（农产品加工及贮藏工程专业论文）嗜酸乳杆菌生物学特性及其在发酵乳中的应用研究.pdf

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t g m l t h r o u g ht h eb i o l o g yc h a r a c t e r i s t i cs t u d y , t h el a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u s s h o w e dag o o d b i o l o g yc h a r a c t e r i s t i c i tc o u l d s u r v i v ei nt h eb a dc o n d i t i o na n d p a s st h eg a s t r o i n t e s t i n a lc o n d i t i o ns u c c e s s f u l l y s oi t w a sb e n e f i c i a lt oh u m a n h e a l t h w ec a n i m p l y i ti n t om a n u f a c t u r i n gf e r m e n t e dm i l k t h es p e e do fp r o d u c i n ga c i dw a si m p r o v e d ，a n dt h ep hw a sd e c r e a s e d w h e ni tw a sf e r m e n t e d b y l a c t o b a c i l l u s a c i d o p h i l u st o g e t h e r w i t l l s t r e p t o c o c c u st h e r m o p h i l u s t h e ys h o w e dag o o ds y m b i o s i sw h e n f e r m e n t e d t o g e t h e r t h r o u g ht h eo r t h o g o n a l e x p e r i m e n t ，w e g a i n e d t h eb e s t p r o c e s s p a r a m e t e r s t o p r o d u c e t h ef e r m e n t e dm i l k i tw a s 4 0 f e r m e n t i n g t e m p e r a t u r e ，8 s u g a rc o n t e n t ，4 p i t c h r a t ea n dl ：4 p r o p o r t i o n o f 2 山东农业= 学硕士学位论文 s t r e p t o c o c c u st h e r m o p h i l u sa n dl a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u s t h ef e r m e n t e dm i l kw a sp r o d u c e db a s e do nt h eb e s tp r o c e s s t h e ni tw a s l a y e du n d e r4 i nt h e 1lt h d a y , t h er e s u l t s i n d i c a t e d p h4 0 8 ，10 5 0 t t i t r a t a b l e a c i d i t y 10 5 ”t - 1 ：im ：2 p r o p o r t i o n o fl a c t o b a c i l l u s a c i d o p h i l u s a n d s t r e p t o c o c c u st h e r m o p h i i u s a n da b o u t 1 07 c f u m l q u a n t i t y o f l a c t o b a c i l l u s a c i d o p h i l