（农产品加工及贮藏工程专业论文）核桃青皮中多酚类物质及其抗氧化性的分析.pdf

摘要 核桃系胡桃科核桃属植物，在我国分布范围广阔。本文首先以普通核桃的不同 部分为研究对象，确定各部分多酚类物质的组成及含量的分布；再以普通核桃、不 老屯核桃、美国黑核桃为试验材料，重点研究不同品种核桃青皮中多酚类物质的成 分、含量及抗氧化活性。 试验结果表明：核桃中对人体有益的多酚类物质主要集中在青皮、种皮部分， 且青皮中多酚类物质的绝对含量相对较高；在不同品种核桃青皮的多酚类物质中， 从总酚含量、单宁含量及胡桃醌含量看，美国黑核桃青皮均最高，其次为普通核桃 青皮，不老屯核桃青皮均最少。 从所拥有的多酚类物质种类数看，普通核桃青皮的最多，其次为美国黑核桃青 皮，不老屯核桃青皮最少。在三个品种的酚酸类物质中，没食子酸含量均是最高 的，且从其含量看，不老屯核桃青皮最高，其次为美国黑核桃青皮，普通核桃青皮 最少。在三个品种的黄酮类物质中，芦丁的含量均是最高的，且从其含量上看，美 国黑核桃青皮最高，其次为普通核桃青皮，不老屯核桃青皮最少。 从抗氧化性看，利用d p p h 自由基的反应体系进行清除自由基实验，美国黑核桃 青皮清除自由基的能力最强，其次为不老屯核桃青皮，普通核桃青皮最弱。 关键词：核桃青皮；多酚类物质；抗氧化性 d e t e r m i n a t i o no ft h ep o l y p h e n o l sa n dt h ea n t i o x i d a n t a c t i v i t yi nt h ew a l n u tg r e e n r i n d a b s l r a c t w i d e s p r e a di nc h i n a , w a l n u t l a n sr e 昏al ) i sam e m b e rp l a n to f w a l n u tg e n e r ai n t h ew a l n u tf a m i l y t h ep a p e rf i r s tm a d eas t u d yo nd i f f e r e n tp a r t so fw a l n u tt od e t e r m i n e t h et y p e sa n dc o n t e n to fp o l y p h e n o l si ne a c hp 锄t h e nt h r e et y p e so fw a l n u t s ( i e w a l n u t , b u l a o t u nw a l n u ta n de a s t e r nb l a c kw a l n u t ) w e r es e l e c t e da se x p e r i m e n t a lm a t e r i a l sa n d r e s e a r c hw a sm a i n l yf o c u s e do nt h et y p e s ，c o n t e n ta n da n t i o x i d a n ta c t i v i t yo fp o l y p h e n o l s w i t h i nt h eg r e e nf i n d so f t h et h r e et y p e so f w a l n u t s i ts h o w st h a tp o l y p h e n o l sg o o df o rm a na r em a i n l yr e s e r v e di ng r e e nr i n da n dk e r n e l p e u i c l eo f w a l n u t sa n dm o s th i g h l yi nt h eg r e e nr i n d a n da m o n g t h et h r e et y p e so f w a l n u t s , e a s t e r nb l a c kh a st h eh i g h e s ta m o u n to ft o t a lp h e n o f i c s p p pa sw e l la sj u g l o n ei ni t s g r e e nf i n d w a l n u tr a n k ss e c o n da n db u l a o t u nh a st h el o w e s t i nt e r m so fn u m b e ro fp o i y p h e n o iv a r i e t i e s ，t h eg r e e nr i n do fw a l n u th a st h em o s t e a s t e mb l a c kr a n k ss e c o n da n db u l a o t u nh a st h el e a s t f o re a c ho ft h et h r e et y p e so f w a l n u t s ，g a l l i ca c i di sa l w a y so fah i g h e ra m o u n