（农产品加工及贮藏工程专业论文）米根霉高密度半连续发酵L乳酸初步研究.pdf

米根霉高密度半连续发酵l - - 孚l 酸初步研究 摘要 微生物的高密度半连续发酵，可以有效提高菌体的发酵密度和发酵液 的体积产率，从而缩短生产周期、降低生产成本。本文通过对米根霉菌株 的高密度培养与半连续发酵产l 一乳酸效果的研究，探索适于高密度半连续 发酵的培养基组成和培养条件，确定补料分批法高密度培养米根霉的最佳 方式与参数，同时对米根霉高密度半连续发酵的产酸强度及其动力学特性 进行研究，建立发酵过程动力学模型。具体结论如下： ( 1 ) 通过单因素实验结合正交试验的方法，确定发酵培养基组成主要 参数为：葡萄糖1 6 0 9 l ，( n h 4 ) 2 s 0 46g l ，n a h 2 p 0 40 15 0 9 l ，k h 2 p 0 4 0 1 5 0 9 l ，m g s 0 4 7 h 2 00 2 5 9 l ，z n s 0 4 7 h 2 00 2 2 9 l ；操作条件为：接 种量5 ，装液量7 5 m 1 2 5 0 m 1 ，接种时间为2 4 h ，发酵温度3 2 ，摇床转 速2 0 0 r m i n 时，首批发酵的米根霉生物量可达到1 2 5 0 3 9 l 。 ( 2 ) 研究了恒速流加、变速流加和葡萄糖浓度反馈流加等方式对发酵 过程中米根霉菌体生物量累积的影响情况，结果表明以葡萄糖浓度反馈流 加方式最佳；通过对补料参数进行优化，确定出碳源为葡萄糖1 6 0 9 l ， 补料葡萄糖与硫酸铵质量比为2 0 ：1 ，补料时间2 4 h 一6 0 h ；采用基于葡萄糖 浓度的反馈流加方式，在15 l 发酵罐中初始装液7 l ，控制温度3 2 ，转 速2 0 0 r m i n ，每升发酵液通气量为2 l m i n 时，乳酸产量为1 1 7 9 l ，生物 量可达到1 8 5 4 9 l ，比分批培养提高了9 1 9 。 ( 3 ) 通过对米根霉高密度半连续产酸效率的考察获得了发酵最佳方式 和不同阶段的培养基组成。采用葡萄糖浓度反馈流加进行第一批次发酵， 提高菌体生物量；从第2 至第5 批次补入i i 号培养基以继续累积生物量， 培养基组成为：葡萄糖l o o g l ，( n h 4 ) 2 s 0 44 9 l ，k h 2 p 0 40 15 0 9 l ， m g s 0 4 7 h 2 00 2 2 9 l ，z n s 0 4 7 h 2 00 3 3 9 l ；从第6 批次开始，补加i 号 培养基以提高产酸，培养基组成为葡萄糖l o o g l ，( n h 4 ) 2 s 0 42 9 l ，k h 2 p 0 4 0 1 0 9 l ，m g s 0 4 7 h 2 00 2 2 9 l ，z n s 0 4 7 h 2 00 3 3 9 l 。发酵1 5 批次，平 均产酸强度为3 0 4 5 9 ( l h ) ，高于分批发酵的1 2 3 9 ( l h ) 。 ( 4 ) 建立的米根霉高密度发酵产l 一乳酸的发酵过程动力学模型为： 出、， 微生物生长模型： i = 0 1 4 0 8 ( 卜害老) j j o ，u ，、j 乳酸生成模型：半= 6 0 9 6 7 ( u ) + 0 0 10 6 x d t d t 验证结果表明，该动力学模型能够较好的描述实验过程。 关键词：米根霉 l 一乳酸 高密度发酵半连续 p r i m a r ys t u d yo np r o d u c t i o no fl - l a c t i ca c i db y h i g hc e l ld e n s i t ya n ds e m i - c o n t i n u o u s f e r m e n t a t i onw i t hr h i z o p u so r y z a e a b s t r a c t h i g hc e l ld e n s i t ya n ds e m i c o n t i n u o u sf e r m e n t a t i o no fm i c r o o r g a n i s m c a na c h i e v es u c har e s u l to fs h o r t e n i n gt h ef e r m e n t a t i o nt i m ea n dr e d u c i n gt h e c o s tb yi n c r e a s i n gt h ec e l ld e n s i t ya n dv o l u m e t r i cy i e l d se f f i c i e n c y b yt h e s t u d yo fh i g hc e l ld e n s i t yc u l t u r i n go fr h i z o p u so r y z a ea n dp r o d u c t i o no f l - l a c t i ca c i db ys e m i c o n t i n u o u