（森林培育专业论文）喜树愈伤组织和叶片中喜树碱含量变化研究.pdf

摘要 喜树( c a m p t o t h e c aa c u m i n a t ad e c n e ) 是我国南方特有树种，它所含的喜树碱 ( c a m p t o t h e c i n ，c p d 是一种具有显著抗癌活性的生物碱，也是迄今为止发现的唯一 种拓扑异构酶i ( t o p o i s o m e r a s ei ，t o p oi ) 抑制剂，被誉为2 1 世纪人类首选的3 大抗癌药物之一。本试验探讨了诱导喜树愈伤组织的最佳培养基，以及外植体类型和 取材季节对愈伤组织诱导的影响，并采用高效液相色谱法( h p l c ) 对c p t 的提取方 法、不同处理条件下愈伤组织中c p t 的含量变化，以及叶片中c p t 含量的季节变化 进行研究，结果如下： 1 本试验的最佳色谱条件为：以乙腈水( v v = 3 0 7 0 ) 为流动相，流速1 0m l m i n ， 柱温2 5 。c ，进样量2 0ul ，检测波长2 5 4b i n 。在该色谱条件下喜树碱的保留时间适中， 约为6 3m i n ，峰形良好。 2 提取c p t 的最佳方法为9 5 乙醇索氏回流提取，样品不经任何处理，测得 提取液中c p t 含量极显著的高于9 5 乙醇超声提取和0 3 n a o h 溶液碱法提取。 3 以嫩叶和带芽茎段为外植体，在m s + n a a l 0m g l + i b a l 0m g l + k t 0 1m g l 培养基上，愈伤组织的诱导率高，3 0d 时统计可达9 0 0 以上，愈伤组织质地好、生 长迅速；以嫩叶为外植体诱导的愈伤组织，在m s + n a a 0 0 5r a g l + 6 b a 0 2 5 m g l + k t 0 5m g l 培养基上不能分化出不定芽，而以茎段为外植体诱导的愈伤组织， 在m s + n a a 0 0 5m g l + 6 一b a 0 2 5m g l + k t 0 5m g l 培养基上诱导分化不定芽，3 0d 后统计芽分化系数可达4 2 。 4 s h 基本培养基较1 2 m s 、m s 、b 5 和w h i t e4 种基本培养基更有利于愈伤组 织中喜树碱的积累。在s h 基本培养基上，以嫩叶为外植体诱导的愈伤组织的c p t 含量最高，可达o 0 3 8 2 ，显著高于以茎段和叶柄为外植体诱导的愈伤组织。 5 最佳取材季节为7 月，在s h _ 咐a a l 0m g l + i b a l 0m g l + k t 0 1m g l 培养 基上，愈伤组织中c p t 含量可高达0 0 4 1 2 ，愈伤组织诱导率也较高，为8 2 2 ， 外植体污染率为1 8 5 。 6 n a a 和i b a 对c p t 的积累有显著影响，最佳处理浓度均为3 0m g l ，在此 浓度下处理1 0d 后，愈伤组织的c p t 含量分别高出对照( c k ) 2 5 7 和1 1 4 ，愈 伤组织的存活率均能达到9 0 以上。 本研究为四川省科技厅攻关项目“喜树的组织培养和喜树碱的提取研究”的部分内容 7 经秋水仙碱处理后愈伤组织的存活率和c p t 含量均会迅速下降；经2 0m g l 的8 羟基喹啉处理1 0d ，愈伤组织中c p t 含量能高出c k5 1 4 ，愈伤组织存活率 也能达到9 0 以上。 8 叶片中c p t 含量分别在6 月和9 月出现峰值，6 月含量为全年最高，嫩叶可 达1 9 4 1 ，成熟叶可达1 3 2 5 。所有月份中嫩叶的c p t 含量均极显著的高于同 期的成熟叶。 9 从最佳采叶时间来看，4 月份以5 日龄内的叶片的c p t 含量最高，可达1 1 1 4 以上；7 月份以3 日龄内的叶片的c p t 含量最高，可达1 9 6 0g o 以上；而1 0 月份 则以7 日龄内的叶片的c p t 含量最高，可达0 9 5 0 以上。相同叶龄叶片的c p t 含 量，7 月极显著的高于4 月，4 月( 除7 日龄叶外) 极显著的高于1 0 月。 以上结果表明，以7 月的嫩叶为外植体，选择在添加3 0m g ln a a 的s h 培养 基上诱导愈伤组织，或经2 0m g l 的8 羟基喹啉处理愈伤组织，均能极显著的提高愈 伤组织中的c p t 含量。从喜树的整个生长季节来看，叶片采收的最佳季节为6 月， 此时新叶葫发迅速，c p t 含量为全年最高，新叶展开后1 3d 为叶片采收的最佳时 间，叶片中c p t 含量最高，3d 后喜树碱含量会迅速降低。 