（农产品加工及贮藏工程专业论文）基于LCMSMS法的色氨酸合成代谢组学分析平台的构建.pdf

摘要 蚴r i r l t i tjililllilr i l l y 1 8 8 9 5 9 0 随着微生物法生产色氨酸研究的不断进展，利用微生物生产色氨酸已经走向实用并 且处于主导地位。为了进一步提高色氨酸的产量，微生物代谢组学便应运而生。微生物 代谢组学研究涉及到对大量代谢物同时进行定性和定量分析，这就要求建立一个能够分 析代谢网络中代谢流的变化以检验分子改造效果的技术平台。本文通过对一系列液相色 谱和质谱参数进行优化，建立了色氨酸合成代谢组学l c m s m s 分析方法；将此分析方 法应用于ec o l i 代谢组学样品前处理关键步骤的考查，从而优化出最佳的前处理方法， 建立色氨酸合成代谢组学的分析平台；利用此平台对ec o l i 发酵后期代谢流和代谢节点 进行分析。主要结论如下： 1 建立了一种快速、准确的同时测定大肠杆菌( ec o l i ) 2 4 种胞内代谢中间产物 的液相色谱串联质谱( l c m s m s ) 分析方法。样品经w a t e r sa t l a n t i sh i l i cs i l i c a 色 谱柱分离，以乙腈1 0m m l 乙酸铵水溶液为流动相进行梯度洗脱，流速为2 5 0i - t l m i n 。 电喷雾负离子( e s i ) 模式电离，多反应监测模式( m u l t i p l er e a c t i o nm o n i t o r i n g ，m r m ) 监测，基质标准溶液法定量。结果表明：2 4 种代谢物在0 1 0 1 0 0l a m l 范围内呈良好 的线性关系，相关系数均大于0 9 9 ；2 4 种代谢物的检出限( s n 3 ) 为0 0 5 - - - 0 3 4 t m l ， 三个添加水平的回收率为8 3 7 - - - 1 0 8 1 ，相对标准偏差( r s d ) 均小于1 0 。 2 比较研究了基于液相色谱和质谱联用技术( l c m s m s ) 的ec o l i 菌体淬灭、 洗涤和胞内代谢物的提取方法，并对细胞破碎方法和破碎次数进行了考查。结果显示： 在淬灭过程中，甘油- n a c i 溶液能较好的保持细胞的完整性，防止代谢物的泄漏， 0 9 n a c l 能较好的维持细胞的渗透压，是菌体洗涤溶液的较好选择；在对样品进行淬 灭和洗涤后，冷甲醇提取法所得到的相对提取率最高，且重复性好( r s d 甘油甘露醇溶液( 4 8 4 ) 甘油n a c i 溶液( 2 4 0 ) 。对有机酸和氨基 酸来说，同样是甘油- n a c l 溶液作为淬灭剂时重复性最好，均低于3 ，分别为2 4 9 和 2 9 8 ；重复性最差的是甲醇水作为淬灭剂所得到的平均相对标准偏差，其对有机酸和 氨基酸的平均r s d 分别为9 6 9 和1 5 4 0 。 比较4 种淬灭方法，我们可以发现，采用甘油和其它溶剂或者溶液混合的淬灭剂对 细胞的破坏作用较含有甲醇体系的淬灭n d , ，这与甘油对微生物细胞的保护作用和甲醇 由于较强的渗透能力有关；而含有n a c l 溶液和甘露醇溶液的两种淬灭剂，由于两种溶液 在维持细胞渗透压方面起到了一定作用，有利于维持细胞的形态，所以和另外两种淬灭 剂相比，其在淬灭过程中有效阻止了微生物细胞的裂解。从淬灭方法的稳定性方面看， 含有甘油的体系和含有甲醇的体系相比，具有较强的稳定性，见表3 6 。 综合四种淬灭剂在阻止大肠杆菌裂解和淬灭效果的稳定性方面考虑，选择甘油 - n a c i 溶液作为本研究中大肠杆菌的淬灭剂是一种不错的选择，虽然暂时还不能证明此 体系不会引起胞内代谢物的泄漏，但是其泄漏程度远远小于此前被广泛使用的甲醇水 体系。 