sf e r m e n t a t i o n ，t h ec u l t u r em e d i u mi n g r e d i e n t a n df e r m e n t a t i o nc o n d i t i o nw e r e o p t i m i z e d ，t h eo p t i m u mm e t h o da n d p a r a m e t e ro ff e d b a t c hc u l t u r ew e r ed e t e r m i n a t e d ，t h ef e r m e n t a t i o ns t r e n g t h a n dt h ek i n e t i c sw e r er e s e a r c h e da sw e l l t h em a i nr e s u l t sw e r ea sf o l l o w i n g ： ( 1 ) t h ec u l t u r em e d i u mi n g r e d i e n ta n df e r m e n t a t i o nc o n d i t i o nw e r e o p t i m i z e db yt h ec o m b i n a t i o no fs i n g l ef a c t o re x p e r i m e n t sa n do r t h o g o n a l e x p e r i m e n t s t h er e s u l t sw e r ea sf o l l o w i n g ：w h e nt h ek e yp a r a m e t e r sb e i n g g l u c o s e16 0 9 l ，( n h 4 ) 2 s 0 46 9 l ，n a h 2 p 0 40 15 0 9 l ，k h 2 p 0 40 15 0 9 l ， m g s 0 4 7 h 2 0o 2 5 9 l ，z n s 0 4 7 h 2 0o 2 2 9 l ；i n o c u l u ms i z ew a s5 ， i n o c u l u m sa g ew a s2 4 h ，a n dw o r kv o l u m ew a s4 0 ；t h eb i o m a s so fr h i z o p u s o r y z a ei nt h ef i r s tb a t c ho ff e r m e n t a t i o nc o u l da c h i e v e 1 2 5 0 3 9 l 。 ( 2 ) t h eb i o m a s so fr h i z o p u so r y z a ew e r es t u d i e dw h e nc u l t u r em e d i u m w e r ef e e d i n gi nc o n s t a n ts p e e d ，i nd i f f e r e n t s p e e da n df e e d b a c kb yt h e c o n c e n t r a t i o no fg l u c o s ew h i c hw a sp r o v e dt ob et h eb e s t s t r a t e g y 。t h e p a r a m e t e r s o f f e e d i n g c u l t u r ew e r e o p t i m i z e d a sf 0 1 l o w s ：t h e g l u c o s e a m m o n i u ms u l f a t er a t i ow a s2 0 ：1 ( w w ) ，c u l t u r em e d i u mf e e d i n gs p e e d w a sf e e d b a c kb yt h ec o n c e n t r a t i o no fg l u c o s ef r o m2 4 ht o6 0 h ，t h ei n i t i a lw o r k v o l u m ew a s7 li n15 lb i o r e a c t o r t e m p e r a t u r ew a s3 2 ，r o t a t i o nr a t ew a s 2 0 0r m i n ，a e r a t i o nv e l o c i t yw a s2l m i np e r1 i t e r t h ey i e l do fl 1 a c t i ca c i di s 1 1 7g l ；t h eb i o m a s si s1 8 5 4 g l ，w h i c hi n c r e a s e db y9 1 9 o v e rt h a to f b a t c hc u l t u r e ( 3 ) t h ef e r m e n