关键词：喜树愈伤组织喜树碱薄层层析高效液相色谱 t h ec h a n g e so fc a m p t o t h e c i nc o n t e n t si nc a l l u sa n dl e a v e so f c a m p t o t h e c a a c u m i n a t ad e c n e g u o y o n g d i r e c t e db yp r o f s h id a x i n g a s s o c i a t ep r o f l i ng u i y u n ( c o l l e g eo f f o r e s t r ya n dh o r t i c u l t u r e ，s i c h u a n a g r i c u l t u r a lu n i v e r s i t y ，y a a n ，s i c h u a n ，c h i n a ，6 2 5 0 1 4 ) a b s t r a c t c a m p t o t h e c aa c u m i n a t ad e c n e w a sap e c u l i a ra n t i c a n c e rp l a n tn a t i v ei ns o u t hc h i n a i tc o u l dp r o d u c ec p t ( c a m p t o t h e c i n ) ，am o n o t e r p e n o i di n d o l ea l k a l o i d ，w h i c hw a sk n o w n f o ri t sr e m a r k a b l ei n h i b i t o r ya c t i v i t ya g a i n s tt u l n o u rc e l l s i tw a st h eo n l yo n ei n h i b i t o r f o u n du pu n t i ln o wt oi n h i b i tt o p oi ( t o p o i s o m e r a s ei ) ，a n dw a s p r a i s e da so n eo ft h e3 a n t i c a n c e rd r u g so fm a n k i n df i r s t - s e l e c t e di n2 1 s tc e n t u r y n l ee f f e c t so fv a r i o u sb a s i c c u l t u r em e d i u m s ，e x p l a n tt y p e sa n ds a m p l i n gs e a s o n so nt h ep e r c e n t a g eo fc a l l u si n d u c t i o n w a sd i s c u s s e di nt h i sp a p e r , a n ds t u d i e do nt h ec h a n g e so fc p tc o n t e n ti nc a l l u sa n dl e a v e s b yh p l c ，t h er e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： 1 t h ec o n t e n to fc p tw a sd e t e r m i n e db yh p l co n ao d s c l sc o l u m nw i t ham o b i l e p h a s ec o n s i s t e do fa c e t o n i t r i l e w a t e r ( 3 0 ：7 0 ) a taf l o wr a t eo f1 0m l m i n ，b yt h ed e t e c t i v e w a v e l e n g t h2 5 4m a n dt h ed e t e c t i v et e m p e r a t u r e2 5 c u n d e rt h e s ec h r o m a t o g r a p h i c c o n d i t i o n s ，r e t e n t i o nt i m eo fc p tw a sa b o u t6 3m i n u t e s ，a n dt h es h a p eo f c h r o m a t o g r a p h i cp e a ko fc p tw a sv e r yw e l l 2 a m o n gt h e s et h r e ee x t r a c t i o nt e c h n o l o g y , s o x h l e te x 廿a c t i o nt e c h n o l o g yw a st h e b e s to n eb yw h i c ht h ec o n t e n to fc p tw a sr e m a r k a b l yh i g h e rt h a nt h a to fs u p e r s o n i c e x t r a c t i o nt e c h n o l o g ya n dn a o hs o l u t i o ne x t r a c t i o nt e c h n o l o g y 3 w i t ht h ei n d u c t i o nc u l t u e rm e d i u mo fm s + n a a l 0m g l + i b