3 结果与讨论 磷酸化糖和磷酸亿有机酸p h o s p h o r a t e ds u g a ra n do r g a n i ca c i d 葡萄糖6 磷酸g 6 p 果糖6 磷酸f 6 p 果糖1 ，6 一二磷酸f b p 赤藓糖4 磷酸e 4 p 甘油醛3 磷酸g a p 2 3 磷酸甘油酸2 3 p g 磷酸二羟丙酮d h a p 磷酸烯醇式丙酮酸p e p 平均a v e r a g e 有机酸o r g a n i ca c i d 草酰乙酸o x a 2 酮戊二酸a k g 琥珀酸s u c 富马酸f u m 苹果酸m a l 柠檬酸c i t 邻氨基苯甲酸a n t h 莽草酸s h i k 平均a v e r a g e 氨基酸a m i n oa c i d 丝氨酸s e r 谷氨酰胺g l n 天门冬氨酸a s p 酪氨酸t y r 天门冬酰胺a s n 苯丙氨酸p h e n 色氨酸t r p 谷氨酸g l u 平均a v e r a g e 0 5 2 0 6 3 2 9 6 2 3 2 3 5 7 4 1 2 1 8 7 3 1 7 2 4 0 2 4 9 3 4 5 1 2 4 3 4 2 3 6 7 1 4 3 2 3 2 1 9 0 2 4 9 1 0 5 4 0 5 3 8 7 1 1 9 6 4 8 1 9 7 2 7 8 2 4 7 2 9 8 5 6 3 5 4 8 5 3 2 3 0 6 4 3 7 2 3 3 1 6 3 1 0 8 7 4 8 4 2 1 6 4 4 3 3 6 4 2 7 9 2 4 6 3 2 1 4 8 7 5 9 6 3 6 9 8 4 3 6 2 3 4 9 8 1 2 3 2 1 6 4 5 8 6 3 8 6 3 4 5 0 4 9 4 3 1 1 4 7 1 0 9 5 4 。5 8 8 6 7 4 6 9 2 4 6 1 9 8 6 7 8 2 7 8 4 6 8 4 5 8 9 6 4 6 7 2 3 3 4 6 5 5 6 9 4 5 6 5 5 6 9 7 5 4 3 0 5 2 4 9 3 7 5 4 2 9 6 5 4 7 5 9 4 4 9 1 9 3 7 4 2 8 5 8 7 1 5 5 3 1 7 4 9 1 7 5 8 1 3 3 6 1 5 2 2 1 3 5 9 1 0 4 2 2 0 1 5 5 8 8 4 9 8 4 1 2 7 4 9 l o 9 5 1 3 5 5 9 6 9 2 2 4 9 1 4 4 5 2 0 4 9 9 5 3 1 6 3 5 7 4 3 1 5 6 4 1 6 7 8 1 5 4 0 3 2 2 茵体洗涤溶液的选择 微生物在淬灭后，应尽快在低温条件下通过离心实现菌体与培养液的分离。微生物 经过离心，弃去上清液中的培养液和淬灭剂，沉淀中不仅有菌体和细胞内液的存在，往 往还混有细胞间液。细胞间液中往往包含有培养基成分和胞外代谢物，这样，沉淀经过 提取后细胞内液将无法去除。在提取步骤之前洗涤菌体将有利于去除细胞间液，但这一 江南人学硕士学位论文 过程也存在缺陷，即容易导致一些能够自由出入细胞膜的胞内代谢物浓度降低( 如小分 子的有机酸和氨基酸) ，并溶液导致细胞的破碎。同时，这一过程的实现必定会增加操 作时间，将可能导致某些不稳定成分发生变化。所以，在这一步骤上面，既要做到洗去 细胞间液和残留的培养液，又要尽可能的不引起细胞的裂解，同时，操作要迅速。 由于大肠杆菌对渗透压很敏感，所以应在能够尽可能的将非胞内代谢物洗去的同 时，考虑维持细胞渗透压这一问题，为此，在对同一批微生物发酵液进行淬灭后，选择 0 9 n a c l ，2 6 n a c i ，l b 培养基和甲醇甘油( v 3 ：2 ) 四种洗涤溶液对菌体沉淀进行 洗涤，随之进行胞内代谢物的提取和上机测定。通过比较在上述四种溶液进行洗涤后磷 酸化糖和磷酸化有机酸类、有机酸类以及氨基酸类2 4 种代谢物的量，以及不同的洗涤 方法的稳定性来选取最合适的菌体洗涤液。为便于比较，选取甲醇甘油洗涤液作为对 照组，其它三种洗涤方法处理后所得到的各代谢物的峰面积与其做商，其比值在对数坐 标匕进行表示。 