（农产品加工及贮藏工程专业论文）毛霉驯化及微波对腐乳白点抑制效果的研究.pdf

西南大学硕十学何论文中文摘要 毛霉驯化及微波对腐乳白点抑制效果的研究 农产品加工及贮藏工程硕士研究生江景泉 指导教师张惟广副教授 中文摘要 腐乳是我国传统的发酵豆制品，由于其独特的风味、极高的营养价值，深受广大人民群 众的喜爱。但是，腐乳是经多种微生物发酵而成，工序繁多，其成份较难控制，因此质量问 题也比较多，腐乳白点就是其中之一。腐乳白点是指附在成熟腐乳表面或悬浮于腐乳汁液中 的白色小颗粒。腐乳白点是影响市场上大多数腐乳产品的外观质量的重要因素之一，其成份 经分析主要为酪氨酸以及少量苯丙氨酸。酪氨酸属于难溶于水的氨基酸，因此当腐乳中存在 过量的酪氨酸便容易结晶产生白点。为了解决腐乳的白点问题，本论文从以下几点展开研究， 研究内容及相关结果简介如下： 1 本试验采用五通桥毛霉与雅致放线毛霉混合发酵腐乳，研究最佳的发酵工艺条件。通 过腐乳预发酵实验确定白坯的最适水份含量为7 0 1 ；比较不同p h ，培养时间，培养温度 等对毛霉蛋白酶活性的影响，确定最佳的前期发酵温度与时间分别为2 8 与4 8 h 。毛霉蛋白 酶随培养基p h 的增大而升高，当p h 在9 1 0 时达最大值，但考虑到豆腐坯的p h 范围主要为 6 5 - 一7 2 ，因此腐乳发酵毛霉蛋白酶被视为中性蛋白酶系。 2 用酪氨酸驯化毛霉以减少毛霉中酞酰酪氨酸水解酶的合成，从而降低酶水解蛋白质产 生的酪氨酸量，驯化毛霉的酪氨酸用量分别为0 0 0 、0 0 1 、0 0 2 、0 0 3 ( g l o o m l ) ，驯化后 的五通桥毛霉与雅致放线毛霉的中性蛋白酶活力随着传代次数的增加而减小：相互比较发现， 不同的酪氨酸添加量对菌株产中性蛋白酶活力影响差别不是很大，但是当酪氨酸添加量增大 时，毛霉蛋白酶降解蛋白质产酪氨酸的能力呈大幅下降，最后确定酪氨酸添加量为 0 0 3 9 l o o m l ，为保持菌株一定的蛋白酶活力，五通桥毛霉的驯化代数为1 5 代，中性蛋白酶 相对活力下降为8 9 4 9 ，雅致放线毛霉的驯化代数为1 3 代，中性蛋白酶相对活力降为9 0 2 4 ：驯化后的五通桥毛霉与雅致放线毛霉的酪氨酸产生能力分别降为原来的7 4 9 1 与7 2 2 3 。用驯化后的两种毛霉采用正常的发酵工艺进行腐乳的混合发酵，取样分析检测其感官、 理化指标，与未驯化菌种发酵的腐乳无明显差异，但其酪氨酸生成量大为减少；贮存一段时 间后，与对照样相比，白点率也明显较小。 3 微波处理成熟腐乳能够有效灭酶，降低酪氨酸的生成量，最终达到抑制白点继续生成 的目的。成熟腐乳经4 0 0 w 功率微波处理1 2 0 s 后贮存2 个月，通过分析不同处理时间的腐乳 样品的酪氨酸、a n 、水溶性蛋白质等理化指标可以看出，1 2 0 s 处理的腐乳样品其酪氨酸、a n 、 i 两南大学硕士学位论文 中文摘要 水溶性蛋白质均无明显增加，因此可以确定4 0 0 w 功率微波对腐乳进行1 2 0 s 的处理后，腐乳 蛋白酶活已被完全灭失，因而白点的生成受到抑制。最终将1 2 0 s 确定为微波的最佳处理时间。 关键词：腐乳毛霉白点酪氨酸微波 n 西南大学硕士学位论文a b s t r a c t s t u d yo nt h ei n h i b i t i o no ff u r uw h i t ef l a k e o ft h em u c o rd o m e s t i c a t i o na n dm i c r o w a v e c a n d i d a t e ：j i n g q u a nj i a n g a d v i s o r s ：a p r o f w e i g u a n gz h a n g a b s t r a c t f u r ui so n eo ft h et r a d i t i o n a lf e r m e n t e ds o y b e a np r o d u c t si nc h i n a i ti sv e r yp o p u l a rb yi t s d e l i c i o u sf l a v o ra n dr i c hn o u r i s h m e n t b e c a u s eo fi t sm u l t i t u d ep r o c e d u r e sa n dd i f f e r e n tp r o d u c t s f e r m e n t e db yk i n d so fm i c r o o r g a n i s m s ，t h ec o m p o n e n t so ff u r ua g ec o m p l e xa n dt h eq u a l i t y p r o b l e m si sc o m m o n ，t h ew h i t ef l a k ei so n eo ft h e mw h i c hs e v e r e l ye f f e c t sa p p e a r a n c eo ff u r u q u a l i t y t h ew h i t