（农产品加工及贮藏工程专业论文）姬松茸多糖提取及纯化工艺的研究.pdf

姬松茸多糖提取及纯化工艺的研究 摘要 多糖又称多聚糖，由单糖聚合而成，是聚合度大于1 0 且极性复杂的大分子碳 水化合物，分子量一般为数万，数十万到数百万，是构成生命活动的4 大基本物 质之一，并与维持生命所需的多种生理功能相关。多糖是生物界中含量最丰富的 生物聚合糖，几乎存在于所有的生物中。虽然糖类的研究并不比蛋白质和核酸晚， 但其研究层次与水平还远远落后于蛋白质和核酸。2 0 世纪7 0 年代以来，随着免 疫物质、生物膜及多种生物活性物质的研究表明，糖类在生物体内具有特殊的生 物学功能，因此糖类的研究成为人们关注的焦点。有关真菌多糖的研究变得越来 越深入和广泛，特别是有关食用菌多糖的研究，报道频率颇高。活性多糖专指具 有某种特殊生物活性的多糖化合物。包括植物多糖、真菌多糖等。这类多糖因具 有抗肿瘤、增强免疫力、抗突变、降血脂，抗病毒等生物活性，而越来越受到人 们的重视。 本论文系长春市科技攻关计划项目姬松茸第三代系列功能食品的研制与开 发，并属其中主要研究内容之一。主要对姬松茸多糖的提取及纯化技术进行了 研究，确定条多糖提取及纯化的最佳工艺。主要研究成果如下： 1 、采用超临界萃取技术对姬松茸原料进行脱脂处理，最大限度脱除脂肪， 从而使多糖萃取效果更好，提高多糖的萃取率。对萃取压力、萃取温度、萃取时 间、萃取剂流量四个因素进行了正交试验与分析，确定超临界萃取的最佳工艺条 件为萃取压力2 5 m p a ，萃取温度3 5 ，萃取时间l o o m i n ，1 2 0 2 流量3 0 l m 。 2 、打破了传统的热水浸提，乙醇沉淀的工艺，采用了微波萃取技术，大大 节省了萃取时间。在试验中对微波萃取功率、微波萃取时间、料液比及原料粒度 四个因素进行了正交试验和分析，确定微波萃取的最佳工艺参数为微波功率 7 0 0 w ，萃取时间6 m i n ，料液比l ：l o ，原料粒度0 1 4 7 m m 。 3 、进行姬松茸多糖纯化技术研究。对s e v a g 脱蛋白法、三氯乙酸脱蛋白法、 大孔树脂脱蛋白法的脱蛋白效果进行分析。 从蛋白脱除率及多糖损失情况进行了比较，用弱碱性阴离子大孔树脂脱蛋白 效果理想，该法条件温和、有脱色效果、易工业化生产，蛋白脱除率达7 9 2 6 ， 多糖回收率达8 配。 关键词：姬松茸，多糖，超临界c 0 2 流体萃取，微波萃取，层析 s t u d y0 1 1t h et e c h n o l o g yo fe x t r a c t i n ga n dp u r i f y i n gp o l y s a c c h a r i d e s a b s t r a c t p o l y s a c e h a d d e ，n a m e l ys a , x h a x a n , w h i c hi so n eo ft h ef o u rb a s i cm a t e r i a lc o n s t i t u t el i f e a c t i v i t i e s ，i sr e l a t e dw i t hm u l t i p l ep h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n s i t sd p 1 0a n di ti sak i n do f p o l a r i z e d m a e r o m o l e c u l ec a r b o h y d r a t ea g g r e g a t e db yn l a l n l o t h em o l e c u l a rw e i g h to fp o l y s a c c h a r i d ei s u s u a l l yr a n g e df r o mm i l l i o n st ob i l l i o n s t h o u g ht h ec o n t e n to fp o l y s a c c h a r i d ei st h er i c h e s ti n b i o l o g yc i r c l e s 。t h er e s e a r c hl e v e li sf a rb e h i n dt h a to fp r o t e i na n dn u c l e i ca c i d w i t ht h es t u d yo n i n l l n u n em a t e r i a l ，b i o l o g i c a lm e m b r a n ea n dk i n d so fb i o l o g i c a la c t i v em a t e r i a l ss i n c e1 9 7 0 s ，t h e b i o l o g i c a lf u n c t i o no fp o l y s a c c h a r i d sb e c o m t h er e s e a r c h i n gf o c u s a c t i v ep o l y s a c c h a