（农产品加工及贮藏工程专业论文）竹叶多糖的提取分离、抗氧化性及竹叶调味茶饮料工艺研究.pdf

竹叶多糖的提取分离、抗氧化性及 竹叶调味茶饮料工艺研究 赵丽莉 摘要：竹子是禾本科竹亚科多年生常绿植物，是当今世界最具有利用价值的 植物之一。竹叶在我国有着悠久的食用和药用历史，其性淡、微涩、寒、味甘， 具有清热利尿、明目解毒、止血、免疫调节、抗氧化、抗爱滋病和抑制肿瘤等功 效，且无毒无害，可作为绿色食品进行开发。但目前对竹叶的利用还很有限，竹 叶大部分还是以一种加工废弃物处理，未能得到充分的利用。 竹叶多糖是是一种具有多种生理功能和开发价值的植物活性多糖，在竹叶中 的含量极其丰富，对人体具有独特的保健功效。但目前对竹叶的研究也主要集中 在竹叶黄酮及其生物活性和药理方面的研究，而对于竹叶多糖等方面的研究还不 够深入。 本试验主要研究了竹叶多糖的提取分离工艺和抗氧化性，并开发出竹叶调味 茶饮料，丰富竹叶在食品领域研究的理论基础，加速竹叶在食品上的应用，使我 国的竹子资源得到有效的开发利用，从而创造出它应有的社会效益和经济效益。 通过研究，得出结论如下： 1 热水提取竹叶多糖最佳条件是：料液比1 ：3 0 ，提取温度8 0 ，时间1 5 h ， 浸提次数为2 次，竹叶多糖提取率可达到3 9 5 。 2 超声提取竹叶多糖最佳条件为：超声处理时间1 5 r a i n ，超声波功率3 0 0 w ， 料液比1 ：1 5 ，竹叶多糖提取率可达到4 2 2 。 3 微波提取竹叶多糖最佳条件为：料液比1 ：3 0 ，微波功率6 0 0 w ，微波处理 时间6 r a i n ，竹叶多糖提取率可达到4 1 4 。 4 竹叶多糖最佳沉淀方法：以乙醇为沉淀剂，提取液体积浓缩至原料重的2 5 倍，添加4 倍体积的9 5 乙醇，竹叶多糖沉淀率可达到7 1 。 5 竹叶多糖最佳脱除蛋白方法：采用蛋白酶+ s e v e g 法对竹叶多糖脱蛋白，用 木瓜蛋白酶降解后，再用s e v e g 法脱除两次，蛋白脱除率可达到7 4 3 。 6 采用d e a e - - 5 2 纤维素对竹叶多糖进行纯化，检测到竹叶多糖共有4 种多 糖组分，蒸馏水、0 1 m o l ，l n a a 、0 3 m o i l n a c l 及0 5 m o i l n a c i 洗脱各出现一个 峰。此外，试验中用0 0 5 m o l l n a c i 洗脱，未检测到多糖。 7 竹叶多糖对油脂有一定的抗氧化性，对植物油抗氧化活性比v e 差，对猪油 抗氧化性与v e 相当；对超氧阴离子的清除作用不明显，在所选浓度范围内，清除 率基本上没有变化，均低于5 0 ，其清除能力弱于v c ；清除羟基自由基的能力与 v c 相当，其i c 5 0 都大约是o 4 m g m l 。 8 竹叶调味茶饮料配方为：竹叶提取液7 0 ，柠檬酸0 0 7 ，蜂蜜8 。 9 竹叶调味茶饮料杀菌条件：杀菌温度9 0 ，杀菌时间5 m i n 。 1 0 竹叶调味茶饮料护色条件：在竹叶调味茶饮料中添加2 0 0 p p m 异抗坏血酸 钠。 关键词：竹叶多糖：提取分离；抗氧化性；竹叶调味茶饮料；加工工艺 s t u d yo ne x t r a c t i o na n ds e p a r a t i o no fb a m b o op o l y s a c c h a r i d e s a n dt h ep r o c e s s i n gt e c h n o l o g yo fc o m p o u n db e v e r a g e o ft h eb a m b o ol e a v e s z h a ol i 肺 a b s t r a c t ：b a m b o oi so n eo ft h em o s tu s e f u lp l a n t si nt h ew o r l d t h el e a v e so f b a m b o oh a v eb e e nu s e df o rf o o da n dm e d i c i n e sf o ral o n gt i m ei nc h i n a t h e yh a v e v a r i o u sp h a r m a c o l o g i c a le f f e c ta n db i o l o g i c a lf u n c t i o n s t h e ya x ea b l et ob u i l d u p i m m u n i t yc a p a b i l i t y ，r e s i s tc a n c f f ra n d r e s t r a i nt h eg r o w i n go ft h et o m o n re c t t h e ya l s o c a l lb eu s e da sg r e e nf o o d b u tt h e ya r e u tu s e dt o om u c h m o s to ft h e ma r ed r o p p e da s r u b b i s h b a m b o op o l y s a c c h a r i d ei sak i n do fp l a