ef l a k e ，t h el i t t l ew h i t ep a r t i c l e s ，i sc o m p o s e db ym u c ht y r o s i n ea n dl i t t l e p h e n y l a l a n i n e ，a p p e a r e do nt h es u r f a c eo ff u r uo rs u s p e n d e di nt h es o u p t h ew h i t ef l a k ea p p e a r e a s i l yi ft h e r ei se x c e s s i v et y r o s i n ei nf u r ub e c a u s et y r o s i n ei sl i t t l ed i s s o l v e di nw a t e r t or e m o v et h e w h i t ef l a k e ，t h ee x p e r i m e n t sd i s c u s s e dt h a th o wt of o r mw h i t ef l a k ea n dh o wt oc o n t r o li t sf o r m i n g ： 1 f o rf i n d i n gt h eb e s tt e c h n o l o g y , t h ef u mw a sf e r m e n t e db ym u c o rw u t u n g q i a oa n d a c t i n o m u c o rr e p e n ss c h o s t a k o w i s c h b y e x p e r i m e n to ft h ep r e - f e r m e n t a t i o no ff u m ，s o m e t e c h n o l o g yp a r a m e t e r sw e r ec l e a r ：t h eb e s tw a t e rp r o p o r t i o ni s7 0 士1 ；t h eb e s tt e m p e r a t u r ea n d t i m eo fp r e - f e r m e n t a t i o no ff u mi ss e p a r a t e l y2 8 ( 2a n d4 8 h t h ep r o t e a s ea c t i v i t yo fm u c o ri st h e h i 曲e s ta tp h9 1 0 ，b u tb e c a u s eo ft h ep ho fg r e e nb e a ng e n e r a l l yi s6 5 7 2 ，t h ep r o t e a s eo f m u c o ri sc o n s i d e r e dn e u t r a l 2 a d dt y r o s i n et op d am e d i u mt od o m e s t i c a t em u c o rw u t u n g q i a oa n da c t i n o m u c o rr e p e n s s c h o s t a k o w i s c hf o rw e a k e n i n gt h e i ra b i l i t yo fs e c r e t i n ga c i dp e p t i d et y r o s i n eh y d r o l a s e ，a n dt h e t y r o s i n ec o n t e n ti ss e p a r a t e l y0 0 0 10 0 m l ，0 01 10 0 m l ，0 0 2 10 0 m l ，o 0 3 10 0 m l t h ea b i l i t y o fs e c r e t i n gn e u t r a lp r o t e a s eo fa c c l i m a t e dm u e o ri sd e c r e a s i n gc o m p a r i n gt ot h ep r o d u c i n gm u c o r t h ed i f f e r e n tt y r o s i n ec o n t e n th a sl i t t l ea f f e c t i o no nt h ea b i l i t yo fs e c r e t i n gn e u t r a lp r o t e a s eo f a c c l i m a t e dm u c o ra n df o rk e e p i n gt h ea b i l i t yo fs e c r e t i n gn e u t r a lp r o t e a s e ，t h et y r o s i n ec o n t e n ti s i d e n t i f i e da so 0 3 10 0 m l t h ew u t