（农产品加工及贮藏工程专业论文）猪肺中胶原蛋白的提取及理化特性研究.pdf

中文摘要 猪肺中胶原蛋白的提取及理化特性研究 农产品加工及贮藏工程专业硕士研究生李小勇 指导教师李洪军教授 中文摘要 胶原蛋白( 也称胶原) 是一种多糖蛋白，呈白色或乳白色，含有少量的半乳糖和葡萄糖， 是细胞外基质( e c m ) 的主要成分，约占胶原纤维同体物的8 5 ，占体内蛋白质总鼙的2 5 3 0 0 o ，相当于体重的6 。胶原蛋白中含有大量的甘氮酸，约占总氨基酸的1 ，3 ，其一级结构均 为“g l v x y ”重复序列。胶原蛋白作为天然的生物资源，具有优越的生物相容性和生物可降 解性，广泛应_ f j 于食品、饮料，保健品、医疗产品、化妆品及整形手术中。 我国是养猪大国，每年要产出近5 0 万吨猪肺。目前，猪肺基本上都用作猪或宠物饲料， 没有得到很好的利用，有的屠宰场甚至根本没回收处理，既浪费资源，又污染环境；如果用 来提取胶原蛋白，至少增值2 0 5 0 倍。 本文测定了猪肺中胶原蛋白的含量，主要研究了提取时猪肺中非胶原蛋白成分的去除： 胶原蛋白提取过程中各种因素对提取效果的影响，最终从4 种提取方法中找出一种最佳提取 方法；提取的粗胶原蛋白的纯化；纯化后的胶原蛋白的基本理化特性。目前，尚未见文献报 道从猪肺中提取胶原蛋白，因此本文的研究能填补这方面的空白。现将主要研究结果总结如 下： ( 1 ) 猪肺的总蛋白含量为1 2 5 l - + 0 4 1 ，粗脂肪含量为3 o l - 0 2 0 ，水分含量为8 3 1 7 4 - 0 3 3 ，胶原蛋白含量为3 0 8 o 1 2 。与参考值之间差别不显著。 ( 2 ) 用丙酮，5 n a 2 c 0 3 ，l ：l 乙醚+ 石油醚，石油醚浸泡几种试剂脱脂，1 ：i 乙醚：石 油醚的脱脂效果相对较其它试剂脱脂效果好，但效果都不显著。去除杂蛋白的条件为：4 n a c l 溶液，体积比1 ：8 ，处理时间8 h 。 ( 3 ) 四种提取方法中，木瓜蛋白酶与柠檬酸结合提取得率最高，达到4 7 3 ，提取条件 为：o 1 m o l l 柠檬酸溶液，最适p h 6 0 ，酶辟j 量为1 5 ( w w ) ，猪肺颗粒大小用1 0 0 0 0 转下 捣碎8 0 s 来控制，体积比1 ：1 5 ，处理时间7 0 h 。 ( 4 ) 猪肺胶原蛋白热变性温度为3 5 4 0 。c ；其中醋酸提取的猪肺胶原蛋白特性粘度为 9 1 d v g ，柠檬酸提取的猪肺胶原蛋白特性粘度为9 5 6d v g ，酸性蛋白酶结合醋酸提取的猪肺胶 原蛋白特性粘度为8 8d v g ，木瓜蛋白酶结合柠檬酸提取的猪肺胶原蛋白特性粘度为8 5 6d v g 。 ( 5 ) 木瓜蛋白酶结合柠檬酸提取的猪肺胶原蛋白溶液在浓度为o 4 时，乳化性及乳化稳 定性分别为5 2 7 和6 4 。而浓度超过0 2 之后，乳化性增加趋势明显，而乳化稳定性增加 已不明显。猪肺胶原蛋白在p h 6 0 时乳化性达到最大值4 8 8 9 ，而乳化稳定性在p h 3 0 和p h 8 0 i 西南人学硕士学位论文 达剑最大值5 6 。 ( 6 ) 木瓜蚩自酶结合柠檬酸提取的猪肺胶原蛋白，在r h 4 3 的条件下，吸湿性比较低， 在6 0 h 达到最大2 1 7 ，之后逐渐一f 降；当吸湿性达到最大后，再过2 4 h 其保湿性都比较强， 达到5 3 1 9 。而在r h 引的条件一f 在2 4 h 时其吸湿度已经很大，在3 6 h 达到最大5 2 0 3 ，之后逐渐一f 降；在吸湿性达到最大后，再过3 6 h 其保湿性都很强，达到7 1 8 8 ；到4 8 h 还能达到4 0 6 2 。结合上面的吸湿实验，猪肺胶原蛋白在实际应用中最好在r h8 l 的条件 下使用。 关键字：猪肺胶原蛋白提取理化特性 u a b s t r a c t s t u d yo ne x t r a c t i o na n dt h ep h y s i c a la n dc h e m i c a lp r o p e r t i e s o fp o r kl u n g c o l l a g e n p r o d u c ep r o c e s s i n ga n ds t o r a g ee n g i n e e r i n g c a n d i d a t e ：x i a o y o n gl i a d v i s e r ：p r o f h o n g j u nl i a b s t r a c t c o l l a g e nw a sat y p eo fp o l y - g l y c o p r o t e i n , w h i t eo ri v o r y - w h i t e ，i n c l u d e ds o n i cg a l a c t o s ea n d g i l u c o s e c o l l a g e ni st h em a i np r o t e i no fe x t m c e l l u l