a u s eo fu n d e r s t a n d i n g i n a d e q u a c yo fp r o b i n gf e e d i n gc o n t r o ls t r a t e g y , t h e r ea r e n op e o p l er e s e a c h i n go n p r o b i n gf e e d i n gc o n t r o ls t r a t e g ya n dt h e r ea r en o tf e e d i n gc o n t r o ls y s t e mw h i c h i sb a s e d l 上海海洋大学硕：e 学位论文 o np r o b i n gf e e d i n gc o n t r o ls t r a t e g y t h i st h e s i sm a i n l yr e s e a r c ho nt h ea p p l i t a t i o no f p r o b i n gf e e d i n gc o n t r o ls t r a t e g yo nh i g h - d e n s i t yc u l t u r ep r o c e s so fg e n ee n g i n e e r i n g b a c t e r i u ma n dt h ed e s i g no ff e e d i n gc o n t r o ls y s t e mw h i c hi sb a s e do np r o b i n gf e e d i n g c o n t r o ls t r a t e g y i no r d e rt or e s e a r c ht h ep r o b i n gf e e d i n gc o n t r o ls t r a t e g y , m a t l a bs o f t w a r ei s u s e dt ob u i l dt h ed y n a m i cm o d e lo fg e n ee n g i n e e r i n gb a c t e r i u m t h ep r i n c i p l ea n d a l g o r i t h mo fp r o b i n gf e e d i n gc o n t r o ls t r a t e g yi sa n a l y s e da n dr e s e a r c h e d u s i n gt h e m a t l a bs o f t w a r ea n dt h ed y n a m i cm o d e lo fg e n ee n g i n e e r i n gb a c t e r i u m , as i m u l a t i o n i sd o n ef o rt h ep r o b i n gf e e d i n gc o n t r o ls t r a t e g y t h r o u g ht h es i m u l a t i o ns o m ek e y p a r a m e t e r so ft h ep r o b i n gf e e d i n gc o n t r o ls t r a t e g y i s o p t i m i z e da n dt h e t h e o r e t i c a l f o u n d a t i o ni sl a i df o rt h ea p p l i c a t i o no fp r o b i n gf e e d i n gc o n t r o ls t r a t e g y i nt h i st h e s i s ，t h ef e e d i n gc o n t r o ls y s t e mf o rt h eh i 【g h d e n s i t yc u l t u r eo fg e n e e n g i n e e r i n gb a c t e r i u mi sd e s i g n e db a s e do