n tp o l y s a e c h a r i d e ，w h i c hh a sv a r i o u sh e a l t h c a r ef u n c t i o n s t h e r ea x el o i so fb a m b o op o l y s a c c h a r i d ei nt h eb a m b o ol e a v e s b u tt h e r e a r e n tm a n y d i ps t u d i e so i lb a m b o op o l y s a c c h a r i d et i l ln o w t h ee x t r a c t i o na n ds e p a r a t i o nt e c h n i q u e ，s c a v e n g i n ga c t i v i t yt of r e er a d i c a l sw e r e s t u d i e da n dc o m p o u n db e v e r a g eo fb a m b o ol e a v e sw e r ed e v e l o p e di nt h i sp a p e r t h ea b o v e s t u d i e sc a np r o v i d er e f e r e n c e sf o ra p p l i c a t i o na n de x p l o r a t i o no fb a m b o or e s o u r c e sa n d t h e o r e t i c sg i s tf o re x p l o r a t i o no fb a m b o of u n c t i o n a lp r o d u c t s t h em a i nr e s u l t ss h o w e d ： 1 t h eo p t i m a lp a r a m e t e r so fe x t r a c t i n gb a m b o op o l y s a c c h a r i d eb yw a t e rw e r ea s f o l l o w s ：m a t e r i a l s o l v e n tr a t i o1 ：3 0 ，e x t r a c t i n g1 5 ha t8 0 f o rt w i c e t h ee x t r a c t i n g r a t er e a c h e d3 9 5 2 t h eo p t i m a lp a r a m e t e r so fe x t r a c t i n gb a m b o op o l y s a c c h a r i d eb yu l t r a s o n i cw e r e a sf o l l o w s ：u l t r a s o n i cp o w e r3 0 0 w , t r e a t i n g1 5 m i n ，m a t e r i a l s o l v e n tr a t i o1 ：1 5 t h e e x t r a c t i n gr a t er e a c h e d 4 2 2 3 t h eo p t i m a lp a r a m e t e r so fe x t r a c t i n gb a m b o op o l y s a c c h a r i d eb ym i c r o w a v e w e r ea sf o l l o w s ：m i c r o w a v ep o w e r6 0 0 w , t r e a t i n g6 r a i n , m a t e r i a l s o l v e n tr a t i o1 ：3 0 t h ee x t r a c t i n gr a t er e a c h e d4 1 4 4 t h eo p t i m a ls e d i m e n t a t i o nt e c h n i q u e so fb a m b o op o l y s a e e h a x i d ew e r ea sf o l l o w s ： u s i n ge t h a n o la sp r e c i p i t a t o r , c o n c e n t r a t i n gt h ee x t r a c tl i q u i dt o2 5t r u e s o ft h em a t e r i a l q u a l i t ya n da d d i n g4 t i m e s9 5 e t h a n o lo fc o n c e n t r a t e dl i q u i d t h es e d i m e n t a t i o nr a t e r e a c h e d7 1 5 t h eo p t i m a lt e c h n i q u e so fr e m o v i n gp r o t e i nf r o mc r u d eb a