a rm a t r i x ( e c m ) ，a c c o u n t e df o ru pt o8 5 o f t h ew e i g h to f t h ec o l l a g e nf i b r e ，a b o u t2 5 3 0 o f t h ew e i g h to f t h et o t a lp r o t e i n ，a n da b o u t6 o f a v o i r d u p o i s c o l l a g e na n dw a sr e s p o n s i b l ef o rt h er e s i l i e n c ea n de l a s t i c i t yo ft h es k i n c o l l a g e n s e l e m e n t a r ys t r u c t u r ew a s g l y - x - y ”，h a da b o u t1 3g l y c i n b e c a u s eo fi t ss p e c i a lb i o l o g i c a l p r o p e r t i e s ，f o rm a n yy e a r s ，i n j e c t a b l eb o v i n e ，p o r c i n e ，o rp o l y m e r i z e dc o l l a g e n sw e r es a f e l ya n d e f f e c t i v e l yu s e da sab i o m a t e r i a lf o rd e r m a la u g m e n t a t i o no rf o rt h ec o r r e c t i o no fd e r m a ld e f e c t s c a u s e db ya g i n g ，a c h es c a r s , o rt r a u m a ，c o l l a g e nw e r ew i d e l yu s e di nf u n c t i o n a lf o o d s ，c o s m e t i c ， b e v e r a g e ，p l a s t i cs u r g e r y , t o o c h i n aw a sas u p e r p o w e ro fp i gi n d u s t r y , p r o d u c e da b o u t0 5m i l l i o nt o n sp o r kl u n gp e ry e a a t p r e s e n t , m o s to f i tu s e df o rf e e d so f p i go fp e t ，f u r t h e r m o r e ，m a n yp o r ka b a t t o i r sd i dn o tr e c o v e r yi t a ta ni nc h i n a w h i c hw a s t e dr e s o u r c e ，p o l l u t e de n v i r o n m e n t ，t o o i t sv a l u ew o u l di n c r e a s e2 0 - - 5 0 t i m e sa tl e a s t , i f u s e di tt oe x t r a c tc o l l a g e n t h i sp a p e rd e t e r m i n e dt h ec o n t e n to fc o l l a g e ni np o r kl u n g t h er e m o v i n go fg r e a s ea n d n o n - e n l l a g e np r o t e i n s ，t h ee f f e c tf a c t o r st oe x t r a c tc o l l a g e nf r o mp o r kl u n g ，( c o l l a g e n s ，b a s e do nt h e p r e p a r a t i o np r o c e s s e s ，c a nb ed i v i d e di n t os a l ts o l u b l ec o l l a g e n ，a c i ds o l u b l ec o l l a g e n ，a n dp e p s i n s o l u b l ec o l l a g e n a l t h o u g haf e ws t u d i e sa p p l i e dc o l dn e u t r a ls a l ts o l u t i o n sf o rc o l l a g e ne x t r a c t i o n ， t h es o l u b l ef r a c t i o