a l 0m g l + k t o 1 m g l ，c h o o s i n gt h et e n d e rl e a fo rs t e ma st h ee x p l a n t ，t h ep e r c e n t a g eo fc a l l u si n d u c t i o n c o u l dr e a c he v e nm o r et h a n9 0 0 t h ec a l l u sh a v eg o o dq u a l i t ya n dg r o w i n gr a p i d l y b u t o n l yt h o s ec a l l u sw h i c hi n d u c t e db ys t e mc o u l di n d u c eb u d w i t ht h ec u l t u e rm e d i u mo f m s + n a a 0 0 5r a g l + 6 一b a 0 。2 5m g l + k t 0 5m c l ，t h ec o e f f i c i e n to fb u ds p l i tc o u l d r e a c h u p t 0 4 2 4 c o m p a r e dw i t h1 2 m s ，m s ，b 5a n dw h i t ea sb a s i cc u l t u r em e d i u m ，c h o o s i n gt h e t e n d e rl e a fa se x p l a n tt oi n d u c t i o nc a l l u sw i t hs ha sb a s i cc u l t u r em e d i u m ，t h ec o n t e n to f c p ti nc a l l u sw a st h eh i g h e s t w i t c hc o u l d r e a c h0 0 3 8 2 o 5 ，w m lt h ec u l t u r em e d i u mo fs h + n a a l o m g l + i b a i 0m g l + k t o 1 m e j l ，c h o o s i n gt h et e n d e rl e a fa se x p l a n tt oi n d u c t i o nc a l l u s ，t h eb e s ts a m p l i n gs e a s o nw a s i nj u l y d u r i n gt h i st i m e ，t h ep e r c e n t a g eo fc a l l u si n d u c t i o nc o u l dr e a c h8 2 2 ，t h ec o n t e n t o f c p t i nc a l l u sc o u l d r e a c h 0 0 4 1 2 a n d t h e p o l l u t i n gr a t e o f e x p l a n t w a s l 8 5 6 t h eb e s tc o n c e n t r a f i o no fn a aa n di b at oi n f l u e n c et h ec o n t e n to fc p ti nc a l l u s i n d u c t i o nb yt e n d e rl e a fw a s3 0m g l ，1 0dl a t e ru n d e rt h et r a t m e n t 诵t 1 1n a aa n di b a ， t h ec o n t e n to fc p ti nc a l l u sr e s p e c t i v e l yg o t2 5 7 a n d11 4 h i g h e rt h a nc k ( c o n t r a s t ) 7 b o t hs u r v i v a lr a t eo fc a l l u sa n dc o n t e n to fc p ti nc a l l u sg o td o w nr a p i d l ya f t e r b e i n gd e a l tw i t h10 db yv a r i o u sc o n c e n t r a t i o no fc o l c h i c i n e s b u ta n o t h e rr e s u l ts h o w e d t h a tt h ec o n t e n to fc p ti nc a l l u sw a sh i g h e rt h a nc k ( c o n t r a s t ) a f t e rb e i n gd e a l tw i t h10 d b yv a r i o u sc o n c e n t r a t i o no f8 - h y d r o x yq u i n o l i n e ，t h eb e s tc