tm e t h o da n dt h ec u l t u r em e d i u mi n g r e d i e n ti nd i f f e r e n t p h a s ew e r eo p t i m i z e d a d o p tf e e d b a c k - f e e d i n gc u l t u r et oi n c r e a s eb i o m a s si n t h ef i r s tb a t c ho ff e r m e n t a t i o n c u l t u r em e d i u m1 1w a sa d d e dt ot h er e a c t o r f r o m2 n dt o5 hb a t c ho ff e r m e n t a t i o nt oi n c r e a s eb i o m a s sf u r t h e rw h i c hw a s c o m p o s e do fg l u c o s e l0 0 9 l ，( n h 4 ) 2 s 0 44 9 l ，k h 2 p 0 40 15 0 9 l ，m g s 0 4 7 h 2 0 0 。2 2 9 la n dz n s 0 4 7 h 2 0o 3 3 9 l c u l t u r em e d i u m1w a sa d d e dt ot h er e a c t o rf r o m6 mb a t c ho ff e r m e n t a t i o n t ot h ep r o d u c t i o no fl 1 a c t i ca c i dw h i c hw a sc o m p o s e do fg l u c o s e l0 0 9 l ， ( n h 4 ) 2 s 0 42 9 l ，k h 2 p 0 40 10 9 l ，m g s 0 4 。7 h 2 00 2 2 9 l ，z n s 0 4 7 h 2 0 0 3 3 9 l t h ef e r m e n t a t i v es t r e n g t hi s3 。0 4 5 9 ( l h ) i na v e r a g e ( 4 ) k i n e t i cm o d e l so fl 1 a c t i ca c i dp r o d u c t i o nb yh i g hc e l ld e n s i t yc u l t u r e o fr h i z o p u so r y z a ew e r ee s t a b l i s h e d t h em o d e lo fr h i z o p u so r y z a eg r o w t h ： t h em o d e lo fl - l a c t i ca c i dy i e l d ： 生d t = o 1 4 0 8 ( 1 一志17 芍6 鱼：6 0 9 6 7 ( a x ) + 0 0 1 0 6 x d td t t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h em o d e l sc o u l dd e s c r i b et h ep r o c e s se x a c t l y k e y w o r d s ：r h i z o p u so r y z a e l l a c t i ca c i d h i g h - c e l l - d e n s i t y - f e r m e n t a t i o n s e m i c o n t i n u o u s 插图清单 图1 。1 乳酸的结构式1 图1 2 米根霉细胞的葡萄糖代谢模型4 图1 3 补料控制示意图8 图2 1 葡萄糖标准曲线1 6 图2 2 接种量对菌体生物量的影响1 8 图2 3 接种时间对菌体牛物量的影响1 9 图2 4 装液量对菌体生物量的影响2 0 图2 5 因素与乳酸产量及牛物量的关系2 2 图2 6 葡萄糖不同浓度对发酵的影响2 3 图2 7 硫酸铵不同浓度对发酵的影响2 4 图2 8 硝酸铵不同浓度对发酵的影响2 5 图2 9 因素与乳酸产量及生物量的关系2 8 图3 1 米根霉分批发酵动力学曲线3 l 图3 2 分批发酵中菌体比生长速率变化曲线3 l 图3 3 补糖浓度对生物量的影响3 3 图3 4 恒速补料发酵动力学曲线3 4 图3 5 恒速补料比生长速率变化曲线3 4 图3 6 变速补料发酵动力学曲线3 5 图3 7 变速补料比生长速率变化曲线3 5 图3 8 葡萄糖反馈补料发酵动力学曲线3 6 图3 9 葡萄糖反馈补料比生长速率变化曲线3 7 图4 1 第二批发酵动力学曲线，4 2 图4 2 发酵批次与生物量的关系，4 2 图4 3 发酵批次与产酸的关系4 3 图4 4 动力学模型的验证4 6 表格清单 表1 1 乳酸异构体的理化性质1 表1 2 几种高密度培养技术的优缺点6 表1 3 补料分批培养中的流加技术8 表1 4 几种微生物的高密度培养研究1 0 表2 1 葡萄糖标准曲线制作试剂表1 5 表2 2 培养条件正交试验方案及试验结果分析2 1 表2 3 培养基组成正交试验方案及试验结果分析2 6 表3 1 补料培养基优化3 2 表3 2 流加补料方式对发酵结果的影响3 7 表4 1 半连续发酵培养基正交试验方案与结果分析4 l 表4 2 高密度发酵试验数据4 5 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得金胆王些太堂或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示谢意。 