tc o m p a r e dw i t ho t h e rp h e n o l i ca c i d m a t e r i a l s a n di nt e r m so fc o n t e n t ，g r e e nr i n do fb u l a o t u np o s s e s s e st h eh i g h e s ta m o u n t e a s t e r nb l a c kr a n k ss e c o n da n dw a l n u th a st h el e a s t a n df o re a c ho ft h et h r e et y p e so f w a l n u t s ，g u t i ni sa l w a y se rah i g h e ra m o u n tc o m p a r e dw i t ho t h e rf l a v o n o i dm a t e r i a l s a n d i nt e r m so f c e m e n t , g r e e nr i n do f e a s t e r nb l a c kp o s s e s s e st h eh i g h e s ta m o u n t w a l n u tr a n k s s e c o n da n db u l a o t u nh a st h el e a s t w i t hr e g a r dt oa n t i o x i d a ma c t i v i t y , t h eg r e e nr i n do f e a s t e r nb l a c ki sm o s ta b l ew h e nt e s t i n ga n t i o x i d a n tp o w e rb yt h ed p p hm e t h o d b u l a o t u n r a n k ss e c o n da n dw a l n u tt h ew e a k e s t k e yw o r d s ：w a l n u tg r e e nr 砸p o l y p h e n o l s , a n # o x i d a n t a c t i v i o ， d ir e o t e db y ：p r o f z h a ol i q i n a p p ii c a n tf o rm a s t e rd e g r e e ：w a nz h e n i c n i n ( a g m u l t u r , d p r o c e s s i n g a n d s t o r a g e ) ( f o o d s o l m c e a n d e n g i n e e r i n g d e p a r l m t ，i n n e r m o n g o h a a g n c u l t u r a l u m v e t m t y , h t t h h o t o l 0 0 1 8 , d m m ) 内蒙古农业大学 研究生学位论文独创声明 本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的- 地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包 含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一 同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说 明并表示谢意 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任 论文作者签名：冱醢熬_ 日期：亟z 鲤 内蒙古农业大学研究生学位论文版权使用授权书 本入完全了解内蒙古农业大学有关保护知识产权的规定，即：研 究生在攻读学位期问论文工作的知识产权单位属内蒙古农业大学本 人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为内蒙 古农业大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为内蒙古农业 大学学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电 子文档，允许论文被查阅和借阒学校可以公布学位论文的全部或部 分内容( 保密内容除外) ，采用影印，缩印或其他手段保存论文 论文作者签名：歪毽筮 指导教师签名：盘塑i 日 期：扭玉垒： 内蒙古农业大学硕士学位论文 1 1 引言 1 1 核桃的概况 1 1 1 核桃的种类及分布 核桃( j u g l a n sr e g f a 三) 系被子植物门双子叶植物纲胡桃科( j u g l a n d a n c e a e ) 核 桃属植物，原产于欧洲东南部、东亚及北美地区，是人类种植最古老的树生坚果之 一1 。