r i d e m e a n sc e r t a i np o l y s a c c h a r i d ec o m p o u n dt h a to fs o m es p e c i a lb i o l o g i c a l a c t i v i t i e s ，p l a n t p o l y s a e c h a r i d ef u n g u sp o l y s a c c h u r i d ea n da t e i n c l u d e d t h i sk i n do fp o l y s a c c h a r i d eh a st h e b i o l o g i c a la c t i v i t i e so f a n t i - t u m o r , s t r e n g t h e ni m m u n i t y , a n t i m u t a t i o n , d e c r e a s i n gf a ti nb l o o da n d a n t i - v i r u s ，a n di st a k e nm o r ea n dm o r ei m p o r t a n c eo i l t h i sp a p e rw a sam a i np a r to fc h a n g c h u nc i t ys c i e n c , ea n dt e c h n o l o g ys t r a t e g i cp l a np r o j e o t d e v e l o p m e n to fa g a r i c u sb l a z e im u r i l l s e r i e sf u n c t i o n a l f o o d ”t h ee x t r a c t i o na n d p u r i f i c a t i o nt e c h n o l o g yo fa g a r i c u sb l a z e im u r i l lp o l y s a c e h a r i d ew a gs t u d i e d , t h eo p t i o n a l t e c h n o l o g yw e f e 越f o l l o w s 1 a g a r i c a sb l a z e im u r i l lw e r ed e f a t t e db ys u p e r c f i f i c a lf l u i de x t r a c t i o nt e c h n o l o g yb e f o r e e x t r a c t i o n , s ot h ep o l y s a c c h a r i d ee x t r a c t i o nr a t ew a si n c r e a s e o r t h o g o n a lt e s ti n c l u d e de x t r a c t i n g p r e s s u r e ，e x t r a c t i n gt e m p e r a t u r e ，e x t r a c t i n gt i m e ，c o e v o l u m ew e l ed o n ea n da n a l y z e d t h e o p t i o n a lt e c h n o l o g yc o n d i t i o n sw e r ea sf o l l o w s e x t r a c t i o np r e s s u r e2 5 m p a ，e x t r a c t i o n t e m p e r t u r e 3 5 c ：e x t r a c t i o nt i m e1 0 0 r a i n ，c 0 2v o l u m e3 0 l h 。 2 m i c r o w a v ee x t r a c t i n gt e c h n o l o g yw a su s e di nt h es t u d y , s a v i n gp l e n t yo ft i m ec o m p a r e d w i t ht r a d i t i o n a lh o tw a t e re x t r a c t i n g 既h a n o lp r e c i p i t a t i n gt e c h n o l o g y o r t h o g o u a lt e s tw e r ed o n e a n da n a l y z e do ne x t r a c t i o np o w e r , e x t r a c t i o nt i m e ，m a t e r i a la n dl i q u i dr a t i oa n ds i z eo f p a r t i c l e s t h eo p t i o n a lt e c h n o l o g yc o n d i t i o n sw e r e 岱f o l l o w s e x t r a c t i o np o w e r7 0 0 w ，e x t r a c t i o nt i m e 6 r a i n ，m a t e r i a la n dl i q u i d r a t i o1 1 0 ，s i z e o f p a r t i c l e s 0 。