u s s oa l lt h e s ei n d e x e sw e r en o r m a l l a c t o b a c i l l u s a c i d o p h i l u s c o u l dr e d u c et i l ec o n t e n to ft h et o t a l c h o l e s t e r o l ，t r i g l y c e r i d e a n da is i g n i f i c a n t l y t h e a b i l i t y t om o d u l a t et h e c o n t e n to fh d l ci nb l o o ds e f u mw a sn o to b v i o u s k e y w o r d s ： l a c t o b a c i l l u s a c i d o p h i l u s ；s t r e p t o c o c c u s t h e r m o p h i l u s ；f e r m e n t e dm i l k ； b i o l o g i cf u n c t i o n 嗜馥乳杆菌的生物学特性及其在发酵乳中的应用研究 1 引言 1 1 乳与乳制品的消费及加工现状 乳与乳制品含有丰富的高质量蛋白、乳脂肪、糖类、维生素、矿物质 以及免疫活性因子等营养成分。营养学研究表明，乳的生物学价值( 人体 生理上的利用率) 为8 5 ，消化率为9 8 。因其营养全面而且容易吸收， 乳与乳制品被认为是“接近完善的食品”口3 1 。 世界各国都在大力提倡乳与乳制品的消费，如日本就提出了“一杯牛 奶强壮一个民族”的口号。在发达国家，乳与乳制品已成为人们日常膳食 的重要组成部分。在发展中国家，其消费量也随着人们的收入增加而逐年 提高。如今随着生活水平的提高，我国人民也开始注重对乳与乳制品的消 费，尤其在城市更为突出。1 9 9 0 年我国人均乳品消费量为4 4 k g ，2 0 0 0 年 为7 6 4 k g 。进入2 i 世纪以来人均消费量快速增长的势头依然强劲不衰， 2 0 0 3 年全国人均奶类消费量为1 4 k g ，但与世界人均消费量l o o k g 相比， 我国乳制品消费水平还是偏低的。目前，在肉蛋奶的消费比例中，发达国 家肉、蛋、奶的比例是o 4 ：0 0 6 ：1 ，乳制品消费比例最高；而我国的比例为 6 7 ：2 8 ：1 0 ，乳制品消费比例最低。 消费需求的增长有力地推动了乳品行业的发展。同时乳品行业作为 个同人民生活密切相关的行业，其发展也越来越引起了我国政府和社会的 关注。2 0 0 3 年科技部将乳业列入1 2 项重大科研专题项目之一；国家经贸 委将乳制品加工业列入重点支持的行业，中国政府还正在积极推行和实施 “学生饮用奶计划”。由此可见，我国宏观环境对乳品行业发展越来越有 利。加之乳制品企业自身的努力，乳品行业已经成为我国新兴而又极具发 展潜力的食品行业，被社会公认为“朝阳行业”【1 7 1 。 资料显示，2 0 0 2 年中国乳制品工业企业有1 6 0 0 多家，其中国有企业 以及年销售额在5 0 0 万元以上的非国有企业有4 6 2 家，规模以上乳品企业 共完成工业总产值3 5 8 亿元，销售收入3 4 0 亿元，同比增长2 5 2 ，利税 总额3 6 亿元，同比增长1 3 8 。2 0 0 3 年全国乳制品加工企业生产干乳制 品1 4 0 5 万吨，比1 9 9 8 年增长1 5 5 9 n ，平均年增长率为3 1 2 ；生产液 态奶5 8 2 9 万吨，比2 0 0 0 年增长3 3 4 9 平均年增长率为6 7 ；乳制品加 工企业产值达5 0 0 4 亿元，比1 9 9 8 年增长3 1 倍 2 刀。在乳制品产量中，奶 山东农业大学硕，卜学位论文 粉类产品约占7 0 ，其中，全脂奶粉约占1 9 ，全脂加糖奶粉约占3 8 ， 脱脂奶粉约占2 6 ，婴儿配方奶粉约占1 8 1 ，其他奶粉约占2 1 5 ； 而在液体奶中，巴氏杀菌奶约占5 3 1 ，超高温灭菌保鲜奶约占2 9 9 ， 发酵乳约占1 7 o 。虽然乳品工业高速发展，但各种乳制品的发展速度并 不相同，奶粉增长速度已经变慢，并将逐步降低，而液态奶发展迅速。 