核桃属( j u g l a n s 工) 植物分为三个组，核桃组( s e c t j u l a n s ) 、核桃楸组 ( s e c t ，c a r a 目o c a r y o nd o d e ) 、黑核桃组( s e c t n i g r a ) 总共有2 1 个种，分布于亚洲、欧 洲、美洲地区。我国有4 个种，分别为核桃楸( j u g l a n sm a n d s h u r i c am a x i m ) 、野 核桃u u t a n sc a t h a y e n s i sd o d e ) 、铁核桃u u l a n ss i g i l l a t ad o d e ) 、河北核桃( j u l a n s h o p e i e n s i s 王m ) 和1 个变种“。 核桃又名胡桃、羌桃，与扁桃、腰果、榛子并列为世界四大干果，分布在世界 上许多国家。亚洲主要有中国、土耳其、印度、伊朗、日本、朝鲜等；欧洲主要有 俄罗斯、英国、法国、德国、意大利、希腊、保加利亚、罗马尼亚；美洲主要有美 国、智利。我国核桃分布范围较广，以秦岭巴山山区、吕梁太行山区及燕山山区最 为集中嘲。 1 1 2 核桃的生产现状及保健功能 在全球范围内，核桃在油脂类干果中产量较高，全世界常年产量达1 3 0 万吨， 居于果类的第一位。世界上有三十多个国家发展核桃生产，目前栽培较广、较集中 的国家有美国、土耳其、中国、意大利、前苏联、南斯拉夫、法国等二十多个国 家。美国是引进核桃树种栽培历史最短的国家，只有一百多年的时间，但其生产发 展快、效益高。其原因是他们注重核桃良种选育研究工作，经过3 0 年的努力，培育 出了适合美国发展的优良品种，建立品种园、采穗园、优良品种繁殖园等。在全国 范围内推广优良品种的种植，形成良种化栽培，采取嫁接繁殖、区域化发展和机械 化生产，产量猛增，一跃成为世界核桃生产大国。七十年代，美国从核桃进口国变 为出口大国，占领世界市场，夺走了中国长期占领国际市场的席位。美国南钻石公 司生产的“钻石”核桃就是国际市场走俏的商品核桃，以其味美、核桃外观好、颗 粒规范化而受到消费者的欢迎。 我国是核桃原产地之一，已有2 0 0 0 多年的栽培历史。随着果树生产形势的发展 和技术管理的加强，核桃生产正从过去的粗放、半放任的经营状态向科学管理、集 约经营方向转变，通过普及推广核桃实用增产技术和优良品种，核桃的产量和品质 都有了明显的提高，商品性状也有了较大的改善呻1 。2 0 0 0 年我国核桃产量约3 0 万 吨，是世界上核桃产量最大的国家，居世界首位m 】。 我国核桃种质资源丰富，在众多经济树种中，核桃以其用途多样、核仁营养丰富 著称，在内销外贸中均占有重要地位旧。我国核桃大体分为两类，即南方核桃和北方 2核桃青皮中多酚类物质及其抗氧化性的分析 核桃，南方核桃口感比较清香，北方核桃口感则比较涩。 唐代名医孟诜说，核桃“通经脉、润血脉、常服骨肉细腻光润”；明代大医学 家李时珍把核桃的医药价值的概括为“补气养血、润燥化痰、益命门、利三焦、温 肺润肠等”叫。 1 2 多酚类物质的结构、性质 1 2 1 多酚类物质的结构 多酚是一组植物中化学元素的统称，因具有多个酚基团而得名，通常存在于植 物性食物中，在一些植物中能起到呈现颜色的作用，具有潜在的促进健康作用，当 前被称为“第七类营养素”。酚类物质在植物中通常呈现为多种环状物的集合，即 许多酚类物质在一起出现，因此被称为“多酚”。多酚包括酚酸、类黄酮、异黄 酮、花青素、单宁、花色苷等。 植物中多酚的含量仅次于纤维素、半纤维素和木质素嘲，是果树果实中含量较 多的次生产物之一，是苯酚的衍生物，在植物中有着多方面的生理功能，几乎贯穿 植物生长发育的每一个过程，是影响其生长发育的重要因素。涉及许多重要代谢反 应，其代谢直接影响果实外观、生食和贮运品质m 。 人们对植物多酚的科学认识始于1 7 9 6 年，s e g u i n 首次将植物水浸提物中能使生 皮转变为革的多酚类化合物合称为“植物单宁”。w h i t e 和b a t e s m i t h 则把相对分 子量在5 0 0 - 3 0 0 0 范围内具有鞣性的多元酚定义为植物单宁。1 。 k f r e u d e n b e r g 于1 9 2 0 年提出植物多酚的科学分类法，即按照单宁的化学结构 特征，将其分为水解单宁( h y d r o l y r s a b l et a n n i n s ) 和缩合单宁( c o n d e n s e dt a n n i s ) 两 大类。水解单宁主要是聚柿酸脂类多酚；缩合单宁则主要由聚黄烷醇类多酚或原花 色素。水解单宁和缩合单宁在结构组成上完全不同，因此它们在化学性质和应用范 围上差异显著。这种分类方法更着重以结构特征为依据，而不考虑分子量，更符合 人们在对这类混合物开展研究工作的实际情况哪。 而“植物多酚”这一术语是由h a s l a m 在1 9 8 1 年根据单宁的分子结构及分子量 提出的，涵盖了所有单宁以及单宁的衍生物。植物多酚可根据其化学结构、来源和 用途等进行分类，人们最初研究的植物多酚主要为单宁，通过研究逐渐认识到，植 物浸提物中能产生鞣制作用的是一系列多酚类化合物，它们能与蛋白质发生结合。 1 2 2 多酚类物质的性质 1 2 2 1 溶解性 多酚类物质具有较强的极性，可溶于水、乙醇和丙酮等极性强的溶剂，也可溶 于乙酸乙酯，不溶于极性小的溶剂，如乙醚、氯仿、苯及石油醚等。 