u n g k i a om u c o ri sa c c l i m a t e db yt y r o s i n et og e n e r a t i o n15 ，a n d t h ea b i l i t yo fp r o d u c i n gn e u t r a lp r o t e a s ei s8 9 4 9 c o m p a r i n gt ot h ep r o d u c i n gm u c o r ；a n dt h e 西南大学硕士学位论文 a b s t r a c t a c t i n o m u c o rr e p e n ss c h o s t a k o w i s c hi sa c c l i m a t e dt og e n e r a t i o n13 ，t h ea b i l i t yo fp r o d u c i n gn e u t r a l p r o t e a s ei s9 0 2 4 n et y r o s i n ec o n t e n to fp r o d u c tm a d eb ya c c l i m a t e dm u c o rw u t u n g q i a oa n d a c t i n o m u c o rr e p e n ss c h o s t a k o w i s c ha r es e p a r a t e l yd e c r e a s i n gt o7 4 9 1 a n d7 2 2 3 c o m p a r i n g t ot h ep r o d u c i n gm u c o r t h ec h a r a c t e r so fs e n s o r ya n dp h y s i c o c h e m i c a lo ff u r ut h a tp r o d u c e db y a c c l i m a t e dm u c o rw u t u n g q i a oa n da c t i n o m u c o rr e p e n ss c h o s t a k o w i s c h 锄n o r m a l b u tt h et y r o s i n e c o n t e n ti sl e s sa n dt h ew h i t ef l a k eo ff u mi sl e s sl i r l ec o m p a r i n gt oc o n t r a s ts a m p l e 3 m i c r o w a v ec a l lk i l lt h ep r o t e a s ei nf u r ua n dt h et y r o s i n ec o n t e n td o e sn o ti n c r e a s e ，s ot h e w h i t ef l a k ei nf u r ud o e sn o ti n c r e a s e a t i e rf u r uw a st r e a t e db y4 0 0 wm c r o w a v ei n12 0 sa n di ti s s t o r e df o rt w om o n t h ，a n dt h ec o n t e n to ft y r o s i n e ，a n ，s o l u b l ep r o t e i nd i dn o ti n c r e a s e s ow e t h o u g h t , t h ep r o t e a s ei nf i l mh a sb e e nk i l l e d ，a n dt h ew h i t ef l a k ed o e sn o tf o r m k e yw o r d s ：f u 邝 m u c o rw h i t ef l a k e t y r o s i n e m i c r o w a v e 独创性声明 学位论文题目：垂重刿丝丞邀边过鹰里b 自点控鱼4 堑墨的硒究 本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中己加了 特别标注。对本研究及学位论文撰写曾做出贡献的老师、朋友、同仁 在文中作了明确说明并表示衷心感谢。 学位论文作者：毛二承氟签字日期：矽哆年口月。多日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院( 筹) 可以将学位 论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密， 口保密期限至年月止) 。 学位论文作者签名：乏二景 签字日期：勿舶尹年o ，月6 多日 1 日 、r 年 童多q 懈矿 旁乳龟嘲 参 明 稚 字 两南大学硕士学位论文第1 章文献综述 第1 章文献综述 腐乳，俗称豆腐乳，也叫乳腐，霉豆腐，酱豆腐，长毛豆腐。