牛奶被喻为人类的白色血液，而含有大量有益活性菌的发酵乳更是营 养与保健功能兼备的现代人类理想食品之一。近年来发酵乳由于其特有的 风味、丰富的营养及良好的保健作用，深受广大消费者的青睐，我国发酵 乳的产量以3 0 以上的速度在发展，目前已经成为我国人民生活消费中 不可或缺的重要食物。 1 2 发酵乳的研究趋势 早在公元前2 0 0 年，印度、埃及和古希腊就有用有益于人体的乳酸菌 制作发酵食品的记载；公元1 0 0 8 年，德国建立了世界上第一个酸奶作坊； 到1 6 世纪中叶，发酵乳酪渐渐成为一些民族的传统食品。我国制作酸奶 的历史也很悠久，后魏贾思勰的齐民要术记载了酸奶的做法。2 0 世 纪初，梅奇尼科夫出版了长寿一书，论述了酸奶能使人长寿，掀起了 近代发酵乳生产和消费的开端；1 9 3 4 年，h e n n e b e r g 首先提出，为了提高 酸奶的保健价值，在制作酸奶的菌中补充嗜酸乳杆菌；1 9 5 0 年以来，随 着对酸奶生产技术和影响其感观性质的因素的深入了解，开始使用纯菌种 制造发酵制品，并能利用现代化装置进行连续生产，相继出现了品种花色 多样的发酵乳；近几年来，大量的学者在深入研究乳酸菌及其发酵乳功能 特性的基础上，重点在改善发酵乳品质和开发益生菌产品方面做了大量的 研究。 虽然我国的发酵乳生产早有历史，但大规模生产还是起源于2 0 世纪 8 0 年代初期，比欧洲发酵乳的工业化生产晚了近一百年。因此我国发酵 乳的生产和研究开发等方面与国外相比仍有很大差距。目前国内市售发酵 乳品种单一，多局限于保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌生产的普通酸奶。研 究表明，嗜热链球菌和保加利亚杆菌发酵乳糖产生乳酸、细菌素等健康促 进成分，但是它们对酸及胆汁盐非常敏感，也不能在肠道中定植，从而其 保健作用受到了很大限制b ”。 嗜酸乳杆菌的生物学特性及其在发酵乳中的应用研究 随着人们生活水平的提高，发酵乳制品的营养价值和保健功能已经越 来越受到重视，调查显示：消费者在选购时经常考虑到健康因素的约占 6 9 。第2 2 届国际乳制品联合会预测，发酵乳发展有以下几种趋势h l 】： 生产多种具有良好感官特性的发酵乳，在不久的将来，保健性会变得更加 重要。生产发酵乳时要选择能在牛奶中生长良好的并与胃肠微生物菌丛 相互作用并产生良好代谢的微生物菌株。对免疫系统的影响和癌症的预 防是进一步探索的科研领域。微生物的遗传工程和基因技术将应用在新 型发酵乳中。在维持和改进传统产品的基础上，发展新产品。因此开发 含有益生菌的保健型发酵乳成为当前的研究热点。 f u l l e r 将益生菌定义为“一种通过改善肠道微生物平衡从而对宿主施 加有益影响的微生物添加物”1 5 “。常应用的益生菌是产生乳酸的细菌，如 乳杆菌和双歧杆菌等，它们是人类肠道重要的生理菌，对机体有多种其它 正常生理菌群无法比拟的生理作用。其生理作用包括：调整肠道菌群；提 高蛋白质和维生素的代谢；防止便秘；产生抗菌素；缓解乳糖不耐症；治 疗肝损伤；降低结肠癌的发病率；抗肿瘤；增强免疫功能；降低胆固醇； 治疗泌尿系统感染等 4 3 , 8 2 , 9 5 , 2 3 】。肠道菌群的组成对人体营养、免疫、衰老 等有着密切的关系，促进肠道中有益菌的增殖，抑制有害细菌的生长，对 于高血压、高血脂、心脏病、糖尿病和癌症等生活习惯病防治方面的重要 意义，已经引起各国的重视。因此，目前益生菌及其制品成为国内外研究 热点，在食品、保健品、药品等领域已有多种益生菌制剂问世，并普遍受 到广大消费者的欢迎。 益生菌以发酵乳作为其主要食用形式，乳制品也是益生菌的最重要的 载体。发酵乳之所以能作为益生菌的有效载体，主要有以下原因 1 2 1 ：( 1 ) 发酵乳本身就具有很好的健康功效；( 2 ) 消费者已熟知发酵乳中含有活性 微生物；( 3 ) 益生菌可将发酵特性与健康功效结合。此外从技术原因上， 发酵乳制品已优化其加工和贮藏条件，最大程度保持发酵活菌数，这也为 益生菌的存活创造了有利条件。嗜酸乳杆菌作为乳酸菌家族中的一种重要 的益生菌，被视为第三代发酵剂菌种。美国科学家s e l l a r s 先生早在1 9 8 1 年就预言，在今后的二三十年间，嗜酸乳杆菌的开发、研究及应用将具有 强大的生命力。 