内蒙古农业大学硕士学位论文 3 1 2 2 2 还原性 多酚类物质结构中具有邻二酚羟基，容易被氧化，且对活性氧等自由基有较强 的捕捉能力m ，可还原吐伦试剂及斐林试剂。 1 2 2 3 收敛性 多酚类物质可通过疏水键和多点氢键与蛋白质结合生成不溶于水的沉淀，能使 蛋白质自水溶液中沉出，故有涩味，可作为收敛剂并用于皮革。 1 2 2 4 与金属盐类作用 多酚类物质的水溶液遇高铁盐产生兰黑色或绿黑色沉淀。鞣质的水溶液加入重 金属盐如醋酸铅、醋酸铜、氯化亚锡等溶液，或碱土金属氢氧化物溶液生成沉淀。 此外，鞣质与铁氰化钾的氨溶液反应呈深红色，并很快变成棕色。 1 2 2 5 其他作用 植物多酚在波长2 0 0 - 3 0 0 r u a 之间还有着较强的吸收紫外光的能力。 1 3 多酚类物质的分离、提纯、鉴定 1 3 1 多酚类物质的分离、提纯 多酚类物质主要有酚酸类和黄酮类物质，因而有必要进行分离提纯，从而得到 单一或同类多酚类物质，以利于对其生理功能进行研究。目前，一般采用吸附树脂 的方法将得到的粗提物进行分离提纯，在总结了很多有关资料后，我们采用 s e p h a d e x - 2 0 分离核桃多酚类物质。 多酚类物质的稳定性较差，提取时样品的状况和提取条件都能够影响多酚类物 质的变化，提取分离存在很大困难，普通的分离方法不易得到纯的化合物。原料提 取前需经粉碎成粉末，通常细小的粉末利于提取，但是过细反而会使鞣质含量减 小，这是因为粉碎时间过长，多酚类物质容易氧化变性。最合适的尺寸在1 0 0 目左 右啪，并且温度应该控制在5 0 以下“一。 水虽然是植物多酚类物质的良溶剂，但并非最适合多酚的提取。因为多酚类物 质在植物体内通常与蛋白质、多糖以氢键和疏水键的形式构成稳定的分子复合物。 这种现象对于分子量大、羟基数量多的植物单宁尤为突出，所以在提取时提取试剂 不仅要求对多酚类物质有很好的溶解性，而且必须具有氢键断裂的作用。因此有机 溶剂和水的混合溶液( 有机溶剂占5 0 到7 0 ) 最适合多酚类物质的提取。 孟洁、杭瑚等人在核桃仁活性成分的提取及体外抗氧化活性的研究中表明 使用正己烷、9 5 乙醇浸提，将收集滤液分别经旋转真空蒸发器浓缩干燥，即为所需 多酚类物质n 。1 。郑晓珂、李钦在冬凌草中酚酸类化学成分研究中使用7 0 丙酮浸 4 核桃青皮中多酚类物质及其抗氧化性的分析 提制得多酚类物质m 。 根据多酚类易溶于水及有机溶剂等性质，张洁、李忠正等在兴安落叶松树木 中酚类化合物组成研究提出，原料依次经冷水一热水一7 8 苯乙醇( 1 ：1 ) 一1 5 亚硫酸钠一1 氢氧化钠浸提，所得产物分别是水溶性单宁、水溶性单宁、水不溶性 单宁、木质素及少量单宁和酚酸及少量木质素嘲。 1 3 2 多酚类物质的鉴定 由于多酚类物质是多元酚的聚合物，吸附性很强，多数酚类物质能够被牢固的 吸附在一般的硅胶上而不易洗脱，单独的方法很难确定化合物的结构，要几种方法 配合使用才能比较准确的确定物质的结构，目前有如下几种分析方法。 1 3 2 1 定性实验 利用颜色反应，鉴定是否含有多酚类物质。常用的反应是三氯化铁检验酚类和 鞣质，明胶进一步分离鞣质，镁粉一盐酸鉴别黄酮类物质。 1 3 2 2 薄层层析法 目前在化合物结构鉴定中，常用于多酚类物质结构鉴定的方法有纸层析法、紫 外法、红血球凝聚法和薄层层析法，其中目前最常用的是薄层层析法乜4 “。薄层 层析法( t h i nl a y e rc h r o m a t o g r a p h y ，简称t l c ) 也称薄层色谱法，是一种简单、快 速、微量的层析方法。其特点是可以同时分离多个样品，分析成本低，对样品预处 理要求低，对固定相、展开剂的选择自由度大，适用于含有不易从分离介质脱附或 含有悬浮微粒的样品分析剀；利用混合物中各组分的物理和化学性质的差异，使各 组分以不同程度分布在两个不相混溶的相中，其中一相为固定的，称为固定相 ( s t a t i o n a r yp h a s e ) ；另一相则流过此固定相，称为流动相( m o b i l ep h a s e ) ，各组分 以不同速度移动而达到分离的目的乜酊，兼备了纸色谱和柱色谱的优点，分离效果 好，斑点集中，检测没食子酸的重现性好，灵敏度高。常用的固定相为硅胶，将固 定相的浆料均匀的涂布在毛玻璃片上，经烘干活化即可使用。t l c 广泛的应用于药 物、生化、食品和环境分析等方面，在定性鉴定、半定量以及定量分析中发挥着重 要作用嘲。 采用薄层层析法的关键即是选用适当的展开剂及显色剂，多酚类物质常用展开 剂有以下四种：一、乙酸乙酯：甲酸：水( 9 ：l ：卜7 ：2 ：3 ) ；二、甲醇；三、异丁醇： 醋酸：水( 4 ：1 ：5 ) ；四、正丁醇：醋酸：水( 4 ：l ：5 ) 。常用显色剂为碘、1 铁氰化 钾：1 - - - 氯化铁( 1 ：1 ) 、丙酮：水( 1 ：1 ) 、环己烷：醋酸( 9 3 ：7 ) 等。 内蒙古农业大学硕士学位论文 5 1 3 2 3 羟丙基葡聚糖凝胶( s e p h a d e xl h - 2 0 ) 柱层析法 这是一种鞣质分离最常用的方法，它不仅具有一定的分子筛作用，同时还对含有 酚羟基的化合物有一定的吸附作用。