英文译名有s u f u ，t u s u f u ，s o y b e a n c h e e s e ，c h i n e s ec h e e s e 等，是将大豆制成的白豆腐坯经接种发酵、腌制、加料后酵等工艺而制 成的一类口味鲜美、风味独特、质地细腻、营养丰富的佐餐食品或调味品，深受国内外人们 的喜爱n 2 1 。 1 1 腐乳的生产简史及其分类 据史料记载，我国生产腐乳已有1 5 0 0 余年的历史。早在公元五世纪魏代末年的古书中就 有“干豆腐加盐成熟后为乳腐”之说。本草纲目拾遗也有“腐乳又名菽乳，以豆腐腌过， 加酒糟或酱制者，味甘咸，性平，养胃调中。”的记载。明代更有李日华的蓬栊夜话和 王士祯的食宪鸿秘，清代袁枚的随圆食单、汪日祯的湖雅及王士雄的饮食谱 等关于豆腐乳加工方法的记载。明清以后，腐乳制作已开始进入了规模化生产时期。而且， 据传早在公元1 7 0 0 年，( 红) 腐乳的制作技术即由鉴真和尚东渡时传到了日本h 1 。 由此可见，我国腐乳生产历史悠久。我国腐乳产地分布很广，腐乳种类繁多，风味各异。 根据生产工艺可分为腌制腐乳和发霉腐乳两大类。发霉腐乳按微生物种类又可分为毛霉型腐 乳和细菌型腐乳和根霉型腐乳，本文以毛霉型腐乳为例子进行分析。酿造腐乳所用的微生物 不同，所得产品质量、风味也有很大的差别。按产品的颜色和风味大体上可分为红腐乳、白 腐乳、青腐乳、酱腐乳以及各种花色腐乳：按产品的规格又可分为太方腐乳、行方腐乳、醉 方腐乳、中方腐乳、棋方腐乳、精醉方腐乳；其中因加不同的辅料而又有桂花、酒糟、五香、 虾子、火腿、玫瑰、香菇、辣椒等特殊风味懵1 。我国幅员辽阔，各地区气候不尽相同，饮食习 惯也有所差异，因此形成了许多具有地方特色的腐乳产品，如绍兴腐乳、桂林腐乳、克东腐 乳、夹江腐乳、广州辣腐乳等m 1 。 1 2 腐乳的营养价值及保健功能 腐乳的主要营养成分列表如下【7 】： 表l - i 腐乳的主要营养成分 t a b l el - im a i nc o m p o s i t i o no ff u r u 两南大学硕士学何论文 第1 章文献综述 | m m m mi 皇曼曼鼍曼皇曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼皇量曼曼曼皇曼曼曼曼皇曼曼曼曼曼曼! 曼曼曼曼曼曼 腐乳的营养保健功能如下： 现代医学和食品营养学的研究结果发现：豆制品除了含有大豆固有的优质蛋白、大豆异 黄酮、大豆低聚糖、皂甙、卵磷脂、亚油酸、亚麻酸以及丰富的钙、铁等营养保健成分外， 通过发酵更增加了如下保健功能： ( 1 ) 发酵豆制品营养丰富，易于消化，具有抗衰老，防癌症，降血脂，调节胰岛素等多 种生理保健功能： ( 2 ) 腐乳中疏水性氨基酸占组成氨基酸的比例从大豆蛋白的3 6 1 上升至4 5 6 埔1 ，使其 具有降低血液中血脂和胆固醇的能力，减少患冠心病危险的功能啊1 0 1 ： ( 3 ) 腐乳含有降血压肽，使其具有降血压功刨川； ( 4 ) 具有预防骨质疏松症功能： ( 5 ) 有研究发现豆腐中含有的抗氧化成分，如维生素e 、大豆异黄酮等酚类物质，以及 一些肽类，使豆腐具有清除自由基的能力，而经过发酵制得的腐乳清除自由基能力比豆腐高5 1 0 倍，比番茄、葡萄等果蔬还高1 0 多倍，其中，大豆异黄酮由糖苷几乎完全水解为甙元形 式，有效地提高了异黄酮的生物学活性n 2 j 引； ( 6 ) 发酵豆制品具有防治老年性痴呆症的功效。 1 3 腐乳生产的微生物学特性 现代腐乳的生产已经改传统的自然发酵为纯种发酵了，这样更有利于腐乳质量稳定，风 味良好，也更容易控制生产工艺。 腐乳生产所用的微生物大部分为丝状真菌，如毛霉、根霉等，除少数如黑龙江克东腐乳 就用藤黄小球菌。毛霉和根霉能分泌大量的蛋白酶，使豆腐坯中的蛋白质充分降解成小分子 多肽和游离氨基酸，得到的腐乳成品质地柔软，滋味鲜美，并且由于毛霉菌丝的包裹，腐乳 不易破碎，完整性好。我国腐乳生产常用的微生物如下1 2 6 l ： 表1 2 腐乳生产常用微生物 t a b l ei - 2m i c r o o r g a n i s mi nf u r up r o d u c t i o n 微生物腐乳产地 五通桥毛霉( m u c o rw u t u m g k i a o ) 腐乳毛霉( m s u f u ) 总状毛霉( m r a c e m o s u s ) 雅致放射毛霉( a c t i n m u c o re l e g a n s ) 根霉( p h i z o p u s ) 藤黄微球菌( m i c r o c o c c u sl u t e u s ) 枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss p ) 四川五通桥 浙江、绍兴、江苏、苏州 台南 北京王致和腐乳 南京 黑龙江克东腐乳 武汉 1 4 腐乳发酵的生产工艺 2 两南大学硕士学位论文 第1 章文献综述 毛霉型腐乳生产的一般过程如下：制作白坯一接种一前期发酵一腌制一泡乳一 后期发酵一加料后熟 腐乳的生产主要分为白坯的制作和发酵两个阶段，而发酵又分为前期培菌和后期发酵成 熟两个阶段。 1 4 1 白坯制作 制作腐乳所用的白坯是大豆经过浸泡、磨浆、点浆等工艺而制成的老嫩合适、富有弹性 的豆腐。制作出来的白坯要求切面光滑整洁，无蜂窝，水分适当n 劓。 