（影像医学与核医学专业论文）胰岛细胞移植中抑制tf的表达对ibmir的影响.pdf

摘要 目的：构建反义r n a 干扰组织因子( t f ) 在猪胰岛细胞的表达， 观察抑制t f 表达的胰岛细胞对移植后i b m i r 发生程度的影响。 方法：采用反义技术，设计5 条反义r n a 转染猪胰岛细胞，运 用半定量逆转录一聚合酶链反应( r t - p c r ) 及实时定量r t p c r 方法筛 选对t f 沉默效果最佳反义r n a ；应用i b m i r 体外模型，对沉默t f 后 的猪胰岛细胞在i b m i r 体外模型中各项指标进行检测，从而了解 i b m i r 发生程度。 结果：经p c r 检测在5 条反义r n a 中抽取有沉默效果的 o l i g o t f 一1 0 0 6 、o l i g o t f 一1 0 0 9 、o l i g o t f 一11 4 ：该三种反义r n a 转染 胰岛细胞后，通过实时定量r t - p c r 方法检测发现转染胰岛细胞后4 天对t f m r n a 的沉默效果达到最佳，分别为7 1 9 5 9 6 、5 9 6 3 、1 9 0 5 ； 根据p c r 结果采用转染后4 天的胰岛细胞加入体外i b m i r 模型中，形 成血凝块的质量较轻，血液各项指标显示这三组i b m i r 的发生程度较 空白转染对照组减轻。 结论：t f 作为启动凝血途径的重要因素，与胰岛细胞移植后 i b m i r 的发生存在一定关系，用反义r n a 转染胰岛细胞抑制其表达， 可以减低胰岛细胞移植后i b m i r 的发生程度，有望在将来应用在临床 上，减低移植物的丢失，提高移植后胰岛细胞存活率。 关键词胰岛细胞移植，i b m i r ，反义r n a ，t f a b s t r a c t o b j e c t i v e - a n t i s e n s er n aw a sc o n s t r u c t e dt oi n h i b i te x p r e s s i o no f t fi np o r c i n ei s l e tc e l l ，t h e nt h ee f f e c to fi n h i b i t i o no fe x p r e s s i n gt fi n i s l e tc e l lw a so b s e r v e df o ri b m i ra f t e rt r a n s p l a n t a t i o n m e t h o d s ：5a n t i s e n s er n aw e r ed e s i g n e dt ot r a n s f e c tp o r c i n e i s l e tc e l lw i t ha n t i s e n s et e c h n o l o g y ，t h e nt h es e m i q u a n t i t a t i v er e v e r s e t r a n s c r i p t i o n p c ra n dr e a l t i m e - q u a n t i t a t i v er e v e r s et r a n s c r i p t i o n - p c r w e r ea p p l i e dt os e l e c tt h eb e s ta n t i s e n s er n af o rt f s i l e n c i n g ；t h e i n d e x e sw e r ed e t e c t e di nv i t r om o d e lo fi b m i ri nt h ep o r c i n ei s l e tc e l l a f t e rt f s i l e n c i n g ，t ok n o w n t h el e v e lo fd e v e l o p m e n to fi b m i r r e s u l t ：t h eo l i g o t f - 10 0 6 、o l i g o t f - 1 0 0 9 、o l i g o t f - 114w h i c hh a d e f f e c to fs i l e n c ew e r es e l e c t e db yp c r d e t e c t i o n ；t h er e a l t i m e q u a n t i t a t i v e p c rs h o w e dt h a tt h er e s u l t so ft f m r n as e l i e n c i n ga f t e r4d a y sb y t r a n s f e c t i o no ft h e s et h r e ea n t i s e n s er n ai ni s l e tc e l l s ，w h i c ha r e 71 9 5 、5 9 6 3 、19 0 5 r e s p e c t i v e l y ；t h e