缸助 图3 - 5 不同洗涤液洗涤效果的比较( a ) 磷酸化糖和磷酸化有机酸；( b ) 有机酸；( c ) 氨基酸。 f i g 3 - 5t h ec o m p a r a t i o no fd i f f e r e n tw a s h i n gs o l u t i o n ( a ) p h o s p h o r a t e ds u g a r sa n do r g a n i ca c i d s ；( b ) o r g a n i ca c i d s ；( c ) a m i n oa c i d s 在洗涤过程中，既要尽可能的将菌体洗涤干净，又要尽量减少胞内代谢物的泄漏和 某些不稳定代谢产物的变化，因此通过比较前三种洗涤方法与甲醇甘油法洗涤后各代 谢物的峰面积之比得出其物质的量之比，可反映了不同洗涤方法过程中代谢物的泄漏程 度。如图3 5a 所示对于磷酸化糖和磷酸化有机酸，除l b 培养基洗涤法所得到的2 3 p g 的峰面积低于所选的对照组外，其它所有采用三种方法洗涤处理得到的代i 身 物的峰面积 2 4 曩巾吐睁盈p一；l 阳盈p a p 盖 3 厕譬kr _ f 0 上耕麓盥节；l 上从 吐一 l m匝刚陋，l l l j 胀置g b吐一 3 结果与讨论 都高于对照组，其中2 6 n a c i 和l b 培养基洗涤法所得到的各代谢物的峰面积比较相 近，各代谢物峰面积的平均值分别达到对照组的2 5 5 倍和2 5 2 倍；0 9 n a c 洗涤法在 阻止细胞泄漏方面的效果则更为明显，各代谢物峰面积的平均值达到了对照组的3 1 7 倍。如图3 5b 所示，对于有机酸，不同方法在对不同代谢物所表现出防止泄漏能力参 差不齐：对f u m ，a n t h ，s h i k 三种代谢物，0 9 n a c l ，2 6 n a c i ，l b 培养基洗涤 法所得到的峰面积相当；对o x a ，s u c 和c i t ，o 9 0 o n a c l 所得到的峰面积要明显高出 2 6 n a c l ，l b 培养基洗涤法所得到的代谢物峰面积；对m a l ，只有0 9 n a c i 溶液 洗涤法得到的峰面积和对照法相当，2 6 n a c l 和l b 培养基所得到的峰面积只有对照组 的o 6 1 和0 6 2 倍。而对于氨基酸类代谢物( 图3 5c ) ，0 9 n a c l ，2 6 n a c i ，l b 培 养基洗涤法处理后所得到的a s p 的峰面积均小于对照组，分别为对照组的0 9 3 ，0 7 8 和0 3 9 倍；对于g l u ，l b 培养基洗涤法所得到的峰面积也小于对照组；0 9 n a c i 溶 液法得到的另外几种代谢物的峰面积则相对较高。 分析原因：0 9 n a c 比较接近大肠杆菌正常生长时的渗透压，可以减少大肠杆菌因 外界渗透压过低所导致的细胞裂解；原理上讲，2 6 n a c i 由于其更高的外界渗透压， 应该能更好的阻止胞内代谢物的泄漏，但由于盐浓度的升高会导致在之后的仪器分析过 程中代谢物离子化效率的降低，并可能造成同一批次的不同样品检测结果的差别较大， 影响到代谢物的准确定量；l b 培养基对于微生物来说无疑是最适宜的外界环境，但由 于l b 培养基中含有较为复杂的成分，尤其会带来和胞内待测中间代谢产物同样的化合 物，虽然我们可以在样品分析时选取单独的l b 培养基作为对照，扣除因为l b 培养基 成分所带来的误差，但这却增加了本己非常复杂的样品前处理和数据分析步骤，而且同 样会增加代谢物定量的误差。由以上分析可以得出0 9 n a c l 是较为适宜的茵体洗涤溶 液，其成分简单，所以在维持细胞正常渗透压的同时不会带入其他的干扰代谢物定量的 其它化合物，且不会因为盐浓度过高而影响离子源的离子化效率。 