m b o op o l y s a c c h a r i d e w e r ea sf o l l o w s ：u s i n gt h em e t h o do fe n z y m ea n ds e v a gt or e m o v ep r o t e i n a tf i r s t 1 1 1 d e c o m p o u n d i n gt h ep r o t e i nb yp a p i a n ，a n dt h e nr e m o v i n gt w i c eb ys e v a g a n dt h e p r o t e i nh a sb e e nr e m o v e d7 4 3 6 u s i n gd e a e - - c e l l u l o s et oa n a l y z et h ec o m p o n e n to fb a m b o op o l y s a c c h a r i d e f o l l o w e db yd i s t i l l e dw a t e r o 1 ，0 3 ，0 5m o l ln a c ia n d4k i n d so fp o l y s a c c h a r i d e c o m p o n e n tw e r em e a s u r e d a n dn op o l y s a c c h a r i d ew a sm e a s u r e df o l l o w i n gb y 0 0 5 m o i ln a c l 7 t h ea n t i o x i d a t i o no fb a m b o op o l y s a c e h a r i d et ov e g e t a b l eo i lw a sw e a k e rt h a nv e b u ti tw a sp a r a l l e lt ov et of a t t h es c a v e n g i n gc a p a b i l i t yt os u p e r o x i d ea n i o nr a d i c a l w a sn o to b v i o u sa n dl e s st h a nv ca n dt h es c a v e n g i n gr a t ec h a n g e dal i t t l ea n da l ll e s s t h a n5 0 w i t ht h ec o n c e n t r a t i o ni n c r e a s e df r o m0 2 m g m lt o 1 o m g m lt h e s c a v e n g i n gc a p a b i l i t yt oh y d r o x y lr a d i c a lw a sp a r a l l e lt ov ca n dt h ei c 5 0w e r ea l la t 0 4 m g m l 8 t h eo p t i m a lm a k i n g - u pp r e s c r i p t i o no fc o m p o u n db e v e r a g eo fb a m b o ol e a v e sw a s d e t e r m i n e da sf o l l o w s ：o r g a n i cb a m b o oe x t r a c t7 0 ，c i t r i ca c i d0 0 7 ，h o n e y8 9 t h eo p t i m u mp a r a m e t e ro fs t e r i l i z i n gc o m p o u n db e v e r a g eo fb a m b o ol e a v e sw a s ： s t e r i l i z i n g5 m i n u t e su n d e rt h et e m p e r a t u r e8 5 1 0 t h ec o l o r - s u s t a i n i n gt e c h n o l o g yo fc o m p o u n d b e v e r a g eo fb a m b o ol e a v e sw a s ： a d d i n g2 0 0 p p md v c i nt h ec o m p o u n db e v e r a g eo fb a m b o ol e a v e s k e yw o r d s ：b a m b o op o l y s a c c h a r i d e ；e x t r a c t i o na n ds e p a r a t i o n ；a n t i o x i d a t i o n ； c o m p o u n db e v e r a g eo fb a m b o ol e a v e s ；p r o c e s s i n gt e c h n o l o g y 学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除文中已经注明引用的内容外，论文中不包含其他个人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得陕西师范大学或其它教育机构的学位 或证书而使用过的材料。