主要用于不同聚合度的鞣质的分离，其分离效 果受多酚类物质的吸附力的影响，而不受凝胶过滤的影响。此凝胶不仅可用水。还 可以用有机溶剂来洗脱，根据洗脱剂可以分为正相和反相两种类型。正相型所用的 洗脱剂可为甲醇、乙醇、正戊醇、丙酮和氯仿，常用的系统有不同比例的乙醇一水 一丙酮。反相型所用的溶剂为不同比例的甲醇一水。此法的缺点是对某些多酚类， 特别是大分子缩合鞣质吸附力太强而不易洗脱，影响凝胶的使用寿命嘲。常用的洗 脱剂为水一乙醇系统。当用水洗脱时，主要得到糖类，氨基酸和非酚性苷类成分；用 1 0 - 3 0 乙醇水溶液洗脱时，主要得到酚性苷类成分( a ) ；用4 0 一8 0 乙醇水溶液洗脱时， 可以得到相对分子量为3 0 0 - 7 0 0 的鞣质( b ) ；用8 0 - 1 0 0 乙醇水溶液洗脱时，可以得 到相对分子量为7 0 0 - 1 0 0 0 的鞣质( c ) ；用5 0 的丙酮水溶液洗脱时，可以得到相对分 子量大于1 0 0 0 的鞣质( d ) 。分离结束后，用大量水一丙酮( 1 ：1 ) 冲洗，可使吸附柱再生 并重复利用，将得到的a b c d 四个组分上液相和质谱。 1 3 2 4 大孔吸附树脂层析法 以d i a i o nh p 2 0 ，m c i g e lc i - i p2 0 p 和t o y op e a r lh w4 0 f 等为填料，用不同比 例的甲醇一水或乙醇一丙酮作为洗脱剂，往往在用s e p h a d e x - - 2 0 h 柱分离之前先用 此法将样品粗分成几个部分，然后再使用s e p h a d e x - - 2 0 h 细分阻”。 1 3 2 5 高效液相色谱 高效液相色谱( h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y 。简称h p l c ) 是6 0 年 代末7 0 年代初发展起来的一项新技术蚴。这项技术在其发展过程中亦称为高速液相 色谱( 碰g hs p e e dl i q u i dc h r o m a * o g r a p h y ，简称h s l c ) 、高压液相色谱( h i g h p r e s s u r el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ，简称h p l c ) ，或高分辨液相色谱( h i g hr e s o l u t i o n l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ，简称h r l c ) ，是现代分析的重要手段阻棚。h p l c 具有高分 辨、速度快、重现性好，适用面广的特点，现己广泛应用于天然产物的分析之中， 成为天然产物化学成分纯度鉴定、含量测定、制剂质量控制的有效方法抵“川。高效 液相色谱分析在现代仪器分析中占有重要地位，其独特的高效快速分离特征适合于 复杂混合物的分离分析。色谱法其原理是基于样品组分在两相之间的分配系数不同 而分离。按其分离原理又可分四类：即吸附分离、排阻分离、离子交换分离和分配 分离。与其他类型分析方法相比。色谱法具有分离效率高、灵敏度高、分析速度 快、应用范围广等显著特点，而它的不足之处是对被分离组分的定性较为困难。我 们可以用它与质谱分析联用来解决这一问题。 高效液相色谱法只要求样品能制成溶液，不受样品挥发性的限制，流动相可选 6核桃青皮中多酚类物质及其抗氧化性的分析 择的范围宽，固定相的种类繁多，因而可以分离热不稳定性和非挥发性的、离解、 非离解的以及各种分子量范围的物质。与试样预处理技术相结合，唧l c 所达到的高 分辨率和高灵敏度，使分离和测定性质上十分相近的物质成为可能，能够分离复杂 的微量成分。随着固定相的发展，有可能在充分保持生化物质活性的条件下完成分 离洲。胛l c 的出现和应用，为鞣质定量分析开辟出新的前景，极大地推动了植物中 鞣质的研究，已成为鞣质含量测定非常有效和准确的方法，其方便快捷，不仅可以 检测鞣质组分中的a 、b 异构体，还可以预示鞣质分子的大小、判断结构测定中水 解反应进行的程度及进行定量分析。s a l a g o i t y 嘲用高效液相色谱法测定了五倍子中 五倍子鞣质的含量；刘延泽等利用反相高效液相色谱成功地测定了茶叶7 0 丙酮提 取物及其抗癌有效成分m ；罗文毓等人用高效液相色谱对大黄中没食子酸的含量进 行了研究，测定出这两种鞣质的含量。已报道的还有槟榔花m 、地榆和茶叶m 中鞣质含量的测定。近年来，h p l c 已经成为鞣质分析的一种重要手段。 1 3 2 6 气相色谱一质谱联机技术 质谱法( m a s ss p e c t r o m e t r y ，简称m s ) 具有灵敏度高、定性能力强等特点，但 进样要纯，才能发挥其特长，且进行定量分析较复杂。气相色谱( g a s c h r o m a t o g r a p h y ，简称g s ) 则具有分离效率高、定量分析简便的特点，但定性能 力却较差，因此气相色谱与质谱联机( c - c - - m s ) 是分析复杂有机化合物的有力工 具。目前它已广泛的应用于食品、环境、农业、生物、医药、石油和工业等诸多 科学领域。 