1 4 7 r a m 3 p u r i f i c a t i o no fa g a r i c u sb l a z e im u r i l lp o l y s a e e h r i d e sw e r es t u d i e d 。t h ee f f e c to f i i e l i m i n a t i n gp r o t e i no f s e v a gm e t h o d ，t c am e t h o da n dm a c r o p o m u sr e s i nw e r ea n a l y z e d 1 r h fe l i m i n a t i n gp r o t e i nr a t ea n dl o s sc o n d i t i o no fp o l y s a c e h a r i d e w e r ec o m p a r e d t h ee f f e c t o f n e g a t i v ei o nm a c r o p o r o u sr e s i nw a ss u i t a b l e t h ec o n d i t i o no f t h i sm e t h o dw g e n t l e e a s yt o r e a l i z ei n d u s t r i c a t i o n , a n dw a so fd e c o l o u re f f e c t t h ee l i m i n a t i n gp r o t e i nr a t ew a s 7 9 2 6 p o l y s a c c h a d d e so b t a i n e dr a t ew a s8 j 枞 k e yw o r d ：a g a r i c u sb l a z e im u r i l l , p o l y s a c c h a r i d e s , s u p e r c r i t i c a lf l u i de x t r a c t i o n ， m i c r o w a v ee x t r a c t i n g , c h r o m a t o g r a p h y 1 1 1 独创性声明 本人声盼所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其它教育机构的学位 或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：弹2 l 硷签字日期：厶唧年6 月肋e t 关于论文使用授权的说明 本人完全了解吉林农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保 留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存、汇编学位论文。同意吉林农业大学可以用不同方式在不同媒体上 发表、传播学位论文的全部或部分内容。 学位论文作者签名：耸玉挞签字日期：如呵年月2 口日 导师签名： 签字日期：上胡年f 月2 0 日 吉林农业大学硕士学位论文炬格茸多搪提取及纯化工艺的研究 1 1 研究的目的 第一章前言 姬松茸又名小松菇、柏式蘑菇、巴西蘑菇，属担子菌纲、伞菌目，是原产于巴西圣 保罗山区、秘鲁及美国加利福利亚南部、佛罗里达州海边草地上的一种美味食药用菌。 姬松茸具有浓郁的杏仁香味，美味可口，碳水化合物和蛋白质含量非常丰富，姬松茸菌 盖嫩，菌柄脆，口感极好，味美鲜香，食用价值很高。其新鲜子实体含水分8 5 8 7 ， 1 0 0 克干菇中含粗蛋白3 8 4 3 ，碳水化合物3 8 4 5 ，纤维素6 8 ，粗灰分 5 7 。粗脂肪3 4 ，并含有维生素b 卜b 2 和烟酸，以及钾、磷、钠、钙等矿物 质，具有极高的营养价值。除此之外，姬松茸还含有大量对人体具有医疗保健作用的特 殊功能成分，如姬松茸b 葡聚糖、姬松茸低聚肽、姬松茸腺嘌呤核苷、姬松茸醛赖氨酸 及姬松茸低聚膳食纤维，这些物质都属于第三代功能食品的功能因子，尤其是多糖类， 可提高人体免疫力、抑制肿瘤、降血糖、降血脂、抗炎、抗动脉硬化，因此，姬松茸被 人们誉为“真菌皇后”。现在国内对姬松茸多糖的研究也日益增多1 w 】。 近年来，随着姬松茸栽培新技术的使用与推广，姬松茸的产量在逐年增加，但目前 姬松茸的食用方式还以餐桌菜肴为主，消费方式单一，消费量小于供应量。为充分利用 我省乃至我国丰富的姬松茸资源，使其能够物尽其用，本项目采用超临界流体萃取、微 波萃取、柱层析等现代食品高新技术，对姬松茸多糖进行了提取和纯化，为进一步研制 保健食品奠定基础，同时，还可以促进姬松茸种植业的发展，为广大种植者，尤其是为 我省东西部地区的菇农开辟一条新的致富途径，既有经济效益又有社会效益。 