学位论文作者躲却啄签字嗍口产了日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解 金胆王些太堂 有关保留、使用学位论文的规定。有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人 授权 金肥至些太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：刍 落 签字日期： 口罗年。月多日 | i v 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 导师签名： 胁罕 签字日期哆年月，日 电话： 邮编： 致谢 本文是在我的导师潘丽军教授的悉心指导下完成的。从实验方案的制 定、实验过程的实施到论文的完稿，导师都倾注了大量的心血，给了我受 益终生的教诲，在此向我的导师致以最真挚的谢意。 同样感谢姜绍通教授，感谢他对我的无私关怀和严格要求。姜老师开 阔的视野，敏锐的思维，对全局的把握能力和不畏困苦的奋斗精神深深的 影响了我，使我收获到书本上永远学不到的精神财富。 感谢郑志老师，李兴江老师，罗水忠老师，赵妍嫣老师，钟昔阳老师， 孙汉巨老师，陈晓燕老师，韩卓老师等对我的试验给予了大力支持和无私 帮助的老师们。 感谢吴学风博士、潘牧博士、张轶博士、刘模博士、张福建博士在实 验过程中给我的帮助和指导，他们的学术态度和钻研精神是我学习的榜 样；感谢杜威、张巧兰、王颖、庞瑞、张明等学弟学妹在实验过程中给我 的帮助，和你们一起在实验室度过的日子，我将永生难忘；更要感谢我的 同学们：罗炳华、冯丽桦、聂慎德、胡艳红、桂蕾、张丽、蔡静、罗蕾蕾， 你们在我的学习和生活上给与我很多建议和帮助，总是在我遇到困难的时 候坚定的和我站在一起，感谢你们陪伴我一同度过这美好的时光。 最后还要感谢我的家人，不管我在哪里，背后总会有你们默默的支持 和关爱，在此我向你们表示深深地感谢! 作者：刘靖 2 0 0 9 3 18 1 1 乳酸的结构、性质及应用 1 1 1 乳酸的结构和性质 第一章绪论 乳酸( l a c t i ca c i d ) ，学名为a 一羟基丙酸( a h y d r o x y 。p r o p a n o i c a c i d ) ，分子 式为c 3 h 6 0 3 ，结构式为c h 3 c h o h c o o h ，相对分子质量9 0 0 8 ，是一种常见的 天然有机酸。乳酸分子内含有一个不对称碳原子，具有光学异构现象，有d 一 型和l 一型两种构型【1 1 ，其中l 一乳酸为右旋，d 一乳酸为左旋，其结构式见图1 1 。 当l - - 孚l 酸和d - - 孚l 酸等比例混合时，即成为外消旋的d l - - 孚l 酸。不同分子构型 的乳酸有不同的理化性质，如表1 1 所示拉 。 纯净的无水乳酸是白色结晶体，熔点为1 6 8 ，沸点为1 2 2 ( 2 k p a ) ， 相对密度为1 2 4 9 。乳酸通常是乳酸和乳酰乳酸的混合物，为无色透明或浅黄 色糖浆状的粘稠液，几乎无臭或微带有脂肪酸臭，味酸，易与水、乙醇、乙醚、 丙二醇、甘油混溶，几乎不溶于氯仿、石油醚、二硫化碳和苯【3 】。浓度达到6 0 以上的乳酸具有很强的吸湿性。一般工业用乳酸含量为5 0 一8 0 ，食品及医药 工业用l - - 孚l 酸的含量为8 0 - 9 0 。乳酸分子内含有羟基和羧基，可以参与氧化、 还原、缩合、酯化等反应【4 】，同时乳酸具有自动酯化能力，脱水能聚合成聚l 一 乳酸。 h h 3 c “ d ( 一) 一乳酸 o h h o l ( + ) 一乳酸 图1 1 乳酸的结构式 f i g 1 一lt h es t r u c t u r eo fl a c t i ca c i d 表1 1 乳酸异构体的理化性质 o h t a b l e 1 1t h ep h y s i c a la n dc h e m i c a lc h a r a c t e r so fl a c t i ca c i di s o m e r 1 1 2 乳酸的应用 乳酸是世界公认的三大有机酸之一，乳酸及其盐类和衍生物广泛用于食品、 医药、饲料、化工等领域。 由于乳酸的酸性柔和且稳定，有助于改善食品的风味，在食品工业上广泛 用作酸味剂、防腐剂和还原剂。