采用四种洗涤液对菌体沉淀进行洗涤，每种处理方式做三个平行样，考查方法的稳 定性，表3 7 列举了采用不同洗涤方式后，平行样中2 4 种代谢物的相对标准偏差( r s d ) 。 从表中数据可以看出：采用0 9 n a c l 溶液洗涤后，各代谢物的r s d 均小于5 ，稳定性 最好，其次为采用2 6 n a c l 溶液的洗涤方式，对于磷酸化糖和磷酸化有机酸、有机酸和 氨基酸三类代谢物，其平均相对标准偏差( r s d ) 分别为4 6 4 ，4 2 6 ，5 1 5 。而采 用l b 培养基洗涤的结果显示，其稳定性较差，三类物质的平均相对标准偏差( r s d ) 分 别达到9 8 3 ，8 2 0 和7 7 5 。甲醇甘油洗涤法处理结果显示，三类物质的平均相对标 准偏差( r s d ) 较高，且个别代谢物( s e r ，g l n ) 的r s d 达到了1 4 3 4 和1 3 6 9 ，不 具有较强的稳定性。 综合比较0 9 n a c l ，2 6 n a c l ，l b 培养基和甲醇甘油四种洗涤液再维持细胞稳定、 减少胞内代谢物的泄漏和平行样的稳定性方面考虑，对于本实验的研究对象大肠杆菌， 采用0 9 n a c l 溶液对菌体沉淀进行洗涤是较为理想的菌体洗涤方式。 江南人学硕十学位论文 表3 7 不同洗涤方法平行样的r s d t a b 3 7r s d so fp a r a l l e ls a m p l e sf r o md i f f e r e n tw a s h i n gm e t h o d s 平行样的相对标准偏差( r s d ) ( ) 代谢物 m e t a b o l i t e r s d so fp a r a l l e ls a m p l e s ( ) 0 9 n a c l2 6 n a c ! l b 培养基甲醇- 甘油 l bm e d i u mm e t h a n o l - g l y c e r o l 3 2 3 代谢物不同提取方法的比较 实验对比了冷甲醇法、热乙醇法、甲醇氯仿法、热乙醇法和高氯酸提取法的提取效 果，如图3 6a 所示，除p e p 与高氯酸法所得到的相对提取率相差不大外，对于磷酸化糖 和磷酸化有机酸，冷甲醇法所得到的相对提取率是最高的。对于己糖单磷酸( g 6 p ，f 6 p ) ， 利用高氯酸法所得到的相对提取率是最低的，这和v i l l a s b o a ssg 1 1 1 ，5 4 1 提取酵母胞内代 3 结果与讨论 谢产物的六种方法的比较结果是一致的，该结果也显示，高氯酸法所得到的相对提取率 是最低的。高氯酸法提取率低的原因是某些化合物在强酸条件下的分解，。以及为中和高 氯酸所产生的k c l 0 4 对胞内代谢产物的吸附。对于2 3 p g ，e 4 p 和p e p ，由于其热不稳定 性，故热乙醇提取法和热甲醇提取法所表现出来的相对提取率与高氯酸法相比，没有明 显提高。 由图3 6b 中不同方法提取有机酸的结果可见，所有提取方法得到的相对提取率均高 于高氯酸法，其中，除c i t ；, b ，冷甲醇法对其它有机酸的提取效果均优于另外4 种方法。 综合所有有机酸来看，与高氯酸法相比，冷甲醇法的相对提取率最高( 9 8 倍) ，依次是 热乙醇法( 6 4 倍) ，热甲醇法( 5 8 倍) ，甲醇氯仿法( 5 7 倍) 。 冷甲醇法在提取氨基酸时，同样得到很高的相对提取率，如图3 7c 所示。除s e r p b ， 冷甲醇法所得到的相对提取率明显高于其他方法。与高氯酸法相比热乙醇法和热甲醇法 所得到的相对提取率办较高，分别达到高氯酸法的2 0 倍和1 7 倍。甲醇氯仿法与其他三 种方法相比，相对提取率则低一些，这与氯仿极性较弱，而g l n ，a s p 和a s n 属于极性 氨基酸，其在氯仿中的溶解度较小有关。 童 蹬 。：。 