本论文系长春市科技攻关计划项目姬松茸第三代系列功能食品的研制与开发， 并属其中主要研究内容之一。主要对姬松茸多糖的提取及纯化技术进行了研究。 1 2 食用菌多糖国内外研究现状 1 2 i 真菌多糖类产品开发现状 多糖类物质来源很丰富，近二十年来，食药用真菌多糖的开发有了长足的进展。在 日本，l n t ，p s k 于7 0 年代末进入临床，用于肿瘤等疾病的免疫治疗。灰树花多糖、裂褶 多糖等已在欧美、日本临床上广泛应用；目前在我国，也已经有多种多糖正式批准生产 并应用于临床。如云芝多糖、槐耳多糖分别作为国家中药二类、一类新药投入生产嘲。 1 2 1 1 香菇多糖( l e n t i n a n ) 香菇多糖是从人工栽培的香菇( l e n t i n u se d o d e s ) 中提取而得 吉林农业大学硕士学位论文姬栏茸多糖提取及纯化工艺的研究 到的，主要成分为葡聚糖。香菇多糖是一种免疫调节剂，能增强宿主免疫系统的反应性， 使机体淋巴细胞大量增殖；又能激活补体系统。对多种同基因、同种异基因和原发肿瘤 具有显著的抑制作用：能防止化学因素、病毒因素引起的致癌作用；抑制肿瘤转移；同 时能增强机体对不同细菌、寄生虫和病毒包括h i v 的抵抗力。临床主要用于治疗肿瘤， 也可用于治疗a i d s 。我国正式生产的香菇多糖有香菇多糖粉针剂( 静脉滴注，南京振声 生物工程公司) 等，上海药物研究所与珠海丽珠药业厂合作研制的香菇多糖已报批二类 新药；另外还有肌注香菇多糖和口服胶囊剂。 1 2 1 2 云芝多糖( k a e s t i n ，p s k ) 为杂色云芝( c o r i o l u sv e r s i c o l o r ) 干燥子实体或深层发酵 物的多糖租提物。临床上用于治疗慢性气管炎、慢性活动肝炎等。有胶囊剂( 南京老山 制药厂) 、片剂( 如云芝糖肽等) 。 1 2 1 3 猪苓多糖系从猪苓( g r i f o l au m b e l l a t e ) 干燥菌核中分离的葡聚糖，具有明显的免 疫调节作用，能保护肝脏。临床上主要用于癌症辅助治疗以及用于肝炎治疗。猪苓多糖 注射液是国家中药二类新药。正式生产的商品还有猪苓多糖胶囊等。 1 2 1 4 银耳孢糖( t s p ) 为银耳( t r e m e l l af u c i f o r m i s ) 深层发酵物中提取物，主要含有银耳 多糖和孢子。为多糖免疫增强剂，具有升白作用、抗放射性损伤和增强机体免疫功能的 作用。对慢性支气管炎有效率达8 0 。 1 2 1 5 多糖蛋白片为新鲜白蘑( t r i c h o l o m aa l b u m ) t g 煮液浓缩物。能增强白细胞增长， 用于白血球减少症状、传染性肝炎和神经衰弱等症。 1 2 1 。6 茯苓多糖( p a c h y m a r a n ) 茯苓多糖及其人工半合成衍生物羧甲基茯苓多糖 ( c a r b o x y m e t h y l p a c h y m a r a n ) 己, 作为免疫增强剂与化疗、放疗联合使用。 1 2 1 7 姬松茸多糖对于姬松茸及姬松茸多糖，国外特别是日本对其研究一直十分重视， 而且处于世界领先水平。1 9 6 5 年日本引进菌种，在1 9 8 0 年就先后报导了姬松茸多糖具 有提高机体免疫力、抗肿瘤、抗病毒等功效。还报导了姬松茸其他一些成分的功效。1 9 9 0 年，t a k a s h im i z u n o 9 l 等对姬松茸子实体依次用热水、1 0 0 c ，1 ( n h 4 ) 2 c 2 0 4 、3 0 0 ， 5 n a o h 、8 0 ，5 n a o h 、3 0 ，2 0 n a o h 、1 0 0 c ，提取其中的多糖，并对其进 行了分离和活性研究，从中发现了6 种高分子物质具有较强的抗肿瘤活性。1 9 9 7 年， h i t o s h il t o 等人【1 0 j 从菌丝体的水提物中分离出一种具有很强抗肿瘤活性的多糖蛋白复 合物( a t o m ) ，单糖以甘露糖和葡聚糖为主、并有少量的半乳糖和核糖组成，但是具 体结构未作阐明。1 9 9 9 年，在韩国，c h os o o m u k 等人【1 l 】用0 9 n a c l 水溶液从姬松茸 子实体中提取水溶性多糖，经乙醇沉淀、d e a e 离子交换层析和凝胶层析得到了8 种主 要多糖组分。2 0 0 2 年，j m a r t i n sd eo l i v e i r a 等人研究了姬松茸水提取液对哺乳动物细胞 的抗基因毒性影响，结果表明该提取液有较强的抗诱变作用【1 2 1 。 在我国，姬松茸的研究相对较晚。1 9 9 1 年四川省农业科学院食用菌开发研究中心的 研究员，赴开本考察时，从日本带回了姬松茸菌种，1 9 9 2 年，福建省农科院引进了该菌 2 吉林农业大学硕士学位论文 姬松茸多糖提取及纯化工艺的研究 种，并展开了栽培试验，对姬松茸的生物学特性和栽培技术进行了详细的研究【l3 1 ，摸索 出一套适合我国条件的栽培技术，从此国内开始了姬松茸的种植、开发以及特性研究1 1 4 j 。 