o n c e n t r a t i o no f8 - h y c k o x y q u i n o l i n ew a s2 0m g 几u n d e rt h i sc o n c e n t r a t i o n ，t h ec o n t e n to fc p t i nc a l l u sg o t51 4 h i g h e rt h a nc k ( c o n t r a s t ) a n dt h es u r v i v a lr a t eo f c a l l u sc o u l d r e a c h9 0 8 t h e r ew e r et w op e a k so fc p tc o n t e n tb o t hi nt e n d e rl e a fa n do l d e rl e a fa r o u n dt h e y e a r ，i nj u n ea n ds e p t e m b e r t h ec o n t e n to f c p ti nj u n ew a st h eh i 曲e s ta r o u n dt h ey e a r i n t h i sm o n t h ，t h ec o n t e n to fc p ti nt e n d e rl o a fc o u l d r e a c h1 9 4l ，a n dt h ec o n t e n to fc p t i no l d e rl e a fc o u l dr e a c h1 3 2 5 oc o r r e s p o n d i n g l y i na l lm o n t h s t h ec o n t e n to fc p ti n t e n d e rl e a f w a se x t r e m e l yr e m a r k a b l eh i g h e rt h a nt h a ti no l d e rl e a f 9 i na p r i l ，t h ea g eo fl e a fw i t h i n5dh a st h eh i g h e s tc o n t e n to fc p t ，i tc o u l dr e a c h a b o v e1 1 1 4 o i nj u l y , t h ea g eo f l e a f w i t h i n3dh a st h eh i g h e s tc o n t e n to f c p t , i tc o u l d r e a c ha b o v e1 9 6 0 o i no c t o b e r , t h ea g eo fl e a fw i t h i n7 dh a st h eh i g h e s tc o n t e n to fc p t i tc o u l dr e a c ha b o v e0 9 5 0 o a tt h es a m ea g e s t h ec o n t e n to fc p ti nl o a fi nj u n ew a s e x t r e m e l yr e m a r k a b l eh i g h e rt h a ni na p r i la n di no c t o b e r t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a tc h o o s i n gt h et e n d e rl e a fi nj u l ya se x p l a n t ，a n du s i n gs ha s b a s i cc u l t u r em e d i u mw i t h3 0m g ln a ao rd e a l i n gt h ec a l l u sw i m8 - h y d r o x yq u i n o l i n e b yt h ec o n c e n t r a t i o no f2 0m g lw e r ea b l et or e m a r k a b l yi n c r e a s et h ec o n t e n to fc p ti n c a l l u si ti so b s e r v e df r o mi t sg r o w t ha n dd e v e l o p m e n ts e a s o n s t h eb e s tc o l l e c t i n gs e a s o n o fl e a fw a si nj u n e a tt h i st i m et h el e a v e sg r o wr a p i d l ya n dt h ec o n t e n to fc p tc o m et o t h eh i 曲e s ta r o u n dt h ey e a r k e yw o r d s ：c a m p t o t h e c aa c u m i n a t ad e c n e c a l l u sc a m p t o t h e c i n t l ch p l c 论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个 人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机 构的学位或证书所使用过的材料。