混合物样品经色谱柱分离后进入谱仪离子源，在离子源被电离成离子，离子经 质量分析器、检测器之后即成为质谱信号并输入计算机。计算机可以自动将每个质 谱的所有离子强度增加，显示出总离子强度，总离子强度随时间变化的曲线就是总 离子色谱图，总离子色谱图的形状和普通的色谱图是一致的，可以认为是用质谱作 为检测器得到的色谱图。质谱仪可以采用全扫描的方式对指定质量范围的离子全部 扫描并记录，得到的是正常的色谱图，这种质谱图可以提供未知物的分子量和结构 信息，可以进行库检索，而质谱的优点就是通过离予选择性技术很方便的避开了主 体组分的影响叫。g c m s 联用技术既发挥了色谱法的高分离能力，又发挥了质谱 法的高鉴别能力，因此适用于做多组分混合物中未知组分的定性鉴定。 1 4 核桃青皮的研究情况 1 4 1 核桃青皮中的主要化学成分 核桃青皮内含有胡桃醌、a 一氢化胡桃醌_ 4 一葡萄糖苷、鞣质、没食子酸、胡桃 醌生物碱和萘醌等，未成熟时含有丰富的v c 和6 0 以上的水分。 内蒙古农业大学硕士学位论文 7 i 4 2 核桃青皮生物活性作用及其研究进展 i 4 2 1 抗肿瘤作用 核桃青皮中所含有的胡桃醌物质具有抗肿瘤作用，根据张野平等人的研究，胡 桃醌对h e p 小鼠生命延长率为9 5 ，抑制s 1 8 0 实体型达5 0 ；应用同位素方法发 现，以胡桃醌0 i m g m l 作用5 h ，对h e p 小鼠细胞d n a 合成抑制为高峰，分别是 7 1 5 和6 0 ；电镜观察发现，胡桃醌主要影响h e p a 细胞线粒体，胡桃醌中的多酚 类对小鼠自发性乳癌有明显的抑制作用。胡桃醌和蓝雪醌对大鼠肠肿瘤形成有抑制 功能，可能成为良好的化疗药物n 。1 。 1 4 2 2 镇痛作用 杜旭等对胡桃楸未成熟果实青核桃的研究表明，核桃青皮具有与咖啡相似的明 显镇痛作用，其作用持续时间长，强度与剂量相关，是通过多种途径发挥镇痛作用 的m ；宛蕾等认为胡桃也有镇痛及抗炎作用h 6 1 ；在中医药方中，青核桃洗净用酒浸 泡，饮用。对十二指肠溃疡、胃炎、胃神经痛患者均有明显的止疼作用。 1 4 2 3 清除氧自由基的作用 多酚类物质最重要的功能是抗氧化和清除自由基。氧自由基旷、o h - 是生物体 内主要的活性氧自由基，由它所引发的体内脂质过氧化是导致人体产生疾病的原因 之一。自由基过多是引起心脑血管疾病，诱发肿瘤、老年性痴呆、白内障、糖尿 病、肝病、帕金森病以及衰老的重要原因。由于多酚的结构中有许多共轭双键，即 便某些位置的电子被氧自由基抢走，多酚本身也可以利用电子的共轭现象而使其自 身分子结构不被瓦解，从而可以抵挡自由基的攻击而保护细胞。 1 4 2 4 抗菌作用 在中医药方中，核桃青皮又叫青龙衣，用酒浸泡后可治一些皮肤疾病；青核桃 和红糖用黄酒浸泡，经常饮用，可治寒气痛经m ；胡桃醌在体外能中和破伤风及白喉 毒索m 。 i 4 2 5 农业上的应用 植物化感作用是化学生态学的重要研究内容，是近年来研究相当活跃的领域， 由于核桃的化感作用对植物有抑制和促进的双重作用，因此在生产实践中可以科学 设计核桃与作物、蔬菜间作类型和间作距离。利用核桃化感作用有效控制田间杂 草，为人类开发新型的无公害植物除草剂提供了新的途径。核桃外果皮的水提取物 有杀虫作用m 。 8 核桃青皮中多酚类物质及其抗氧化性的分析 1 4 2 6 其它作用 核桃很强的药理作用与核桃中的多酚物质具有直接的关系。从胡桃和黑胡桃青 皮中提取的多酚类有消炎作用；黄酮对犬试验，有降低血压的作用m 。 现代药理实验表明，单宁( 分子质量在5 0 0 3 0 0 0 的植物多酚) 具有很强抗氧 化活性。多酚类物质对人体一般都具有抗氧化性、抗诱变性和抗癌活性，酚酸类物 质：如咖啡酸用于治疗各种原因引起的白细胞减少症、血小板减少症；绿原酸是众 多药材和中成药抗菌解毒、消炎利胆的主要有效成分，具有清除自由基、抗脂质过 氧化、抗诱变作用，且通常被作为定性甚至定量的指标；阿魏酸在人体内具有抗血 栓、抗炎镇痛、抗氧化、抗自由基等作用，临床主要用于冠心病、脑血管、白细胞 和血小板减少等病症；黄酮类化合物具有扩张冠状血管、降低高血压、增强心脏收 缩、减少心脏搏动数、止咳去痰、抗菌消炎、抗毛细血管脆性、抑制肿瘤细胞、保 肝、泻下、解痉等作用。芦丁是黄酮醇类的主要来源，有维生素的作用，能降 低血管脆性及异常通透性，可做防治高血压及动脉硬化的辅助治疗剂；槲皮素具有 较好的祛痰、止咳、平喘、降低血压、增强毛细血管抵抗力、减少毛细血管脆性、 降血脂、扩张冠状动脉、增加冠脉血流量等作用，用于治疗慢性支气管炎，对冠心 病及高血压患者也有辅助治疗作用。 1 5 核桃多酚类物质的研究现状 1 5 1同一品种的核桃果实各部分中多酚物质的研究现状 1 5 1 1 核桃青皮中多酚的研究现状 核桃果实由青皮、硬壳、种皮、无种皮仁组成，大量研究表明，核桃果实中各 部分均含有多酚类物质，只是含量多少存在差异。尤其是青皮资源丰富，但几乎被 废弃。酚类物质在核桃果实生长发育中呈差异性分布，王勇、吴国良等人对核桃青 皮内不溶性酚类物含量和可溶性酚类物质含量进行了测定。结果表明：随着核桃果 实的生长发育，青皮内酚类物质也随之变化，不溶性酚类物质含量较可溶性酚类物 质含量高m 。