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中 作了明确说明并表示谢意。 作者签名：型叁弛- 1 日期：葫，1 学位论文使用授权声明 本人同意研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属陕西师范大 学。本人保证毕业离校后，发表本论文或使用本论文成果时署名单位仍为陕西师 范大学。学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其它指定机构送交论文的电 子版和纸质版；有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校 图书馆、院系资料室被查阅；有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索 有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。 作者签名：嘴 日期： 丑：f 1 竹子 文献综述 1 1 竹子的药用价值 竹子是禾本科竹亚科多年生常绿植物，是当今世界最具有利用价值的植物之 一。全世界己记载的约有7 0 属1 2 0 0 多种竹子，广泛分布于东南亚，印度、中国南 部、南美和日本等地1 1 2 j ，我国素有“竹子王国”之称，是竹子中心产区之一，利 用竹子的历史可追溯到五、六千年前。竹子在我国文化发展史上起了重要作用。 我国竹类资源非常丰富，自然分布区很广，南至海南岛、北至黄河流域、东至台 湾、西至雅鲁藏布江下游，约相当于北纬1 8 3 8 0 和东经9 2 1 2 2 0 长江以南地区的 竹种最多，面积最大，生长最旺。现有竹种3 9 属6 0 0 多种，全国竹林面积现己达到 4 3 9 4 万公顷，( 不含台湾省，下同) ，占全国林地面积的2 7 4 ，其中毛竹林面积2 9 2 1 7 万公顷，竹林总蓄积达1 1 0 8 6 7 万吨，其中毛竹蓄积量达8 7 6 6 万吨( 5 8 4 4 亿株) ，占 7 9 0 7 | 3 1 。 竹子的医疗作用早己为我国人们所认识， 中国中药资源志要内1 2 6 9 4 种中 药中，竹类共收集1 0 属3 2 种，记入中国药典1 9 9 0 版的竹类植物近5 种。不同竹 种的竹叶、竹鞭根、竹茹、竹沥、竹捧、竹实( 米) 、竹秆、竹膏、竹黄、竹笋、竹 砂仁、竹荃、竹衣、竹精、竹鼠( r h i z o m y ss i n e n s i s g r a y ) ，竹蠢虫( l y c t u s b r u n n e u s s t e p h ) 、竹蜂( x y l o c o p a d i ss i m i l i sk p ) 等均有不同疗效l ”。其性淡、微涩、寒、味甘、 苦，具有清热利尿、明日解毒、止血、免疫调节、抗氧化、抗爱滋病和抗肿瘤等 功效1 1 6 1 ，在我国具有悠久的药用和食用历史。 本草求真e l ：“竹味据书载， 凉心缓脾、清痰止渴，为治上焦风邪烦热、咳逆喘促、呕岁吐血、一切中风惊痛 等症，无非因其轻能解上、辛能散郁、甘能缓脾、凉能人心、寒能疗热故耳。” 本经逢原载：“竹叶兼行肌表，故能疗疮杀虫”。药品化义载。竹叶清香 透心，微苦凉热，气味俱清。经日治温以清，心清心气，味淡利窍，使心经 热血分解。主治暑热消渴，胸中热痰，伤寒虚烦，咳逆喘促，皆用为良剂也。又 取清气入肺，是以清气分之势，非叶不能”淡竹叶始载于别录，被列为 中品，载：“大寒，无毒。主治胸中疾热，咳逆上气。”食疗本草日：。主咳逆， 消渴，痰饮，喉痹，除烦热。”历代医药家均有论述竹叶的食用和药用功效，贾 所学在药品化义中道：“竹叶清香透心，微苦凉热，气味俱清。”圣惠方 记载一食疗方：“淡竹( p h y l l o s t a c h y sg l a u c a ) 叶粥治4 , j l 心脏风热，精神忧惚，淡竹 叶6 0 9 粳米适量，茵陈1 5 9 ，作粥食之。”另据中药大辞典记载，淡竹叶功用 主治：清热除烦，生津利尿，治热病烦渴，小儿惊痈，咳逆吐血，面赤、小便短赤， 口糜舌疮等。 竹沥具有镇咳、祛痰、清肺热等功效，对其化学成分的研究表明其中除含氨 基酸、糖类之外，还含有愈创木酚、甲酚、苯酚、甲酸、乙酸、苯甲酸、水杨酸 等酚酸类组分。根据中药学的原理，清热解毒药的主成分多为黄酮和酚酸组分。 近年来我国植物研究工作者分别在散生和丛生竹叶中检出了黄酮成分，日本发现 刚竹的竹汁中存在微量的锗和硅，具有通便作用，能使人的血色好转。从箬竹属 四种竹叶中均提得多糖体b a m f o l i n 八b 两种，能提高正常和荷瘤动物的y 一球蛋白 含量，对s i m 、艾氏实体瘤有一定的抑制率i 州。国外从碧竹叶中提取多糖用于治疗 食道癌、胃癌等1 1 种晚期癌症，竹叶多糖对晚期癌的恶液质有防治功效，毛竹笋 入药对艾氏腹水瘤和肉瘤有抑制作用，是较好的营养防癌物i 训。 