no b t a i n e db yt h i sm e t h o dh a sav e r yl o wc o l l a g e ny i e l da n dc o n t a i n sal a r g e p o r t i o no fn o n - c o l l a g e np r o t e i n s s o ，i nt h i sp a p e ro n l yt h ea c i dp r o c e s sa n dt h ee n z y m a t i cm e t h o d w e r ec o v e r e d ) t h ep u r i f i c a t i o no f p o r kl u n gc o l l a g e n a c d ，即酶用 量 p h 体积比 提取时问；从杂蛋白的角度来说，影响最大的因子也是酶用量。组合 a 2 b 正l d 2 即p h 2 5 ，酶用量1 0 ，体积比l ：8 ，提取时闻6 4 h ，胶原蛋白的提取率相对晟高， 但杂蛋白含量也较高。综合考虑胶原蛋白的提取率和杂蛋白的影响，最终确定a 2 8 2 c 3 d i 为最 佳提取组合，即p h 2 5 ，酶用量5 o ，体积比l ：1 2 ，提取时间5 8 h 时，因单网子实验没做 a 2 8 2 c ，d i ，通过验证实验表明a 2 8 2 c 3 d l 的提取方案切实可行。 4 3 4 2 木瓜蛋白酶与酸结合提取 4 3 4 2 1 酸的种类的确定 3 5 躺 m m 圳 珈 2 5 6 2 6 2 6 们 妄： ：兮 舛 盯 i 2 3 3 l 2 2 2 2 2 3 两南大学硕十轻吡论文 l 蒸腔原蛋白浓度。杂蛋白浓度! l l 0 钿o l 1 醋酸也l m o l l 拧攘酸 酸豹种类 图2 3 术瓜蛋白酶提取艘种类的确定 f i 9 2 3t h es o r t o f a c i d i oe x t r a c tc o l l a g e n b y p a p a i n 实验结果如图2 3 ，术瓜蛋白酶与o 1 m o l l 的柠檬酸结合使用效果比与0 5 m o l l 的醋酸结 合使用效果显著，结合查阅的资料，摄后确定用0 1 m o l l 的柠檬酸酸与木瓜蛋白酶结合使用。 4 3 4 2 2 酶最适作用p h 的确定 l + 胶原蛋白浓度+ 杂蛋白浓度l 4 05 06 07 08 09 0 p h 图2 4 术瓜蛋白酶最适作用时i 的确定 f i 9 2 4 t h ep ho f a c i ds o l v e n tt oe x t r a c tc o l l a g e nb yp a p a i nw i t hc i t r i ca c i d 实验结果如图2 4 在p h 6 0 7 0 之问，提取效果非常好，而在p h 7 0 时杂蛋白的值也相对 较高，因此最后确定术瓜蛋白酶作用的最适p h 为6 0 。 4 3 4 2 3 酶用量的确定 l n n o n l-譬一链棰蟮fj端 一i，6e一避艇嘲荣 ；5；3 巧2 12， 惦 o 0 o 0 n n o o 5 1 5 1 5 9 l 仰 蚴 n l圳，6s毯艇皿嘲隧甾 第4 章猪肺胶原蛋白的提取 l 二 胶原驰宣量二! 二参堡例 o 5 l 0 l 5 2 0 2 5 酶用量 图2 5 木瓜蛋白酶酶用量的确定 v i 9 2 st h ed o s eo f p a p a i nt oe x 口a c tc o l l a g e n 实验结果如图2 5 ，随着酶用量的增加，胶原蛋白提取量也增加，但超过1 5 之后，增加 幅度已不太当达到2 5 时，胶原蛋白还发生了一定程度的分解，而且随着酶_ l i j 量的增加， 成本也会增加，因此，最后确定术瓜蛋白酶的最适用量为1 5 。 4 3 4 2 4 体积比的确定 + 胶原蛋白总量- - - o - - - 杂蛋白总量l 1 ：0 8l ：l ol ：1 2l ：1 51 ：2 0 3 5 3 0 2 5 鑫 增 2 0 蔷 妊 1 5 1 0 体积比 幽2 6 木瓜蛋白酶提取体积比的确定 f i 9 2 6t h er a t i oo f r a wm a t e r i a lt op a p a i ns o l u t i o nt oe x t r a c tc o l l a g e n 实验结果如图2 6 随着体积比的增加，胶原蛋白提取量也增加，但当体积比超过l ：1 5 之后，增加的幅度已不显著，而且随着提取体积比的增加，增加了胶原蛋白回收成本和废液 一毛，6量型最正蜮蠢 ；5 ； 3 筋 2 佰 ， o 0 0 0 o 0 0 0 4 2 ， 8 6 4 2 o 1 1 0 0 o o 一毛，6e一蝥髭皿嘲臣垡 寻竹 一口e一咖砑位嘟臣甾 两南大学硕+ 毕业论文 处理成本，因此，最后确定木瓜蛋白酶的提取体积比为l ：1 5 。 