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名 饵，真 2 。童年6 只2 9 b 关于论文使用授权的声明 本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有 关部门或机构送交论文的复印件和电子皈，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学 位论文的全部或部分内容。 研究生签名：，啕。 a p 导师签名 天，芎 上。f 年多月劣日 cf 每乡r 韬日 ，廷 必 1 前言 植物是药物的重要来源，我国野生药用植物种质资源十分丰富，据统计约有8 0 0 0 余种。我们利用药用植物的历史也渊远流长，山海经记载了我国早在三千七百 多年前的商周时期甚至更早的初民时期就开始利用中草药。我国中草药植物的栽培史 也有两千多年【2 】。自上世纪8 0 年代以来，受“回归大自然”思潮的影响，天然药用 植物资源的开发和利用受到世界各国的广泛关注，药用植物除用作药材和制药原料 外，还广泛应用于食品、饮料、保健品、调味剂、香料、化妆品、天然杀虫剂等诸多 领域。近年来，随着我国生态环境建设和退耕还林还草工程的实施，许多药用植物还 被赋予改善生态环境、调节山区农业产业结构、增加农民收入的新使命，集生态、经 济和社会效益于一身。 喜树是我国特有植物，广泛分布于长江以南各地区。自1 9 6 6 年美国的m o n r o e e w a l l 率先从喜树皮中分离出喜树碱并证实这种生物碱具有显著的抗癌活性以来，掀 起了喜树和喜树碱研究与开发的高潮，使喜树成为继红豆杉之后又一重要的木本抗癌 药用植物而备受世人关注【】。然而长期以来我们都是以采集和消耗大量资源为代价 获取喜树碱，当采集和消耗量超过资源的再生能力时，必然会导致物种的濒危甚至灭 绝。喜树分布地区自然条件优越，长期以来的毁林开田使得喜树野生资源急剧减少， 分布区域破碎化严重，目前仅在云南西双版纳、四川i 农业大学都江堰分校试验林场、 广东怀集县等处尚存总数不超过4 0 0 株的野生喜树。国家林业局己将喜树列为重点保 护植物，限制出口 7 1 。 我国现有的喜树资源多为上世纪6 0 到8 0 年代绿化造林、消灭易林荒山时期作为 速生绿化树种栽种，资源分散、管理粗放1 8 ，随着人们对喜树碱抗癌药物需求量的增 加，迫切需要扩大药源，并探索新的喜树碱生产途径，以减轻对自然资源和环境的破 坏。组织培养被认为是一种理想的途径，通过组织培养，一方面可培育并快速繁殖大 量基因型一致的优质种苗，满足人工栽培高产原料林的需求，同时营造速生喜树林也 可改善南方人工林区由于造林树种单一、针叶化现象严重而造成的地力严重衰退、生 态环境恶化等问题，维持林业的可持续发展；另一方面，通过愈伤组织或悬浮细胞的 大量培养直接提取喜树碱，是喜树碱工业化生产的一个新方向，不仅可满足长期稳定 的工业化生产，还能减少对喜树资源的过度开发和破坏，保护南方广大喜树分布区的 生态环境。 本文在吸取前人研究成果的基础上，就喜树愈伤组织的诱导，不同处理条件下愈 伤组织中喜树碱含量变化，以及叶片中喜树碱含量的季节变化进行研究，以期为当前 和今后喜树碱的工业化生产提供理论和实践方面的依据。 2 文献综述 2 1 喜树的形态特征及生物学特性 喜树( c a m p t o t h e c a a c u m i n a t ad e c n e ) 又叫早莲木、千丈树，为山茉萸目( c o m a l e 5 ) 珙桐科( 蓝果树科) ( n y s s a c e a e ) 喜树属( c a m p t o t h e c a d e c n e ) 植物，是我国南方特有 树种，产于江苏南部、浙江、福建、江西、湖北、湖南、四川、贵州、广东、广西、 云南等省区。 喜树为多年生亚热带落叶阔叶乔木，高可达2 0m ，树皮灰色或浅灰色，纵裂成 浅沟状。当年生枝紫绿色，有灰色微柔毛，多年生枝淡褐色或浅灰色，无毛，有稀疏 圆形或卵形皮孔；冬芽腋生，锥状，有4 对卵形鳞片，外被短柔毛。单叶互生，纸质， 矩圆状卵形或矩圆状椭圆形，长1 2 2 8 ，宽6 1 2f i l l ，顶端短锐尖，基部近圆形， 全缘，叶面幼时脉上有短柔毛，其后无毛；叶背疏生短柔毛，中脉微凹，侧脉1 1 1 5 对。头状花絮近球形，直径1 5 2 锄，常由2 9 个头状花序组成圆锥花序，顶 生或腋生，通常上部为雌花絮，下部为雄花絮。花杂性同株，花萼杯状5 浅裂，花瓣 5 ，雄蕊l o ，子房1 室；球形头状果序，坚果香蕉形，有狭翅。 喜树于3 月下旬开始抽梢，7 8 月为盛期，9 月中下旬高生长基本停止：径生长 以7 月上旬至8 月最快，1 0 月中旬基本停止。