可用于清凉饮料、糖果、糕点的生产，也可用 于鱼、肉、蔬菜的加工和包藏。在软饮料方面，乳酸在很大程度上取代了柠檬 酸和磷酸等；在啤酒制造上，美国禁止使用磷酸等无机酸调节p h ，而全部使用 乳酸。世界上四分之一的乳酸用来生产硬脂酰乳酯酸。由于人体中含有l 一乳酸 脱氢酶，故l - t l 酸在食品工业中的使用是绝对安全的，世界卫生组织提倡在食 品及医药行业使用l - $ l 酸取代目前广泛使用的d l 一乳酸【5j 。 l - $ l 酸的聚合物一一聚l - $ l 酸( p l a ) 是无毒高分子化合物，具有生物相容 性，在人体内可以被分解为l 一乳酸，为人体所代谢。因此，聚l 一乳酸可用于 生产缓释胶囊制剂【6 】，从而使血液循环中药物浓度相对降低，大大提高疗效， 降低副作用。由聚l 一乳酸制成的手术缝合线，可随伤口的愈合而被机体分解吸 收，无需拆线，这特别适合机体深部组织的缝合，减少病人的痛苦。聚l 一乳酸 除在医药行业中使用外，由于其具有与聚苯乙烯相似的光泽度、加工性能及生 物可降解性，可以广泛用于降解塑料及绿色包装材料的生产【7 j 。近年来，许多 国家为消除“白色污染 进行了大量的工作，研究发现聚l 一乳酸在空气、水和 普通细菌存在下可完全分解成水和二氧化碳，形成良好的生态循环哺j 。聚l 一乳 酸具有良好的机械性能，熔点约17 0 c ，其膜材对氧、水汽有良好的透过性， 又有较好的透明性，另外还有较好的抗菌、防霉性，使用寿命可达2 3 年。因 此，聚l 一乳酸是良好的绿色材料，对消除“白色污染”具有极其重要的意义， 预计不久将有数百万吨级的塑料被聚l 一乳酸所取代。 世界上乳酸需求量递增迅速，19 9 0 年世界乳酸年产量为4 万吨，目前，世 界乳酸消费量每年约达15 万吨，且年均增速达5 8 。由于合成p l a 需要的 l - $ l 酸光学纯度至少达到9 2 以上，世界上一些知名化学公司如美国的c a r g i l l 和d o w 公司、德国的i n v e n t a f i s c h e r 公司、日本的岛津制作所等将重点放在生 产高光学纯度的l - $ l 酸上【9 j 。 我国生产乳酸的历史较长，解放前我国就用大米发酵来生产乳酸，该法在 无锡第二制药厂和苏州第四制药厂一直沿用至今，由于当时生产工艺落后，加 之粮食供应不足，其产量一直徘徊在数百吨水平。1 9 8 0 年上海工业微生物研究 所选育出乳酸杆菌j 8 4 1 2 ，用于山芋粉发酵生产乳酸，随之乳酸生产厂蓬勃兴起。 7 0 8 0 年代，我国乳酸工业经历了较长的技术开发和市场开拓历程；9 0 年代以 来，我国乳酸生产技术和消费得到了快速的发展，已成为世界重要的乳酸生产 国。国内现有乳酸生产能力可以达到3 万吨年以上，乳酸消费约2 万吨年：其 中啤酒和其他食品工业消费可达l 万吨年以上，其他工业消费l 万吨年以上，出 2 口1 万吨年以上。生产厂商如安徽丰原格拉特乳酸有限公司、江西武藏野生物 化工有限公司等都正在积极投资扩大生产l 一乳酸【1 们。 i 2 乳酸的生产方法 1 2 i 化学合成法 19 6 3 年，美国m o n s a n t o 公司开始采用化学合成法生产乳酸【l 。化学合成法 包括乳腈法和丙烯腈法两种，采用较多的是乳腈法【1 2 】。该法是乙醛与氢氰酸经 碱性催化作用生成乳腈，粗乳腈通过蒸馏纯化并用浓盐酸或硫酸水解为粗乳酸， 粗乳酸再经酯化法精制形成不同等级产品。化学合成法的缺点是产品为外消旋 乳酸即d l 乳酸，另外成本也高，而且由于该法所用的原料为乙醛和剧毒的氢 氰酸，应用受到一定的限制。 i 2 2 酶法生产l 一乳酸 日本东京大学的本崎等人【l3 】分别从恶臭假单胞菌和假单胞菌1 1 3 细胞中抽 提纯化出l 一2 。卤代酸脱卤酶( 简称为l 酶) 和d l 一2 卤代酸脱卤酶( 简称为d l 酶) ， 使之作用于底物d l 2 氯丙酸，即可制得l 一乳酸和d 乳酸。h u m m e l 等【l 副从 d 一乳酸脱氢酶活力最高的混乱乳杆菌d s m 2 0 1 9 6 菌体中得到d 乳酸脱氢酶，以 无旋光性的丙酮酸为底物制得d 一乳酸。酶法虽然可以专一性地得到旋光乳酸， 但工艺条件复杂，应用到工业上还有待研究。 1 2 3 发酵法生产乳酸 发酵法制备乳酸是以淀粉、葡萄糖等糖类或牛乳为原料，接种微生物经发 酵生成乳酸的过程。自然界中产乳酸的微生物很多，但产酸能力强，可以应用 到工业上的只有根霉属和乳酸菌类。按乳酸菌发酵糖类经由的过程和生成的产 物不同，又将细菌乳酸发酵分为同型乳酸发酵、异型乳酸发酵和混合型乳酸发 酵。 1 2 3 1 细菌发酵法 用于乳酸生产的细菌菌属主要有乳杆菌属( l a c t o b a c i l l u s ) 、链球菌属 ( s t r e p t o c c o c c u s ) 、芽孢杆菌属( b a c i l l u s ) 。