4 3 4 2 5 颗粒大小的确定 巨至画垂匿三趸董醉匈 2 0 s4 0 s6 0 s8 0 s 0 捣碎时问 图2 7 木瓜蛋白酶提取颗粒大小的确定 f i 9 2 7 t h es i z eo f p o r kl u n gt oe x t r a c tc o l l a g e nb yp a p a i nw i t hc i t r i ca c i d 实验结果如图2 7 ，在捣碎8 0 s 时，胶原蛋向提取量最大；而当捣碎时问为4 0 s 时。杂蛋 白还有一个降低的现象，经分析可能是捣碎2 0 s 时，因组织颗粒太大，猪肺中一些色素蛋白含 量相对较高，会对实验结果的测定产生一定的误差，从而使得捣碎4 0 s 时的杂蛋白含量比捣碎 2 0 s 时的含量还低：当捣碎时间超过8 0 s 时，胶原蛋白变性的可能性增加，因此，最后确定木 瓜蛋白酶的提取颗粒大小为1 0 0 0 0 转捣碎8 0 s 来控制。 4 3 a 2 6 提取时间的确定 仁：= 藤蓄爵疆= j 蔡萄稠 2 4 h5 2 h5 8 h6 4 h7 0 h7 6 h 提取时何 图2 8 术瓜蛋白酶提取时闻的确定 f i 9 2 s t h et i m eo f e x t r a c tc o l l a g e nb yp 掣l i nw i t hc i t r i ca c i d 3 8 一毛，6邑赳爱ll；谣 衢 2 1 2 ， ：兮 n n n n m 他m 邶m 汜m m m 舰，肿 1 1 1 1 1 1 1 1 o 一毛，6e一越瑾丑!l；鹫垡 一l山，6曼赵鞋皿嘟臻 3 笛 2 幅 ， g n n n n m n 0 6 4 2 1 8 6 4 2 o 侣他， 蛇。 一i山，6e世嵌也嘲隧缒 第4 章猪肺胶原蛋自的提取 实验结果如图2 8 ，随着时间的增加，胶原蛋白提取的量也明显增加，而当时间超过7 0 h 后，则胶原蛋白的提取鼋还减少了，分析可能是因为随着时问的延长，胶原蛋白发生了部分 分解所致，因此最终确定7 0 h 为最适的酸性蛋白酶提取时间。 4 3 4 2 7 正交试验 表6 术瓜蛋白酶提取正交试验结果 t a b l e 6t h er e s u l t so f o r t h o g o n a le x p e r i m c n t k l 1 3 7 41 3 7 01 3 7 21 3 7 6 k 2 1 3 9 ，01 3 7 71 3 8 51 3 8 7 墨21 1 1 ：! 型：! ! 竺：! ! ! ：! r2 0 34 1 02 8 71 9 3 由表6 可知，在木瓜蛋白酶结合柠檬酸提取过程和影响因子主次为：b c a d ，即酶 用量 体积比 p h 提取时间，从杂蛋白的角度来说，影响最大的因子也是酶的用量。虽然 a t b 3 c 3 d 3 ，即p h 5 0 ，酶用量2 o ，体积比h2 0 ，提取时间7 6 1 1 时，胶原蛋白的提取率最 高，但考虑到杂蛋白含量也较高，而且随着酶_ l j 量的增加，提取成本也会增加，因此。最终 确定a 2 8 2 c 3 d 1 为最优组合，即p h 6 0 。酶用量1 5 ，体积比l ：2 0 ，提取时问( m h 时。因单 因子实验没做a ：b 2 c 3 d 。，通过验证实验表明a 2 8 2 c 3 d 1 的提取方案切实可行。 4 种提取方法提取的胶原蛋白比较见表7 ： 8 i 6 2 6 8 4 4 4 引 叭 鸵 0 2 3 引 叭 北 2 o 3 2 7 8 4 4 4 m 也 心 两南大学硕十毕业论文 表74 种不矧提取方法提取胶原蛋白的比较 t a b l e 7t h ec o m p a r eo f p l ce x t r a c t e db yd i f f e r e n tm e t h o d s 4 3 5 胶原蛋白的纯化 剖 絮 螫 童j 量量点量姜点星曼星星姜善 蒿蚤氮嚣嚣嚣薰磊薰善善蓍藉螽 波长 n 5 n4 5 魁m 4 蚕t 3 5 0 3 0 , 2 5 n2 n 1 5 n 1 0 0 5 图2 9 纯化前的胶原蛋白提取液吸光度图3 0 纯化后的胶原蛋白提取液吸光度 r i t e 9 t h ea b s o r b e n c yo f p l cs o l u t i o n f i 9 3 0t h ea b s o r b e n c yo f p l cs o l u t i o n b e f o r ep u r i f i c a t i o na f t e rp u r i f i c a t i o n 实验结果如图2 9 、3 0 ，该图由木瓜蛋向酶结合柠檬酸提取的猪肺胶原蛋白制得，其它二 种方法提取的胶原蛋白的变化规律与上图类似。由图可知，由该方法提取的蛋白质未纯化前 在2 8 0 r i m 左右有一定的吸收峰，而纯化之后在2 3 0 r i m 以下有强吸收峰，而在2 8 0 r i m 处吸收峰很 低，说明该蛋白质是胶原蛋白，而且纯度较高。 