nt h ep r o b i n gf e e d i n gc o n t r o ls t r a t e g y t h e c o r eo ff e e d i n gc o n t r o lh a r d w a r es y s t e mi sp c i 8 0 2d a t aa c q u i s i t i o nc a r d i nt h i sc o n t r o l s y s t e mb r u s h l e s sd cm o t o rc o n t r o l l e r i su s e dt oc o n t r o lb l e n d e rr o t a t i o n a la n d s t e p - m o t o rc o n t r o l l e ri su s e dt oc o n t r o lp e r i s t a l t i cp u m pr o t a t i o n t h i sc o n t r o ls y s t e m c 柚b ei n d e p e n d e n to ft h eo r i g i n a la u t o m a t i cc o n t r o ls y s t e m i ti sc o n v e n i e n ta n dh a s b e t e e rp r a c t i c a b i l i t y t h ep cs o f t w a r eo ft h i sc o n t r o ls y s t e mi sd e v e l o p e db yt h em i x i n g p r o g r a m m i n gb e t w e e nm a t l a b a n dl a b v i e ws o f t w a r e t h el a b v l e ws o f t w a r ei s t h em a i na p p l i c a t i o ns o f t w a r ef o rt h ed e v e l o p i n go fv i r t u a li n s t r u m e n ti nl a b o r a t o r y a n d i ti sw i d e s p r e a da p p l i c a t i o ni ni n d u s t r ym e a s u r e m e n ta n dc o n t r o l l i n gf i e l d l a b v i e w s o f t w a r em a i n l yc o m p l e t e st h ea c q u i s i t i o no fr e l a t e dp r o c e s sp a r a m e t e r si nf e r m e n t a t i o n p r o c e s sa n dt h e c o n t r o lo fm i x e rs p e e da n dp e r i s t a l t i cp u m pr o t a t i o n t h ep r o b i n g f e e d i n gc o n t r o ls t r a t e g yi sr e a l i z e db ym a t l a b s o f t w a r e t h ep cc o n t r o ls o f t w a r eh a s g o o di n t e r a c t i o nw h i c h i sd e v e l o p e db yt h el a b v i e ws o f t w a r e t h i st h e s i sm a k e sad e t a i l e da n a l y s i so ft h ep r o b i n gf e e d i n gc o n t r o ls t r a t e g y , u s et h e m a t l a bs o f t w a r et ob u i l dt h ed y n a m i cm o d e lo fg e