山东农业大学硕士学位论文 1 3 作为益生菌的嗜酸乳杆菌 1 _ 3 1 嗜酸乳杆菌的生物学特性 嗜酸乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u s ) 属乳杆菌科中的乳杆菌属， 为g + 菌，形态呈细长杆状，细胞大小一般为o 6 0 9 1 5 - - 6 0pr n ，成 单、成双或者2 3 个成短链排列。无鞭毛，不运动，革兰氏染色阳性。 厌氧或者兼性厌氧。最适生长温度为3 5 3 8 ，2 0 。c 以下不生长，最 高生长温度4 3 4 8 ，耐热性差。最适p h 为5 5 - - 6 0 ，生长初始p h 为5 0 - - 7 0 ，耐酸性强，能在其它乳酸菌不能生长的环境中生长繁殖。它 能利用葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖进行同型发酵，发酵产生d l 型乳酸。 广泛存在于人及一些动物的肠道中，是一种有益的微生物菌群，对维持胃 肠道的生理功能有重要作用。嗜酸乳杆菌产酸、耐渗透压、耐胆汁盐、同 化胆固醇以及水解蛋白等生物学特性对其在发酵乳中的应用起着决定性 的作用。 嗜酸乳杆菌生长繁殖需要一定的维生素等生长因子，最适宜生长温 度下培养生长缓慢，生产周期长；在乳中产酸速率偏低，主要是由于其不 完全的蛋白分解酶系、氧化还原电势和微量元素所致。在乳中添加降低氧 化还原电势的物质( 如抗坏血酸、半胱氨酸等) 以及生长促进物质，如肝 浸出物、胡萝h 浸出物、乳糖、乳糖水解物和酪蛋白水解物等，可促进嗜 酸乳杆菌的生长。 1 _ 3 2 嗜酸乳杆菌及其代谢物的生理功能 嗜酸乳杆菌具有较强的耐酸及耐胆汁盐能力，能顺利通过胃肠道而定 植于大肠内9 7 1 ，是人体肠道中的重要微生物，与人体健康息息相关。当其 达到一定数量时，可以起到健康促进效果。k u r m a n n 等报道，嗜酸乳杆菌 产品发挥功能特性的活菌数临界值为1 0 6 个m l 或1 0 。个俺门。 ( 1 ) 生物屏障作用 嗜酸乳杆菌与肠粘膜上皮细胞相互作用、密切结合构成了生物学屏 障；同时，通过其自身及其代谢物与其它细菌之间的相互作用，调整菌群 之间的关系，维持和保证菌群最佳优势组合以及这种组合的稳定性，从而 阻止了致病菌的入侵和定殖，拮抗致病菌和有害微生物的生长及其毒素的 粘附 1 0 8 , 1 0 2 】。 嗜酸乳杆菌的生物学特性及其在发酵乳中的应用研究 但) 营养作用 乳酸菌发酵后产生的乳酸，可提高胃内食物的预消化，提高钙、磷、 铁的利用率和维生素d 的吸收；乳糖分解产生的半乳糖，是构成脑神经 系统中脑苷脂的成分，与婴幼儿出生后的生长有密切的关系；同时产生的 大量维生素b 群能促进人体神经细胞的发育；提高人体肠内的b 一半乳 糖营酶的活性，促进奶质中乳糖的吸收，从而缓解乳糖不耐症；能分泌蛋 白酶，促进蛋白质的消化吸收【5 2 , 6 3 1 。 ( 3 ) 降低血液胆固醇 嗜酸乳杆菌生长过程中胆汁和厌氧情况的存在使其能够吸收胆固醇， 这种对胆固醇的吸收作用使人体从消化系统摄入的膳食胆固醇进入血液 的量减少，故产生降血脂的作用 9 1 。1 9 7 5 年，h a r r i s o n 和p e a t 将嗜酸乳杆 菌添加到婴儿配方食品中，研究其对肠道微生物区系及血液中胆固醇含量 水平的影响。结果表明，摄入含嗜酸乳杆菌婴儿配方食品的试验者，血液 中胆固醇含量明显下降，对照组的试验者血液中胆固醇含量有轻微增长。 可见肠道微生物菌群影响血液中胆固醇的含量1 6 ”。1 9 8 5 年，g i l l i t a n d 和 其他研究人员进一步指出，嗜酸乳杆菌在含适量胆盐的高胆固醇培养基中 生长时，其菌体细胞可以同化胆固醇到自身的细胞膜中去【6 ”。1 9 9 0 年， g i l l i l a n d 和w a l k e r 针对如何控制和减少高胆固醇血症人血液中胆固醇的 含量，在实验室中筛选、分离出了多种对血液胆固醇具有吸收作用的嗜酸 乳杆菌菌株【5 ”。1 9 9 4 年，b u c k 和g l l l i l a n d 【6 l j 通过猪饲喂的动物试验，选 择了7 种嗜酸乳杆菌的培养物和嗜酸乳杆菌a t c c 4 3 1 2 1 ，前7 种嗜酸乳 杆菌的培养物分解胆固醇的能力远远不及a t c c 4 3 1 2 1 。