按照g b 9 6 9 5 2 3 9 0 肉和肉制品中u ) 粕脯氨酸含量测定的方法测得4 种提取方法提取 的猪肺胶原蛋白的纯度分别是：醋酸提取纯度为9 3 5 ；柠檬酸提取纯度为9 1 4 ；酸性蛋白 酶结合醋酸提取纯度为8 7 7 ；木瓜蛋白酶结合柠檬酸提取纯度为8 5 3 。 4 4 小结 4 4 1 用丙酮、5 n a e c 0 3 、l ：l 乙醚+ 石油醚、石油醚几种试剂浸泡脱脂，1 ：l 乙醚：石 油醚的脱脂效果较其它试剂脱脂效果好，但因猪肺的脂肪含量很低，总的来说脱脂效果都不 明显；而脱脂时间的长短对脱脂效果也没有显著影响。在后面的实验过程中，低温条件下离 第4 章猪肺胶原蛋白的提取 心有l 部分脂肪凝l 古i 析出随废液倒掉，从而样品中脂肪含越很低，加上有机试剂处理猪肺会 使蛋白质发生很大程度的变性，会影响后面性质的测定，因此在后面的提取实验中，就没有 再单独的进行脱脂处理。 4 4 2 除杂蛋白的条件为：4 n a c l 溶液，体积比l ：8 ，处理时问8 h 。 4 4 3 醋酸提取猪肺胶原蛋白得率为2 6 5 ；柠檬酸提取猪肺胶原蛋白得率为3 0 1 ：酸性 蛋白酶与醋酸结合的提取得率为3 7 6 ；都相对较低。木瓜蛋白酶与柠橡酸结合的提取得率 为4 7 3 ，是4 种提取方法中得率最高的方法，提取条件为：0 i m o l l 柠檬酸溶液，最适p h 6 0 ， 酶用量为1 5 ( w w ) ，猪肺颗粒大小用1 0 0 0 0 转下捣碎8 0 s 来控制，温度l o ，体积比1 ： 1 5 ，处理时间7 0 h 。 4 4 4 四种实验方法提取的蛋白质纯化后在2 3 0 n m 以下有强吸收峰，而在2 8 0 n m 处几乎无 吸收峰，说明本实验提取的蛋白质是胶原蛋白用国标方法测得4 种方法提取的猪肺胶原蛋 白的纯度分别是：醋酸提取纯度为9 3 5 ；柠檬酸提取纯度为9 1 4 ；酸性蛋白酶结合醋酸 提取纯度为8 7 7 ；木瓜蛋白酶结合柠檬酸提取纯度为8 5 3 。 4 两南人学硕十_ 毕、世论文 第5 章猪肺胶原蛋白理化特性的测定 5 1 实验材料 5 1 i 主要原料及试剂 猪肺胶原蛋白实验室自制 高氯酸四川成都化学试剂厂( a r ) 异丙醇 重庆川东化工集团有限公司( a r ) 正丙醇 天津市光复精细化工研究所( a r ) 氯胺t天津天泰精细化学品有限公司( a r ) 氢氧化钠重庆川东化工集团有限公司( a r ) 氯化弧锡成都天华科技股份有限公司( a r ) 盐酸 国营重庆无机化学试剂厂( a r ) l ( ) 一羟脯氨酸上海康达氨基酸厂( a r ) 柠檬酸重庆川东化工集团有限公司( a r ) 无水乙醚上海马陆制药厂( a r ) 对二甲氨基苯甲醛上海试剂三厂( a r ) 甘油重庆川东化工集团有限公司( a r ) 醋酸钠 重庆北碚化学试剂厂( a r ) 碳酸钠 上海虹光化工厂( a r ) ( n h 4 ) z s 0 4重庆北碚化学试剂厂( a r ) 其它试剂为实验室常用试剂 5 1 2 实验仪器与设备 f s h 一2 型可调高速匀浆器江苏大地自动化仪器厂 乌式粘度计 上海中立玻璃仪器有限公司 7 5 2 型紫外分光光度计 上海精密科学仪器有限公司 其它为实验室常_ 【f 】仪器 5 2 实验方法 5 2 1 特性粘度的测定 采j 【h 乌氏枯度计对制备好的胶原蛋白醋酸溶液在1 5 c 常温中测定，原始浓度为 i m g m l ，分别测定5 ，6 ，2 3 ，l ，2 ，1 3 浓度时的牯度，以o 5 m o l l 的醋酸为对照陋”“】。计算公 式为： 4 2 第5 章猪肺胶原蛋白理化特性的测定 增比粘度ns p = 二一l t o 比浓粘度= ns p c ，当浓j 立外推剑0 时，此时的比浓枯度为特性枯度，即 q = l i mn s p c ，其中，t 是样品流出时问，t d 为溶剂流山时间，c 为样品浓度。 5 2 2 变性温度t d 测定 采用乌式桔度计对各种胶原蛋白溶液进行测定。原始浓度为l m g m l 在浓度不变的条件 下，在5 4 5 c 之间逐渐升高温度( 间隔5 c ) ，各温度点恒温3 0 m i n ，测定各样品在不同保温 温度下的流出时间。同时测定溶剂( o 5 m o l l 醋酸) 的流出时间。比较各温度下( qs p c ) t ( qs p c ) 5 的变化，( qs p c ) t 表示温度为t 时的比浓粘度，( qs p c ) 5 表示5 c 时的比浓 粘度。( q s p c ) t ，( ns p c ) 5 的值急剧变化5 0 时所对应的温度为变性温度t d 2 “。 从前面的部分理化特性研究来看，几种方法提取的猪肺胶原蛋白性质基本一致，在后面 的研究中，结合实验情况，就只研究了术瓜蛋白酶结合柠檬酸提取的胶原蛋白。 5 2 3 乳化性及乳化稳定性的测定 根据d i p kkd c v 的方法改良如下：刚0 i m o l l 的乙酸分别制备0 0 5 ，0 1 、o 2 、 0 3 ，o 4 的胶原蛋白溶液，用0 i m o l j l 氢氧化钠调节p h 为7 0 ，定量到l o m l ，再加入l o m l 纯花生油。