1 2 竹子的利用现状 竹类植物作为森林资源的重要组成部分，不仅有着较高的经济价值，而且具 有广泛的生态与社会效益。竹子以其独特的生物学、生态学及多用途等特点，日 益受到人们的重视，在中国可持续发展战略中正发挥着越来越重要的作用。 竹材是竹林的主产品，竹材工业利用主要有：竹浆造纸、竹质人造板、竹家 具和日用品、竹工艺品等。据不完全统计，中国有1 亿多人口全部或部分从竹林和 竹林产品加工中获取生活费用。竹材工业是我国轻工业中一个独具特色的组成部 分，也是地方工业的一个重要经济部门。近些年来，在改革开放大潮的推动下， 我国的竹材工业迅速发展。据有关资料统计，1 9 9 0 年我国竹产业总值约5 5 亿多元， 其中竹产工业产值约1 5 2 0 亿元，外贸出口超过1 5 亿美元1 7 j 。 竹笋作为食物在我国已有2 5 0 0 多年的历史，近年来更是受到有识之士的推崇， 竹笋作为食品具有下列优点：营养丰富、无污染和残毒、低脂减肥、美味可口、 具有一定的保健作用。竹笋的种类繁多，有开发利用价值、可形成生产规模的不 少于3 0 种。全国可产竹笋面积在2 0 0 万公顷以上，年产鲜笋1 2 5 万吨以上。以竹材、 竹笋和其他竹产品为原料可以生产多种多样的天然食品。竹笋和竹笋制品、竹子 食用菌、竹木糖醇和竹叶饮料是目前我国着重开发的食品1 8 j 。 目前，竹子已广泛地应用于工业生产、工艺品的制作、食品加工、医药制造等行 业，但与竹子的整株利用相比，竹叶的开发明显滞后，基本上还处于原始的初级 阶段：绝大部分自然落叶、腐烂后成为优质的有机肥；在某些地区作为冬春季的牛羊 2 青饲料：近年来有一部分竹叶、竹屑用作竹子食用菌的培养基原料。竹叶是一类相 当大的潜在资源，竹叶的利用还有待进一步地开发。竹叶是竹材加工过程中的一 项副产品，早在1 9 9 8 年( 淡) 竹叶就被卫生部正式批准列入“药食两用的天然植物名 单”。但目前对竹叶的利用还很有限，竹叶大部分还是以一种加工废弃物处理， 未能得到充分的利用。对竹叶的研究也主要集中在竹叶黄酮及其生物活性和药理 方面的研究，而对于竹叶多糖及其作用机理等方面的研究还不够深入i l o l 。 1 3 竹叶有效成分和其他有用成分 近年来的研究表明，竹叶中含有大量的黄酮类化合物和生物活性多糖及其它 有效成分，如酚酸类化合物、葱酮类化合物、砧类内酷、特种氨基酸和活性肤、 芳香成分和锰、锌、硒等微量元素1 3 1 1 嘲。 1 3 1 竹叶活性多糖 研究发现，竹叶中含有活性多糖，其含量按干青叶计，一般在1 0 0 7 0 0 m g l o o g 之间。 1 3 2 竹叶黄酮及其甙类 有关学者对6 属1 7 种竹子中竹叶黄酮类成分进行过定量研究，竹叶以醇提取， 平均得总黄酮1 9 7 ，即平均含量在2 左右。 1 3 3 竹叶特种氨基酸 从桂竹和金毛竹的竹叶及提取物中分离得到了一种有相当含量的羟化氨基 酸，a p d - 羟基赖氨酸( n h 2 c h 2 c h ( o h ) c h 2 c h 2 c h ( n h a ) c o o h ) ，主要以游离单体 和小肽形式存在。其中，d - o h l y s 有比l y s 更高的清除超氧阴离子( 0 2 - ) 的能力1 1 6 1 。 1 3 4 竹叶芳香成分 对阔叶箬竹、金毛竹和四季竹的竹叶精油和头香，分别检出风味化合物5 7 种、 6 8 种和8 2 种，共1 4 4 种，其中2 2 种为3 种竹子所共有的，约占总挥发物的6 0 7 0 。 芳香成分以醛、醇、呋喃、酮类为主，c 6 c 8 中等长度碳链的含氧化合物占主导 地位，是竹叶清香的物质基础i 切。 1 3 5 竹叶矿质元素 通过对箬竹、刚竹、毛竹、雷竹和清竹竹叶进行矿质元素测定，检出了2 0 多 种矿质元素。其中富含人体必需的f c 、c a 、s i 等常量元素和z n 、m n 、c u 、n i 等 微量元素。 3 2 多糖 2 1 多糖概述 多糖( p o l y s a c c h a r i d e ) 又称多聚糖，是由2 0 个以上的单糖以糖苷键相连组成 的聚合物。它是组成高分子化合物家族中最丰富多彩的成员。多糖是来自于高等 植物、动物细胞膜、微生物的细胞壁中的天然大分子物质，是所有生命有机体的 重要组成成分与维持生命所必需的结构材料l 捌。人们对糖的认识首先是把它看作 食物中的能量来源瞄j 。早在1 0 0 多年前，德国著名科学家e f i s c h e r 就开始了搪类研 究。糖类化学的先驱者m i w o l f r o m 自二十年代起，多年坚持致力于糖类结构的测 定，成功地对肝素这种难处理的多糖，用乙硼烷还原其骨架的糖醛酸部分，以便 于用裂解法进行结构分析1 2 4 l 。至5 0 年代，陆续发现一些真菌多糖和高等植物多糖 具有明显的抑瘤活性。但其作为广谱免疫促进剂而引起人们的极大重视是在6 0 年 代，经过4 0 余年的不断发展，人们对多糖这一类重要生命物质产生了新的认识i 硎。 7 0 年代以来，科学家们发现多糖及糖复合物参与和介导了细胞各种生命现象的调 节，特别是免疫功能的调节，多糖尤其是中药多糖因具有增强机体免疫功能及抗 肿瘤等药理作用，而且几乎没有毒性并可通过化学手段控制其质量，愈来愈引起 国内外药理学家、生物学家和化学家们的兴趣，成为当前的研究热点l 冽。