白坯制作工艺流程大致如下n 毛： 大豆一洗净一浸泡一磨浆、煮浆一过筛一豆乳与豆渣 豆乳一点浆一养脑一上榨一压榨一划块、摆架一成型一切块一干燥一 白坯 我国生产豆腐的历史已经有两千年历史，但是其生产工艺流程却基本没有太大的改变， 特别是二十世纪五十年代前，采用的都是作坊式生产，生产环境恶劣、工艺条件落后，基本 都是使用人力、畜力磨浆。直到中国解放初期，腐乳的生产条件才开始有所改观，生产方式 由手工作坊式向工厂模式转变，电力磨浆取代了人力和畜力；电动吊浆、挤浆、刮浆、离心 过滤代替了手工过滤；蒸汽煮浆代替了土灶直火煮浆。目前，我国腐乳白坯的生产，从大豆 的清洗、浸泡、磨浆到豆腐的压榨、划块，基本都实现了机械化或半机械化，而且机械化的 生产模式仍然在不断更新瞳1 。 通过不少学者专家的研究，对于豆腐的各种感官指标系统在不断完善，如豆腐的硬度、 含水量、水溶性蛋白质含量、脂肪含量等等，通过这些指标的鉴定，我们能够系统的评定白 坯的质量。 1 4 2 前期发酵 古代甚至在中国现在的农村，腐乳前期发酵都是将豆腐包裹菜叶或摆放在稻草、麦杆之 上，于室外进行自然发酵，这种发酵方式感染杂菌的机会非常大，产品质量差，产量低，并 且大都只能在冬季进行。1 9 2 8 年，魏岩寿、祝汝佐首先对腐乳生产所用毛霉进行了研究。1 9 4 2 年，方心芳先生从腐乳坯上分离出四株川系毛霉菌株：高大毛霉、总状毛霉、黄色毛霉及五 通桥毛霉。到了建国后，广大专家学者对腐乳生产霉菌进行了分离鉴定、诱变育种n l 埔1 ，筛选 出了二十多种生产菌种，而其中的五通桥毛霉( a s 3 2 5 ) 和雅致放线毛霉( a s 3 2 2 7 8 ) 就是其 中的优良菌种，并得到了少数性能优良的细菌品种，如黑龙江克东腐乳生产所用的藤黄微球 菌( m i c r o c o c c u sl u t e u s ) 就是其中之一。 各生产厂家将这些优良菌种应用到腐乳生产中，并根据各菌种的生物学特性进行调节温 度、控制湿度以及前期培菌时间等措施，极大提高了腐乳的生产效率和产品品质。 3 两南大学硕十学位论文第1 章文献综述 其中毛霉型腐乳的前期发酵工艺基本流程如下： 白坯前处理一入框一接种( 菌粉或菌悬液) 一入屉一入室培菌一倒屉一腐乳坯 1 4 3 后期发酵 腐乳的后期发酵是将腌制( 有些厂家在腌制后还进行泡乳) 后的豆腐坯加料密封至数月。 在上世纪七八十年代之前，腐乳生产厂家基本都是将腌制好的豆腐坯集中到大坛进行后期发 酵。等腐乳成熟时再将腐乳开封散装销售，这种生产销售模式缺点明显：不卫生，需大量人 力、物力，所占空间大，发酵周期长，产品质量不稳定等。 经历过上世纪八十年代的分坛瓶装销售模式后，许多生产厂家将腐乳半成品装入小瓶进 行后期发酵，成熟后直接销售，这种模式可以避免成熟腐乳再次瓶装时感染其它微生物的机 会，并且使后期发酵时间缩短了一半，产品质量也有了很大提升n9 刎。不少研究表明，在后酵 时添加诸如酵母、酶等辅助材料可以大大缩短后期发酵的周期啦。 近年来，人们一直在对改进腐乳的生产工艺以及生产菌种方面不懈的努力着，例如，y o k o 等研究了用菠萝蛋白酶生产腐乳口引；王瑞掣2 3 1 研究证实了生物特性相似的双菌种混合前期发 酵优于单菌种：张远琼和魏琴采用加大人工接种量的方法，使腐乳的后酵期缩短至1 5 天乜； 邵伟等用大豆蛋白为原料，采用乳酸发酵制坯、然后接种毛霉的二步发酵法酿制腐乳幢副。 1 5 腐乳发酵的生化变化 腐乳的生产是以豆腐坯为培养基进行微生物发酵的，在前期发酵阶段，微生物大量生长 繁殖，同时产生的大量的蛋白水解酶乜l 捌，开始分解豆腐坯的蛋白质为水溶性蛋白质，大量研 究表明，经过毛霉发酵的豆腐坯水溶性蛋白质含量有所增加啪1 ，但是这个阶段时间短，生物 化学变化也比较小。毛霉的前期培养可以为后酵微生物提供速效氮养分，在蛋白酶系与后酵 微生物的共同作用下啪1 ，随着腌制、泡乳和后酵的进行，在酶、盐、酒精、曲料的作用下， 豆腐坯中的水溶性蛋白质、氨基酸不断增多，豆腐坯也慢慢进行各种呈香、呈色的变化。 1 5 1 色泽 腐乳的品种不同，其色泽也有所不同。如红腐乳是在汤汁中加入红曲而成，白腐- 孚l , n 不 加红曲，所以成熟后呈淡黄色或乳白色而酱腐乳则是添加了豆酱或面酱，成品表面和内部 酱色较深。而其他花色腐乳也是根据品种不同添加的辅料也不同，从而产品的颜色也各异。 1 5 2 香气 腐乳后酵期间，微生物的代谢会利用各种原料、辅料产生各种有机酸，和乙醇作用后生 成脂类物质，构成了腐乳特有的香气嗍。其他香气成分还包括醇、醛、有机酸以及醋等物质。 1 5 3 滋味 4 两南大学硕士学位论文第1 章文献综述 皇曼曼皇量璺曼量曼曼曼量曼曼曼曼舅舅量量量量皇鼍曼曼曼曼舅i l1 1 i 一一一一一i 蔓寰腐乳中的鲜味主要来自于氨基酸和核酸类物质的钠盐。氨基酸主要来自于腐乳中蛋白质 的酶水解，其中谷氨酸起主要作用。其次，霉菌、酵母菌和其他细菌在相关的核酸酶水解后， 生成的核苷酸，如鸟苷酸、肌苷酸的钠盐和谷氮酸的钠盐起到了增鲜的作用3 。而腐乳中的 甜味则来自于淀粉水解生成的葡萄糖、麦芽糖等物质。酸味是来自于后期发酵过程中乳酸发 酵产生的乳酸和琥珀酸等【3 引。 