根据微生物寄主 的专一性，为了能筛选、分离出能应用于人体的菌株，他们进行了如下试 验。以1 6 名志愿者为试验对象，通过对比初步分离出1 2 3 种嗜酸乳杆菌， 最后分离出了8 种符合条件的嗜酸乳杆菌，虽然没有a t c c 4 3 1 2 1 效果好， 但其分解胆固醇的作用也较明显。1 9 9 9 年a n d e r s o n 和g l l l i l a n d 让高胆固 醇血症人摄入用嗜酸乳杆菌l 1 生产的一种发酵乳产品。试验结果表明： 摄入用嗜酸乳杆菌l 1 生产的发酵乳产品的高胆固醇血症人，第一阶段血 液中胆固醇下降了3 2 n ，患冠心病的危险减少2 4 倍。关于嗜酸乳杆菌 l 1 对高胆固醇血症病人有疗效的机理，可能是由于嗜酸乳杆菌l 1 在生长 山东农业大学硕士学位论文 过程中可以吸收血液中的胆固醇，还能够使胆盐早期解离为胆汁酸，及时 排出体外。由于胃肠道内胆汁酸减少，因而血液从胃肠道中吸收的胆固醇 明显减少【l ”。 ( 4 ) 抗癌作用 腐败性细菌作用于食物成分和胆汁酸盐类，能生成亚硝基化合物、胆 固醇及胆汁酸的代谢物、氨基酸代谢物( 酚类、吲哚、硫化氢) 等有机致 癌物质。与这些致癌物质有关的肠内细菌酶有b 葡萄糖醛酸酶、巯基还 原酶、偶氮还原酶等。嗜酸乳杆菌能改善肠道菌群，抑制了致癌物质的产 生；同时，嗜酸乳杆菌及其代谢物活化了免疫功能，抑制癌细胞的形成和 增殖口+ l 。j 。 ( 5 ) 增强机体免疫力 嗜酸乳杆菌在肠道内定植，相当于自然免疫，能激活机体巨噬活性， 诱发特异性和非特异性免疫反应，提高抗感染的能力【9 10 1 。 ( 6 ) 延缓机体衰老 人的衰老与肠内有害细菌产生的氨、胺、硫化氢、吲哚、酚、粪臭素 等有害腐败产物有很大关系。嗜酸乳杆菌代谢产生的乳酸抑制了这些腐败 物，使机体衰老的过程变得缓慢 9 ”】。 1 4 胆固醇与人体健康 1 4 1 胆固醇的生理功能 胆固醇( c h o l e s t e r 0 1 ) 是以环戊烷氢菲核为骨架的2 7 碳化合物。它们 广泛存在于各种组织和细胞中，在体内发挥着重要的生理作用。胆固醇是 人体必需的营养成分，它是质膜、内质网、线粒体、高尔基体等细胞器膜 的组成成分之一，与膜的通透性密切相关。脑神经组织和肾上腺中胆固醇 的含量更为丰富，说明它和神经传导有一定的关系。此外，胆固醇在体液 免疫中起着重要的作用，是维持白细胞生理机能不可缺少的物质，如果体 内胆固醇含量过低，机体对异物的清除能力将大大下降，从而导致致癌几 率的上升l l “j 。胆固醇也是体内许多重要激素的合成原料和前体物质，它 在体内转化为孕醇酮，进一步合成皮质激素、孕酮、雄性激素、雌性激素 等多种类固醇激素。这些激素物质在代谢调节、反应应激、免疫激活等方 面发挥一定的作用。胆固醇还是合成维生素d ( v d 3 ) 的前体物质 4 0 , 2 4 。 嗜酸乳杆菌的生物学特性及其在发酵乳中的应用研究 但胆固醇在体内积累过多会影响人体健康。 1 4 2 血液胆固醇超标对人体的危害 近年来随着人们生活水平的提高和膳食结构的变化，胆固醇的摄入过 量已带来种种健康问题。胆固醇是非水溶性物质，它在血液中常结合在高 密度脂蛋白( h d l ) 及低密度脂蛋白( l d l ) 等上进行运转。正常成年人 血液中胆固醇的含量一般为2 8 2 5 9 5 r n m o l l 。 h d l 可摄取血液中肝外细胞释放的游离态胆固醇，在卵磷脂胆固醇脂 酰转移酶的催化下生成胆固醇酯，生成的胆固醇酯一部分可转移到极低密 度脂蛋白上。在这个过程中，i y d l 密度降低，转变为h d l 2 ，h d l 2 最终 在肝脏里面降解。由此可见，与l d l 把肝脏合成的胆固醇运向外周组织 相反，h d l 的主要功能是运载胆固醇离开细胞到肝脏，然后经肝脏转化 为其他物质，因此称之为胆固醇的逆向运转。h d l 的逆向运转可防止胆 固醇在血管壁的沉积，以维系血液中胆固醇的动态平衡。l 瞄床研究发现， 血液中h d l 的浓度与冠状动脉粥样硬化成负相关，h d l 被认为是抗动脉 硬化因子。 l d l 中的主要脂类是胆固醇和胆固醇酯。l d l 的代谢功能是把肝脏内 合成的内源性胆固醇运转到肝外细胞。