n ee n g i n e e r i n gb a c t e r i u m ，a n d s i m u l a t et h ep r o b i n gf e e d i n gc o n t r o ls t r a t e g yb a s e do nt h ed y n a m i cm o d e l t h ep c 一圭塑塑鲎查兰堡主堂竺望奎一一 _ _ _ _ - _ - _ _ - - l _ _ _ - _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ - - _ _ - _ _ _ _ _ _ - - 一。一一一 c o n t l o ls o f t w a r ei sd e s i g n e db a s e do nt h el a b v i e w s o f t w a r em o d u l a rd e s i g n i n g 1 th a s g o o de x p a n s i b i l i t y rc o u l dq u i c k l yr e a l i z et h eo t h e rf e e d i n gc o n t r o ls t r a t e g yb a s e d o n t h i sf e e d i n gc o n t r o ls y s t e m t h ed e s i g na n di m p l e m e n t a t i o no ft h i sf e e d i n gc o n t r o l s y s t e ml a y saf o u n d a t i o na n dp r o v i d e sh a r d w a r es e c u r i t yf o rt h e f u t u r er e s e a r c ho f h i g h d e n s i t y c u l t u r eo fg e n ee n g i n e e r i n gb a c t e r i u m i th a sv e r yi m p o r t a n ta c a d e m i c s i g n i f i c a n c ea n da p p l i c a t i o n v a l u e k e yw o r d s ：g e n ee n g i n e e r i n gb a c t e r i u m ，p r o b i n gf e e d , c o n t r o ls y s t e m ，l a b v i e w , m a t l a b l 渔渔滢太堂博硕士学位论文 答辩委员会成员名单 姓名工作单位职称备注 王永鼎上海海洋大学教授主席 中国水产科学研究 张祝利院渔业机械仪器研高级工程师委员。 究所 宋秋红上海海洋大学副教授委员 委员 委员 。委员 委员 同丹丹上海海洋大学讲师秘书 答辩地点工程学院3 0 2 室答辩日期 2 0 11 0 1 17 上海海洋大学硕士学位论文 第一章引言 1 1 本论文研究目的及意义 近年来随着基因工程技术的飞速发展，重组蛋白和生物酶的商业化生产逐步 地形成和完善。发酵法生产的重组蛋白，如q 淀粉酶、1 3 半乳糖苷酶、干扰素 y 等，广泛应用在医药、化学、食品工业、农产品加工等国民经济诸多行业。目 前生物制药行业成为我国重点扶持发展的高科技行业之一。而外源重组蛋白表达 量偏低，成为制约基因工程菌株应用的关键因素。重组蛋白生产能力的不足会导 致生产成本的提高，在一定程度上制约了生物制药行业的产业化程度。高密度培 养技术就是为提高重组蛋白的生产能力而发展起来的一门新兴技术。它具有生产 率高、生产成本低、培养体积小、工业污水少、下游处理方便等诸多优点。高密 度培养技术( h i g h c e l l d e n s i t y c u l t i v a t i o n ，h c d c ) 是增加重组蛋白产率的最有效方 法。根据r i e s e n b e r g 的计算，大肠杆菌最高菌体密度理论上可达干重( d c w ) 4 0 0 州。考虑了培养基和其他因素，最高菌体密度仍可达到2 0 0g l ( d c w ) 。