1 6 腐乳生产的问题研究进展 腐乳作为一种传统的发酵食品，有史以来一直是采用自然接种、自然霉制的方法制作， 直到上个世纪的4 0 年代，我国微生物学家方心芳先生从四川五通桥德昌酱园腐乳坯上分离出 五通桥毛霉( a s 3 2 5 ) 等品种之后，国内各大厂家才开始陆续分离和使用纯种发酵，使腐乳的 生产走向科学化的道路。但由于腐乳的生产采用的是固态发酵技术，不像现代深层液体发酵 那样对发酵底物进行严格的灭菌处理，其发酵过程也是开放式的，因此腐乳作为一种高蛋白 食品，其感染病源微生物的机率还是相当大的口引。并且在腐乳生产工艺的三个阶段和二十几 个生产工序中，各个工序的技术标准和要求不同，容易出现操作不当而造成腐乳的质量问题， 严重影响产品的市场销售和企业的品牌声誉和经济效益，是企业生存发展的极大障碍。就目 前生产情况来讲，易出现的质量问题有：产品的发霉、发酸、发黑、发臭、发硬、粗糙、酥 烂、易碎、产气，半成品的“秃斑 、红变、黄身等口 矧。 腐乳的发酵过程涉及多种微生物，这些微生物在特定的盐醇溶液中处于一种动态的平衡 之中，多种类的微生物的协同作用促进了蛋白质、糖类、脂类等物质的降解，促进了风味物 质的形成，如p a o m l 、h a n 呻1 研究腐乳中的嗜盐乳酸菌时就发现嗜盐片球菌( p h a l o p h i l u s ) 对 整个腐乳风味的形成是很有益处的，但是多种类的微生物的存在还带来了一些腐乳生产中难 以攻克的难题，其中的“白点”及“产气”现象即属于这类问题。 1 7 腐乳的白点问题研究进展 腐乳白点是如今腐乳市场上较为严重的外观质量问题，虽然经证实白点属氨基酸结晶， 无毒无害，可是消费者仍然拒绝购买带有白点的腐乳产品，成批的“白点问题”腐乳摆在商 场的货架上无人问津，尤其是白腐乳，由于其颜色较浅，白点问题尤为突出。白点问题严重 影响了腐乳的销售，给绝大多数腐乳生产厂家带来了巨大的经济损失，成为腐乳企业家们心 中挥之不去的痛。所以腐乳企业都尽量避免腐乳中白点的产生。但由于腐乳白点的产生涉及 到腐乳发酵微生物的复杂的蛋白酶作用机理，这个问题几十年来一直都没有得到彻底的解决。 成为了腐乳生产中的一大难题。 1 7 1 白点的组成 腐乳白点是指附着于成熟腐乳表面上直径约一毫米左右的乳白色硬质圆粒状小点，有时 5 西南大学硕十学位论文第1 章文献综述 呈片状有时附在腐乳表层松散的毛霉菌丝上，或悬浮于腐乳汁液中，或沉积于容器底部， 随着腐乳产品的货架期的延长，白点有增多的趋势。腐乳出现白点严重影响成品外观质量， 使消费者误认为这是腐乳的质量问题而拒绝购买。 腐乳白点问题由来己久，最初有人根据白点的硫酸溶液能使几滴高锰酸钾溶液褪色，推 测它是由毛霉孢子囊壁的草酸钙结晶。后来一些学者对腐乳白点的化学本质进行了全面、系 统的化学和仪器分析，确定白点主要由酪氨酸( t y r o s i n e ) 以及少量苯丙氨( p h e n y l a l a n i n e ) 组成的悟耵1 。酪氨酸属芳香族氨基酸，分子式c 9 h l l n 0 3 ，分子量1 8 1 1 9 。是蛋白质的组分之一， 天然品为l 型，无色或白色针状结晶或结晶性粉末。熔点3 4 2 - - 3 4 4 ( 分解) 。纯品稳定， 与烃类共存下则易分解。化学性较活泼，微溶于水。溶于稀无机酸和碱性溶液。不溶于无水 乙醇和乙醚。属非必需氨基酸。其结构式为： 心 苯丙氨酸分子式为c 9 h l l n 0 2 ，分子量为1 6 5 1 9 ，为白色结晶或结晶性粉末固体，味略 苦，熔点2 8 3 ( 分解) ，比旋光度3 5 1 。( c = 1 9 4 ，水中) ，减压升华，溶于水，难溶 于甲醇、乙醇、乙醚，结构式为： o 1 7 2 白点的形成原理 配置好含一定盐份、酒以及p h 值的类似腐乳后酵溶液，加入略微过量的酪氨酸可以测出 游离的酪氨酸在水中溶解度仅0 0 3 8 ，是属于难溶于水的氨基酸。林影等研究当腐乳中酪氨 酸含量超过2 0 0 m g 1 0 0 9 时，产生白点1 。经研究表明，腐乳中的氨基酸主要是在蛋白酶和肽 酶的共同催化下形成的，腐乳中游离酪氨酸的含量与蛋白酶的种类、数量以及微生物的类群 有关。 白点的形成是腐乳在后发酵阶段中，大豆蛋白质受毛霉蛋白质水解酶系催化、水解释放 出酪氨酸，酪氨酸进一步积累的结果。然而，现在对毛霉中蛋白酶的种类及其酶学特征还没 有深入的研究。与酪氨酸释放有关的蛋白酶可能有如下两类： ( 1 ) 内肽酶毛霉在老熟时能积聚优先切断肽链中酪氨酸肽键的蛋白酶。 ( 2 ) 外肽酶内肽酶作用生成了以酪氨酸为末端的肽链，接着再受酪氨酸羧基肽酶的作用 生成酪氨酸h 羽。 李理h 3 1 在研究毛霉蛋白酶对大豆分离蛋白的降解作用时发现，酶解后的可溶性大豆多肽 中酪氨酸的摩尔比比大豆分离蛋白中酪氨酸的摩尔比明显增加了，这就说明了毛霉蛋白酶由 于其酶切位点的特性，有将酪氨酸带入可溶性肽的趋势，当含有大量酪氨酸的小肽物质进人 6 西南大学硕士学位论文 第1 章文献综述 汤汁后，如果再遇到足够数量的外肽酶，便可产生大量的酪氨酸。进而形成“白点”当然， 酪氨酸的生成除毛霉蛋白酶的作用之外，其他耐酸菌或者嗜盐菌、嗜酒菌等也可能起着重要 的作用。 1 7 3 酸性条件对白点生成的影响 c h i o u h 町研究了几种微生物生长抑制剂对“白点”形成的影响。