l d l 超标意味着过多的胆固醇存 在于血液循环之中，血脂升高，这些“废物”进一步聚集在动脉壁上，造 成动脉粥样硬化。发生动脉硬化等最主要的危险因素就是l d l 胆固醇水 平的增加。 高脂血症( h y p e r l i p i d e m i a ) 又称高脂蛋白血症( h y p e r l i p o p r o t e i n e m i a ) ， 主要症状表现为血清总胆固醇( t c ) 、甘油三酯( t g ) 等含量过高。我国 高脂血症的诊断标准是：血清总胆固醇 5 7 m m o l l ，甘油三酯 1 7 m m o l l ， 高密度脂蛋白胆固醇 0 9 m m o l l 。血清胆固醇含量超标时，很容易导致高 脂血症的发生。另外，血液中的l d l 胆囿醇、乳糜微粒等过多，容易在 动脉壁上沉淀形成斑块，当斑块过多时，动脉管腔变窄，阻碍血液循环， 长期如此就发生以心脑组织缺氧为特征的冠心病、中风等病症。流行病学 和临床观察结果已经证实，血清中胆固醇含量过高是引起动脉硬化和冠心 病等最重要的危险因素之一。现在心脑血管疾病已成为导致人类死亡的第 一杀手，尤其在西方发达国家和城市中老年人口中。研究发现，降胆固醇 1 0 山东农业大学硕士学位论文 是对临床治疗心血管疾病的一种重要补充【】。人们已发现许多以乳酸菌发 酵的食品可以降低人体的血清胆固醇含量 8 3 , 8 5 , 7 0 】，因此，科研工作者越来 越关注降胆固醇益生菌的研究与开发。 1 4 3 乳酸菌降低胆固醇作用的机理 f 1 1 同化作用 体外研究表明，厌氧条件下某些乳酸菌在含胆盐的高胆固醇培养基里 生长时，菌体可以同化培养基中的胆固醇到自身的细胞中去f 6 ”。g i l l i l a n d 等( 1 9 8 5 ) 对分离自猪肠道的高效降胆固醇嗜酸乳杆菌p 4 7 进行了一系列 的研究。他们用p p l o ( p l e u r o p n e u m o n i a - l i k eo r g a n i s m ，类胸膜炎体) 血 清提出物作为培养基中胆固醇的来源，在含牛胆汁的高胆固醇培养基上对 p 4 7 进行培养实验，发现厌氧条件下随着牛胆汁浓度的增加，培养基内胆 固醇的残留量大大下降【6 1 4 8 1 。他们将原因归结为la c i d o p h i l u s 对胆固醇 的同化作用，即细菌把胆固醇吸收到自身的膜之中去了。g i l l i l a n d 将高胆 固醇培养基培养的乳酸菌细胞破碎后，用石油醚抽提细胞膜中的胆固醇， 发现细胞内胆固醇同空白对照( 生长在普通培养基中的菌体) 相比显著增 加h 6 1 。此后，不少研究人员重复了他们的实验，得出了相似的结论 1 0 6 1 ， 从而证实了菌体对胆固醇具有同化作用。 ( 2 ) 沉淀作用 f r a n d a m 等否定了乳酸菌的胆固醇同化作用，他们认为乳酸菌对胆 固醇的脱除是因为酸性条件下( p h 6 0 ) 乳酸菌的胆盐共轭活性增加，使 胆固醇与胆盐形成了沉淀，从而降低了培养基中胆固醇的含量【1 ”】。现在 人们普遍认为，乳酸菌产生的胆盐水解酶在厌氧条件催化结合态的胆盐分 解为解聚态胆盐和氨基酸，解聚态胆盐、胆固醇分子团和乳酸菌菌体细胞 一起沉淀，从而导致环境中胆固醇的降低1 7 7 “”。m o t t 等对仔猪进行了研 究，发现饲喂嗜酸乳杆菌的仔猪的血清胆固醇水平降低的同时粪便中类固 醇的含量升高 8 ”。大鼠等其他试验动物的研究也证实了乳酸菌促进胆固醇 沉淀和排除的观点 韶】。因此推测人体内也存在解聚态胆酸盐和胆固醇共同 沉淀的现象，这一作用将阻止胆固醇进入血液循环，避免了高血清胆固醇 的出现。 0 1 其它理论 嗜酸乳杆菌的生物学特性及其在发酵乳中的应用研究 乳酸菌降胆固醇的方式因菌株不同差异很大。嗜酸乳杆菌多表现为同 化作用，将胆固醇吸收到自身的细胞膜之中。而干酪乳杆菌、双歧杆菌多 破坏胆固醇分子团的稳定性，从而使之和脱去氨基酸残基的次级胆酸盐共 同沉淀1 30 ，“j 。随着研究的进一步深入，部分研究人员开始倾向于同化和共 沉淀两种方式共同作用脱除基质中的胆固醇，而且不同条件下表现出以同 化或以共沉淀为主的能力。张佳程等对l a c i d o p h i l u s 、s t h e m o p h i l u s 等乳 酸菌脱胆固醇的效果的实验也证明了这两种作用的存在 3 。