在中医验方中，核桃青皮又叫青龙衣，用酒浸泡后可治一些皮肤疾病 及胃神经痛；在国外也有利用青核桃制作核桃酒的习惯，其过程大致如下：在每年 的7 月中旬采收无病虫害的青核桃、洗净、切成碎块，添加一定量的香辛料如桂 皮、丁香、柠檬皮等，用食用酒精对其进行浸泡1 - 3 个月，过滤，在滤液中添加一 定量的糖和水，陈化3 - 1 2 个月，再次过滤，就能获得金黄色、味香醇美的青核桃 酒。此酒一般在晚餐后饮用叫。用此法制作的核桃酒中多酚类物质含量一般在 2 7 5 9 m g 儿茶素l 左右，其中单宁类物质约为1 3 7 6n a g 儿茶素l ，二者之间呈正相关 的关系。用d p p h ( 二苯代苦味酰自由基) 法证实青核桃酒具有明显的抗氧化能 力，对人体的抗氧化效果可以与红葡萄酒相媲美洲。 深入研究青皮中的生物活性成分，特别是用核桃青皮活性物质研制开发新型产 内蒙古农业大学硕士学位论文 9 品，将展现出广阔的开发利用前景。 1 5 1 2 核桃壳中多酚物质的研究现状 s z et a o 叫等人研究表明带壳的鲜核桃和去壳的鲜核桃中的单宁含量分别是 3 7 2 - 1 0 9 5 m g 几茶素l o o g 和3 6 3 - 6 6 7 m g 儿茶素l o o g 干重。另外郑德勇等人指出植 物抗氧化剂及其有关活性成分主要有黄酮类化合物、植物多酚、酚酸类化合物、维 生素、活性多糖、酶、蛋白质和氨基酸等类型，由此推断核桃壳中含有多酚类物 质，但是其确定性及含量多少尚待进一步证明。胡博路m 等人用化学发光法和硫代 巴比妥酸法研究了核桃壳的抗氧化作用。结果表明，核桃壳对超氧阴离子自由基无 清除作用，但能清除羟基自由基并可有效地抑制脂质过氧化，且核桃壳含有良好的 抗氧化物质。 1 5 1 3 核桃种皮中多酚类物质的研究现状 王勇、吴国良等人对核桃种皮内酚类物质含量进行了测定，结果表明：在核桃 生长发育过程中种皮内酚类物质含量变化比较剧烈，在其实验观察期内，自6 月2 5 日到7 月1 0 日，种皮内的酚类物质含量呈迅速上升趋势。至7 月2 5 日核桃进入种 仁充实初期，有一个短时生长缓慢期种皮酚类物质含量为4 9 4 2 m g g 鲜样。从8 月 1 日起核桃进入种仁充实中末期，此期果实进行大量营养物质的转化，至8 月2 5 日，种皮内的酚类物质含量又上升达到第二高峰。至9 月1 0 日核桃果实已进入采收 期。种皮内酚类物质含量稍微下降，而趋于变化平缓。 试验结果还表明核桃种皮中酚类物质含量是青皮的7 倍左右，而恰恰种皮在发 育阶段和贮藏期间的组织褐变与其酚类物质含量有着密切的关系，进而影响核桃的 品质。大量资料也表明：组织褐变与组织中所含的酚类物质有关。在p p o 的催化下 酚类物质被氧化为醌，醌可以通过聚合作用产生有色物质从而引起组织褐变。褐变 程度与其酚类物质含量呈显著的正相关。此外，种皮内酚类物质含量高水平分布直 接影响着核桃果实的食用品质。 l e o n a r dj u r d 撕1 研究表明核桃仁种皮含有邻苯三酚的衍生物即鞣花酸、没食子 酸、没食子酸甲酯和胡桃苷。t o s h i y u k if u k u d a t “l 等人从核桃中分离出2 ，3 一h h d p d _ 吡喃糖( 2 ，3 - h h d p d g l u c o p y r a n o s e ) 、异小木麻黄素( i s o s t r i c t i n i n ) 、长梗马兜铃 素( p e d u n c u l a g i n ) 、木麻黄鞣宁( c a s u a r i c t i n ) 、小木麻黄素( s u i c t i n i n ) 、铁马宁 i 和( t e l l i m a g r a n d i ni 和t e l l i m a g r a n d i n i i ) 、小飞阳草( r u g o s i n ) 、大麻黄鞣 宁( c a s u a r i n i n ) 等1 6 种多酚类物质，其中3 种是新分离的水解类单宁；1 4 种多酚 类化合物具有s o d 的功能，可以有效清除氧自由基0 2 一嘲；长梗马兜铃素 ( p e d u n c u l a g i n ) 直接作用于凝血酶。可以抑制血纤维蛋白原凝血酶的活性，显著延 长凝血时间。 1 0 核桃青皮中多酚类物质及其抗氧化性的分析 1 5 1 4 核桃仁中多酚物质的研究现状 k o r e nj a n d e r s o n 饵1 从英国核桃中提取多酚类物质，液相色谱和质谱分析表明 核桃的提取物中含有鞣花酸单体，聚合鞣花单宁和其他酚类化合物。以鞣花酸为对 照，进行体外的血液和低密度脂蛋白抗氧化试验，鞣花酸和核桃提取物对a a p h ( 2 ，2 ，a z o b i sh y d r o c h l o r i d e ，2 , 2 ，偶氮2 眯基丙烷) 诱导的低密度脂蛋白氧化的抑 制率分别为8 7 和3 8 ；对c u 离子催化的低密度脂蛋白氧化的抑制率分别为1 4 和 8 4 ；可以显著抑制血浆中硫代巴比妥酸反应物的形成：核桃提取物的t r o l o x 当量 抗氧化能力要高于d 一维生素e 。他认为在评价核桃的抗动脉粥样硬化的作用时应该 考虑到核桃多酚的作用。z et a o 洲等人研究表明核桃仁的收敛性与单宁的含量呈正 相关的关系，相关系数r = 0 9 2 4 9 。 