乳杆菌属的菌种有干酪乳杆菌 ( l a c t o b a c i l l u sc a s e i ) 、嗜热乳杆菌伍以c f d 6 口c 纪r f 甜珑t h e r m o p h i l u m ) 、唾液乳杆菌 他口c 幻6 以c i ，甜ss a l i v a t i u s ) 、清酒乳杆菌( 三口c 幻6 口c f ，“ss a k e ) 、嗜酸乳杆菌 ( l a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u s ) 、德氏乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sd e l b r u e c k i i ) 、嗜淀 粉乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sa m y l o p h i l u s ) 、植物乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u m ) 等。 3 链球菌属有嗜热链球菌( s t r e p t o c o c c u st h e r m o p h i l u s ) 、乳脂链球菌( s t r e p t o c o c c u s c r e m o t i s ) 、唾液链球菌( s t r e p t o c o c c u ss a l i v a r i u s ) 等。芽孢杆菌属主要是凝结芽 孢杆菌( b a c i l l u sc o a g u l a n s ) 。 工业生产乳酸的细菌菌株主要采用德氏乳杆菌，其生产的乳酸主要为d l 一 乳酸，采用厌氧分批式发酵。对于传统的发酵原料一一小麦面粉水解液，德氏 乳杆菌较之干酪乳杆菌有更高的产量和生产率。目前国内外研究的重点是诱变 选育耐高糖和高酸的德氏乳杆菌菌株，并进行高浓度发酵驯化【1 4 以6 | 。 1 2 3 2 根霉发酵法 副井等【1 4 】曾指出，产l ( + ) 一乳酸较多的根霉菌种有：黑根霉( r h i z o p u s n i g r i c a u s ) 、爪哇根霉( r h j a r a n i c u s ) 、小麦区根霉( r h y r i f i c i ) 、华根霉( r 矗 c h i n e n s i s ) 、甘蔗根霉( r h b a t a t a ) 、米根霉( r h o r y z a e ) 、结节根霉( r h n o d o s u s ) 、 日本根霉( r h j a p o n i c u s ) 、东京根霉( r h f o n k i n e s i s ) 、高温根霉( r h t h e r m o s u s ) 、 少根根霉( r h a r r h i z u s ) 、美丽根霉( r h e l e g e n s ) 等十多种。 根霉属中的米根霉是生产l ( 十) 一乳酸的理想菌种，目前国内外研究者所采 用的根霉菌种多为米根霉l l7 1 。 图1 2 米根霉细胞的葡萄糖代谢模型 f i g 1 ，2m o d e lo fg l u c o s em e t a b o l i s mi nr h i z o p u so r y z a e 米根霉发酵生产乳酸的糖分解代谢过程中，主要包括e m p 途径和t c a 途 径，没有磷酸戊糖途径。米根霉将大部分糖转化为乳酸，同时伴随着产生乙醇、 富马酸等副产物，如图1 2 。葡萄糖从细胞外转入细胞内，经过6 一磷酸葡萄糖 ( g 6 p ) 、1 ，6 一二磷酸果糖( f 1 ，6 2 p ) 、磷酸烯醇丙酮酸( p e p ) 等中间产物，生成 终产物丙酮酸盐( p y r u v a t e ) 。丙酮酸有4 条去路：其一，经乳酸脱氢酶( l d h ) ， 4 生成乳酸；其二，转化为乙醛( a c e t a l d e h y d e ) 后生成乙醇；其三，生成乙酰辅酶 a ，进入三羧酸( t c a ) 循环，此循环中会产生副产物：延胡索酸盐( f u m a r a t e ) 、 苹果酸盐( m a l a t e ) 、草酰乙酸盐( o x a l o a c e t a t e ) ；其四，羧化生成革酰乙酸盐 ( x a l o a c e t a t e ) ，然后转化为苹果酸盐( m a l a t e ) $ 【l 延胡索酸盐( f u m a r a t e ) i s 】。 微生物发酵法生产乳酸，可通过菌种和培养条件的选择而获得具有立体专 一性的d 一乳酸、l 一乳酸或是两种异构体以一定比例混合的消旋体，以满足生产 聚乳酸的需要。根霉对营养要求简单，菌丝体大，易于分离；根霉发酵得到的 乳酸为光学纯度很高的l ( + ) 一乳酸，产品质量很高，对进一步生产聚l 一乳酸极 为重要。因此米根霉成为目前l 乳酸发酵研究的重点和热点。 本发酵研究采用的菌株为米根霉。 1 3 高密度发酵技术 1 3 1 高密度发酵 高细胞密度发酵( h i g h c e l l d e n s i t yf e r m e n t a t i o n ，h c d f ) ，是通过提高菌体 的发酵密度，最终提高产物的比生产率( 单位体积单位时间内产物的产量) 的 一种新型发酵技术9 1 。 