w e i g h to fb l o o dc l o tw a s l i g h t e rw h e nt h ei s l e tc e l l sw h i c hw e r et r a n s f e c t e d4 d a y sa g oh a db e e n a d d e di ni b m i rm o d e l si nv i t r oa c c o r d i n gt op c r ，a n dt h eb l o o di n d e x e s s h o w e dt h a tt h ed e v e l o p m e n to fi b m i ri nt h e s et t h r e eg r o u p sw e r e l i g h t e rt h a no n e si nb l a n kt r a n s f e c t i o ng r o u p c o n c l u s i o n ：t h e r ei sar e l a t i o nb e t w e e nt fw h i c hi st h ei m p o r t a n t f a c t o rt os t a r tb l o o dc l o t i n gp a t ha n di b m i ra f t e rr e p l a n t a i o no fi s l e t c e l l s ，a n da n t i s e n s er n a c a ni n h i b i tt h ee s p r e s s i o no ft fa n dr e d u c et h e d e v e l o p m e n to fi b m i ra f t e rr e p l a n t a i o no fi s l e tc e l l s t h i sm e t h o dc a nb e u s e dt ol o w e rt h el o s to f g r a f t sa n di n c r e a s et h es u r v i v a lr a t eo f i s l e tc e l l s c l i n i c a l l yi nt h ef u t u r e k e y w o r d ：i s l e tc e l lt r a n s p l a n t a t i o n ，i b m i r ，a n t i s e n s er n a ，t f 硒堂位j 金室 芸塞绮坠翊盍 英文缩略词表 英文缩写英文全称 中文全称 i b m i r i n s t a n tb l o o d m e d i a t e di n f l a m m a t o r yr e a c t i o n t f m r n a h e s p s s i e q t a t c 3 a c 5 b 一9 u m t i s s u ef a c t o r h e m a t o x y l i na n de o s i n s t a tis ti c a lp a c k a g ef o rt h es o c i a l s c i e n c e u m o l l 立即经血液介导的炎 症反应 组织因子 信使r n a 苏木素一伊红 社会科学统计软件包 胰岛细胞当量 凝血酶抗凝血酶复合 物 人补体片段 人末端补体复合物 原创性声明 本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含 其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学 位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文 中作了说明。 作者签名：名缸日期：丛里3 年! 月尘日 关于学位论文使用授权说明 本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位 论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容， 可以采用复印、缩印或其他手段保存学位论文；学校可根据国家或湖南有关部门 规定送交学位论文。 作者签名： 导师签名： 嗍衅年点月丛日 硕十学位论文 刖再 _ 1 j 一 月i j吾 糖尿病是全球性、发病率逐渐增高的严重代谢性疾病，外源性胰岛素治疗不 能稳定控制血糖，不能制止糖尿病并发症的发生和进展。建立内源性胰岛素分泌 系统是人们一直在研究的热点，胰岛移植给l 型糖尿病病人带来治愈的希望【i 2 】 o 2 0 0 1 年埃德蒙顿中心牵头的国际多中心5 年合作研究结果显示，5 8 的1 型糖尿病病人在接受胰岛移植以后2 年仍可以获得脱离外源性胰岛素治疗，接受 胰岛移植5 年以后仍然有1 4 的病人不需要接受外源性胰岛素，大部分l 型糖 尿病病人在接受胰岛移植以后都得到很大改善【3 1 。 