利用小鼠模型 的实验结果表明，嗜酸乳杆菌和双歧杆菌可以影响胆固醇合成途径中的b 一 羟基b 甲基戊二酸单酰辅酶a ( h m g c o a ) 还原酶的活性，因而具有降低 血清胆固醇的功效【8 8 6 j 。研究结果说明乳酸菌降胆固醇的机制是复杂的， 或许还有其它作用方式存在，有待进一步的研究。 1 5 本研究的目的和意义 近年来，随着人们健康意识的逐步增强，含有益生菌( p r o b i o t i c ) 的 微生态制剂正作为一个新的领域被研究和开发。目前，含有益生菌的产品 市场十分活跃，品种越来越多，包括食品、胶囊、片剂、粉剂及口服液等 多种投放形式。然而，产品中益生菌的稳定性直接关系到产品能否发挥其 健康促进作用，也是检验产品质量的关键指标之一。同时，人体胃酸的 p h 值通常在3 左右，肠道中胆汁盐的含量一般为0 _ 3 o 5 ，许多微 生物无法忍受人体肠道中的不良环境，导致到达人体内并存活下来的益生 菌活菌数目很少，因此选择能够忍受胃肠环境并具有潜在健康作用的嗜酸 乳杆菌使其能以较高的活菌数到达宿主并定值下来，是保证充分发挥健康 促进作用的一个重要标准。 研究报道，许多种食品都可以作为嗜酸乳杆菌的载体，如糖果、果 冻等。然而，这些食品大都不能使嗜酸乳杆菌维持较高的活菌数以充分发 挥其益生作用。发酵乳营养丰富而全面是益生菌的最佳食物载体。随着人 们对嗜酸乳杆菌健康促进作用研究的不断深入，含有嗜酸乳杆菌的发酵乳 陆续问世，但嗜酸乳杆菌纯菌发酵存在着发酵时间比较长，而且嗜酸乳杆 菌含有乙醇脱氢酶能够将乙醛转化为乙醇，使产品酸涩，风味欠佳等诸多 缺点，因此混菌发酵制品日益引起人们的关注【埘。1 9 9 7 年张兰威等研 究了用嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、丁二酮乳链球菌混合 山东农业大学硕士学位论文 生产发酵乳。1 9 9 7 年刘慧等 18 j 对嗜酸乳杆菌与乳酪链球菌混合发酵制作 发酵乳进行了研究。1 9 9 9 年吕兵等【l 州以嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、保加 利亚乳杆菌等作为新型酸奶发酵剂，并制得了令人满意的发酵乳制品，但 菌种之间的配合性影响产品中的活菌存活率，特别是保加利亚乳杆菌的代 谢产物过氧化氢等可抑制嗜酸乳杆菌的生长 1 。 目前，国内的众多学者对嗜酸乳杆菌的生物学特性及其在发酵乳中的 应用等方面进行了一些探索，但缺乏系统性，并且菌株之间表现出明显的 差异性。本研究以本院动物性食品研究室保藏的嗜酸乳杆菌为对象，评价 其益生特性，并把嗜热链球菌与嗜酸乳杆菌混合培养，综合考虑其p h 值、 酸度及活菌数的变化情况，以初步探讨其微生态关系，同时优化出发酵乳 的最佳生产工艺。最后，以小白鼠为动物模型，进步验证嗜酸乳杆菌发 酵乳对血清胆固醇等的影响。从而为嗜酸乳杆菌在乳品中的应用及功能性 乳制品的开发寻找一条新途径，为该产品大规模生产提供参考依据。 嗜醢乳杆菌的生物学特性及其在发酵乳中的应用研究 2 材料与方法 2 1 材料 2 1 1 菌种 嗜酸乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u s ) ( 山东农业大学食品学院保藏) 嗜热链球菌( s t r e p t o c o c c u st h e r m o p h i l u s ) ( 山东农业大学食品学院保藏) 2 1 2 培养基 ( 1 ) n f m 培养基 称取1 1 9 脱, q r g l 溶解到1 0 0 m l 的蒸馏水中，自然p h 值，1 1 5 c ，灭 菌1 5 r a i n 。 f 2 ) 麦芽汁培养基( 2 0 0 0 m 1 ) 原麦芽汁2 0 0 0 m l 调整糖度9 0 b x ，煮沸15 2 0 m i n ，结束前5 分钟加 澄清剂( 瓜尔多胶) 4 0 p p m ，冷却到4 0 ，用滤纸过滤，滤液再定容至 2 0 0 0 m l 。固体培养基：上述麦芽汁+ o 5 酵母粉+ o 6 碳酸钙粉末十 1 8 琼脂，然后1 2 1 ，2 0 r a i n 灭菌；液体培养基：上述麦芽汁+ o 5 酵 母粉，同时分装o 6 的碳酸钙( 用时加入) ；然后1 2 1 ，2 0 r a i n 灭菌， 用于菌种保存和活化。 