8 0 年代 又发现多糖的糖链在分子生物学中具有决定作用，能控制细胞分裂和分化，调节 细胞的生长和衰老 2 7 1 。8 0 年代末形成新型学科“糖生物学( g l y c o b i o l o g y ) ”和“糖 工程学( g l y c o t e c l m o l o g y ) ”，发展极其迅速，并将成为二十一世纪的重大前沿学科 之一【冽。 近十多年来，由于膜的化学功能、免疫物质的化学研究与发展以及新药物资 源的寻找与研究等，人们对多糖及其复合物作用的认识越来越深入，发现糖类在 生物体内不仅作为能源物质或结构材料， 种活动，具有丰富多彩的生物活性其中， 更重要的是参与了生命现象中细胞的各 一些分子量在几千以上、具有很强生物 活性的多糖受到日益重视的研究，它们的生理活性、化学结构以及构效关系成为 多糖研究的前沿阵地，取得了很大的进展 2 9 1 。日本历来重视多糖的研究，在9 0 年 代初创刊了糖科学与糖工程动态杂志，出版了专著糖工程学，近年来日 本加强了对中药多糖活性决定簇等的化学结构与功能关系的系统研究，并在柴胡、 当归等中药的研究方面有一定的突破i m j 。其他国家和政府也十分重视多糖的研究， 美国能源部于1 9 8 6 年创建了复合搪类研究中心，建立了复合糖类数据库。欧盟九 十年代将“欧洲糖类研究开发网络”作为一项重要的计划旧。人们把糖生物学 4 ( g l y c o b i o l o g y ) 称做生物化学最后一个“伟大的战线”p j 。 我国在多糖方面的研究起步较晚，尚未形成多糖生物学、化学及多糖药用相 关的研究机构和研究战略。1 9 8 2 年，糖复合物的生化技术研究技术的出版，标 志我国在糖化学方面的研究工作已经有了一个较好的开端1 3 4 j 。1 9 9 6 年我国将其列 为国家重点课题。研究的对象涉及真菌类、地衣类、植物以及花粉、动物等；研 究的范围包括多糖的分离纯化、结构分析、理化性质、免疫学、药理学以及治疗 应用等，对其免疫增强作用机理的研究已深入到分子、受体水平：研究的方法涉 及化学、生物学、医药学等诸多领域1 。目前，从天然产物中提取分离出来的多 糖己达3 0 0 多种，其中以植物多糖，尤其是中草药中水溶性的多糖最为重要。科学 工作者逐渐发现多糖类化合物具有抗肿瘤、抗衰老、抗感染、降血糖血脂、治疗 艾滋病等方面的生物活性。近年来，又发现多糖的糖链在控制细胞的分裂和分化， 调节细胞的生长和衰老方面起着决定性作用，多糖己逐渐显示出越来越广泛的应用 前景。 2 2 多糖提取 多糖作为一大类天然产物，来源十分丰富，广泛存在于动物、植物、微生物 ( 细菌和真菌) 和海藻中( 如植物的种子、茎和叶，动物粘液，昆虫及甲壳动物 的壳真菌，细菌的胞内外等) ，从动植物器官组织、菌类及微生物发酵产物中可得 到不同种类的多糖。在提取多糖之前，首先要根据多糖的存在方式及提取部位的 不同，决定是否作预处理。动物多糖和微生物的细胞内多糖多有脂质包围，一般 需先加入醇或醚进行回流脱脂，释放多糖，然后依多糖性质( 如酸碱性、胞内或 胞壁多糖) 再将脱脂后的残渣采用冷水、热水、冷或热的氢氧化钠、乙酸或苯酚 等溶液提取。溶剂性质、浸提温度、时间等均影响提取效果。一般植物细胞壁比 较牢固，在提取前需进行专门的破细胞操作，包括机械破碎( 研磨法、组织捣碎法、 超声波法、压榨法、冻融法) 、溶胀和自胀、化学处理和生物酶降解。因此，植物 多糖提取的研究中采用了许多不同的方法，包括溶剂提取法、酸提法、碱提法、 酶解法、超滤法、超声波强化法、微波法。 2 2 1 溶剂提取法 溶剂提取法指利用溶剂从植物中把所需要的有效成分溶解出来，而对其它成分不 溶或少溶i 删。溶剂提取法是从植物中提取多糖的常用方法。溶剂提取法首先要考 虑的因素是选择溶剂，一般都应遵循相似相溶的原则，即极性强的有效成分选择 极性强的溶剂，极性弱的有效成分选择极性弱的溶剂。例如，糖类、氨基酸等极 性较大的物质应选择水、醇等亲水性的溶剂，萜类、甾类等脂环类及芳香族类化 5 合物因其极性小，应选择极性小的氯仿、乙醚等亲脂性溶剂旧。多糖是极性大分 子化合物，应选择水、醇等极性强的溶剂。在所有溶剂中，水是典型的强极性溶 剂，对植物组织的穿透力强，提取效率高，在生产上使用安全。它能用于各种植 物多糖，被广泛应用【圳。用水作溶剂来提取多糖时，可以用热水浸煮提取，也可 以用冷水浸提。水提取的多糖多数是中性多糖。除了选好适宜的溶剂外，影响提 取率的因素还有提取温度、提取时间、溶剂用量以及物料的粒度等。应根据提取 目标物，综合考虑，选择适宜的溶剂、提取温度、提取时间、溶剂用量等。一般 植物多糖提取多数采用热水浸提法，该法所得多糖提取液可直接或离心除去不溶 物；或者利用多糖不溶于高浓度乙醇的性质，用高浓度乙醇沉淀提纯多糖；但由 于不同性质或不同相对分子质量的多糖沉淀所需乙醇浓度不同，它也可以用于样 品中不同多糖组分的分级分离：还可按多糖不同性质在粗分阶段利用混合溶剂提 取法对植物中不同的多糖进行分离；其中，以乙醇沉淀最为普遍【3 9 l 。溶剂提取为 常用的传统方法之一，有自身的优点，如不需特殊设备，成本低等，溶剂提取对 热敏物质破坏少，采用多级萃取时，溶质浓缩倍数和纯化度高，便于连续生产， 生产周期短，但此法往往溶剂消耗量大，对设备和安全要求高j 4 0 1 ，提取效率低又 费时，因此，近年来，伴随着现代工业工程技术的迅猛发展，一些现代高新技术 不断被应用到植物多糖的提取中。 