大量的研究表明，胰岛移植后的初期常伴有大量胰岛的丢失【4 】，这些现象与以 下因素有关： ( 1 ) 胰岛制各中胰岛细胞的丢失： ( 2 ) 新植入的胰岛与血流接触的瞬间所引发的反应，被称为立即经血液介导的炎 症反应( i n s t a n tb l o o d - m e d i a t e di n f l a m m a t o r yr e a c t i o n ，以下简称i b m i r ) t 5 1 。 ( 3 ) 免疫排斥反应； ( 4 ) 胰岛在肝脏微环境再血管化完成以前，移植物缺氧导致胰岛凋亡； i b m i r 是胰岛植入后的最早损伤，i b m i r 的特征是移植物导致受体凝血系 统和补体系统的激活，这些瀑布式级联反应导致7 0 的移植物在移植后的几分钟 内死亡。 i b m i r 体外模型的研究已经证明，当胰岛移植物与血液接触时，i b m i r 反 应启动的关键因素是凝血系统激活。已有报道表明：胰岛移植物与受体血液接触 后几分钟内，释放的组织因子( t f ) 就激活了受体血液的v i i 因子，导致了外源 性凝血途径的激活【6 】，这种外源性的激活i b m i r 反应中发挥重要作用，同时移 植物暴露的胶原等又激活因子，从而激活内源性凝血途径【6 】。在体内，生理性 止血与血栓形成的凝血过程几乎都是通过组织因子( t f ) 与f v u a 形成复合物而启 动的。因此，如何抑制移植物t f 的表达，以防止i b m i r 对胰岛移植物的损伤， 已成移植医学研究的热点。 反义r n a 技术是指利用基因重组，构建人工表达载体，使其离体或体内表 达反义r n a ，通过碱基互补与靶r n a 配对结合，封闭或抑制靶基因的表达，从 而对细胞的功能产生影响。 反义技术具有明显的优点：( 1 ) 反义核苷酸是针对特定的靶m r n a 的序列设 计合成，具有极高的特异性；( 2 ) 反义核酸是针对已知序列的靶基因设计合成的， 由于靶基因序列已知，反义核酸仅有1 5 3 0 个碱基，结构简单，容易设计和体外 硕十学位论文 h u高 大量合成。( 3 ) 反义核酸进入细胞内与细胞周期无关，既可进入增殖期细胞又可 进入非增殖期细胞。( 4 ) 反义寡核苷酸不含病毒序列，不会产生免疫反应，也不会 整合入宿主染色体内。反义r n a 技术具有重大的理论与现实意义，可以作为基 因治疗的一种有效手段而发挥重要作用。 基于国内外研究进展结合我们已有的研究基础，我们实验室首次将反义r n a 引入i b m i r 基因治疗的实验研究，拟以t f 为靶标，应用反义r n a 技术为手段， 拟通过下调胰岛细胞t h 的表达，抑制i b m i r 的发生。 2 硕十学位论文 材料与方法 第一章材料与方法 一、反义r n a 的设计合成 反义r n a 寡核苷酸类是在3 一丁醇尾巴上加一个2 一o - 甲基修饰来增加其 体内稳定性。大量研究表明，反义r n a 的一系列特性如对热、酸、碱的稳定性和 对核酸酶的耐受性是与靶r n a 快速、强有力的结合的，而且能破坏靶r n a 的二级 结构口叫们。小r n a 最显著的优点是r n a 寡核苷酸能以包括两个以上的反义r n a 在 内的多种形式存在来用于治疗，这可以标记在已经病理学定义的与疾病有关的一 种或不同基因上的任一不同位点。 为了从已知序列中为设计反义r n a 选择核酸序列，与起始部分、5 非翻译 区及终止信号靠近或者重叠的序列被选为r n a 寡核苷酸靶位点。这种与非手性 r n a 结合的方法被证明能在体内或体外有效而持久的制造活性寡核苷酸单分子。 典型的反义r n a 寡核苷酸制造过程包括：( i ) 选择一个靠近或者与基因靶位区重 叠的寡核苷酸( i i ) 根据靶基因决定和该寡核苷酸有关的g i b b s 自由能量值( iii ) 根据靶基因评估t ( i v ) 开展序列数据库研究决定一个不同于靶基因的基因的 m r n a 中和5 u t r 、翻译起始序列、3 u t r 或翻译终止位点的寡核苷酸重叠序 列。 反义r n a 由澳大利亚新南威尔大学孙仑泉博士设计合成。 二、体外i b m i r 模型试验 1 2 1 仪器材料： 主要试剂来源 c 3 a 、c 5 b 一9 、t a t 、b - t g 试剂盒武汉中美科技有限公司 胰岛素试剂盒 北京泰格科信生物科技有限公司 o 型新鲜全血本实验室体检健康的志愿者 u w 液、l i b e r a s e 酶、n b 酶、f - i o 培养液美国s i g m a 公司 主要仪器 t e 2 0 0 0 - s 显微镜 c o b e 2 9 9 1 细胞纯化机 b s 2 2 4 s 电子天平 体外循环管道( t u b i n gl o o p s ) 血糖仪 q h z - 9 8 a 全温控振荡摇床 真空采血管 来源 日本n i k o n 公司 美国m a n u f a c t u r e di nu s a 公司 德国s a r t o r i u s 宁波菲拉尔公司 美国强生公司 江苏太仓市华美生化仪器厂 美国b d 公司 硕十学位论文 材料与方法 7 0pm 过滤筛美国b d 公司 离心机美国s i g m a 公司 1 2 2 猪胰岛细胞的分离纯化： 新生猪( 2 4 日龄) 由中南大学湘雅医学院实验动物学部提供。