1 9 9 4 年，福建省进行了姬松茸的小规模生产其产品主要出口日本。随后，很快被推广 到全国各地，并开发了许多栽培方式，使生产量不断扩大。许多学者在姬松茸多糖的提 取纯化及成分分析领域中作出了贡献，改善了姬松茸的加工工艺，推动了姬松茸在我国 的普及推广和商业化，带来了巨大的经济效益。1 9 9 7 年，杨梅等【l5 】就用氨基酸自动分 析仪分析了姬松茸的氨基酸成分，经测定其含量丰富，且品种齐全。1 9 9 8 年，杨梅、周 小兰、施巧琴等人【1 6 】探讨了姬松茸子实体多糖和菌丝体多糖提取的条件，对子实体多糖 和菌丝体多糖的提取率进行比较分析。2 0 0 0 年，郑晓冬等1 1 7 1 对姬松茸子实体提取的工 艺条件中的多糖提取温度、提取时间、浸提液p h 值三因子的最优化组合问题进行了定 量研究，建立了具有良好预测性能的姬松茸提取条件的模型，并利用回归模型对工艺条 件的最优化组合，对单因素的多糖得率及其交互作用进行了探讨。同年，黄谚谚等【l 硼 报道了采用凯氏定氮法、索氏提取法、气相色谱、苯酚一硫酸法等对姬松茸营养成分分 析的结果。2 0 0 1 年，沈爱英和谷文英两人【2 j 发表了复合酶法提取姬松茸子实体多糖的研 究论文，通过比较热水提取法、碱浸提法、酸浸提法、酶法浸提及复合酶与水浸提并用 法五种不同方法的比较，提出酶解与水提相结合的提取方法能显著提高多糖的提取率。 1 3 多糖的功能性 现代医学、细胞生物学及分子生物学研究表明免疫系统的紊乱不仅会产生各种免疫 性疾病，而且与人体衰老及老年人的多发病如肿瘤、高血压、糖尿病甚至精神疾病等的 发生均有密切的关系【1 9 o l ，艾滋病的危害是人们对免疫系统的缺损的严重后果有了更深 刻的认识，因此寻找良好的免疫调节药物是当代医学的迫切需要。 大量的药理和临床研究表明，多糖类化合物具有复杂的多方面的生物活性与功能， 而对正常的细胞没有毒副作用，已逐渐发展成为一种免疫疗法【2 ”。到目前为止，己有 3 0 0 余种多糖类化合物从天然产物中被分离出来，其中从中草药、食药用菌中提取的水 溶性多糖最为重要。已发现有1 0 0 多种中草药、食药用菌来源的糖缀合物具有广泛的药 理及生物活性。 1 3 1 多糖的免疫调节作用 多糖的特殊结构可能有利于宿主免疫系统的识别【2 2 1 ，不仅能提高机体的非特异性 免疫，且能够提高机体的特异性免疫【圳：多糖分支结构是宿主补体系统识别的位点j ， 而且是一类新的巨噬细胞激活剂2 5 】；戴玲等人的研究发现，中药丹皮提取的丹皮多糖有 吉林农业大学硕士学位论文姬橙茸多糖提取及纯化工艺的研究 效部位p s m 2 b 在体外能直接促进小鼠脾细胞增殖。 1 3 1 1 多糖对巨噬细胞的激活作用巨噬细胞是体内非常重要的免疫细胞，在抗感染免 疫和抗肿瘤免疫等方面都起重要的作用。但是，未活化的巨噬细胞的吞噬杀伤作用有限， 因此活化是巨噬细胞有效地参与免疫监视的先决条件。大量实验表明，海带多糖、玉米花 粉多糖、云芝多糖、黄芪多糖、枸杞多糖、牛膝多糖、香菇多糖等可激活巨噬细胞，增 强其吞噬作用，能诱导产生i l 1 ，t n f d 等细胞因子 2 1 5 - 3 。 1 3 1 2 多糖对t 、b 淋巴细胞的激活作用多糖化合物特别是从高等植物中提取的多 糖，可部分恢复并加强癌症和艾滋病等患者免疫功能。如白术多糖能明显提高外周血t 淋巴细胞a n a e 染色率，说明其能促进淋巴细胞向成熟t 淋巴细胞转化，提高小鼠细胞免 疫功能1 3 “。当归多糖能直接激活b 细胞并对辅助性t 细胞的功能具有间接激活作用3 2 1 。 香菇多糖是一个典型的t 淋巴细胞激活剂。它在体内和体外均能促进特异性细胞毒t 淋巴 细胞的产生，并提高其杀伤活性。香菇多糖在体内还能提高辅助性t 细胞的功能，提高 抗体依赖的细胞毒细胞活性【3 3 l 。 1 3 1 3 多糖对迟发型超敏反应( d t h ) 的作用l a c a 种小鼠连续1 5 d 经口给予虫草多糖 后在6 8 5m g 傲g 剂量下可增强小鼠迟发型变态反应 3 4 1 。 l _ 3 1 4 多糖对天然杀伤细胞的影响人外周血单核细胞在香菇多糖作用下促进n k 细胞 产生，增强细胞毒作用【3 5 1 。 l t 3 1 5 多糖对l a k 细胞活性影响近年来用l a m l - 2 疗法治疗肿瘤在临床上取得了明 显疗效，但该疗法需要大量i l 2 和l a k 细胞，而i l - 2 的毒性及价格昂贵限制了它的使用。 用增强l a k 活性、降低i l - 2 用量而本身无毒性的生物反应修饰剂是改进该疗法的重要 措施。研究表明，猪苓多糖与r i l 2 有协同作用，可使内源性l 斌活性显著提高p 6 j 。灵芝 多糖能明显增强人脐血l a k 细胞活性，并能协同r l l 2 提高人脐血l a k 细胞表面i l 2 受 体的表达i j “。 1 3 2 多糖其他功效作用 1 3 2 1 抗肿瘤活性多糖的抗肿瘤活性一般是通过增强免疫细胞的活性实现的。多糖不 仅能激活t 细胞、b 细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、杀伤性t 细胞、淋巴因子激活的 杀伤细胞( ( l a k ) 等免疫细胞，还能促进白细胞介素1 ( i l 1 ) 、白细胞介素2 ( i l 2 ) ，肿瘤坏 死因子( t n f ) 和干扰素( i f n ) 等细胞因子的生成，调节抗体和补体，从多个方面抑制肿瘤 3 8 - 4 0 l 。 