口冷甲醇法c 0 1 dw t h a n o l 瞄热乙醇法h o te l ；h a n 0 1 甲薛氟仿法m t h a n o l c h l o r o f o r m 热甲醇法h o tm t h a n 0 1 k k 一一 f 6 pf b pd i t a p g a p 2 3 p g e 4 pp e p 哼一峰一睁峰。峰 图3 - 6 不同方法提取代谢物的相对提取率 ( a ) 磷酸化糖和磷酸化有机酸；( b ) 有机酸；( c ) 氨基酸。 图中相对提取率用对数坐标表示 f i g 3 - 6 t h er e l a t i v ee x t r a c t i o nr a t eo f m e t a b o l i t e sf r o md i f f e r e n te x t r a c t i o nm e t h o d s ： ( a ) p h o s p h o r a t e ds u g a r sa n do r g a n i ca c i d s ：( b ) o r g a n i ca c i d s ：( c ) a m i n oa c i d s 2 7 峥 _l0k a 蛆川搴 = _ 札曲眦陋m 溺翻曲姒圜舭 l l 量 啮呲 江南入学硕十学位论文 提取所用的溶剂极性不同，其相对提取率会有很大差别，在所用的有机溶剂中，水 和甲醇具有较高的极性，其在提取磷酸化糖和部分极性氨基酸时所表现出来的提取能力 也是较高的；甲醇氯仿法在最初设计的时候是用来提取非极性的代谢产物的，后来被d e k o n i n g 和v a nd a m t 5 3 】用于酵母糖酵解中间代谢产物以及其它小分子代谢产物的提取，但 其对强极性物质较小的溶解性则限制了它在代谢组分析中的应用。高氯酸法具有较低的 提取能力则是因为其较强的酸性引起的代谢物的分解和提取过程中产生沉淀造成的对 胞内代谢物的吸附。 热乙醇和热甲醇法与其它方法相比具有一些潜在的优势：( 1 ) 它们可以使蛋白和 多糖变性、沉淀；( 2 ) 整个过程没有盐的加入；( 3 ) 溶剂较容易挥发，便于提取物的 富集，所以这两种方法被用于多种细胞的多类代谢产物的提取，但在提取过程中因为高 温所带来的热敏性中间代谢产物的丢失也是显而易见的( 图3 7 a ) 。而冷甲醇法除具有 热乙醇法和热甲醇法的所有优势外，很重要的一点就是不会导致热敏性物质的变性或者 分解。 3 2 4 进样和提取方法的重复性 3 次重复进样的结果数据显示( 表3 8 ) ：对于磷酸化糖和磷酸化有机酸，重复进样 的平均r s d 从大n d , 依次是为：热甲醇法( 1 3 o o ) 高氯酸法( 9 o o ) 热乙醇法 ( 6 1 0 ) 冷甲醇法( 4 8 1 ) 甲醇氯仿法( 2 8 2 ) 。热甲醇法的重复性是最差的， 其中除f b p ，d h a p 和p e p 外，其他提取物的r s d 都大于1 0 。对于有机酸，重复进样的 平均r s d 从大n d , 依次为：热甲醇法( 1 0 6 1 ) 热乙醇法( 8 7 0 ) 高氯酸法( 6 9 3 ) 甲醇氯仿法( 5 1 0 ) 冷甲醇法( 5 0 6 ) 同样，热甲醇法的重复性也是最差的，除 c i t ：夕i 所有的提取物利用冷甲醇法和甲醇氯仿法得到的r s d 都小于1 0 。对于氨基酸， 重复进样的平均r s d 从大n d , 依次为热乙醇法( 7 2 1 ) 热甲醇法( 5 6 5 ) 高氯酸法 ( 5 6 4 ) 甲醇氯仿法( 3 8 7 ) 冷甲醇法( 3 4 1 ) 。考虑到所有类型的代谢产物，可 以得到具有最低r s d 的提取方法是冷甲醇法和甲醇氯仿法( 平均r s d 均小于5 ) ，平 均r s d 最高的提取方法是热甲醇法( 9 7 ) 。 2 8 3 结果与讨论 表3 8 不同提取方法的代谢物重复进样的相对标准偏差( r s d ，n _ 3 ) t a b 3 8r s d so fr e p e a ti n j e c t i o no fm e t a b o l i t e sf r o me a c he x t r a c t i o nm e t h o d ( n = 3 ) 代谢物 m e t a b o l i t e 重复进样相对标准偏差( r s d ) ( ) 垦苎望! q ! 