喜树生长速度快，速生期早，3 1 0a 为树高生长速生阶段，年生长量可达1 0 1 8m 。喜树一般5 7a 开始开花结果，花 期为5 月中下旬至8 月初，6 月下旬至7 月上旬开始结果，1 0 月下旬到1 1 月初果实 成熟。 喜树喜温暖湿润气候，年平均气温在1 4 1 8 、年降水量在1 0 0 0 m m 以上且时 间分布较为均匀、一月份平均气温不低于2 、相对湿度在8 0 以上的地区为其适 生范围。不耐低温，在0 以下常使幼树枯梢。喜光，深根性，喜土层深厚、疏松、 肥沃、湿润的土壤，对土壤酸碱度要求不高，在酸性、中性、微碱性土壤中均能正常 生长，但以p h6 o 6 5 最好。耐水湿，在地下水位较高的平坝、河边、小溪边和田 埂上均生长良好；常生于海拔1 0 0 0m 以下林缘或溪边2 1 。 2 2 喜树资源的利用 喜树叶中含有丰富的营养元素，干叶含氮2 6 2 、磷0 5 1 、钾2 5 6 ，每5 0 0 k g 干叶的肥分相当于磷酸铵6 5 5 坞、过磷酸钙1 2 7 5 蚝、硫酸钾2 5 5k g ，因此喜树 叶是较好的绿肥。在湖南岳阳，自5 0 年代起当地农民就用喜树叶做承稻的秧苗绿肥， 水稻产量明显提高，并且少有病虫害发生。 喜树树干端直高大、枝叶繁茂、树形美观、生长迅速，兼可入药，无论作为生态 林、风景林、药用林、肥料林栽培，都是可行的：喜树材质轻软柔韧，容易干燥，切 面光滑，花纹较美观，大多作为包装、造纸、胶合板等的工业原料，但不耐腐、易开 裂反翘1 1 2 ；喜树叶对有害气体诸如二氧化硫、氟化氢、氮氧化物等具有较强的抗性， 也是大气污染严重地区的优良造林树种 1 3 】。喜树果实中含脂肪油，出油率1 6 ，可 供工业用【1 2 】。 喜树味辛、苦，自古以来就是我国一些地区重要的药材，全株均可入药，用于治 疗恶性疗毒、肿瘤等，具有很好的治疗效果。如江西中草药学记载将喜树嫩叶加 少许食盐，捣烂，外敷，可治疗疖肿、疮痛初起；浙江民间常用草药也有用喜树 皮或树枝治疗牛皮癣的记载f 8 】。近年来从喜树中提取得到的喜树碱及其衍生物更是作 为一种高效抗癌药物风靡全世界。 2 3 喜树碱研究概况 2 3 1 喜树碱的结构及性质 2 0 ho 图1 喜树碱结构图 f i g 1 t h ec h a r to f c p ts t r u c t u r e 喜树碱( c 锄p t a t h e c i n ，c p t ) ，按含氮母核类型划分，属于喹啉类生物碱14 1 ，是 喜树体内化学成分十分复杂但具有较强生物活性的一类含氮有机化合物，化学名为 3 ( s ) 一4 - 乙基一4 - 羟基一1 h 一吡喃 37 ，47 ，6 ，7 氮茚 1 ，2 - b - 喹啉一3 ，1 4 一( 4 h ，1 2 h ) 二酮，分子量 3 4 8 11 1 ，分子式c 2 0 h 1 6 n 2 0 4 ，其化学结构式见图1 ，成一平面五环结构，仅有一个不 对称中心c 2 0 ，其构型为s 型【8 l 。 喜树碱的熔点为2 6 4 2 6 6 ，微具吸湿性，对光、热敏感易分解。此外，喜树 碱还具有一些不同于普通生物碱的化学性质：( 1 ) 喜树碱不溶于水，也难溶于普通的 有机溶剂，如甲醇、氯仿、乙酸乙酯等，可溶于毗啶、二甲基亚砜、醋酸和氯仿与甲 醇的混合液，溶液在紫外光下有明显的蓝色荧光；( 2 ) 生物碱分子结构中都有氮原子， 通常具有碱性【1 4 , 1 6 1 ，喜树碱却近于中性，不与各种酸形成结晶性盐；( 3 ) 喜树碱e 环的一羟基内脂结构在室温下能被氢氧化钠打开( 见图2 ) ，生成水溶性的钠盐，酸 化后又重新生成喜树碱；( 4 ) 喜树碱对常用的生物碱检测试剂，如碘化铋钾 ( d r a g e n d o r f f ) 、碘化汞钾( m a y e r ) 、碘- 碘化钾( w a g n e r ) 、苯酚( 三氯化铁) 等试 剂，均呈负反应 8 , 1 6 , 1 7 】。 图2 喜树碱与氢氧化钠反应式 f i g 2 t h ec h e m i c a lr e a c t i o nw i n t h i nc p ta n dn a o hs o l u t i o n 2 3 2 喜树碱在植物中的分布 喜树全株均含喜树碱，过去一直认为果实中含量最高，次为根皮、根、树皮，树 枝含量较低。近年来的研究表明：嫩叶为富含喜树碱的器官，含量高达2 0 o ，是种 子含量的1 5 倍、根皮的2 5 倍，为整个植株地上部分平均含量( 0 4 4 o ) 的4 5 倍， 但随着叶片逐步成熟，喜树碱含量会急剧下降1 8 , 1 9 。m e y e r 通过研究发现，喜树各器 官的喜树碱含量由高到低依次为：枝顶端的l 3 位叶、种子、根皮、4 6 位叶与茎 尖、枝皮、茎皮、木质部【2 0 l 。 喜树树龄不同，各器官的喜树碱含量也有差异。l i u 等1 1 8 l 研究发现，随着树龄的 增大叶片的喜树碱含量迅速下降，2 年生喜树叶片中喜树碱含量是3 年生喜树叶片含 量的2 倍，是4 年生叶的1 6 倍；4 年生以前的幼树，枝龄与喜树碱含量呈负相关，4 年生以后，不同年龄的枝条喜树碱含量差别不大。 