随着发酵剂的商业化生产和应用的迅速增加，工业发酵的基本目标基本转 向了以最小的代价获得最大的产值和利润，而实现这目标的工程手段就是针 对特定的过程建立相对应的高效发酵模式。高细胞密度发酵就是为了满足这一 需求而发展起来的一门新兴技术。高密度发酵可以提高菌体的发酵密度或单位 体积培养液中菌体的浓度、减少培养体积、提高体积产率、强化下游分离提取； 还可以缩短生产周期、减少设备投资，从而降低生产成本，提高产品在市场上 的竞争力2 0 1 。 高密度发酵技术的出现与发展，最初是与重组药物的生产密切相关的。这 一技术的基本思想在于：以大肠杆菌为代表的一类微生物作为宿主表达的重组 药物多为胞内产物，如果能在保证比生产率的前提下尽可能的提高细胞密度， 则有可能使体积生产率大幅度提高。自2 0 世纪9 0 年代以来，高密度发酵技术取 得了长足的发展，新科学和新技术不断发展，为我们提供了很多达到细胞高密 度的方法，主要涉及如何设计适于高密度发酵的培养基；如何在发酵过程中采 用适当的补料控制策略来实现细胞的高密度培养；如何针对微生物类型选择合 适的反应器等。 由于不同菌种所能达到的最高菌体浓度相差较大，例如大肠杆菌培养的生 物量可达到1 5 0 2 0 0 9 l ，而对于一些极端微生物或者自养微生物，细胞浓度尚 不能达到lg l ，所以高密度发酵是一个相对的概念，目前的文献资料中并没有 对高密度培养有确切的定义。一般来说，高密度培养是指应用一定的培养技术 5 或装置提高菌体的发酵密度，使菌体密度较分批培养有显著的提高，最终提高 特定产物的比生产率。 表1 2 几种高密度培养技术的优缺点 t a b l e 1 2a d v a n t a g ea n dd i s a d v a n t a g eo fs e v e r a lh c d c 1 3 2 补料分批培养 1 3 。2 1 补料分批培养的应用范围 补料分批培养( f e db a t c hc u l t u r e ) 特指发酵过程中将某一种或几种限制性 底物流加到反应器中，而目的生成物则要到反应结束时才提取出来的操作方式。 对那些培养基成分的浓度显著影响菌体和产物得率的反应过程十分适用。补料 分批培养由于采取了相应的对基质浓度的控制方法消除了些不利因素，因此 提高了产物的生产效率，它一般应用于以下几种情况： 细胞的高密度培养：通过流加高浓度的营养物质，培养液中的细胞浓度 可以达到非常高的程度，如大肠杆菌的浓度可达1 5 0 2 0 0 9 l ，这对于胞内产物 的生产过程十分有利。 发生基质抑制的过程：一些微生物能利用甲醇、乙醇、乙酸、某些芳香 族化合物，但这些物质在较高浓度下对细胞的生长会有抑制作用，采用补料培 养法，使这些基质浓度保持在较低的水平，解除它们的抑制作用。 分解代谢物阻遏：某些很容易被微生物利用的物质( 如葡萄糖) 作为碳源 且浓度较高时，会使细胞内某些酶的合成受到阻遏。采用补料培养使培养液中 基质浓度保持在低水平，可以有效地去阻遏。 6 营养缺陷型菌株的培养：某些营养缺陷型菌株可以积累某种产物( 如氨基 酸) ，利用这类菌株进行生产时须补充其不能合成的物质供生长之需，但这些物 质过量存在时，可能产生反馈抑制或阻遏作用，影响产物的合成。采用补料培 养法可使这些物质保持在低浓度水平，提高产物的生成率。 1 3 2 2 补料分批培养的优点 传统的发酵过程是分批培养过程，由于分批式培养的一次性投料和放罐， 培养液初始底物浓度较高，容易产生底物和代谢产物的抑制作用，同时也不利 于氧的传递，菌体生长到一定的密度就停止增殖，分批培养过程中的生长抑制 现象主要由于一下几个方面： 基质抑制现象：高浓度的基质会对细胞产生生长抑制作用。高密度发酵的 生物量能达到很高，因此需要投入数倍于生物量的基质，然而高浓度营养对大 多数微生物生长不利。按照米氏动力学当营养物质加到_ 定量时( 1 0 - 2 0 k s ) ， 生长显示饱和型动力学曲线，进一步增加底物浓度，就可能发生一种基质抑制 区，表现为迟滞期延长、比生长速率下降、细胞的率下降等。另一方面，机制 浓度过低也对生长造成抑制。 产物抑制现象：如果细胞的代谢产物对细胞的生长有抑制作用，随着这种 代谢产物的累积细胞的比生长速率将逐渐下降。 与分批培养相比，补料分批培养具有以下优点：可以不断补充由于通气 蒸发等带来的水分损失，改变发酵液流变等性质，使发酵液过程中的泡沫得以 控制，提高装罐系数；可以提高出芽细胞的比例( 以酵母生产为例) ，控制细 胞质量，使p h 得以稳定；可以在一定程度上解除或者减轻底物抑制、产物反 馈抑制和分解代谢无阻遏；可以供给有毒底物或者不稳定底物，如间歇性的 加入抗生素等以增加抗生素标记质粒的稳定性；可以提高产物浓度，特别对 于产物合成偶联型发酵过程；可以进行连续进料和补料操作，在发酵后期， 待形成一定浓度的代谢产物后放出一部分发酵液，同时连续补充一部分新鲜的 营养液，实现连续操作，既有利于提高产物产量，又可以降低成本，从而使发 酵指数得到大幅度的提高；可以使菌种保持最佳的生产性能；可以基于发 酵过程动力学分析，建立数学模型，实现对发酵过程的最优化控制。 