1 3 2 2 抗病毒活性研究表明，许多多糖对各种病毒有抑制作用。在1 9 5 8 年首先发现 海藻含有抗病毒活性成分以后，相继报导了多糖类对病毒有抑制作用【4 ”，如艾滋病毒 ( h i v - 1 ) 、单纯疤疹病毒、巨细胞病毒、流感病毒、囊状胃炎病毒、劳斯肉瘤病毒和鸟肉 4 吉林农业大学硕士学位论文 姬辁茸乡糖提取及纯化工艺的研究 瘤病毒【4 2 1 ，多糖的抗病毒作用现已引起医药界的高度重视，尤其是硫酸多糖的强抗病毒 活性，显示了多糖广阔的药用前景。多糖在抗病毒药的研究中也常常作为佐剂，许多研 究结果发现，多糖与其他药物联用具有协同作用。将多糖作为佐剂联合用药可以防止或 推迟耐药株的出现，提高药物的抗病毒活性，减少用药量。例如硫酸右旋糖酐与叠氮胸 苷具有协同作用，可以减少用药量，降低不良反应，提高患者的耐受性1 4 引。 1 3 2 3 抗衰老活性如螺旋藻多糖( p s p ) 是从螺旋藻中分离纯化获得的平均分子量为 1 6 6 k d a 的酸性多糖，对d 半乳糖所导致的衰老小鼠模型有如下作用：抗小鼠肝、脑组织 单胺氧化酶( m a o b ) 的活性明显提高，抗n v k a t p 酶活性降低，对抗小鼠淋巴细胞增 殖转化降低的效应，拮抗小鼠皮肤细胞中羟脯氨酸含量降低，从而防止胶原蛋白肽链之 间交联度的增加，代谢率降低，防止皮肤组织弹性降低m 4 5 1 。 1 3 2 4 抗缺氧、抗损伤作用当归多糖能显著促进正常胃上皮细胞的移动与增殖，具有 促进胃粘膜损伤修复与溃疡修复作用脚l 。实验表明，从c 淞c u t a 拍舰瑚括种子中提取酸 性多糖c s a 3 d 不仅对淋巴细胞增殖与抗体产生具有刺激作用，而且对过氧化氢诱导的 细胞损伤具有保护作用【4 “。许燕萍等研究了麦冬多糖对脑缺血损伤的抗缺氧作用，结 果表明麦冬多糖可使缺血期间脑内乳酸含量下降，从而可逆转缺血后酸中毒造成的各种 损害m 1 。 1 3 2 5 抗氧化活性在生物生命活动的氧化代谢过程中不断产生各种自由基，自由基在 免疫细胞因子网络中起调节、信号转导作用。随着年龄的增长，机体内的自由基的自稳 态平衡性下降，从而导致自身免疫功能的下降。研究表明，多糖类在一定的浓度范围内 对生物体内两种重要的自由基一超氧自由基和羟基自由基都具有清除作用，有一定的抗 氧化活性【舡5 2 l 。 1 3 2 6 抗炎作用炎症反应参与许多疾病的基本病理过程，它与许多的疾病的发生、发 展和治愈的过程密切相关。实验结果表明，4 0 m g k g 姬松茸多糖在致炎后1 h 肿胀抑制 率为4 7 ，2 6 h 平均抑制率为3 3 ，与消炎痛的作用相似，说明姬松茸多糖的抗炎作 用主要是抑制前列腺素e 2 的生物合成和释放，同时对组织胺、5 羟色胺及缓激肽等炎症 介质的生成和释放也有抑制作用【5 3 1 。 1 3 2 7 降血糖作用姬松茸所含的多糖体( b d 葡聚糖) 、多糖蛋白质复合体及r n a - 蛋白质复合体具有降血糖作用，可以改善糖尿病病人的症状。张云凌等( 2 0 0 2 ) 采用姬 松茸三七粉对糖尿病人进行治疗试验，结果表明治疗后患者的全血粘度、血浆粘度较治 疗前降低，纤维蛋白原、红细胞压积、红细胞聚集指数比治疗前明显降低i 孙5 卯。 1 3 2 8 抗应激作用抗应激能力是机体对不利环境( 如缺氧、高温、寒冷、饥渴、放射 等) 适应能力的体现。具有抗应激作用的药物能增强机体对各种有害刺激的非特异性抵 抗能力，延长在有害刺激下的生存时间。实验证明，2 和4 姬松茸多糖能显著提高小 鼠的耐高温能力1 5 6 1 。 吉林农业大学硕士学位论文姬牲茸多糖提取及纯化工艺的研究 1 4 目前多糖研究中存在的问题 虽然近年来多糖类物质的研究取得了很大的进展，但是无论是国内还是国外来看， 多糖类化合物的研究和蛋白质、核酸的研究相比，还有很大的差距，且不够深入，这主 要有以下几个方面的原因。 1 4 1 多糖结构和功能的关系至今尚不十分清楚 目前寻找高活性的多糖具有较大的盲目性。同时也缺乏修饰已有的多糖结构，进而 人工合成多糖的依据。初步认为多糖的生物活性与其一级结构、高级结构、分子量、溶 解度等有关，但尚缺乏规律性的科学依据和结论，大多还是推测和分析，而对多糖的溶 液构象和晶体研究几乎还是空白。 1 4 2 多糖的结构测定方法远未达到象蛋白质和核酸结构测定那样自动化、微量化和标 准化 由于多糖中每个单糖残基都有多个反应位点，这使糖苷键具有多种连接可能性，而 c l 的构型又有a 和b 两种，这种结构复杂形式多样的多糖的结构测定远较蛋白质和核酸 结构的测定难得多。 1 ，4 3 多糖的合成远比多肽、核酸的合成复杂、困难 多糖的异构体数目巨大，这使人工合成非常的困难。糖分子上有6 个碳原子，其上 的功能基团都可以进行反应，因此合成时形成的异构体数目与单体的数目和种类呈几何 级数增长。 1 4 4 多糖样品的提取较为困难 多糖类化合物多是具有很强极性的非电解质或是弱电离物质，其提纯较为困难。