堡巳篁璺! 蚴! ! 垒婴! 堑! 冷甲醇热乙醇甲醇氯仿热甲醇高氯酸 c o l dh o tm e h a n o i h o tp e r c h l o r i c m e h a n o le t h a n o lc h l o r o f o r i l lm e h a n o ia c i d 磷酸化耱和磷酸化寿桃酸h o s p h o r a t e ds u g a ra n do r g a n i ca c i d 葡萄糖6 磷酸g 6 p3 3 73 2 32 5 52 1 3 6l5 7 2 果糖一6 磷酸f 6 p3 9 5 4 5 3 1 9 5 l5 9 95 2 l 果糖1 ，6 二磷酸f b p4 1 2l1 4 61 9 51 8 82 2 3 5 赤鲜糖- 4 磷酸e 4 p2 9 72 4 62 9 61 8 94 9 9 甘油醛3 磷酸g a p4 6 5 2 2 5 0 9 6 2 9 3 94 9 2 2 3 磷酸甘油酸2 3 p g1 1 1 87 4 83 1 71 9 6 53 。3 5 磷酸二羟肉酮d h a p2 0 66 8 05 8 71 1 8 81 2 6 3 磷酸烯醇式丙酮睃p e p6 1 51 0 5 73 1 l1 9 42 8 l 乎卫箩口v p 懈p4 8 l6 1 02 8 21 3 0 09 0 0 有机酸o r g a n i ca c i d 草酰乙酸o x a3 9 l1 4 03 0 22 6 8 0l5 4 6 2 - 酮戊二酸a k g5 0 74 7 43 9 64 0 44 5 1 琥珀酸s u c2 6 93 0 22 6 67 6 21 2 4 3 富马酸f u m 2 9 0 2 7 1 63 8 8 2 0 70 2 9 苹果酸m a l4 7 53 9 77 1 82 4 4 85 0 0 柠檬酸c l t1 1 1 42 2 4 01 0 2 9 2 8 98 7 9 邻氨基苯甲酸a n t h3 9 22 7 83 1 17 7 56 0 4 莽草酸s h i k6 0 74 1 06 6 79 2 02 9 5 - 乎z - y s j a v e r a g e 5 0 68 7 05 10l0 6l6 9 3 氨基酸a m i n oa c i d 丝氨酸s e r2 7 21 0 5 52 8 84 6 14 1 4 谷氨酰胺g l n2 6 96 3 94 9 76 7 6 1 1 6 8 天门冬氨酸a s p2 0 32 8 85 6 47 8 07 4 l 酪氨酸t y r4 5 09 1 l3 9 43 5 75 6 3 天门冬酰胺a s n3 7 23 4 92 3 75 0 54 7 4 苯丙氨酸p h e n3 6 95 6 63 5 43 3 3 3 4 6 色氨酸t r p2 6 43 1 12 9 87 3 63 2 l 谷氨酸g l u5 2 71 6 4 84 6 26 6 94 8 8 平钧a v e r a g e 3 4 17 2 13 8 75 6 55 6 4 其次，提取方法的重复性的结果( 表3 9 ) 显示，对于磷酸化糖和磷酸化有机酸， 平行样的平均r s d 从大到小排列依次为：高氯酸法( 9 1 6 ) 甲醇氯仿法( 7 5 7 ) 热乙醇法( 3 3 5 ) 热甲醇法( 2 7 3 ) 冷甲醇法( 1 9 5 ) 。对有机酸和氨基酸来说， 同样是冷甲醇法的重复性最好，均低于5 ，分别为3 5 4 和2 6 7 ；重复性最差的为甲 醇氯仿法，其对有机酸和氨基酸的平均r s d 分别为1 9 6 8 和1 2 9 8 。 