1 3 2 3 补料分批发酵应用与高密度发酵的研究 补料分批发酵在发酵过程中一方面能够调节发酵过程中的还原糖浓度，使 还原糖浓度适合菌体的生长；另一方面，补料分批发酵还可以减轻由于起始浓 度过高而发生酵解所产生的副产物对菌体生长带来的毒害抑制作用，所以这种 培养方式已经广泛的应用于多种微生物的高密度培养过程中。补料控制方法如 7 图1 3 p 7 i ：示。 r 1 流量测量及变送2 流量控制器3 调节阀 图1 3 补料控制示意图 f i g ，1 3s k e t c hm a po ff e e d - b a t c hc o n t r o l 表1 3 补料分批培养中的流加技术 t a b l e 1 3f e e d i n gt e c h n i q u eo ft h ef e e d b a t c hc u l t u r e 恒定底物浓度在线检测，根据底物消耗情况调节流加速率， 维持反应期内底物浓度恒定。 反馈补料恒p h 法在线监测，通过p h 的变化推测菌体的生长状 态，调节流加速率，维持p h 为恒定值。 菌体浓度法通过检测菌体的浓度，拟合营养的利用情况， 调节流加速率。 c e r 法通过检测c 0 2 的释放率( c e r ) ，估计碳源的 利用情况，调节流加速率。 补料分批控制培养的控制类型根据依据的指标不同可分为预设参数的非反 馈控制补料和反馈控制补料。前者包括间歇补料、恒速补料、变速补料和指数 补料等；后者主要包括具有反馈控制系统的基于溶解氧恒定、p h 恒定、基于细 8 胞浓度和底物浓度的反馈控制。对于带有反馈控制的补料分批发酵，需要详尽 考察分批发酵曲线，选定与发酵过程密切相关的可检测参数作为控制指标。直 接以底物浓度为控制指标进行补料分批培养为人们长期所期望，其技术难点是 缺乏可靠的实时( r e a lt i m e ) 测定手段。如果能够做到在线检测需流加底物的浓 度，就能将其在培养基中的浓度控制在理想的范围内。表1 3 所示为高密度发酵 中几种补料分批培养的流加技术【2 。 ，目前，国内外对补料分批发酵应用于高密度发酵的广泛涉及到生产有机酸 2 2 - 2 4 】、酶2 5 】【2 6 1 、色素【2 7 1 、细菌素【2 8 1 、酵母【2 9 1 及培养重组大肠杆菌生产外源蛋 白 3 0 - 3 6 等。 在国外方面，y a n g 等 3 7 】应用模糊控制，结合基于溶解氧恒定的反馈控制 策略，进行酿酒酵母的高细胞密度发酵，结果细胞浓度达到11 0 9 l ，残糖保持 在0 0 5 9 l 以下。r a j 等【3 8 】在补料分批发酵重组酿酒酵母表达1 3 一半乳糖甘酶的 过程中在线测定培养物p h ，当p h 5 0 时，往培养物中补入甘油，结果生物量 达到1 4 0 9 l 。sk l e i s t 等【3 9 】将d o 设置在5 ，根据d o 的变化通过快速葡萄糖控 制系统( r a p idg l u c o s ec o n t r o lli n g ，r g c ) 控制补料速率，使得葡萄糖浓度 维持在0 1 9 l ，产物肌醇六磷酸酶的产量达到1 8 0 u m l 。a l f a f a r a 等 4 0 】在流加 培养酿酒酵母生产谷胱甘肽的研究中，采用一个模糊逻辑控制系统来控制葡萄 糖的流加速度，对系统进行优化后谷胱甘肽的比生长速率达到6 2h 一。 k o n s t a n t i n o v 等【4 l 】根据尾气中0 2 和c 0 2 的浓度估算出葡萄糖的消耗速率，将 葡萄糖按照它的消耗速率补加入培养基中，避免了葡萄糖的过量积累或不足， 发酵5 6 h 后，大肠杆菌( ec 0 1 1 ) a t 2 4 6 1 和产物苯丙氨酸的浓度分别达到4 0 和4 6g l 。y a m a n e 等【4 2 】连续测定细胞浓度和培养物体积来确定重组大肠杆 菌h b l 0 1 发酵过程中的底物补料速率，生物量达到3 8 4 9 l 。k i m 等人【4 3 】采用 指数流加和p h s t a t 相结合的策略，以重组大肠杆菌( e c o l i ) k 1 2 发酵过程中 p h 的变化为信号，指数流加葡萄糖，控制菌体的比生长速率为0 1 h ，发酵5 2 h ， 菌体浓度积累到l0 1 9 l 。表1 4 列出了国外其他一些报道的高密度发酵研究实 例 4 4 - 5 5 1 。 在国内该领域中，李世杰等【56 】进行了恒速补料分批发酵与分批发酵的平行 对比实验，表明恒速补料分批发酵在最大菌数，晶体含量，独立效价等方面均 优于分批发酵。詹晓北【57 】等研究了不同p h 值对聚唾液酸发酵过程中菌体生长 和产聚唾液酸的影响，对聚唾液酸的流加补料发酵进行了初步研究，最终获得 了较大的菌体干重。李寅等 58 】曾在2 l 发酵罐中研究了不同流加方式对工程菌 9 高密度培养生产谷胱甘肽的影响，结果发现，采用指数流加模式发酵2 5 h ，细 胞密度g s h 总量和生产强度可分别达到8