实验符合 科学技术部2 0 0 6 年关于善待实验动物的指导性意见的要求1 。新生猪胰岛 细胞分离按照本研究中心建立的方法n 2 1 钔进行，将出生2 4 d 的新生猪( 冠尾长 2 0 - 2 2 c m ) 进行戊巴比妥钠麻醉后，在无菌状态下剖腹取胰，去除肉眼所见的胰 外组织、导管及结缔组织后，将胰腺剪成0 5 a m 0 5 m i n x 0 5 m m - - , 1 o m m 1 0m m 1 0m i l l 大小组织碎块；用0 5 9 l 浓度的v 型胶原酶及d n a s e 酶充分消化；用 4 无c a 2 + 和m 9 2 + 的平衡盐缓冲液( d h a n k ，s 液) 中止消化，加入f 一1 0 完全培养基， 于3 7 ，5 9 6 c 0 ：和9 5 空气培养箱内培养。第2 天换培养液1 次，以后每隔2 4 h 换1 次培养液。培养6 天后供给i b m i r 实验，使用前采用亚啶橙染色和胰岛素 释放实验检测活性。 1 2 3 胰岛细胞计数： 用无水乙醇冲洗计数板后，用绸布擦净，另擦净特制盖玻片一张，把盖玻片 覆在计数板上。用无菌细口吸管吸取培养l 天的胰岛细胞悬液一滴，从计数板边 缘缓慢滴入，使之充满计数板与盖玻片之间的空隙中。稍侯片刻，将计数板放在 低倍镜下( 1 0 xl o 倍) 观察计数。计算计数板的四个大方格内的细胞。计数时， 只计数完整的细胞，若聚成一团的细胞则按一个细胞计数。在一个大方格内，如 果有细胞位于线上，一般计上线细胞不计下线细胞，计左不计右【1 6 】。 细胞悬液细胞数m l = ( 4 个大方格细胞总数4 ) 1 0 ，0 0 0 稀释倍数 1 2 4 体外模拟血管内血液循环管道( t u b i n gl o o p s ) 肝素化： 体外模拟血管内血液循环的管道( t u b i n gl o o p s ) ，由硅胶管 ( m e d t r o n i c i n c ，u s a ) 制成，长度5 0 c m ，内径6 3 m m 。将硅胶管分为3 组，于 每组硅胶管内分别加入不同浓度的肝素盐水0 7 m l ，每根t u b i n gl o o p s 内加入 非抗凝的健康人新鲜全血剂量为7 m l ，使l o o p s 管内新鲜血液中肝素的最终浓度 分别为0 0 0 1 m g m l 、0 0 1m g m l 、0 0 2m g m l ，各组l o o p s 管内血液在实验前 取样检测，对各组l o o p s 均用摇摆模拟血液流动6 0 分钟后取样检测，检测指标 为血常规、凝血指标和补体系统实验指标，以确定对l o o p s 最好的肝素化剂量。 硅胶管固定于3 7 c 摇床内，行弧形钟摆式摇摆，调节摇床速度为1 0 0 次分 钟，摇摆幅度约为3 0 。，使t u b i n gl o o p s 中血液达到最大摇摆振幅，模拟快速 流动的血液，以上各组重复实验6 次。 1 2 5 研究样本分组： 空白对照组：健康人新鲜全血抽出后不放入t u b i n gl o o p s ，立即作相关检测； 4 硕十学位论文 材料与方法 对照组：健康人新鲜全血7 m l + l o o u l 培养液，摇摆6 0 分钟； 实验组：健康人新鲜全血7 m l + 包含不同数量( 分别为5 0 0 i e q 、1 0 0 0 i e q ) 胰岛的l o o u l 培养液，具体如下：5 0 0 i e q ( 胰岛当量) 实验组、1 0 0 0 i e q 实验组， 各实验组根据摇摆时间再分为5 、1 0 、6 0 分钟等3 个小组。 以上各组重复实验6 次，确定i b m r i 体外模型添加胰岛数量。 实验中对体外循环管道内表面肝素化，根据实验步骤“1 2 4 体外循环管道 t u b i n gl o o p s 肝素化确定的最佳剂量肝素化。 1 2 6 检测项目： 各小组血液经7 0l lm 过滤网( b d 公司，u s a ) 过滤，各小组血液经7 0bm 过 滤网( b d 公司，u s a ) 过滤，将血液中供体血栓和非血栓的液体部分分开。 固体血栓行h e 染色病理学检测n 7 1 。 血液非血栓部分检测血常规( 包括血小板、白细胞等) 、出凝血时间( p t 、 a p t t ) ；e l i s a 法检测t a t ( 凝血酶抗凝血酶复合物：凝血系统激活的指标) 1 8 , 1 9 ； e l i s a 法检测补体c 3 a ( 人补体片段) 、c 5 b 一9 ( 人末端补体复合物) 含量啪1 ；化学 发光法测定血液内猪胰岛素含量朋1 。 