在高速组织捣碎机中，以8 0 0 0 r m i n 的速度下均质2 m i n ，分成等鼍二份，移入l o m l 离心管中，在1 8 0 0 r m i n 的速度下离心5 m i n t ”+ ”。根据乳化层高度计算不同浓度的胶原蛋白 溶液的乳化性： 乳化性( ) = 酱l 。 以上述同样的方法制取2 0 m l 乳状液，装在1 0 m l 的刻度管中，置于5 0 c 水浴锅中，l h 后测定乳状液的体积。乳化稳定性计算如f ： 乳化稳定性c ，= 霎耄雾。 按同样的方法，然后再制备p h 2 0 8 0 的胶原蛋白醋酸溶液，测定p h 对制备的猪肺胶 原蛋白的乳化性及乳化稳定性的影响。 5 2 4 吸湿实验 将冷冻干燥后的样品放在硅胶干燥器中干燥2 4 h 。将由饱和( n h 4 ) 2 s o 。水溶液作为相对湿 度限h ) 8 1 的干燥器和由饱和n a 2 c 0 3 水溶液作为( r h ) 4 3 的干燥器置于2 0 ( 2 恒温环境中， 两南大学硕十毕业论文 精确称取1 o g 干燥试样置于直径为3 c m 的培养皿中，放在两个干燥器内，经过2 4 h 后，每1 2 h 精确称取各试样重量，由放置前后试样的重量差，用下式求山吸湿度m 。9 09 4 】： 吸湿率( ) 一w n - - - w ox 1 0 0 式中w j 为放置前重量，w n 为放置j 亓重量 巩 。 同时刚甘油作对比。 5 2 5 保湿实验 通过上面的吸湿实验得到猪肺胶原蛋白在不同相对湿度条件达到吸湿恒定的时间，在此 时间之后继续放置，每1 2 h 精确称取各试样重量。通过继续放置前后试样的重量差，由下式求 出保湿率、”叫： 保湿率( 产等1 0 0 式中h 0 为试样含水重量，h n 为放置后试样含水重量- 同时用甘油作对比。 5 3 结果与分析 5 3 1 特性粘度的测定 1 8 1 6 1 4 兰1 2 31 0 鼍8 ：6 4 2 0 01 52 1 53 54 51 浓度( _ g l ” 囤3 t 醋酸提取胶原蛋白特性粘度 f i 9 3 l t h ei n t r i n s i cv i s c o s i t y o f p l c e x t r a c t e db ya c e t i ca c i d 雪 3 善 f 1 52 53 54 5l 浓度( m g m 1 ) 图3 2 柠檬酸提取胶原蛋白特性粘度 f i 9 3 2 t h ei n t r i n s i cv i s c o s i t yo f p l c e x t r a c t c db yc i t r i ca c i d 6 4 2 o 8 6 4 2 0 o 第5 章猪肺胶原蛋白理化特性的测定 9 8 8 一 86 o 芒 詈8 4 f 8 2 8 01 52 s3 s4 5i 诔度( = s m 1 ) 圈3 3 酸性虽白酶提取胶原蛋白特性粘度图3 4 木瓜蛋白酶提取胶原蛋白特性枯度 f i 9 3 31 h e i n t r i n s i c v i s c o s i t y o f p l c f i 9 3 4t h e i n t r i n s i c v i s c o s i t y o f p l c e x t r a c t e d b y a c i d p r o t e a s e w i t ha c e t i ca c i d e x t r a c t e d b y p a p a i n w i t hc i t r i c a c i d 实验结果如图3 1 3 4 ，由图可知，醋酸提取胶原蛋白特性枯度为9 1 d l g ，柠檬酸提取胶 原蛋白特性枯度为9 5 6 d 垤，酸性蛋白酶结合醋酸提取胶原蛋白特性粘度为8 8 d l g ，木瓜蛋白 酶结合柠檬酸提取胶原蛋白特性粘度为8 5 6 d l g 。四种提取方法提取的猪肺胶原蛋白以柠檬酸 提取的特性粘度值最大，但四者之间差别不大。 5 3 2 变性温度t d 测定 图3 5 醋酸提取胶原蛋白变性温度 f i 9 3 5t h e r m a ld e n a t u r a t i o nt e m p e r a t u r ec u r v eo f p l ce x t r a c t e db ya c e t i ca c i d 5 博1 5 2 5 箍柚西 蠹度 圈3 6 柠檬酸提取胶原蛋自变性温度 f j 驴6t h e r m a ld e n a t u r a t i o nt e m p e r a t u r ec u r v eo f p l ce x t r a c t e db yc i t r i ca c i d 2 i 8 6 2 o 1 0 0 n n 日 芝 f v 、h 譬0 f v 婀南大学硕十毕业论文 圈3 7 酸性圭匠白酶提取胶原篮白变性温度图3 8 木瓜蛋白睛提取胶原蛋白变性温度 f i 9 3 7t h e r m a ld e n a t u r a t i o nt e m p e r a t u r ec u r v eo