以米曲和米一豆曲作为酶 源制作腐乳，并分别加入对羟基苯甲酸酯、磺胺、四环素、氯霉素、冰醋酸作为微生物生长 抑制剂，经过1 a 的发酵，以米曲作酶源的产品中未出现“白点”，以米一豆曲作为酶源并在盐 溶液中加入i o m l l 冰醋酸的产品也未出现“白点”，成分分析显示，以米曲作为酶源的腐乳 盐溶液中其p h ，酪氨酸含量以及总的氨态氮含量均低于以米一豆曲为酶源的腐乳盐溶液。可见， 酸性条件可抑制腐乳“白点”的形成。 1 7 4 驯化菌种对防止腐乳产生白点的效果 生物多样性是微生物驯化的基础，驯化条件对微生物进行选择：适者生存，不适者被抑 制或淘汰。此外，微生物还能够通过表型适应和进化性适应主动地去适应驯化条件。微生物 驯化的过程是微生物对其生存环境重新适应和调整的过程，符合生态学“选择与适应”的原 理。我们可以通过调节微生物某种酶的活性的手段以控制其产生相对应物质的代谢速率h 副。 其方式有激活与抑制两种，当在培养基中加入适合微生物生长的营养物质，微生物生长旺盛， 代谢速率增加：而如果向培养基中加入微生物的某种代谢产物，根据微生物代谢机理，则其 相对应的酶活性受到一定的抑制，对应产物的代谢速率下降。依据以上原理，我们可以采用 向培养基中添加一定量的酪氨酸以抑制毛霉中酞酰酪氨酸水解酶的活性，降低其分解蛋白质 产酪氨酸的能力，当毛霉长期在含有酪氨酸的培养基中生长繁殖，并逐渐淘汰不适应的菌株， 适者对这种驯化条件通过表型适应主动的适应，然后逐渐演变成为进化性的适应，最终达到 驯化目的，使毛霉的酞酰酪氨酸水解酶活性得到永久性的降低。 因此，采用在培养基中添加酪氨酸的方法来进行毛霉菌株的酪氨酸驯化，以阻遏毛霉中 酞酰酪氨酸水解酶的合成，再将驯育后的菌株投入生产发酵，可以降低腐乳中的白点率。袁 振远、林影等h 。删在这方面做了一定程度的研究，发现驯化菌种对防止腐乳产生白点有一定效 果。腐乳白点与毛霉蛋白酶作用机理有着密切的联系，要完全弄清毛霉中各种酶系在腐乳发 酵中的作用机理尚需进一步的深入研究。此外，可以通过基因工程手段改良腐乳发酵菌株， 使其合成酞酰酪氨酸水解酶的能力下降，最终达到降低酪氨酸生成的目的。 1 7 5 发酵工艺对腐乳白点产生的影响 除了以上研究外，通过控制品温、前酵时间，悬浮液p h 值、发酵房的相对湿度，调节到 毛霉生长的最适条件是预防、减少腐乳白点产生的有效途径。根据毛霉的生长条件与蛋白酶 7 西南大学硕士学位论文第1 章文献综述 及儿茶酚氧化酶活力消长的关系，必须合理掌握毛霉培养时间。在一定温度下，毛霉培养时 间越长，蛋白质水解酶系积累越多，活力也越来越高大豆蛋白质的消化程度越大，酪氨酸 的析出量也就越多，当它在溶液中的浓度超过其溶解度时，结晶便析出。首先形成微小的晶 核，随着蛋白质的继续水解，析出的酪氨酸晶体逐渐增大。因而前期发酵时间越长，白点微 粒也越大越多。如果时间过短，蛋白酶及儿茶酚氧化酶活力不足，会导致成品腐乳滋味不够 鲜美，色泽也过淡，难以符合质量标准。总结各试验研究结果得出：酿造白腐乳的毛霉培养 时间以4 2 - 4 8 h 为宜。 提高前期发酵的温度，可以适当降低腐乳白点率。但根据腐乳厂家的生产经验，提高前 期发酵温度，如果在湿度、通风等方面控制不好，很容易造成杂菌的感染，乳坯将出现发黄、 粘手等不良现象。所以，从企业生产的角度考虑，应该在前酵温度和时间两者之间找到一个 平衡点 袁振远等的实验表明，在前酵过程中如果控制好毛霉生长条件，如：温度、湿度、时间， 试验腐乳成品的白点率比正常生产腐乳成品的白点率( 白点率是指批量的瓶装腐乳生产中， 出现白点的瓶数与总瓶数之比) 可降低达9 4 ，试验成品色泽比正常生产成品的略浅h 。这说 明控制好腐乳前期发酵的工艺条件可以减少腐乳白点的产生。 从何熙h 7 1 实验可以看出，减小腌制时的用盐量，腐乳毛霉分解大豆蛋白质的速度加快， 成熟腐乳的白点率增加；而且减小泡乳盐水浓度或延长泡乳时间也会使腐乳白点率增加。其 原因可能是与分解代谢产生酪氨酸的酶系在相对较低的盐浓度条件下易发挥其分解作用，导 致酪氨酸增加，从而使腐乳产生更多的白点。 1 7 6 微波对腐乳白点的抑制作用 腐乳发酵成熟进入货架期后，由于各种酶系和微生物仍然会继续存活，仍然在继续分解 大豆蛋白质以及多肽类物质，从而导致腐乳过熟，酥软易碎；并且导致蛋白质过度降解产生 大量酪氨酸，最终形成白点：同时由于酶与微生物的继续作用，货架期的腐乳容易出现产酸 产气等现象，使瓶内的部分汤料溢出造成“溢汤”现象，这是导致腐乳保质期缩短的一个重 要因素。因此，对结束后期发酵要进入货架期的腐乳来说，通过灭酶灭菌的方式中止腐乳的 继续发酵是有着重要意义的h 引。 毛霉蛋白酶在白点形成过程当中起着至关重要的作用，而从生理生化本质来说，酶是一 种类似于生物活细胞具有催化功能的蛋白质，它与其他蛋白质一样，也有等电点和蛋白质变 性的作用。由于蛋白质变性的不可逆性，从而我们可以通过加热钝化酶，甚至使酶完全失去 活性而不会带来非食品组织成分。通过加热使酶失去活性的方式在食品贮藏行业中应用极其 广泛，传统的方法包括沸水和蒸汽热烫，这些方法灭酶比较彻底h 钔。