最近报 道的最高值9 0g l ( d c w ) ，同时蛋白的表达量也可达到2 5 以上【射。而国内报道 的发酵密度则大多低于5 0g l ( d c w ) ，与国外还存在一定差距。而高密度培养的核 心技术就是如何在控制代谢副产物的积累下，让菌体以最佳的比生长速率增长。 而避免代谢副产物积累的重要途径之一就是寻求最优的补料控制策略，设计性能 最佳的补料控制系统。因此，在基因工程菌高密度培养过程中营养物质的流加控 制策略及相应控制系统的研究就显得非常重要。 近年来，人们开始引入模式识别技术对基因工程菌的高密度培养过程进行优 化，提高发酵产物的产量和产率，如发酵过程参数的优化和培养基的优化等等。 特别是神经网络模式识别技术在发酵过程控制方面的应用，通过对发酵过程中特 有的模式和变化特征的识别，把一些不可测或无法在线测得的变量从可在线测量 的变量中提取出来，进行合理定量的判断和数据解释，进而实时反馈调节，优化 发酵过程。发酵过程的在线模式识别，是一种新的控制模式和概念，国内外研究 较为缺乏，具有重要的学术意义和应用价值。 本文主要研究脉冲补料控制策略，并设计出基于脉冲补料控制策略的补料控 制系统。通过m a t l a b 软件，构建基因工程菌的动力学模型，对基因工程菌的脉 冲补料控制策略进行软件仿真：同时利用p c i 8 6 0 2 型数据采集卡搭建硬件平台， 通过l a b v i e w 设计实现上位机控制软件，构建完整的基于脉冲补料控制策略的补 3 上海海洋丈学硕士学位论文 料控制系统，为控制策略的研究提供硬件支持，也为以后该控制策略的应用研究 奠定基础。 1 2 国内外研究现状 1 2 1 基因工程菌补料策略研究现状 基因工程茵高密度发酵成功的关键在于补料策略，即采用合理的营养流加方 式1 3 j 。目前，基因工程茵高密度培养过程中，较为先进的补料方式均为反馈补料方 式，常见的有d o s t a t 法、p h s t a t 法等，这两种方法都属于开关式的反馈控制， 即d o p h 急剧上升后才会有所动作。c h u ny e o nl e e l 4 j 等人在利用毕赤酵母高密度 发酵生产q 淀粉酶时，利用溶氧控制碳源甘油的流加速率，并以流加氨水来补充 氮源并控制p h 为5 o ，经优化后的最大细胞干重可达1 1 0g l 。l i mh k1 5 j 等人同 时控制溶氧跟甲醇流加速率来诱导表达r g u a m e r i n ，补料结束时细胞干重可达1 4 0 g l 。 同时，通过对可测变量的模式识别进行反馈补料的控制方式，是一种较新的 基因工程菌高密度补料控制方式。a k e s s o nm 【鲫l 等人采用脉冲补料方式i 引，根据 d o 的脉冲反馈信号，使用一些简单的数学规则进行在线模型识别，将碳源的比消 耗速率控制在c r a b t r e e 效应的临界值附近，进而避免乙酸的产生。这是模式识别 技术在补料控制方面应用的初型。 a k e s s o nm 等人基于重组大肠杆菌的非构造式动力学模型，进行了该控制策略 的研究。在补料速率稳定期，通过调节搅拌器转速将d o 控制在某一水平，该溶 氧控制器为p i d 反馈控制器，利用比例感度实时调整的方法调节该控制器；在补 料速率脉冲变化期，搅拌器转速固定不变，允许d o 发生变化，进而产生d o 的脉 冲响应信号。根据d o 脉冲响应信号的不同，在线实时的调节补料速率。郑志永p j 等人采用这种脉冲补料方式，高密度培养重组大肠杆菌，菌体干重达到4 8g l ，重 组人表皮生长因子的表达水平提高了4 5 。v e l u ts 1 m 1 1 j 等人在a k e s s o nm 的基础 上，同时考虑d o 和p h 的脉冲响应信号，充分挖掘已知数据所蕴含的潜在信息， 进而更加精确的在线实时调节补料速率，并扩大了该控制策略的适用范围。史仲平 1 1 2 - 1 5 l 等人将神经网络的模式识别技术引入补料控制策略，采用基于d o p h 在线测 量的人工神经网络模式识别控制法( a n n p r c t r l ) ，进行毕赤酵母流加培养诱导生 产植酸酶，在培养3 0h 时，细胞干重可以达到6 5g l 左右，取得了良好的效果。 