2 2 2 酸提法 有些多糖适合用稀酸提取，并且能得到更高的提取率。赵宇等【4 l j 对海篙子多 糖的提取方法研究发现，从硫酸根含量及粗多糖产率看酸提方法好于水提方法。 孟宪元等【4 2 】在茜草多糖提取研究中发现相对于水提。以稀酸提取茜草多糖产品纯 度较高。但酸提法有其特殊性只在一些特定的植物多糖提取中占有优势目前报道 的不多。酸提法在操作上还应严格控制酸度因为酸性条件下可能引起多糖中糖苷 键的断裂。 2 2 3 碱提法 碱提法与酸提法类似，有些多糖在碱液中有更高的提取率，尤其是提取含有 糖醛酸的多糖1 3 9 l 及酸性多糖。采用稀碱提取：多为0 1 l m o l ，喙氧化钠、氢氧化 钾，为防止多糖降解，常通以氮气或加入硼氢化钠或硼氢化钾。同样，碱提法优 势也是因多糖类的不同而异。与酸提法类似，碱提法中碱的浓度也应得到有效控 制，因为有些多糖在碱性较强时会水解1 4 3 1 。另外，稀酸、稀碱提取液应迅速中和 或迅速透析，浓缩与醇析而获得多糖沉淀。 2 2 4 酶提法 酶技术是近年来广泛应用到有效成份提取中的一项生物技术，在多糖的提取 6 过程中，使用酶可降低提取条件，在比较温和的条件中分解植物组织，加速多糖 的释放或提取i 州。此外，使用酶还可分解提取液中淀粉、果胶、蛋白质等非目的 产物，常用的酶有蛋白酶，纤维素酶，果胶酶等l 州。酶提法的优势越来越受到研 究人员的关注，因此有众多关于各种酶在多种植物多糖提取中的应用的报道。此 外，新酶的开发利用也有着广阔的前景。 2 2 5 超滤法 超滤是一种膜分离技术所采用的超滤膜能够从水和其他液体中分离出很小的 胶体和大分子。由于超滤膜具有不对称微孔结构，且采用磨擦流道和湍流促进结 构减少膜污染，使得在分离过程中大分子溶质和微粒( 如胶体，淀粉等) 随溶液切向 流经膜表面，而小分子物质和溶剂则在压力驱动下穿过致密层上的微孔进入膜的 另一侧，超滤膜可以长期连续使用并保持较恒定的产量和分离效果。将超滤膜用 于多糖这种生物活性物质的分离，具有保护活性、分离效率高、能耗低、设备简 单、可连续生产、无污染等优点。 2 2 6 超声提取 超声提取法l 吲是应用超声波强化提取植物多糖的方法，是一种物理破碎过程。 超声波是频率在2 0 k h z 以上的声波，人的听觉阈以外的声波，具有频率高、波长短、 功率大、穿透力强等特点。一般认为，超声波对提取过程的强化作用来源于超声 空化对媒质主要产生独特的机械振动作用和空化作用。当超声波振动时能产生 并传递强大的能量，引起媒质以大的速度加速进入振动状态，使媒质结构发生变 化，促使有效成分进入溶剂中，同时，超声波在液体中还会产生空化作用( 即在有 相当大破坏应力的作用下，液体内形成空化泡的现象) 。空化泡在瞬间涨大并破裂， 破裂时吸收的声场能量在极短的时间和极小的空间内释放出来，形成高温和高压 的环境，同时伴随有强大的冲击波和微声波，从而破坏细胞壁结构，使其在瞬间 破裂，植物细胞内的有效成份得以释放，直接进入溶剂并充分混合，从而提高提 取率。此外，超声波还产生许多次级效应如热效应、乳化、扩散、击碎、化学效 应、生物效应、凝聚效应等也能加速植物有效成份在溶剂中的扩散释放，有利于 提取。超声波的热效应，机械作用，空化效应是相互关联的，通过控制超声波的频率 与强度可突出其中某一作用，减小或避免另一个作用，以达到提高有效成分提取 率的目的1 4 5 1 。在国外，超声波提取法在中草药化学成分提取中应用比较早，r o s e 等利用超声波从萝芙木属植物的根中提取生物碱，d e m a g g l o 等从曼佗罗叶中提取 曼佗罗碱，o v a d i a 等从吐根中提取生物碱，在国内，目前超声波提取法在中草药化 学成分提取中应用比较多，在黄茂、天麻、益母草、大黄等中草药有效成分的提 取中均有报道1 4 6 - 5 “。与常规提取法相比，超声波提取可缩短提取时问，提高提取 7 率，所以超声提取在植物多糖的提取中得到广泛应用。 2 2 7 微波提取 微波是频率介于3 m h z 和3 0 0 0 m h z 之间的电磁波，位于电磁波谱的红外辐射和 无线电波之间1 5 2 1 。微波提取是利用微波的穿透性能够透入基质内部形成内热源， 利用其加热的选择性，能够使细胞内各细胞器升压，细胞壁破裂，使位于细胞内 部的有效成份从细胞中释放出来，传递转移到溶剂周围被溶剂溶解。此法提取时 间短提取率高是强化固液提取过程颇具发展潜力的一项新型辅助提取技术1 5 3 1 。近 年来微波技术开始应用于中药有效成分的提取，如g a n z l e r 从棉籽中提取棉子糖， 从豆类中提取豆碱，国内也有人将微波技术应用于甘草、黄蔑、红景天、麻黄、 槐花、雪莲等有效成分的提取1 5 4 - 6 ”。 2 3 多糖的分离 2 3 1 脱蛋白 多糖粗提物中含有大分子蛋白质，脱蛋白质是分离多糖的重要步骤。首先将 多糖粗提物中的游离蛋白脱去。游离蛋白去除的方法1 6 2 捌】有s e v a g e 法，三氟三氯乙 烷法，三氯乙酸法，酶法或酶法- 与s e v a g e 法结合，等电点沉淀法。 