三反义r n a 沉默胰岛细胞t f 表达 1 3 1 仪器与材料 主要试剂 u w 液、l i b e r a s e 酶、n b 酶、f 1 0 培 养液 新生牛血清 g f p o l i g o f e c t a m i n e ( 脂质体) g f p t m p ( 脂质体) 新生猪( 2 4 日龄) 猪t f 反义r n a - - o l i g o f e c t a m i n e t r i z o lr e a g e n t e v e r t r aa c e q 一f i r s ts t r a n dc d n a s y n t h e s i sk i t t a qd n ap o l y m e r a s e ( r e c o m b i n a n t ) d n t pm i x ( 2 m me a c h ) d n am a r k e rd l 2 ，0 0 0 t r i z o l r e v e r t a id t mhm in u sf i r s ts t r a n dc d n a s y n t h e s i sk i t d e o x y r i b o n u c l e a s ei ( d n a s ei ) r i b o l o c k t mr i b o n u c l e a s ei n h i b i t o r s y b rg r e e n p c rm a s t e rm ix 来源 美国s i g m a 公司 杭州四季青公司 美国i n v i t r o g e n 公司 日本 中南大学湘雅医学院动物部 澳大利亚 i n v it r o g e n ，c a t n o 15 5 9 6 0 2 6 t o y o b o # f s k 10 0 f e r m e n t a s # e p 0 4 0 2 f e r m e n t a s # r 0 2 41 t a k a r ad 5 0 i a i n v i t r o g e n f e r m e n t a s # k 1 6 3 f e r m e n t a s # e n 0 5 21 f e r m e n t a s # e 0 0 3 8 a b i4 3 0 9 1 5 5 硕十学位论文材料与方法 p r i m e ra ( g a p d h ) ，p r i m e rb ( g a p d h ) i n v i t r o g e n 合成 主要设备 6 、2 4 孔培养板 t e 2 0 0 0 一s 显微镜 离心机 超净工作台 c 0 2 培养箱、水浴箱 1 1 0 u l 、2 2 0 u l 、1 0 1 0 0 u l 、5 0 2 0 0 u l 、 2 0 0 10 0 0 u l 移液器 2 m l 、5 0 m l 离心管 p c r 仪 来源 美国c o s t a r 公司 日本n i k o n 公司 b e c k m a n ，德国 h e a l f o r c eh f s a f e l2 0 0 0 上海力申科 学仪器有限公司 s h e l l a b ，美国 g i l s o n 法国 a x y g e n ，美国 b i o m e t r a ，u n oi i 水平电泳槽北京君义东方仪器公司，j y - s p c 高速离心机 s i g m a ，卜1 3 成像系统柯达紫外显相系统4 0 0 w 像素 1 3 2 转染参数的选择，浓度的调整及转染率的检测 胰岛细胞来源、纯化及细胞计数方法同“二、体外i b m i r 模型试验” 1 3 2 1 研究样本分组 将胰岛细胞分t m p 转染组及o l i g o f e c t a m i n e 转染组，每组分三孔，每孔试剂总量 为i m l ，加入胰岛细胞1 0 0 0i e q 及浓度为l u m l 的o l i g o8 u l ； g f p t m p 转染组又分为低浓度组、中浓度组和高浓度组 低浓度组加入g f p - t m p1 9 2 u l 中浓度组加入g f p - t m p3 8 4 u l 高浓度组加入g f p - t m p7 6 8 u l g f p o l i g o f e c t a m i n e 转染组亦分为低浓度组、中浓度组和高浓度组 低浓度组加入g f p - o l i g o f e c t a m i n e4 u l 中浓度组加入g f p o l i g o f e c t a m i n e8 u l 高浓度组加入g f p o l i g o f e c t a m i n e1 6 u l 1 3 2 2 转染后4 4 , 时加入小牛血清至终末浓度为1 0 ，放置c 0 2 培养箱培养1 2 d , 时于荧光显微镜下观察。以上试验重复3 次，荧光显微镜下观察，确定最佳转染 试剂及浓度。 1 3 2 3 于转染细胞最多组抽取l o o u l 细胞混悬液于荧光显微镜下观察，对转染 胰岛细胞进行计数，重复1 0 次，取平均值。 