1 5 2 不同品种的核桃青皮的多酚类物质的研究现状 中国核桃种质资源极为丰富，核桃不同品种之间不仅在叶片、果实的硬壳方面 有明显的区别，而且在青皮的颜色及其浸提液的颜色方面亦有明显的差别。有许多 资源是特别独特的，有的核桃青皮不染手( 不老屯核桃) 、有的青皮呈现黑色，俗 称乌米核桃等。 1 5 2 1 不老屯核桃的多酚类物质研究现状 不老屯核桃的突出特点是青皮颜色比普通核桃青皮浅，呈白色，而且脱青皮时 汁液不易染手，宜作鲜食核桃。王勇等人利用分光光度法测定并分析了晚实光皮绵 核桃和地方特异性品种不老屯核桃在其果实生长发育过程中的青皮和种皮内多酚类 物质含量的变化。结果表明在核桃生长发育过程中多酚类物质含量变化比较剧烈。 不老屯核桃进入采收期后，其青皮中可溶性酚类物质含量为6 5m g g 鲜样，明显 低于晚实光皮绵核桃( 4 5 4m g g 鲜样) ；两品种间不溶性酚类物质含量差别不 大。但是不老屯核桃青皮中多酚类物质的构成及含量，则还很少有人研究。 1 5 2 2 美国黑核桃的的多酚类物质研究现状 黑核桃c u g l a 珊n g r ad 属胡桃科核桃属黑核桃组，原产美国，是美国东部的乡 土树种，常被称为东部黑核桃嘶1 。美国黑核桃不仅能提供十分珍贵的木材，而且能 产出上等坚果及用途广泛的壳粉，因此被认为是经济价值很高的树种嘲。黑核桃与 普通核桃相比，在种皮颜色上具有明显的特点，呈暗绿色，这可能与多酚类色素 ( 花青苷) 组成、胡桃醌之问存在着一定的联系。 1 6 研究目的与意义 核桃酚类物质是各种酚酸类物质、黄酮类物质以及其他物质的混合物。从国内 内蒙古农业大学硕士学位论文 外核桃酚类物质的研究情况来看，对核桃的研究大部分集中在核桃仁酚类物质的总 体含量上。对于核桃青皮中多酚类物质的定性、定量分析以及具体成分差异，目前 尚未有系统的研究。 核桃青皮中的多酚的含量受诸多因素的影响，如品种、成熟期、光照以及贮藏 条件等。为了了解核桃青皮中多酚类物质的具体成分及含量差异，本文首先以同一 品种核桃中青皮、硬壳、种皮、无种皮仁等四个不同部分的物质为原料，确定了不 同部分的多酚物质组成及含量。其次主要对不同核桃青皮中的多酚类物质，从总酚 含量的测定、多酚类物质的分离提纯以及液相分析等几个方面进行分析研究，确定 核桃青皮中多酚类物质的种类及含量差异。 核桃青皮中酚类物质的研究已经成为一个新兴课题，有着广泛的应用前景，并 受到越来越多的关注。核桃青皮本身不能食用，采用乙烯催熟或采用其他天然方式 脱落青皮，通常被认为是废弃物，随着核桃青皮药理活性的发现，我们对核桃青皮 进行了系统的研究。本课题对核桃青皮所进行系统的研究，为其变废为宝提供了前 提，并为其产业化生产与应用提供了更好的理论依据，是本课题所具有的实际意 义。 2 材料和仪器 2 1 试验材料 2 1 1核桃果实不同部位的多酚类物质分析的原料 采集新鲜核桃果实3 0 个，人工剥离青皮、种皮、硬壳、无种皮仁，将获得的青 皮、种皮、硬壳、无种皮仁立即进行液氮冷冻处理后，再进行真空冷冻干燥4 8 h r 。 将干燥后的样品充氮包装，在- 2 8 条件下贮藏，备用。 2 1 2 不老屯核桃、美国黑核桃青皮中多酚类物质分析的原料 称取一定量质量的不老屯核桃、美国黑核桃的青皮，用一定量的7 0 的乙醇反 复浸提收集滤液，抽滤，用乙醚脱脂处理，真空浓缩，备用。 2 2 试验仪器和设备 圣叶恒温水浴锅b - 2 2 0 ( 上海亚荣生化仪器厂) ，r e 5 2 c s 圣叶旋转蒸发器( j z 海亚荣生化仪器厂) ，f a l 0 0 4 万分之一电子天平( 上海精科天平厂) ，t f d - 5 5 0 5 冷冻干燥机( 日本生产) ，k q - 5 0 0 b 型超声波清洗器( 昆山市超声仪器有限公 司) ，s 船一循环水式多用真空泵( 郑州长城科工贸有限公司) ，电热恒温水浴锅 ( 上海医疗器械三厂) ，i n - 2 1 0 2p c 型紫外可见分光光度计( 龙尼柯上海仪器有 限公司) ，高压液相色谱( 咿l c ) w a t e r2 4 4 型，柱子为o i a m o s i l c 1 8 ( o 4 x 2 5 c m ) ，低温冰柜。 1 2 核桃青皮中多酚类物质及其抗氧化性的分析 2 3 试验药品 三氯化铁( f e c l 3 ) 、铁氰化钾( k 3 f c ( c n ) d 、盐酸c 1 ) 、乙醇( c h 3 c 8 ：o h ) 、氢 氧化钠( n a o r o 、十二烷基磺酸钠( s d s ) 、甲醇( c h 3 0 h ) 、乙醚( c h 3 c h 2 0 c h 3 c h 2 ) 、磷酸( h 3 p 0 4 ) 均为分析纯，均为北京化工厂产品；水合茚三酮 ( c 9 1 1 4 0 3 h 2 0 ) ，牛血清清蛋白( b s a ) 生化试剂，均为北京化学试剂公司。二苯 代苦味酰自由基( d p p h ) ，东京华成工业株式会社。 没食子酸、绿原酸、咖啡酸、对羟基苯甲酸、香豆酸、阿魏酸、芦丁、桑色 素、槲皮素等标样为s i g m a 公司产品，纯度为色谱纯。 3 试验方法 3 1 多酚类物质的提取 3 1 1 核桃果实不同部位的多酚类物质的提取 精密称取一定质量的核桃青皮、种皮、硬壳、无种皮仁，于1 0 0 m