4 国外学者还在铁青树科( 青皮木科，o l a c a e a e ) 南柴龙树属的马比木( m a p p i 口 f o e t i d a m i e r s ) 、茜草科( r u b i a c e a e ) 蛇根草属的硬毛蛇根草( o p h i o r r h i z a m u n g o s l ) 、 夹竹桃科( a p o c y n a c e a e ) 狗牙花属的海木狗牙花( e r v a t a m i ah e y n e a n at c o o k c ) 中 发现了喜树碱的存在 2 1 0 2 ；张宪德等【2 3 】也在我国分布的茶茱萸科( i c a c i n a c e a e ) 假柴 龙树属( n o t h a p o d y t e s ) 的多种植物，包括厚叶假柴龙树( n o t h a p o d y t e sc o l l i n ac y w u ) 、 海桐假柴龙树( n o t h a p o d y t e sp i t t o s p o r o i d e s ( o l i v ) s l e u m e r ) 、海南假柴龙树 ( n o t h a p o d y t e so b t u s i f o l a ( m e r r ) h o w a r d ) 、毛假柴龙树( n o t h a p o a y t e st o m e n t o s a c y w u ) 、薄叶假柴龙树( n o t h a p o d y l e so b s c u r ac y w u ) 中发现了喜树碱的存在。但目 前尚未有报道显示这些植物中的喜树碱含量超过了喜树，喜树仍是当前人类获取喜树 碱的主要植物。 2 3 3 喜树碱类药物的研究进展 1 9 5 4 年美国的m o n r o ee w a l l 等人进行抗癌药物研究时，发现喜树的乙醇提取 物对小鼠肺癌7 5 5 ( a d 7 5 5 ) 有定的掷制作用，随后进行的，j 、鼠l 1 2 1 0 自血病生命 延长率测定，喜树提取物仍表现出极高的生理活性。在此基础上，1 9 6 6 年，他们从 喜树皮中分离出了喜树碱，经肿瘤试验证明这种色氨酸萜烯类生物碱对动物肿瘤及 白血病有明显的抑制作用，经临床试验也证明其对胃肠道腺癌、绒毛膜上皮癌、圆柱 形腺癌及急慢性粒白血病、膀胱癌等多种恶性肿瘤有较好的近期疗效 2 4 , 2 5 1 。但由于喜 树碱自身的毒性大，能引起骨髓抑制、呕吐、腹泻、严重出血等副作用，以及制成水 溶性的钠盐后抗癌活性降低等原因，使喜树碱的研究工作一度陷于停顿 2 0 , 2 6 , 2 7 】。 1 9 8 5 年，yh h s i a n g 发现喜树碱的作用靶是拓扑异构酶i ( t o p o i s o m e r a s ei ， t o p oi ) 而不是拓扑异构酶i i ( t o p o i s o m e r a s ei i ，t o p oi i ) ，它能阻断t o p oi 的合成， 是t o p oi 的专属性抑制剂。这也是迄今为止发现的唯一一种专门通过抑制t o p oi 发 挥细胞毒性的天然植物活性成分 2 8 , 2 9 。由此揭示了喜树碱独特的抗癌机理【2 趴，这一发 现立刻掀起了喜树与喜树碱研究的新高潮。 进入9 0 年代，美国、日本、加拿大和英国等国家继续投入大量人力、物力，希 望能找到一种既能保持喜树碱原有的高抗癌活性，又能提高溶解度、减少毒副反应的 抗癌新药。他们通过对喜树碱进行结构修饰”3 0 , 3 1 l ，化学合成或以喜树碱为原料进行 人工半合成 5 , 1 5 , 3 2 ，迄今已得到数百种衍生物，经临床试验证明抗癌活性较高的主要 有两大类：一类是以伊立替康( i r i n o t e c a n ，c p t - 1 1 ) 和拓扑替康( t o p o t e c a n ，t p t ) 为代表的水溶性衍生物；另一类是以9 - 硝基喜树碱( r u b i t e c a n ，9 - n c ) 和9 - 氨基喜树碱 ( 9 - a m i n o c a r n p t o t h e c i n ，9 - a c ) 为代表的水不溶性衍生物 5 , 3 2 - 3 4 】。结构式见图3 6 。 h 臼 l i 1 0 il 图3 伊立替康结构图 f i g3 t h ec h a r to f c p t - 1 1s t r u c t u r e c h i i n 、c o 一 1 6 火一0 静rr 2 】谁 丑 图4 拓扑替康结构图 f i g 4 t h ec h a r to f t p ts t r u c t u r e n 0 2 o ho 图59 - 硝基喜树碱结构图 f i g5 t h ec h a r to f 9 - n cs t r u c t u r e 6 2 o ho 图69 - 氨基喜树碱结构图 f i g 6 t h ec h a ao f 9 - a cs t r u c t u r e o h0 2 2 图71 0 羟基喜树碱结构图 f i g 7 t h ec h a r to f h c p ts t r u c t u r e 1 9 9 5 年，美国临床肿瘤会( a s c o ) 将c p t - 1 1 、t p t 、9 - a c 等列为有临床应用 前途的抗癌药物。