四、反义r n a 转染猪胰岛细胞体外i b m i r 试验 6 硕十学位论文 材料与方法 1 4 1 仪器与材料同“三反义r n a 沉默胰岛细胞t f 表达 1 4 2 研究样本分组 将胰岛细胞分为3 大组，置于2 4 孔板内培养，每孔1 0 0 0i e q 猪胰岛细胞， 根据“第1 3 2 转染参数 的研究结果确认转染载体的使用浓度： 空白组：在不进行任何处理的培养基中培养的猪胰岛细胞 空白转染对照组：培养基内加入o l i g o f e t c t m i n e t f 反义r n a o l i g o f e c t a m i n e 转染实验组：胰岛细胞又分为5 小组，培养基内分 别加入t f 1 0 0 6 、t f 1 0 0 9 、t f 1 ll 、t f 11 4 、t f t s 95 种反义r n a 各实验组根据2 天、4 天、6 天、8 天四个时间点分为4 个小组，一组为一孔( 共 2 8 孔) ，转染步骤如下： 1 6 u lo l i g o f e t c t r n i n e + 6 0 u lf 1 0 培养基混合后在室温下放置1 0 分钟 8 u lo l i g o ( 1 u m l ) + 1 1 6 u lf 1 0 培养基 将前两步中两种试剂混合，室温下放置1 5 分钟 转染的胰岛细胞在转染前用无血清培养基清洗一次 将步骤4 中的混合试剂加入放置细胞后的培养板内，放置于恒温培养箱中培养， 转染后4 小时加入小牛血清至终末浓度为1 0 培养，每4 8 小时更换一次f 1 0 培 养基，每两天从培养板中提取细胞混悬液于离心管中，1 0 0 0 r p m 离心l m i n ，吸出 上清液，下层细胞放置- 8 0 c 冰箱冻存后行p c r 检测。以上实验重复6 次。 1 4 3r t p c r 检澳4 引物资料 h o m o - t f - f h o m o - t f - r 片段长度 h o m o g a p d h f h o m o - g a p d h - r 片段长度 5 一g g a g c c t c t g t a t g a g a a c t 一3 5 一c g g a g g c t t a g g a a a g t g t t 一3 1 6 2 b p 5 一a c c a c a g t c c a t g c c a t c a c 一3 5 一t c c a c c a c c c t g t t g c t g t a 一3 4 5 0 b p 1 4 3 1r n a 提取 ( 1 ) 每份细胞样品加入i m lt r i z o l 试剂。 ( 2 ) 匀浆样品在室温静置5 - 1 0 m i n 后加入0 2 倍体积的氯仿，震荡1 5 秒后在2 - 8 ( 2 下1 2 ，0 0 0 x g 离心1 5 m i n ( 3 ) 将水样层转移至试管，加入0 5 倍体积的异丙醇，混匀后一2 0 c 下 静置l o - 1 5 m i n ，在2 - 8 c 下1 2 ，0 0 0 g 离心l o m i n ( 4 ) 移去上层悬液，将r n a 沉淀用l m l7 5 z , 醇洗涤，在震荡器上混匀 后2 - 8 。c 下7 ，5 0 0 g 离心5 m i n ，弃去上清液。 7 硕十学位论文材料与方法 ( 5 ) 适度干燥r n a 沉淀后，加入适量无r n a s e 的水，使r n a 完全溶解。 ( 6 ) 2 0 0 0 r p m 离心2 0 s e c 1 4 3 2 反转录( 2 0i jl 体系) r t 反 c o m p o s it i o n v o l u m e ( ul ) c o m p o s i t i o n v o l u m e ( ul ) t e m p l a t e ( 反转录产物) p r i m e rs e n s e ( 1 0 0l am o l l ) p r i m e ra n t i - s e n s e ( 1 0 0l im o l l ) d n t pm i x t u r e ( 2 i l l m ) m g c l 2 ( 2 5 m m o l l ) 1 0 p c rb u f f e r t a qd n ap o l y m e r a s e ( 5 0 0 u ) p c rh ：0 1 o o 5 o 5 2 1 5 2 0 5 1 2 o p c r 扩增程序： 8 硕士学位论文材料与方法 产物用琼脂糖凝胶电泳检测 扩增产物用1 5 琼脂糖凝胶电泳，加样量为l o | jl ，电压1 2 0 v ，电泳完毕后在溴化 乙锭( e b ) 中染色，在紫外灯下观察结果并照相。 1 4 4 实时定量r t - p c r ( r e a lt i m eq u a n t i t a t i v ep c r ) 1 4 4 1 引物参数 f o r w a r dp r i m e r ：c c a t g t t c g t c a t g g g t g t g a a c c a r e v e r s ep rim e r ：g c c a g t a g a g g c a g g g a t g a t g t t c t f 基因引物序列 s e n s e ：5 一g g a g c c t c t g t a t g a g 从c t - 3 a n t i - s e n s e ：3 - c g g a g g c t t a g g 从a g t g t t - 5 内参基因引物序列 1 8 s i n v i t r o g e n 合成 s e n s e ：5 - c c g a g 从g t t t c a g c a c a t c c - 3 a n t i - s e n s e ：5 - t g g c a g t g a t a g c g 刖屺g c t 一3 注：定量p c r 的内参引物与普通p c r 内参引物不同，请注意。 