而 对于一确定分子量范围的多糖分子来说，亦不是一个单个物质。而是有一定分子量分布 的混合物，与蛋白质不同，多糖类化合物几乎不能得到其晶体。 6 吉林农业大学硕士学位论文短拯茸多糖提取及纯化工艺的研究 1 5 现代分离重组技术在植物功能成分提取中的应用 1 5 1 超临界流体萃取技；术( s u p e r e r i t i c a lf l u i de x t m c t i o n , s f e ) 超临界流体萃取( s f e ) 是一种新型的提取分离技术，是利用流体在临界点附近某 区域内，与待分离混合物中的溶质具有异常相平衡行为和传递性能，且对溶质的溶解能 力随温度和压力的变化，而在相当宽的范围内变动的规律对目的物进行提取的技术，超 临界流体可以是单一的，也可以是复合的，添加适当的夹带剂可以大大增加其溶解性可 选择性。 超临界流体萃取技术具有以下独特的优点：在医药行业中常用的萃取剂为二氧化 碳。二氧化碳化学性质稳定、无毒、无腐蚀、不易燃易爆，有较低的临界温度和l 临界压 力，在温和的温度下操作能保持中药的有效成分不被破坏，不发生次生化，还可保持产 物的色、香、味，易于安全地从混合物中分离出来，该法在医药领域具有广阔的应用前 景【5 7 1 。流体的溶解能力与其密度的大小相关，而温度、压力的微小变化会引起流体密 度的大幅度变化，从而影响其溶解能力。所以可以通过调节操作压力、温度，使有效成 分得到富集，萃取效率高，便于控制有效成分及产品的质量【5 8 1 。超临界二氧化碳萃取 不是简单地纯化某一组分，而是将有效成分进行选择性的分离，更有利于中药复方优势 的发挥【5 9 】。提取速度快，生产周期短 6 0 l 。 1 5 2 微波萃取技术( m i c r o w a v e a s s i s t e de x w a c - t i o t h m a e ) 利用微波能进行成分萃取的方法称为微波萃取。微波是一种非电离的电磁辐射波， 被辐射物质的极性分子在微波电磁场中快速转向及定向排列，从而产生撕裂和相互摩擦 而发热：同时由于空气及容器对微波基本上不吸收和不反射，从而保证了能量的快速传 导和充分利用。当样品与溶剂混合加入密闭容器中并被微波辐射时，溶剂短时间内即被 加热至沸点，由于沸腾在密闭容器中发生，温度高于溶剂常压沸点，而且溶剂内外层均 达到这一温度，促使成分很快被提取，大大提高了提取效率1 6 1 】。m a e 技术具有选择性 高、操作时间短、溶剂消耗量少，有效成分得率高、不产生噪音，适用于热不稳定物质 的提取等特点。国外有报道用于从棉籽中提取棉酚、从豆类中提取蚕豆嘧啶葡萄糖苷、 金雀花碱等天然化合物；从生物样品中提取药物及其代谢物，提取效率大大高于索氏提 取法和超声法，而且消耗溶剂少、时间短【6 2 、6 3 1 。 7 吉林农业大学硕士学位论文 姬牲茸多糖提取及纯化工艺的研究 1 5 3 大孔树脂吸附分离技术 大孔树脂吸附分离技术是采用特殊的吸附剂，去除无效成分的一种提取精制的新工 艺。该技术是7 0 年代末逐步应用到中草药有效成分提取分离中，与传统的提取方法相 比具有：缩小剂量，提高中药内在质量和制剂水平。经大孔树脂吸附技术处理后得到 的精制物可使有效成分高度富集，杂质少，使有效成分含量提高，也便于质量控制【矧。 吸附树脂是一类高度交联的、具有三维网状结构的高分子聚合物，不溶于任何溶剂， 在常温下十分稳定，因此在使用过程中不会有任何物质释放出来。至于在生产过程中残 留的某些杂质可以在使用前彻底清洗出来。大孔树脂还有再生简单，使用寿命长等特 点。何琦m j 等在大孔树脂提取银杏黄酮性能研究中对树脂进行了1 2 个周期的吸附、洗 脱实验，从吸附量、吸附率、洗脱率、纯度和收率几方面评价树脂，结果表明其性能是 较为稳定的，也表明其具有使用寿命长的特点。 该技术已在国内广泛用于分离纯化苷类、黄酮类、生物碱类等成分及大规模生产嗍。 1 5 4 膜提取分离技术 膜提取分离技术是现代分离技术领域中先进的技术之一。使用膜技术( 包括超滤膜、 微孔滤膜、半透膜、反渗透膜等) ，可以在原生物体系环境下实现物质分离。可以高效浓 缩富积产物，有效去除杂质。 以超滤为代表的膜分离技术具有明显的优越性：富积产物或滤除杂质效率高。可 根据药物或杂质分子的分布情况，有目的地选择一定孔径的滤膜，一次或两次即可完成 药效成分的富积，同时完成杂质的去除，其过程简单，操作方便，分离效率高 6 7 1 。无 需加热浓缩，有效成分不被破坏，能耗小。有效膜面积大，滤速快，不易形成表面浓 度极化现象，无相态变化。因此，与其他提取方法相比，膜提取分离技术有明显潜在的 优势。 1 5 5 层析技术 层析法与其他经典分离法( 蒸馏，结晶和萃取等) 相比优点为：操作简便，分 离效率高，设备简便。近年来，固定相种类不断改进更新，分离效率越来越高。层析 检测系统如紫外分光光度计，荧光法，电化学法等日趋准确快速，大型专用自动化仪器 和分析系统出现，使层析在分离效率，自动化程度和应用范围上都远远超过经典层析法。 层析技术应用范围较广，如：科学研究，医药卫生，环境保护，化工等领域。包括 吉林农业大学硕士学位论文 姬梧茸多掊提取及纯化工艺的研究 一般化合物的定性定量分析与检测；生物大分子，( 蛋白质，核酸，酶，多糖和多肽) ， 生物初级代谢产物( 如氨基酸，核苷酸，有机酸，脂肪酸) 及次级代谢产物( 如糖苷， 色素，生物碱，萜类) 等的分离纯化。