由于对脉冲补料控制策略认识的不足，a k e s s o nm 等人所研究的脉冲补料控制 4 上海海洋大学硕士学位论文 策略被一些学者简单的归入了d o s t a t 1 6 l 法。d o s t a t 法是利用控制葡萄糖的流 加来使d o 控制在一定的水平即当溶氧急剧上升时，快速添加碳源( 如葡萄糖) ， 使溶氧降下来。它以溶氧的急剧上升为控制指标，葡萄糖的流加控制属于开关控 制。只有当碳源耗尽才能有所动作，以控制溶氧为目的，同时也能一定程度抑制 副代谢产物的产生，但控制过程中溶氧震荡较厉害，控制性能有限，基质处在瞬 时匮乏和瞬时过量的状态，并不有利于细胞增殖和完全抑制代谢副产物的产生。 a k e s s o nm 等人的脉冲补料控制策略通过溶氧对补料脉冲信号的反馈来间接地辨 识发酵过程中是否有乙酸的产生。以上两种方法有着本质的区别。首先，两种补 料策略的目的不同；d o - s t a t 法的目的是控制溶氧水平在某一设定值；虽然这在 一定程度上能够减少乙酸等副产物的产生，但这不是其目的，同时控制效果十分 有限。而脉冲补料控制策略的主要目的是根据溶氧信号的脉冲响应来间接辨识是 否有乙酸的产生，进而来控制补料速率，最终抑制乙酸的产生，其溶氧的控制仍 主要靠补料稳定期调节搅拌器的转速来实现；而在补料速率脉冲变化期的短暂时 间内，使搅拌器转速固定不变，主动使溶氧水平发生变化，以获取溶氧的脉冲响 应信号。其次，两者的控制指标不同；d o s t a t 法的控制指标是溶氧水平的急剧 上升，而脉冲补料控制策略的控制指标是溶氧的脉冲响应信号。最后，两者的控 制方式不同；d o s t a t 法是简单的开关控制，只有当碳源耗尽才能有所动作，基 质处在瞬时匮乏和瞬时过量的状态。而脉冲补料控制策略是脉冲控制，控制过程 主动探测溶氧信号的变化，使得基质的浓度控制在c r a b t r e e 效应的临界值附近， 既使基质充分以保证微生物生长，又不至于使基质过量导致乙酸等副代谢产物产 生。 1 2 2 模式识别技术在补料策略中的研究现状 一 模式识别【1 7 。1 8 】是指在某些一定量度或观测基础上把待识别模式划分到各自的 模式类中去。计算机模式识别技术就是指利用计算机等装置对物体、图像、图形、 文字、语音等信息进行自动识别。模式识别方法大致可以分为四类：统计决策法、 结构模式识别方法、模糊模式识别方法与基于人工智能方法。前两种方法比较成 熟，在早期模式识别中应用较多。后两种方法目前的应用较多，由于模糊方法更 合乎逻辑、神经网络方法具有较强的解决复杂模式识别的能力，因此日益得到人 们的重视。 近年来，人们开始引入模式识别技术对发酵过程进行优化。同时模式识别技 术在基因工程菌补料策略中的应用仍处于探索阶段，这方面的研究较少。因而其 5 上海海洋大学硕：i ：学位论文 他微生物的基于模式识别技术的补料策略具有一定的参考和借鉴价值。熊明勇【1 9 l 等人，用模式识别优化l 2 缬氨酸生产菌的培养基，取得了良好的效果。陈敏【捌 等人，采用模糊模式方法对啤酒酵母分批流加发酵的补料控制进行研究，对补料 时机进行辨识，最终达到了提高产率的目的。廖孙启1 2 l l 等人在赖氨酸发酵动力学 研究的基础上，把发酵过程划分为四个阶段。收集了2 2 组赖氨酸分批流加发酵实 验数据，用模式识别优化技术进行寻优，得到了赖氨酸发酵的优化工艺参数及优 化流加策略。特别是，史仲平1 1 2 1 5 l 等人将神经网络的模式识别技术引入补料控制 策略，优化基因工程菌的高密度培养过程，高密度流加培养毕赤酵母生产植酸酶， 是一次非常有意义的尝试，取得了良好的效果。 1 2 3 人工神经网络在补料策略中的应用现状 发酵过程，由于涉及生命体的生长和繁殖，机理复杂，数据获取的准确性较 差。同时，过程的影响因素多，该过程具有高度的非线性、时变性和不确定性。 因此，采用经典的机理解析式模型描述发酵过程比较困难僻j 。人工神经网络由于 具有较强的自适用能力和容错能力，通过网络训练，可以相当准确地模拟系统行 为，所以在发酵优化过程中得到了广泛使用。近年来，以专家系统、模糊集方法、 人工神经网络等为主要内容的人工智能方法在发酵工程中的应用正以迅猛的势头 发展。人工神经网络应用于发酵过程的模拟和预测研究己取得可喜成绩。在系统 辨识、建模、控制、优化等各方面，它都有巨大的作为【1 6 1 。 