1 4 4 2r n a 提取 ( 1 ) 取不超过l0 6 个细胞样品，每份样品加入l m lt r i z o l 。 ( 2 ) 混匀样品在室温静置5 “l o m i n 后加入o 2 倍体积的氯仿，在2 8 下1 2 ，0 0 0 xg 离心1 5 m i n ( 3 ) 将水样层转移至干净的试管，加入o 5 倍体积的异丙醇，混匀后室 温下静置1 5 m i n ，在2 8 。c 下1 2 ，0 0 0xg 离心l o m i n ( 4 ) 移去上层悬液，将r n a 沉淀用l m l7 5 乙醇洗涤，在震荡器上混匀 后2 8 。c 下7 ，5 0 0 g 离心5 m i n ，弃去上清液。 ( 5 ) 空气中干燥r n a 沉淀后，加入适量无r n a s e 的水，使r n a 完全溶解。 基因组d n a 的去除 ( 1 ) 按顺序依次加入下列试剂 c o m p o s i t i o n v o l u m e t o t a li 州a 1 0xr e a c t i o nb u f f e r r i b o l o e k t mr i b o n u c l e a s e i n h i b it o r ( 4 0 u u 1 ) d e p c t r e a t e dw a t e r d n a s ei ( 1 u u 1 ) 1u g 1u l 0 2 5u l u pt o9u l 1u l ( 2 ) 3 7 。c 孵育3 0 r a i n ； 9 硕十学位论文 材料与方法 ( 3 ) 加入l u l2 5 r a m 的e d t a ，6 5 温育l o m i n 使酶失活。 反转录( 2 0 u l 体系) c o m p o s i t i o n v o l u m e ( u 1 ) t o t a lr n a 0 1 i g o ( d t ) 。( 0 5 u m o l u 1 ) w a t e r ( d e p c - t r e a t e d ) 7 0 5 m i n 。c h i l l 5xr e a c t i o nb u f f e r 4d n t pm i x ( 1 0 r m o l u 1 ) r i b o n u c l e a s e i n h i b i t o r ( 4 0 u u 1 ) w a t e r ( d e p c - t r e a t e d ) 3 7 5 m i n r e v e r t a i d wm m u l vr e v e r s e t r a n s c r i p t a s e ( 2 0 0 u u 1 ) 4 2 6 0 m i n 。7 0 l o m i n ， 2u g 1u l u pt o1i u l o ni c e 4u l 2u 1 o 5u l 1 5u l lu l c h i l lo ni c e 1 4 4 3r e a l t i m ep c r ( 2 5 u l 体系) c o m p o s i t i o n v o l u m e t e m p l a t e ( 反转录产物) p r i m e ra p r i m e rb 2xs y b rg r e e np c rm a s t e rm i x d d h ：0 lu l 1 0 0 n m l o o n m 1 2 5u l u pt o2 5 u l r e a l t i m ep c r 扩增程序： 1 4 5 体外i b m i r 实验 1 4 5 1 实验材料及设备、实验方法同“二、体外i b m i r 模型试验 1 4 5 2 按实验“三反义r n a 沉默胰岛细胞t f 表达 的研究结果选用3 种转染 1 0 硕十学位论文 材料与方法 效率较高的3 种t f 反义r n a o l i g o f e c t a m i n e ，本段描述暂用“t f a ，t f - b 和 t f c ”。 研究分组 空白对照组：未处理过的猪胰岛细胞 空白转染对照组：加入o l i g o f e t c t m i n e 后培养的猪胰岛细胞 t f 反义r n a o l i g o f e c t a m i n e 转染实验组：将t u b i n gl o o p s 模型分为t f a 组、t f b 组和t f c 组，分别将t f a 转染后的猪胰岛细胞，t h b 转染后的猪 胰岛细胞和t h c 转染后的猪胰岛细胞分别置入相应组别的t u b i n gl o o p s 模型； 以上各组加入体外i b m i r 模型中3 7 恒温摇摆3 0 分钟，重复实验6 次。 1 4 5 3 检测项目 各小组血液经7 0l am 过滤网( b d 公司，u s a ) 过滤，固体血栓称重。