层析技术现己成为生物工程技术下游加工过程中 最主要的纯化技术。 1 6 本试验研究的意义及内容 1 6 1 研究意义 由于化学合成药物其特有的毒副作用，以及在生产过程中对环境的高污染，在如今 人类回归大自然的潮流下，具有活性的天然产物倍受人们青睐，欧美、日本等国又重新 加强了对天然活性产物的研究，我国具有丰富的动植物资源，中草药的应用已有几千年 的历史。而运用现代科学技术对天然产物的活性成分进行研究，包括分离、纯化、结构 测定、结构与功能等的研究能促进人类健康，是新世纪天然产物研究的趋势，而具有生 物活性的多糖研究是其中的一个重要组成部分。姬松茸多糖的抗肿瘤、抗病毒、增强免 疫力和降血糖等活性作用己得到学术界的公认，其中姬松茸的抗癌作用明显优于其它1 4 种有抗癌作用的大型真菌，位居抗癌真菌首位，而且具有用量少、抗癌作用强等特点【删， 而姬松茸中具有抗癌活性的成分主要是多糖，且姬松茸中多糖含量居食用覃菌之首i 叫。 虽然国内外已有不少文献报道了姬松茸多糖的提取、纯化和一些组分研究，但是提取手 段相对单一，而且有的用酸、碱进行提取会破坏多糖结构，进而影响功效，而对于提取 后的粗多糖进行纯化的报道较少，且不够深入，相信，在相关科技人员的共同努力下， 姬松茸多糖作为免疫调节剂将在抗肿瘤、抗衰老和保健等方面得到更加广泛的应用，为 人类的健康和长寿作出更大的贡献。 在日本和欧美一些国家，已经有商品化的姬松茸多糖胶囊和口服液，作为一种增强 免疫的常用保健食品，深受人们欢迎。我国是食用菌的故乡和生产、销售大国，食用菌 生产量占世界的一半以上。因此搞好食用菌的加工是当前繁荣农村经济，提高农民收入 ( 尤其对于山区菇农) 一条十分重要的途径。而姬松茸在我国是几种主要的食用菌之一， 因此，对于姬松茸进行多糖的提取以及对多糖的纯化研究是很有意义的。 1 6 2 主要研究内容 本论文将从以下几个方向展开研究： 1 、进行姬松茸多糖提取工艺的研究，经过试验得到适合产业化的多糖得率较高的 工艺路线： 9 吉林农业大学硕士学位论文 短枪茸多糖提取及纯化工艺的研究 2 、对提取的姬松茸粗多糖进行几种脱蛋白纯化的比较，得到多糖含量较高的多糖 粉，所得多糖粉经凝胶柱层析进行组分分离，得到生物活性较高的p 一葡聚糖； 3 、对分离得到的某个组分进行收集，之后进行检测分析。 1 7 本研究创额情况 从食用菌加工利用的发展趋势来看，利用食用菌生产保健食品是食用菌精深加工的 主要方向之一，并且有专家预言，2 1 世纪是食用菌的时代。并且在加工技术方面，将趋 向于采用现代生物加工技术，最大限度地保留原料中的各种天然营养成分。本课题研究 的产品具有较高的科技含量及鲜明的新颖性，风味、色泽、组织状态及营养成分，符合 时代特点，产品适合社会各阶层人士，消费面广。本课题研究具有以下创新点： 采用超临界萃取技术对姬松茸进行脱脂处理，工艺流程简单，并且可以在较低温 度下萃取，防止热敏性物质的氧化分解，最大限度的保持姬松茸中的其他营养成分不被 破坏，并且无有害物质残留，安全性好。 采用微波萃取技术进行多糖的提取，不仅可以进一步进行细胞破碎，还可以加速 目的物向溶剂中扩散，替代了传统的热水浸提的方法，大大提高提取速率和多糖的得率， 而且不需加入助提剂，安全性好。 采用大孔树脂对多糖进行纯化，脱除部分蛋白和色素类物质。此方法成本低，树 脂可重复利用，适用于工业化生产。且蛋自、色素等杂质脱除率高，多糖损失少。 1 0 吉林农业大学硕士学位论文短橙茸多糖提取及纯化工艺的研究 2 1 材料 2 1 1 试验原辅料 第二章材料与方法 姬松茸：购于吉林农业大学食用菌研究基地。 超临界萃取用液态c 0 2 ：购于长春市氧气厂，纯度为9 9 9 5 ，食品级。 树脂；长春市新达科学仪器有限公司提供 葡聚糖凝胶( g 7 5 ) ：s i g m a 公司 2 1 2 化学试剂 乙醚、盐酸、氢氧化钠、硼酸、甲基红、溴甲酚绿、硫酸铜、浓硫酸、双氧水、碳 酸钠、酒石酸钾钠、9 5 7 醇、苯酚、斐林酚液、葡萄糖标品、牛血清白蛋白、三氯乙 酸、氯仿等均为分析纯。 b d 葡聚糖标准品购于s i g m a 公司。 2 1 3 主要设备及仪器 d 2 f 6 0 5 0 型真空干燥箱 b s 2 1 0 s 型电子天平 索氏抽提仪 s h l o a 水分快速测定仪 消化装置 凯氏定氮装置 h a l 2 1 - 5 0 0 2 型s f e c 0 2 萃取装置 n n j 9 9 3 型微波萃取装置 c t l 5 r t 快速冷冻离心机 r e 5 2 a a 旋转蒸发仪 h z s - h a 水浴振荡器 p h s 3 b w 电脑数显酸度计 层析柱 上海精密试验设备有限公司 德国赛多利斯特仪器有限公司 北京来亨科贸有限责任公司 上海恒平科学仪器有限公司 上海组检仪器公司 北京来亨科贸有限责任公司 江苏南通华安超临界萃取有限公司 日本松下电器株式会社 上海天美科学仪器有限公司 上海亚荣生化仪器厂 中国哈尔滨市东联电子技术开发有限公司 上海理达仪器厂 上海精密科学仪器有限公司 吉林农业大学硕士学位论文短枪茸多糖提取及纯化工艺的研究