人工神经网络在基因工程菌补料策略中的应用仍处于探索阶段，因而可以借 鉴、参考其他微生物的基于人工神经网络的补料控制策略。方刹2 3 l 等人，基于径 向基函数神经网络建立链霉素发酵过程补料和产率关系的模型，并在此模型上， 应用遗传算法进行寻优，最终实现了链霉素发酵过程中补料过程的自动化。陈仕 学【2 4 l 等人，基于r b f 神经网络的辨识方法，建立了青霉素发酵过程模型，以动力 学模型为基础产生教师数据，采用遗传算法对网络进行训练，建立了基于r b f 神 经网络的发酵过程模型，实验结果表明，该辨识模型对青霉素补料分批培养过程 具有一定的实用价值。吴晓苏瞄j 等人，基于神经网络实现了头孢菌素发酵过程中 补硫酸铵的控制，并设计出了相应的控制系统，具有较好的应用效果。 史仲平【1 2 1 5 l 等人根据d o s t a t 法和p h s t a t 法获得的基础数据进行神经网 络的建模和训练，用于d o 和p h 变化模式的识别，进而辨识葡萄糖是过量还是匮 乏，进一步控制补料速率，使发酵罐中的葡萄糖控制在一个合适的水平，既不积 累代谢副产物又能使得菌体以最大的比生长速率增长，缩短生产周期，提高了菌 6 上海海洋大学硕： 学位论文 体的密度和外源蛋白的表达量，取得了较好的效果。该神经网络为基于n s g a - i i 算法( n o n d o m i n a t e ds o r t i n gg e n e t i ca l g o r i t h mi i ，带精英策略的非支配排序遗传 算法) 的b p 神经网络。 1 2 4 基因工程菌的补料控制系统研究现状 一般而言，针对不同的补料策略会设计专用的补料控制系统，用于实现基因 工程茵的高密度培养。a k e s s o nm 伶7 1 等人设计出了针对重组大肠杆菌的脉冲补料方 式的补料控制系统：上海国强生化工程装备有限公司i 硐，针对p h s t a t 法设计出 了用于过程优化与数据放大的自控发酵装置。 总体而言，针对基因工程菌补料策略的补料控制系统的研究较少，相应的产 品在市场上则更少。如在市场上尚无针对于d o s t a t 法的补料控制系统。而相应 补料控制系统的匮乏，在一定程度上制约的一些较为先进的补料控制策略的研究 因此针对一些先进的基因工程菌补料策略研究和构建相应的补料控制系统2 7 ，为基 因工程菌补料策略的研究提供硬件基础，同样具有十分重要的意义和研究价值。 1 3 基因工程菌补料策略及补料控制系统发展趋势 由于基因工程菌的发酵过程是一个复杂、非线性和时变性的过程，使得利用 常规的数学方法来识别出这些特定的模响应式变得十分困难。同时，由于高密度 培养时期和诱导表达时期这些响应模式存在一定差异，且重组大肠杆菌和重组酵 母的响应模式差异较大，常规方法的通用性较差，使得智能模型尤其是神经网络 建模在发酵过程中得到了越来越广泛的应用。基因工程菌高密度培养技术是基因 工程产业化的关键问题之一，其核心是通过补料调控策略，控制代谢副产物的积 累，让菌体以最佳的比生长速率增长。基因工程菌的发酵过程的复杂性、非线性 和时变性，使得其补料过程的精确控制变得十分困难。人工神经网络、模式识别 和粒子群算法等针对非线性时变系统的先进控制理论，在其他工业过程控制如电 力系统、机器视觉中均有一定的应用成果；而这些先进控制理论在基因工程菌的 发酵过程控制中的应用，仍处于探索阶段，相应硬件设备的研制缺少。如何将这 些先进的控制理论成功的应用到基因工程菌发酵过程的控制中，达到精确控制发 酵过程的目的，将是今后基因工程的一个重要研究方向。 在线反馈控制是当前基因工程菌培养过程控制的发展趋势，然而实现基因工 程菌培养过程的在线优化和控制，需要在线测定一些过程参数。然而，现实中能 够用于大规模工业生产，而且操作维护简易、性能稳定、价格低廉的检测设备并 7 上海海洋大学硕士学位论文 不多。能够最真实地反映过程内在状况和本质的基质浓度、产物浓度、细胞浓度 等的在线测定设备价格昂贵、操作维护复杂、基本上仍然停留在实验室的水平。 工业上较为成熟的可测量变量一般只p h 、d o 、发酵罐进出1 3 处的气体分压等为数 不多的几个。因此，除了不断地开发适用于生物过程的新型传感器和在线检测技 术，当前如何能够有效地利用为数不多成熟的在线检测设备对基因工程菌培养过 程进行控制也是急需研究的课题之一。