然而，传统的加热过程 耗时长，在未达到灭酶温度的过程中，由于温度的逐渐升高酶活性也会相应的增长，从而继 续其催化反应的作用，加剧消耗食品中的营养物质，使食品品质下降，影响产品风味和产品 8 两南大学硕十学位论文第1 章文献综述 l 的加工性能恻。 近年来，微波由于具有传统加热不具备的诸多优点被广泛应用于食品工业。微波是指频 率为3 0 0 3 0 0 0 0 0 删z 的电磁波，和其他电磁波在本质上是同一物质，只是由于频率不同，因 而各自表现出不同的性质，具有不同的用途。微波加热是由物质内部分子振荡所引起，其热 量是从被加热物料内部产生的，并且微波对物料具有良好的穿透能力，其穿透深度一般为几 毫米到几十毫米，可以做到表里一起加热。同时，由于热量是从内部产生的，内外不存在温 度梯度，没有一般加热的热量传输过程，故加热快，预热时间短，热损耗小，热效率较高。 许多学者也已通过实验证实了微波加热处理食品的优点，微波处理能使产品的中心温度在短 时间内达到灭酶的温度，从而缩短了加热升温的处理时间，也很好利用了微波的热效应和非 热效应以及电磁场的协同作用哺h 捌。微波作用时有温度场和电磁场，相比之下，常规加热只 有温度场。曹辉哺3 1 通过小麦胚芽中解脂酶的微波灭酶实验得出结论：温度场和电磁场的共同 作用下灭酶所用的时间与效果都要优于温度场，并且电磁场的作用效果要明显好于温度场。 因此。应用微波进行腐乳的灭酶处理，具有很多优点。 相对常规加热灭酶，微波灭酶主要有以下这些优点： 介质吸收微波时，微波能够穿透至介质内部，其深入距离与微波波长的数量级相同，穿 透至物体内部的微波能量被物体吸收转换成热能，从而使得物体表里温度一致，不至于使物 体受热不均而导致焦化嘲1 。 微波处理时间比传统加热时间短，微波加热是由物体内部开始的，物体的内外不存在温 度梯度，没有传统加热的明显热传递过程，所以加热快，预热时间很短嘞1 ，明显提高了效率。 干燥时间缩短到传统加热的十几分之一甚至几十分之一。 同时还避免了传统加热的缺点，如：能耗大，既损失了能源又对环境造成不利影响；需 要占用大量的空间以及人力，并且微波容易使用，操作灵活方便。 1 8 本文的研究目的与意义 腐乳是中国一种传统的发酵豆制品，它不仅具有大豆本身所含的营养元素与生理活性物 质，而且还由于经过了微生物的发酵，使其具有大豆没有的诸多保健功能，如：抗氧化、抗 癌、降血压等功能，加上其营养丰富、风味独特等优点，深受广大消费者的喜爱，在欧美地 区许多人把腐乳称之为“中国干酪”。但是一直以来，在腐乳的工业化生产中，由于敞开式的 生产工艺以及多种微生物共同参与发酵等各方面条件的限制，腐乳生成与销售期间容易产生 各种质量问题，如发酸、发臭、发硬、酥烂、产气、黄身、白点等。这些问题长期以来一直 困扰着豆制品企业，也给人们在购买腐乳时增添了不少顾忌。其中，腐乳的白点问题就是其 中之一，在腐乳货架期间，不少瓶装腐乳的白点不断增加，严重影响了腐乳的外观，使消费 者望而却步，同时也给企业蒙受了巨大的经济损失。长期以来，各腐乳生产厂家采取了各种 各样的措施解决腐乳的白点问题，但由于多种微生物共同发酵腐乳的工艺特点与微生物蛋白 9 两南大学硕十学位论文 第1 章文献综述 酶复杂的作用机理等因素的影响，部分生产工艺较难控制，因此，收效不甚明显。迄今为止， 腐乳的白点问题仍然是绝大多数豆制品生产企业亟待解决的难题。 本文将在腐乳最佳生产工艺条件下探讨出一套酪氨酸驯化五通桥毛霉与雅致放线毛霉菌 株，以降低毛霉降解大豆蛋白产生过量酪氨酸能力的方法，最终达到降低腐乳白点率的目的。 试验还将研究微波对毛霉蛋白酶的抑制作用，以期通过一定的功率和时间的微波处理成熟腐 乳，达到降低腐乳酪氨酸生成量，最终抑制白点产生的目的，同时改善腐乳酥烂、易碎等质 量问题。 本文通过毛霉驯化及微波对腐乳白点抑制效果的研究可以为腐乳生产厂家提供一套解决 腐乳白点问题的理论依据；对腐乳货架期间白点问题的解决有一定的促进作用；促进腐乳的 销售，降低企业的经济损失。本课题还为酪氨酸诱导驯化毛霉提供了一定的理论依据；近几 年已有不少专家在微波对蛋白酶活力的抑制效果方面进行了研究，但是应用于腐乳白点抑制 的研究却极少报道，本试验从微波对蛋白酶活灭失的角度出发，阻遏蛋白质继续降解生成酪 氨酸，从而抑制了白点的继续生成。 1 9 本文的研究范围与内容 1 酪氨酸溶解性的研究：酪氨酸在不同n a c i 浓度、乙醇浓度以及p h 值条件下的溶解度 变化情况。 2 毛霉菌种( 五通桥毛霉与雅致放线毛霉) 在不同培养温度、培养时间与p h 值等因素 条件下的蛋白酶活力变化情况。 3 腐乳生产毛霉菌种( 五通桥毛霉与雅致放线毛霉) 的驯化，确定毛霉驯化所用的酪氨 酸量及适合的驯化代数。 4 驯化菌株与未驯化菌株在腐乳发酵过程中腐乳及其汤汁中各种理化指标的检测。主要 研究的是两种菌株发酵的成熟腐乳样品在酪氨酸含量、各种外观指标与理化指标的差异。 5 微波对腐乳的处理，主要确定一定功率的微波对腐乳中蛋白酶活灭失的最佳处理时间， 以防止蛋白质的继续降解产生过量的酪氨酸。 l o 西南大学硕士学位论文 第2 章腐乳的发酵工艺条件研究 曼mwmm 曼皇曼曼曼皇曼皇曼皇曼皇曼曼曼! 曼曼皇曼曼皇曼量曼皇曼舅曼皇曼曼曼曼曼曼曼 第2 章腐乳的发酵工艺条件研究 2 1 前言 腐乳发酵工艺涉及到菌种的制