f f i 9 3 8t h e r m a ld e n a t u r a t i o nt e m p e r a t u r ec u r v eo f p l c e x t r a c t e d b y a c i d p r o t e a s e w i t ha c e t i c a c i d p l c e x t r a c t e d b y p a p a i n w i t hc i t r i c a c i d 实验结果如图3 5 3 8 ，四种方法提取的猪肺胶原蛋白的变性温度都在3 5 4 0 c 之间，与 哺乳动物及鸟类的变性温度3 5 4 2 c 接近，接近其生长环境温度2 0 3 5 c ，这一点与淡水鱼 皮胶原蛋白的特性相似1 2 6 6 1 。 5 3 3 乳化性及乳化稳定性的测定 耆 掣 趔 嚣 孽 胛 捌 篁 酥 巨互趣耍圃 n 惦n i n 2n 3n4 蛋白质浓度t 时 艟 硒 g5 4 着5 2 霎5 0 番4 8 茎4 6 辞4 4 4 2 4 0 叵亘殛叵至堑阐 图3 9 浓度对胶原蛋白乳化性及乳化稳定的影响图4 0p h 对胶原蛋白乳化性及乳化稳定性的影响 f i 9 3 9 t h ee f f e c to f c o n c e n t r a t i o no f p l ce x t r a c t e d f i 9 4 0t h ee f f e c to f p ho nt h ee m u l s i f i c a t i o n b y p a p a i n o n t h ee m u l s i f i c a t i o nc a p a b i l i t y a n ds t a b i l i t y c a p a b i l i t y a n ds t a b i l i t y o f p l ce x t r a c t e d b y p a p a i n 实验结果如图3 9 、4 0 ，随着猪肺胶原蛋白浓度的增加，溶液乳化性及乳化稳定性也随之 增加，在浓度为o 4 时，分别为5 2 7 和6 4 而浓度超过0 2 之后，乳化性增加趋势明 显而乳化稳定性增加已不明显，与张联英3 ”研究的淡水鱼胶原蛋白乳化性与乳化稳定性基 本一致。猪肺胶原蛋白在p h 6 0 时乳化性达到虽大值4 8 8 9 ，而乳化稳定性在p h 3 0 和p h 8 0 达到最大值5 6 ，比单苗酯和硬腊酰乳酸钠的乳化性与乳化稳定性都高 9 6 1 ，但与邵秀芝9 2 i 研究 的血浆蛋白相比，乳化性与乳化稳定性都还有一定差距。 第5 章猪肺胶原蛋白理化特性的测定 5 3 4 吸湿实验 表8 罩占肺股原蛋白吸湿性测定 t a b l e 8 s t u d y0 nt h eh y g r o s c o p i c i t y o f p l ce x t r a c t e db yp o p a i nw i t hc i t r i ca c i d 实验结果如表8 ，由表可知，在r h 4 3 的条件卜，猪肺胶原蛋白吸湿性比较低，在6 0 h 达到展大2 1 7 ，之后逐渐下降；而在r h8 1 的条件下，猪肺胶原蛋白吸湿性在2 4 h 时其 吸湿度已经很大，在3 6 h 达到最大5 2 0 3 ，之后逐渐下降。 5 3 5 保湿实验 表9 猪肺胶原蛋白保湿性测定 t a b l e t ) s t u d y o nt h el i q u i d b i n d i n gp o w e r o f p l ce x t r a c t e db yp a p a i nw i t hc i t r i ca c i d 实验结果如表9 ，由表可知，在r h4 3 的条件f ，在猪肺胶原蛋白吸湿性达到最大后， 再过2 4 h 其保湿性都比较强，达到5 3 1 9 ；而在r h8 1 的条件下，在猪肺胶原蛋白吸湿性 达到最大后，再过3 6 h 其保湿性都很强，达到7 1 8 8 ；到4 8 h 还能达到4 0 6 2 。结合上面 的吸湿实验，猪肺胶原蛋白在实际应用中最好在r h8 1 的条件下使用 5 4 小结 5 4 1 醋酸提取猪的肺胶原蛋白特性粘度为9 1 d l g ，柠檬酸提取的猪肺胶原蛋白特性枯度 为9 5 6d l g ，酸性蛋白酶结合醋酸提取的猪肺胶原蛋白特性枯度为8 8d v g ，木瓜蛋白酶结合 柠檬酸提取的猪肺胶原蛋白特性粘度为8 5 6 d 垤。猪肺胶原蛋白的热变性温度都为3 5 4 0 。c 。 5 4 2 木瓜蛋白酶结台柠檬酸提取的猪肺胶原蛋白溶液在浓度为0 4 时，乳化性及乳化稳 定性分别为5 2 7 和6 4 ，而浓度超过o 2 之后，乳化性增加趋势明显，而乳化稳定性增加 已不明显。猪肺胶原蛋自在p h 6 0 时乳化性达到最大值4 8 8 9 ，而乳化稳定性在p h 3 o 和p h 8 0 达到最大值5 6 。 