基因工程菌培养过程存在着大量的反映其 内在实质和特征的模式，对基因工程菌培养过程中特有的模式和变化特征进行识 别，把显形但隐藏内在过程的影响从测量变量中提取出来，进行合理定量的判断 和数据解释，进而采取措施实现基因工程菌培养过程优化的方法，是一种全新的 控制模式和概念，具有重要的学术意义和应用价值。 在基因工程菌高密度培养过程中，使用一些较为先进的控制理论如人工神经 网络、模式识别、粒子群优化算法等，根据一些较易在线测量的变量如d o 、p h 等，辨识或估计一些无法或不易在线测量的重要变量如菌体浓度、葡萄糖浓度、 乙酸浓度等，进而为补料速率的实时调整提供依据。通过一些先进的控制技术 2 8 - 2 9 】，对已有的数据进行充分地分析、挖掘，使基因工程菌的高密度培养上升到 新的层次，摆脱一些尚不成熟的传感器技术或昂贵仪器对基因工程菌实际应用的 限制，加快基因工程菌的应用步伐。 a k c s s o nm 、v e l u ts 等人采用的脉冲补料策略，在脉冲补料期时采用p l 的传 统控制策略根据溶氧的脉冲变化幅度来调整补料的速率，而在补料稳定期采用自 适应p i d 的控制策略，根据搅拌器的转速实时地调整p i d 的参数，在下一个脉冲 补料期开始之前将溶氧维持在一定的水平，整个过程采用的均为传统的p i d 控制策 略，控制效果有限。史仲平等人将神经网络的模式识别技术与d o s t a t 法、 p h s t a t 法相结合，是一次非常有意义的尝试，但受到d o s t a t 法和p h s t a t 法的本质限制，控制效果有限。 基因工程菌高密度培养的补料控制策略的研究和实现，需要生物工程和控制 工程人员的通力协作。目前，我国生物工程的产业化程度落后于与其他行业的产 业化程度。生物工程的产业化进程离不开先进的工业技术和控制理论的支持。我 国的工业技术和控制理论已经取得了飞速的发展，我们需要的是将这些先进的工 业技术和控制理论应用到生物工程的实践中去，最终让先进的控制技术为生物工 程的产业化服务，缩短基因工程菌从研究到实际应用的周期，相信我国生物工程 产业化进程定会取得飞速的发展。 8 上海海洋大学硕士学位论文 1 4 本论文所做的主要研究工作 1 ) 查阅大量的文献资料，深入研究基因工程菌的动力学模型及脉冲补料 控制策略。 2 ) 利用m a t l a b 软件构建基因工程菌的动力学模型，并对基因工程菌的 脉冲补料控制策略进行软件仿真，确定优化脉冲补料控制策略中的一 些关键控制参数。 3 ) 根据补料控制系统的控制需求，确定补料控制系统的硬件方案，并搭 建以p c i 8 6 0 2 型数据采集卡为核心的补料控制硬件系统。 利用l a b v i e w 和m a t l a b 软件进行混合编程，设计实现补料控制系 统的上位机软件，在已搭建的硬件平台上实现脉冲补料控制策略。 9 上海海洋大学硕士学位论文 第二章基因工程茵动力学模型及脉冲补料控制策略 2 1 基因工程菌动力学模型 在传统发酵工业的发酵生产中主要采用的策略有：分批发酵、连续发酵和补料 分批发酵。其中补料分批发酵又称半连续发酵或流加分批发酵，是指在分批发酵 过程中，间歇或连续地补加新鲜培养基的发酵方式。补料分批发酵操作比较简单， 发酵周期短，已经广泛应用于基因工程菌的高密度生产过程中，其发酵过程示意 图如图2 1 。本文所研究的基因工程菌动力学模型是基于补料分批发酵的，其中基 因工程菌的动力学模型包括非线性模型、动力学表达式以及其他部分模型三个部 分。 2 1 1 非线性部分模型 根据质量守恒定律：可得部分变量之间的非线性关系如下所示： 一dv：f(2-1) 出 了d v x ；宰v x 一= j z ，出 了d v g - 砜一幸v x 了d v a - 一坑) 宰v x 了d v o = 瓦( ) 宰v ( o 一d ) 一q d 宰h v x ( 2 2 ) ( 2 3 ) ( 2 - 4 ) ( 2 5 ) 其中v 为发酵液的体积，f 为葡萄糖溶液的补加速度，为菌体生长速率，x 为生物菌体的浓度，g 为发酵罐中葡萄糖浓度，g i n 为补加的葡萄糖溶液中葡萄糖 的浓度，q 。为比摄糖速率，a 为发酵罐中乙酸的浓度，q ：为比乙酸产生速率，q ： 为比乙酸