r 3 ) m r s 培养基 1 升蒸馏水中溶解1 5 9 琼脂( 加热溶解) ，再加入以下成分： 蛋白胨1 0 9肉膏1 0 9 酵母浸取物 5 9柠檬酸二铵 2g 乙酸钠 5 9葡萄糖 2 0 g 吐温8 01 m l磷酸氢二钾 2g m g s 0 4 7 b oo 8 5 9m n s 0 4 4 b o0 2 5 9 然后调p h 6 2 6 4 ，1 2 1 ，1 5 r a i n 灭菌。 ( 4 ) m r s - - 山梨醇培养基 用山梨醇代替m r s 培养基中的葡萄糖，其他同m r s 中的成分州。准 确称取1 l 培养基所需成分( 除山梨醇) ，溶解至8 0 0 m l 蒸馏水，调p h 至 6 2 0 2 ，1 2 1 ，灭菌1 5 m i n ，冷却至7 0 。0 左右，用微孔过滤装置加入 2 0 0 m l ，1 0 的t h 梨醇溶液，摇匀待用，用于嗜酸乳杆菌计数2 1 1 。 ( 5 ) m 1 7 培养基 山东农业大学硕 学位论文 琼脂 1 5 9植质蛋白胨 5 o g 酵母提取物 50 9 聚蛋白胨 5 0 9 抗坏皿酸 0 5 9 牛肉浸膏 2 5 9 d 一甘油磷酸二钠 1 9 91 0 m o l l m g s 0 4 7 h 2 0 1 0 m l 蒸馏水1 l ，调p h 7 1 ，1 2 1 灭菌1 5 m i n ，用于嗜热链球菌计数。 2 1 3 原料乳由泰安市岱岳区牧场提供 2 1 4 实验动物 清洁级昆明种小白鼠4 0 只( 雄性) ，体重3 3 3 5 9 ( 8 周龄) ，购于泰 安米歇尔生物有限公司。 2 1 5 高脂饲料 猪油8 ，胆固醇1 ，牛胆盐0 5 ，普通饲料9 0 5 。普通饲料和 高脂饲料均有泰安米歇尔生物有限公司提供。 2 1 6 主要试剂与仪器设备 ( 1 ) 主要试剂与药品： o - 4 溴甲酚绿分析纯 d 山梨醇生化试剂 胆固醇生化试剂 牛胆酸盐b r 邻苯三酚b r 甲醇b r 邻苯二甲醛a r 茚三酮a r 异亮氨酸 a r 其他：酚酞指示剂食盐浓硫酸磷酸缓冲液o 1 m o l l n a o h 溶液 ( 2 ) 主要仪器与设备： 高压灭菌锅山东新华医疗器械股份有限公司 5 0 0 型立鹤牌电热恒温培养箱山东潍坊医药集团医疗器械厂 d h g 一9 0 7 0 a 型电热恒温鼓风干燥箱上海益恒实验仪器有限公司 康宝牌净化工作台济南空气净化消毒设备厂 d k 一$ 2 8 型电热恒温水浴锅上海精宏试验设备有限公司 嗜酸乳杆菌的生物学特性及其在发酵乳中的应用研究 m p l 2 0 型p h 计 限公司 电子分析天平( o 0 0 0 1 ) l x j 1 1b 型低速大容量多管离心机 u v - 2 1 0 0 型紫外可见分光光度计 d v - i 物性流变仪 其他仪器与设备：冰箱移液枪 2 2 实验方法 梅特勒一托利多仪器( 上海) 有 上海天平仪器厂 上海安亭科学仪器厂 尤尼柯( a z 海) 有限公司 b r 0 0 k f i e l d 电热炉碱式滴定管显微镜 2 2 1 滴定酸度的测定 用浓度为o 1 m o l l 的n a o h 标准溶液滴定酸度( o t ) ( 酚酞作指示剂) 。 2 2 2 活菌计数用倾注平板计数法计数 2 2 - 3 不同低p h 值下嘈酸乳杆菌的存活能力 将m r s 液体培养基分别调p h 值至1 ，5 、2 5 、3 5 、4 5 和5 5 ，然后 分装于1 0 0 m l 的小三角瓶中，做3 个重复。接种已活化好的嗜酸乳杆菌 ( 5 ) ，3 7 恒温培养，在o h ，2 h ，4 h ，6 h 做平板计数，于3 7 恒温培 养箱中培养4 8 h 3 6 1 ，观察其菌落数。 2 2 4 耐渗透压能力的测定 在m r s 液体培养基中加入n a c i ，使其质量分数分别为3 ，4 ，5 ， 6 ，7 ，8 ，分装于试管中，每管1 0 m l ，做三个重复，以质量分数为 0 4 的溴钾酚绿为指示剂。接种已活化好的嗜酸乳杆菌( 3 ) ，3 7 恒温 培养4 8 h ，观察其颜色变化。 2 2 5 耐胆酸盐能力的测定 在m r s 琼脂培养基内加入牛胆酸盐，使其质量分数