4 7 两南大学硕士毕业论文 5 4 3 术瓜蛋白酶结合柠檬酸提取的猪肺胶原蛋白，在r h4 3 的条件f ，吸湿性比较低， 在6 0 h 达剑最人2 1 7 ，之后逐渐下降；在吸湿性达到最大后，弭过2 4 h 其保湿性都比较强， 达到5 3 1 9 。而在r h8 l 的条件下。在2 4 h 时其吸湿度已经很大，在3 6 h 达到最大5 2 0 3 ，之后逐渐下降：在吸湿性达到最大后，雨过3 6 h 其保湿性都很强，达到7 1 8 8 ；到4 8 h 还能达到4 0 6 2 。结合上面的吸湿实验，猪肺胶原蛋自在实际应_ 【 j 中最好在r h8 l 的条件 下使用。 第6 章_ t 耍研究结论及后续研究设想 第6 章：主要研究结论和后续研究设想 6 1 主要研究结论 经过实验，在本实验条什下得出以下结论： 6 1 1 猪肺的总蛋白含量为1 2 5 l 0 4 1 ，粗脂肪含量为3 0 l o 2 0 ，水分含量为8 3 1 7 o 3 3 ，胶原蛋白含量为3 0 8 4 - 0 1 2 ，与参考值之间差异不显著。 6 1 2 用丙酮、5 n a 2 c 0 3 、l ：l 乙醚+ 石油醚、石油醚浸泡几种试荆脱脂，l ：l 乙醚： 石油醚的脱脂效果较其它试剂脱脂效果好，但因猪肺的脂肪含量很低，总的来说脱脂效果都 不明显：而脱脂时问的长短对脱脂效果也没有显著影响。而且在后面的提取过程中。低温条 件下离心有大部分脂肪凝固析出随废液倒掉，从而样品中脂肪含量很低，因此在后面的实验 中就没有单独进行脱脂处理；除杂蛋白的条件为：盐溶液浓度4 n a c i 溶液，体积比1 ：8 ， 处理时间8 h 。 6 1 3 四种提取方法中，木瓜蛋白酶与柠檬酸结合提取得率最高，达到4 7 3 ，提取条件 为：0 1 m o l l 柠檬酸溶液，最适p h 6 0 ，酶用量为1 5 ( w w ) ，猪肺颗粒大小用1 0 0 0 0 转 下捣碎8 0 s 来控制，体积比1 ：1 5 ，处理时间7 0 h 。 6 1 4 猪肺胶原蛋白热变性温度为3 5 4 0 c ；其中醋酸提取的猪肺胶原蛋白特性粘度为 9 i d l g ，柠檬酸提取的猪肺胶原蛋白特性枯度为9 5 6 d l g ，酸性蛋白酶结合醋酸提取的猪肺 胶原蛋白特性枯度为8 8d v g ，木瓜缉白酶结合柠檬酸提取的猪肺胶原蛋白特性粘度为8 5 6 d l g 。 6 1 5 木瓜蛋白酶结合柠檬酸提取的猪肺胶原蛋白溶液在浓度为o 4 时，乳化性及乳化 稳定性分别为5 2 7 和“，而浓度超过0 2 之后，乳化性增加趋势明显，而乳化稳定性 增加己不明显。猪肺胶原蛋白在p h 6 0 时乳化性达到最大值4 8 8 9 ，而乳化稳定性在p h 3 0 和p h 8 0 达到最大值5 6 。 6 1 6 术瓜蛋白酶结合柠檬酸提取的猪肺胶原蛋白，在r h 4 3 的条件下，吸湿性比较低， 在6 0 h 达到最大2 1 7 ，之后逐渐下降；在吸湿性达到最大后，再过2 4 h 其保湿性都比较强， 达到5 3 1 9 。而在r h8 1 的条件下，在2 4 h 时其吸湿度已经很大。在3 6 h 达到最大5 2 0 3 ，之后逐渐下降；在吸湿性达剑最大后，再过3 6 h 其保湿性都很强，达到7 1 8 8 ；到4 8 h 还能达到4 0 6 2 。结合上面的吸湿实验，猪肺胶原蛋白在实际应用中最好在i l h8 1 的条 件下使用。 6 2 后续研究设想 本文研究了猪肺胶原蛋白的提取和基本理化特性，为猪肺胶原蛋白的研究与应用积累 了一定的资料，但囚时问关系和一些重要仪器设施的局限，还有许多需要完善和改进的内容， 在以后的研究中，可以从以下两个方面开展和深入： 6 2 1 在基础研究部分，因胶原蛋白含有十几种类型，可对其具体的胶原蛋白类型的含 婀南大学硕十毕业论文 量和分子量大小进行深入研究。 6 2 2 因胶原蛋白的溶解性不是很好，因此限制了其应用发展，可以研究通过生物技术 对其进入交联城生物改性等来改变其理化特性，从而扩展其应_ l j 范围。 6 2 3 因时问芙系本次实验没有开展猪肺胶原蛋白应用的研究，在后续研究中，可以 增加其在具体的产品中应川的研究，如_ 【 j 于食品加工业、美容化妆品、保健食品，日化洗涤 用品、医疗产品等。 6 2 4 胶原蛋白多肽。因其分子量小，更易溶解，易于吸收，应该是以后研究的趋势， 因此，在后续研究中，可着重增加胶原蛋白多肽的理化特性的研究。 6 2 5 本实验因时问原因未进行废液处理研究。如果进行工业化生产还必须解决废液回 收处理的问题。 参考文献 参考文献 【1 】韩陆奇猪( 上) 【m 】 中国商业出版社，1 9 8 1 ：3 8 5 3 8 9 2 】蒋迪仙等 嗣产儿死冈及其母婴合并症的归囚危j l 盒度的分析【j 】上海医学，1 9 8 5 8 ( 5 ) ： 2 4 9 【3 】邹红云等猪肺表面活性物质的提取制备和分析【j 1中华实用医学，2 0 0 3 ( 5 ) 5 ： 9 7 9 8 【4 】谢尔凡肺表面活性物质的功能研究进展【j 】国外医学呼吸系统分册，1 9 9 7 1 7 ( 1 ) ： 2 4 2 5 【5 1 d 国昌等 猪肺表面活性物质提取及评价【j 】 徐州医学院学报，1