其中由日本y a k u l t h o n s h a 公司开发的c p t - 1 1 和由美国史克公司开 发的t p t 于1 9 9 6 年获得美国食品和药品管理局( f d a ) 批准，用于结肠癌、肺癌、直 肠癌及卵巢癌的临床治疗，另外由美国斯特林癌症基金会( s t e h l i nf o u n d a t i o nf o r c a n c e r r e s e a r c h ) 独家经营的9 - n c ，r t i 开发的9 - a c 和g l a x o ，i n c 公司开发的g g 一2 1 1 等已进入i i 期临床试验，近期可望获得f d a 批准应用于临床治疗癌症 5 , 8 , 3 4 , 3 5 1 。 我国在上世纪6 0 7 0 年代曾对许多种类的中草药进行过筛选，于7 0 年代成立了 全国喜树研究协作组，在对喜树中的活性成分进行全面研究时，发现l o 羟基喜树碱 ( 1 0 h y d r o x y c a m p o t o t h e c i n c ，h c p t ) ( 见图7 ) 对多种恶性肿瘤有效，经小鼠静脉注 射试验表明，随着注射时间的延长，血液中h c p t 的浓度在几十分钟内会很快降低， 但在癌细胞中浓度分布却能2 4h 保持稳定水平，表现出很高的抗癌活性和低毒性。 7 由于h c p t 在喜树中含量极少，朱关平p 6 1 还成功地采用无毒黄曲霉菌株t - 4 1 9 ，将毒 副作用较大、喜树体内含量较高的喜树碱转化为h c p t ，转化率达5 0 ，这也是解 决喜树碱毒性的种有效途径，同时也扩大了生产h c p t 的药源。h c p t 现已成为我 国的常用抗癌药，应用于消化道肿瘤、肺癌、生殖系统肿瘤和白血病等的临床治疗， 发挥了较大的社会和经济效益 4 , 1 5 , 2 0 , 3 7 - 3 8 。美国、日本、欧洲都在广泛开展对该药的 研究，c p t - 1 1 和t p t 从结构上看就是h c p t 的同型物。 喜树碱类抗癌药物与紫杉醇、维生素甲类抗癌化合物一起被誉b - 十一世纪人类 首选的三大抗癌药物，发展前景广阔。到目前为止，全世界共有几十家科研机构和制 药公司从事喜树碱类药物的研发，以期获得水溶性更好、抗癌活性更高和毒副作用更 小的新型抗癌药物，满足人类对喜树碱类药物日益增长的需求。 2 3 4 喜树碱的抗癌机理 最初的研究表明，喜树碱是细胞周期特异性药物，主要作用于s 期细胞，对细胞 中r n a 和d n a 的合成有抑制作用，其中对r n a 合成的抑制可逆，但对d n a 合成 的抑制只是部分可逆，因此可使肿瘤细胞中的d n a 降解。此后美国生物化学家 h o r w i t z 揭示了喜树碱及其衍生物的抗癌活性源于其对癌细胞d n a 复制过程中酶的 抑制。 1 9 8 5 年，y h h s i a n g 进一步发现喜树碱的抗癌机理并不象大多数抗癌维生素那 样抑制t o p oi i ，而是通过抑制t o p oi 发挥其作用，由此揭示了喜树碱独特的抗癌 机理。 d n a 拓扑异构酶是调节d n a 空间构型动态变化的关键性核酶。调节d n a 空间 结构的拓扑异构酶有两种，即t o p oi 和t o p o l l 。试验表明，虽然t o p oi 对细胞存活 并非必不可少，但在d n a 空间构型变化，d n a 复制、重组、转录、切割与再连接、 细胞染色质的组织化及有丝分裂中都起着重要作用；而t o p oi i 是真核细胞生存必不 可少的核酶，它的作用涉及到核酶代谢的许多方面，包括d n a 复制、m r n a 的加工、 染色体的分离浓缩、核基质的组织等。 t o p oi 能对d n a 超螺旋结构起解旋作用：首先t o p oi 以非共价键的形式与d n a 形成一个暂时的络合中间体( d n a - t o p oi 复合物) ，而后t o p oi 通过它的酪氨酸残 基将d n a 的磷酸二酯链切断，形成一个含有游离羟基的中间体，最后断链的一端缠 绕在另一条完整的磷酸二酯链上并紧密结合在一起，从而改变d n a 的链环数。 d n a 。t o p oi 复合物是细胞生长过程中d n a 复制、转录和翻译的重要物质，癌细胞 的生长也离不开d n a t o p oi 复合物，在细胞的增长繁殖过程中需要d n a t o p oi 复 合物进行裂解来复制新的细胞。而喜树碱对t o p oi 的抑制主要表现在影响d n a 断链 的再连接上，即喜树碱与t o p oi 和d n a 切口处的断链接合形成稳定的 c p t - d n a t o p oi 复合物，抑制t o p oi 对d n a 的解旋和再连接，使断裂的d n a 链 堆积，导致癌细胞的d n a 无法进行复制，最终导致癌细胞死亡。 处于s 期的细胞对喜树碱药物诱导凋亡最为敏感，可能是由于s 期的细胞d n a 开始大量复制，存在众多的复制位点，与t o p oi 抑