上述结果表明，无论在相对提取率还是进样和提取方法的重复性上，冷甲醇法均显 著地好于其他几种方法，且操作较简便。 江南人学硕士学位论文 表3 - 9 不同提取方法的代谢物的定昔相对标准偏差( r s d ，n = 3 ) t a b 3 - 9r s d so fm e t a b o l i t e sb yd i f f e r e n te x t r a c t i o nm e t h o d s ( r s d ，n = 3 ) 代谢物 m e t a b o l i t e 平行样的相对标准偏差( r s d ) 【) 垦墨坠q ! 巳垒! 垒! ! ! ! 兰塑巳! 箜! 型 冷甲醇热乙醇甲醇氯仿热甲醇高氯陂 c o l dh o tm e h a n o l h o t p e r c h l o r i c m e h a n o le t h a n o lc h l o r o f o r mm e h a n o l a c i d 磷酸化糖和磷酸化有机酸h o s p h o r a t e ds u g a ra n do r g a n i ca c i d 葡萄糖6 磷酸g 6 p1 8 7o 1 54 0 6 0 3 03 6 7 果糖6 磷酸f 6 p0 3 21 9 3 4 7 81 8 83 8 3 果糖1 ，6 - 二磷酸f b p 0 6 73 0 71 1 9 83 8 89 3 2 赤藓糖- 4 磷酸e 4 p0 2 11 6 36 3 5 1 8 94 9 9 甘油醛3 磷酸g a p0 4 00 5 53 7 41 1 66 1 0 2 3 磷酸 油酸2 3 p g5 9 84 1 7 3 1 72 7 11 4 5 9 磷酸二羟丙酮d h a p 4 3 79 5 92 3 3 45 4 62 6 0 8 磷酸烯醇式内酮酸p e p 1 8 15 6 73 1 l4 5 44 6 7 。z 均a v e r a g e 1 9 53 3 5 7 5 72 7 39 1 6 h - e l 霞o r g a n i ca c i d 草酰乙酸o x a5 9 2 1 4 01 3 1 05 9 71 6 8 9 2 酮戊二酸a k g5 0 72 3 818 6 46 4 019 5 4 琥珀酸s u c1 8 01 3 82 6 1 47 6 25 5 4 富马酸f u m2 9 03 8 01 4 4 64 0 81 7 7 0 苹果酸m a l2 7 84 8 72 3 1 0 5 1 98 1 2 柠檬酸c i t 3 7 72 0 2 82 6 0 13 9 31 8 5 3 邻氨基苯甲酸a n t h2 1 31 5 4 82 0 6 47 7 51 6 3 0 莽争酸s h i k3 9 5 4 8 5l5 3 25 3 6l o 9 9 y g - j a v e r a g e 3 5 46 8 11 9 6 85 7 91 4 2 0 氨基酸a m i n oa c i d 丝氨酸s e r2 0 7l o 5 5+ 1 4 0 81 1 4 58 5 0 谷氨酰胺g l n3 0 4 8 4 6l 7 2 14 8 15 8 6 天门冬氨酸a s p1 6 34 6 54 4 71 9 33 0 8 酪氨酸t y r1 8 71 2 3 1 4 2 32 6 72 1 8 天门冬酰胺a s n3 0 63 9 61 2 8 l1 9 02 8 9 苯丙氨酸p h e n2 8 03 8 9 1 2 5 33 0 0 5 7 8 色氨酸t r p 2 8 11 3 4 82 1 6 61 9 81 1 1 5 谷氨酸g l u4 0 74 9 06 8 74 8 33 8 6 黝a v e r a g e 2 6 76 3 91 2 9 84 0 75 4 1 3 2 5 细胞破碎方法的选择 目前，使用较多的微生物细胞破碎方法有以下几种：( 1 ) 反复冻融法：将待破碎 的细胞( 有时为整块组织) 置8 0 冰箱内冻结，然后缓慢地融化。