血液非 血栓部分检测血常规( 包括血小板、白细胞等) ；e l i s a 法检测t a t ( 凝血酶抗凝 血酶复合物：凝血系统激活的指标) “8 旧1 ；e l i s a 法检测补体c 3 a ( 人补体片段) 、 c 5 b 一9 ( 人末端补体复合物) 含量n 引。 硕十学位论文 结果 第二章结果 一、i 阴l r 体外模型建立 2 1 1t u b i n gl o o p s 内不同浓度肝素对i b m i r 体外建模的影响： 含三种不同浓度肝素的t u b i n gl o o p s 摇摆6 0 分钟后与对照组( 即新鲜抽出 的标本立即作检测) 对比，当肝素浓度为0 0 0 1 m g m l 时，对血液凝血功能影响 最小，可以长时间模拟体内血液并维持其正常生理功能不变：浓度为o 0 1m g m l 、 0 0 2m g m 1 时，虽然也能很好的维持血液的流动性，保持血液中各种血细胞数 量的稳定，但出凝血时间指标均明显延长，不能保持血液的正常出凝血功能。 表l不同浓度肝素的新鲜全血生化及出凝血时间检测结果 与实验前组相比，差异有统计学意义 发生凝血，相关指标未能测得 ，a p 3 n r 时间过长，超出仪器测量范围，未能测出 2 1 2 摇摆6 0 分钟实验各组血细胞、血浆指标结果： 摇摆6 0 分钟含有胰岛细胞的实验组，血小板、中性粒细胞、单核细胞明显 消耗，同时凝血系统、补体系统显著激活；而对照组没有血栓形成，其较明显的 改变是6 0 分钟后血小板消耗了1 5 。 表2摇摆6 0 分钟后各组的血液血细胞检测结果 1 2 硕十学位论文 结果 与对照组相比，差异有统计学意义 孝5 0 0 i e q 与1 0 0 0 i e q 组相比，差异有统计学意义 表3 摇摆6 0 分钟后各组的血液补体及胰岛素结果 与对照组相比，差异有统计学意义 带5 0 0 i e q 与1 0 0 0 i e q 组相比。差异有统计学意义 表4 各组不同时间点的血栓重量( g ) 2 1 3 h e 染色病理学显示胰岛细胞与新鲜全血接触后被包埋于血栓中，血小 板、纤维蛋白连于胰岛表面，且完全包围胰岛( 图8 ) ；同时可见白细胞、单核 细胞围绕胰岛细胞并浸润其内( 图9 ) ；胰岛细胞完整性被破坏，且可见其浓缩 的细胞核( 图1 0 ) 。 二、反义r n a 沉默胰岛细胞t f 表达 2 2 1 转染载体参数的选择 荧光显微镜下，用波长4 8 8 n m 紫外光激发，可见： 用t m p 转染低中高组的胰岛细胞只有少量被荧光标记( 图l ，图3 ，图5 ) ； o l i g o f e c t a m i n e 转染低中高组的有一定数量胰岛细胞被荧光标记( 图2 ，图4 ， 图6 ) ，以高浓度组中被荧光标记的细胞数量最多。 因此采用o l i g o f e c t a m i n e 作为载体转染，t f 反义r n a - o l i g o f e c t a m i n e 转染 浓度取高浓度组值。 2 转染率 2 2 2 转染率 于o l i g o f e c t a m i n e 转染高浓度组抽取l o o u l 细胞混悬液于荧光显微镜下观察， 对转染胰岛细胞进行计数，重复1 0 次，取平均值。 在荧光显微镜下观察，可见细胞内有绿色荧光显示，对转染胰岛细胞进行计 1 3 塑主茎堡造塞壁墨 数，转染率为4 45 ( 圈6 ，图7 ) 三、体外i b i d l r 实验 2 2 3r t p c r 图i ir t - p c r 电泳条带 从左至右依次为：m a f l ( e r 、空白组及空白转染对照组、1 p t s 9 、t f - i i i 、t f - 1 0 0 6 、 t f - 1 0 0 9 、t f - 1 1 4 阳性条带以g e lp r 0 4 0 版凝胶光密度分析软件进行分析，测其1 0 0 值。 经凝胶影像分析仪处理，用平均吸光度乘以条带面积的值表示总的吸光度值 来代表各基因m r n a 量。将目的基因与内参基因的电泳条带的平均光密度和面积 乘积的相对比值( 目的基因，内参基田) 作为目的基因的相对表达量。并照像保 存。各目的基因扩增重复3 次取均值。 根据图片示：f 至o l i g o t f 一1 0 0 6 、o l i g o t f 1 0 0 9 、o l i g o t f - 1 1 4 转染的胰岛细胞t f 无 表达：经o l i g o t f - 1 1 l 、o l i g o t f - t s 一9 转染的胰岛细胞有表达；空白组及空白转 染对照组强表达。 224 实时定量盯一p c r 图1 2 扩增曲线 m u f l l c o m p o n e f tp l o t l l l l m￥0口i 硕士学位论文结果 图1 3 熔点曲线 结果分析 重复扩增3 次，扩增曲线结果显示，平行孔间误差较小；熔点曲线显示 没有非特异性的扩增。因此结果可信。 表5 实时定量r t _ p c rc t 值数据 硕士学位论文结果 8 誉毒墓” t f i 0 0 6t f l 0 0 9t f i l lt f l l 4 t s - 9 空白组阴性对照 表6 反s r n a 转染猪胰岛细胞表达率 圜 以最高值即空白组第8 天值设为1 0 0 三、体外