2 3 1 1s e v a g e 法 利用蛋白质在三氯乙烷等有机溶剂中变性的特点，将s e v a g e 试剂【氯仿：正丁醇 = 5 ：1 ( v v ) 混合】溶液按1 ：5 加入到多糖提取液中，混合物经剧烈振摇后离心，变性蛋 白即可从水层中分出，位于水与氯仿层的界面，离心除去。此法的优点是条件温 和不会引起多糖的变性，但是效率不高，一般要脱除5 次左右方可除尽蛋白质。 2 3 1 2 三氟三氯乙烷法 将提取液与三氟三氯乙烷1 ：1 ( v ，v ) 混合振荡离心，蛋白质即可由水溶液转到溶 剂层中。此法效率高，但因溶剂沸点低，易挥发，不能大量使用。 2 3 1 3 三氯乙酸法 利用三氯乙酸沉淀蛋白质的原理，将提取液与2 0 3 0 的三氯乙酸溶液按 1 ：l ( v v ) 混合在低温下搅拌，蛋白质在三氯乙酸的作用下形成胶状析出，离心弃沉 淀，即可达到脱蛋白的目的。存在于溶液中的三氯乙酸经中和后，通过透析或超 滤等方法除去。此法较为剧烈，会破坏含呋喃糖残基的多糖但效率高，操作简单， 植物多糖多采用此法。 2 3 1 4 木瓜蛋白酶法 在提取液中加入定量的木瓜蛋白酶粉或预先将木瓜蛋白酶配制成一定浓度再 加入提取液中保温一定时间将蛋白质水解，后离心加以脱除的方法，是目前认为 8 较好的脱蛋白质的方法。 2 3 2 脱色 多糖中常含有一些色素( 游离色素或结合色素) ，根据其不同性质采取不同的方 法。常用的脱色方法有：离子交换法、氧化法、金属络合物法、吸附法( 纤维素、 硅藻上、活性炭等1 。d e a e 纤维素是目前最常用的脱色方法，通过离子交换柱不 仅达到脱色的目的，而且可以分离多糖。h 2 0 2 是种氧化脱色剂，浓度不宜过高 且在低温下进行，否则引起多糖的降解i 吲，如红毛五加多糖采用的就是这种方 法脱色。对于同时含有游离蛋白质和色素的多糖，可通过生成金属络合物的方法， 同时除去蛋白和色素。吸附脱色法也常用，如桑叶多糖m 采用活性炭脱色。对于 植物来源的多糖，可能含有酚类化合物而颜色较深，这类色素大多呈负性离子， 不能用活性炭吸附剂脱色，可用弱碱性树脂d e a e 纤维素或d u o l i t ea - 7 来吸附色 素，若糖与色素是结合的，易被d e a e 纤维素吸附，不能被水洗脱，这类色素可进 行氧化脱色。 2 3 3 除盐及小分子物质 除去盐及小分子物质是为以后进一步纯化及色谱分析作准备，最古老的去离 子方法是透析法，必需选择一种规格适宜的透析膜以免样品损失，透析方法不仅 能去盐也可以除去各种小分子物质。使用柱离子交换法如用s e p h a d e xg 2 5 以达到 去离子作用，本法比较简单，但是增大了溶液的体积，影响多糖的沉淀结果。纤 维滤器透析法是根据膜技术而新发展起来的，以这种方式对大多数样品进行浓缩 速度很快，而且温和，所以即使发生失活也是很小的。利用不同孔径的膜有可能 使大小不同的分子分级。但这个方法的分辨率要比分子筛层析可能达到的小得多。 2 4 多糖的纯化 上述经过脱蛋白、脱色和去除小分子杂质的提取液是含多种组分的多糖混合 物，即是多分散性的。其不均一性表现在化学组成、聚合度、分子形状等的不同。 要得到单一的多糖组分，还需要进行纯化。通常采取的纯化方法有分级沉淀法、 柱层析法等i ”硝叫。 2 4 1 分级沉淀法 利用不同分子量的多糖在不同浓度低级醇或低级酮中溶解性不同的原理，逐 步提高溶液中醇或酮的浓度，使不同组分的多糖依分子量由大至小的顺序沉淀可 达到分离的目的。常用的沉淀剂有甲醇、乙醇和丙酮。 2 4 2 柱层析法 离子交换层析法，利用不同多糖分子电荷密度不同，而与离子交换剂中的离 9 子或某些基团发生电性结合。其亲和力随多糖结构与电离性质而异，一般随分子 中酸性基团的增加而增强，现状分子、分子量较大的多糖亲和力较强，支链多糖 较直链多糖更易吸收。常用的离子交换剂有树脂类、纤维素类和葡聚糖类，可处 理为酸性、碱性和硼砂型，洗脱剂可用水、不同浓度盐溶液、碱溶液、硼砂溶液。 阴离子交换柱层析法适用于各种酸性、中性多糖和糖胺聚糖的分离纯化。 凝胶柱层析法，常用的凝胶有葡聚糖凝胶( s e o h a d e x ) 和琼脂糖凝胶 ( s e p h r o s e ) 。以不同浓度的盐溶液和缓冲液作为展开剂，其离子浓度最好高于 0 0 2 。本法除进行多糖分级外，还可以用于小分子杂质的去除，或者在乙醇沉淀法 进行分级后，再根据分子大小进一步分级。 2 4 3 其他方法 利用不同多糖分子大小、形状及荷电不同而在电场作用下达到分离目的的制 备性电泳，分离效果较好。用已知超滤膜分离不同形状与分子量大小的多糖的超 滤法。以多糖与抗血清产生选择性沉淀为原理的亲和层析法。以及具有快速高效 特点的制备性高效液相层析法，已有效的应用于小规模纯品制备中。此外，多糖 纯化的方法还有盐析法、季铵盐沉淀法、金属络合法等。 2 5 多糖的纯度和分子量测定 经过分级纯化的多糖在测定结构前须进行纯度鉴定。多糖的纯度不能用通常 化合物的纯度标准来衡量，因为即便是多糖纯品，其微观也是不均一的，仅代表 相似链长的多糖分子的平均分布，通常所谓的多糖纯品也只是一定相对分子质量 范围的多糖的均一组分1 7 0 - 7 2 1 。目前常用于多糖纯度的鉴定方法有： 2 5 1 凝胶柱层析法 根据分子质量范围，选择不同的凝胶，常用的凝胶有s e p h a d e x 、s e p h a r o s e 、 s