如此反复3 次，大 部分组织细胞及细胞内的颗粒可被融破：( 2 ) 冷热交替法：在细菌或病毒中提取蛋白 质及核酸时可用此法。操作时，将材料投入沸水浴中，9 0 左右维持数分钟，立即置于 冰浴中使之迅速冷却，绝大部分细胞被破坏；( 3 ) 超声破碎法：对微生物和组织细胞 多用此法。处理效果与样品浓度和使用频率有关。一般组织细胞皆易破碎，而细菌，尤 其是真菌的厚膜孢子则较难打破。超声波所使用的频率从1 - - 2 0k h z 不等。同样要间歇 进行，因长时间超声也会产热，易导致抗原破坏。一次超声1 2r a i n ，总时间为1 0 - 一 1 5r a i n ； ( 4 ) 自溶法：利用组织和微生物的自身酶系，在一定的p h 和温度下，使其细 3 0 3 结果与讨论 胞裂解。自溶的温度，对动物组织细胞常选0 - - 4 ，而对微生物常选室温。自溶时常 需加入少量防腐剂，如甲苯或氯仿等。 考虑到本实验所要提取的胞内代谢产物的特殊性和细胞破碎方法操作的简便性，选 取冻融法和超声波进行研究。两种方法对同一批样品破碎后所得到的代谢物浓度如表所 示。 表3 1 0 两种细胞破碎方法的比较 t a b 3 10t h ec o m p a r a t i o no ft w ob r e a k i n gm e t h o d s 由表3 1 0 可以看出，对于大部分比较稳定的代谢物，液氮冻融法处理后所得到的 代谢物的浓度较超声波破碎法略高，其优势并不明显；但是对于g 6 p ，f 6 p ，2 3 p g ， e 4 p ，p e p 和s h i k 等较易转变的代谢物，采用液氮冻融处理所得到的代谢物浓度分别 达到后者的3 3 l ，4 2 3 ，7 2 l ，1 8 9 4 ，9 1 0 和1 1 8 5 倍。由于超声波强大的液体剪切力 3 1 江南人学硕+ 学位论文 以及在超声过程中会产生热量等导致了部分热敏性物质和不稳定物质的变化，而液氮冻 融法全部过程均在0 以下完成，能有效的防止此类物质的转变。 3 2 6 液氮冻融法冻融次数的考察 前面的实验验证了液氮冻融法较超声波破碎法更适宜用于本实验研究对象大肠杆 菌的细胞破碎。本节主要对液氮冻融法反复冻融的次数进行研究，期望得到既能较为全 面和彻底的提取出胞内代谢物，又使冻融的次数尽量减少，使样品处理简单而高效。取 同一批发酵液经过淬灭、洗涤后分成5 批，每批做三个平行样，分别进行1 ，2 ，3 ，4 ， 5 次液氮冻融破碎处理，然后进行代谢物的提取和上机分析，比较不同冻融次数下的代 谢物提取量，以液氮冻融一次所得到的各代谢物的量为对照，将经过冻融2 ，3 ，4 ，5 次所得到的代谢物的量与前者之比作为纵坐标在如图3 7 上进行表示。 i g 6 p - f 6 p - r f b p * - d i t a p * 一g a p - 2 3 p g 电一e 4 p - o - p e p 一0 x a - a k g 6 一s u c 鲁f i j m 卜m a l - - - o - - - c i t h a n t h - 0 - - s h l k 一s e r - 一g i 。n _ - a s p 洳t y r i 一a s n - - o - - p h e n - - - o - - 1 f r p - - o - - - g l u 图3 7 液氮冻融次数对提取效果的影响 f i g 3 7e f f e c to ff r e e z e t h a wt i m e so i le x t r a c t 由图3 7 可以看出，经过1 次液氮冻融后，细胞还没有完全破碎，胞内代谢物不能 全部被提取，经过2 次，3 次冻融后，胞内代谢物的释放量有明显的增加，4 次冻融破 碎后，其释放量达到最大值，在进行第5 次冻融处理，胞内代谢物的