（农产品加工及贮藏工程专业论文）菊芋对双歧杆菌（Bifidobacterium）生长影响的研究.pdf

摘要 本文以菊芋汁和菊芋粉为主要材料，较系统地研究了菊芋对双歧杆菌生长的影 响，以期为进一步开发利用菊芋资源、双歧杆菌的培养及其制品开发提供理论依据。 菊芋在体外对双歧杆菌生长的影响试验表明，菊芋汁在体外对长双歧杆菌( b l m ) 和两歧双歧杆菌( b b m ) 的生长具有促进作用，其效果随着菊芋汁添加量的增加而 增加，并且对不同菌种的促生长效果存在差异；在脱脂乳中添加3 的菊芋粉可以缩 短b l m 和b b m 的凝乳时间，其原因可能为促进了试验双歧杆菌在脱脂乳中的产酸。 研究了以菊芋汁为主要原料的双歧杆菌培养基，大量试验结果表明，在菊芋汁中添 加胰蛋白胨、牛肉膏、大豆蛋白胨、玉米浆和半胱氨酸盐酸盐等成分，对双歧杆菌 有明显的促进生长作用；利用大豆蛋白胨、玉米浆和半胱氨酸盐酸盐设计了三因素 三水平的芷交试验，确定了菊芋汁复合培养基的优化配方：菊芋汁+ 0 3 玉米浆+ 0 0 5 大豆蛋白胨+ o 0 2 5 半胱氨酸盐酸盐。在通过单菌株检验和混菌检验确立了一 种选择性双歧杆菌培养 在动物肠道内对双歧杆 选择性促进生长作用， 鼠为实验动物，研究了菊芋 菊芋汁在体内对双歧杆菌有 杆菌的生长受到抑制；菊芋 中的菊糖成分可能对菊芋在体内选择性地促进双歧杆菌生长起了主要作用；此外， 菊芋还具有明显的整肠作用，周对照组相比，饲喂菊芋汁的小鼠排便顺利，粪便颗 粒大且湿润。初步研究了菊芋对双歧杆菌的胆盐耐受性的影响，实验表明，脱氧胆 酸钠盐对b l r a 和b b m 有一定毒性作用；在培养基中补充一定量的葡萄糖和果糖可以 改善b b m 朐胆盐耐受性，而菊糖和菊芋粉对提高b l m 和b b m 的胆盐耐受性没有明 显作心7 关键词t 菊芋；双歧杆菌 菊芋汁复合培养基；胆盐耐受性 独创性声明 y 3 5 5 墨s 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外。论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得i 雪i 盗堡! ! 至 或其他教 育机构的学位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志对木研究所做的任何 贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：羽、；砂彩签字日期：聊2 年月刁日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解之刍! ! 整! ! 至有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和 借阅本人授权i 型! 鉴! 茎盏可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据 库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存，汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：羽、 砂移 导师签名 霍英影 签字日期：m 年 月 日签字日期：w j 年6 月乃日 学位论文作者毕业后去向：，可 t 纸天品唔产衫侈孜 工作单位：夕确- c ，歇业_ 丈渗 电话：w ? 7 。 通讯地址：家芝节安庄 封伤口多 邮编：7 。 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 文献综述 双歧杆菌( b i f i d o b a c t e r i u m ) 在1 8 9 9 年由法国巴斯德研究所的蒂瑟尔( t i s s e r ) 从健康的母乳喂养婴儿的粪便中首先发现和分离出来”l 。随着对双歧杆菌研究的不 断深入在不同来源中，分离出许多种双歧杆菌，迄今已有3 2 种 2 1 由于对这类菌 的认识存有异议，在分类历史上不同研究者曾使用不少属名为其命名。双歧杆菌属 的名称虽然早在1 9 2 4 年o r t a - j e n s e n 已经提出，但直到伯杰氏细菌鉴定手册第8 舨 ( 1 9 7 4 ) 才将其作为正式属名列入放线菌且放线菌科下目前，国际上公认能安全 应用于食品的双歧杆菌有5 种：两歧双歧杆菌( a b i f i d u m ) 、青春双歧杆菌 ( b a d o l e s c e n t i s ) 、婴儿双歧杆菌( b i n f a n f i s ) 、长双歧杆菌( b 1 0 n g u m ) 和短双歧杆 菌( b b r e v e ) | 3 1 i 双歧杆菌的形态和生理生化特征 双歧杆菌的细胞呈现多种形态：有短杆较规则形、纤细杆状具有尖细末端形、 球形、长而稍弯曲状、各种分叉形、棍棒状或匙形单个或链状、v 型、栅栏状排 列，或聚集成星状其典型形态是有分叉的杆菌。菌落光滑、凸圆、边缘完整、奶 油色至白色、质软有弹性革兰氏阳性美蓝等染色菌体着色不均不耐酸，不形 成芽孢，无荚膜，无运动性厌氧，对氧的敏感性不同的种和菌株存在差异，一些 菌在有c 0 2 存在时可耐受氧最适生长温度为3 7 4 1 ，最低生长温度为2 5 - 2 8 ， 最高生长温度为4 3 - - 4 5 ，最适发酵温度为3 5 i o 起始生长最适d h 为6 5 7 0 ， 在p h 4 5 - 5 0 以下或p h 8 o 嵋5 以上不生长过氧化氢酶阴性，但星状双歧杆菌和蜜 蜂双歧杆菌例外双歧杆菌通常不还原硝酸盐，然而，当生长于含有溶解红细胞的 培养基时，则可能有还原硝酸盐的作用吲哚反应阴性明胶液化阴性联苯胺反 应阴性双歧杆菌对葡萄糖的代谢可归于异型发酵，但不同于其它乳酸菌。而是经 由特殊的双歧支路其中，果糖6 磷酸磷酸酮酶( f 6 p p k ) 起关键作用双歧杆菌 属中大多数细菌细胞的抽提物内具有f 6 p p k ，因此检测出f 6 p p k 可作为鉴定双歧杆 菌属的重要特征产生乙酸和乳酸，理论摩尔比为3 ：2 不产丁酸和丙酸，不生成 c 0 2 d n a 的g + c 含量为摩尔分数5 5 0 0 , 6 7 ，异形双歧杆菌( b 1 n o p i n a t u m ) 除外， c r o c i a n i 等报导( 1 9 9 6 ) ，这个种的g + c 含量为摩尔分数4 4 - 4 6 2 1 2 双歧杆菌对人体的生理功能 双歧杆菌是人体肠道中正常菌群成员之一i j 在人体生理正常的时候，人的体 腔寄生的各种细菌之间形成一种相互依存、相互制约的生态学均势，这种均势使细 菌在体腔中形成具有一定种类及一定数量的菌群，即正常菌群 5 1 科学研究证明， 双歧杆菌是一种益生菌( p r o b i o t i c s ) 州，益生菌的最新定义( g u a m e r ，1 9 9 8 ) 为： 摄入宿主后能产生超过固有基础营养价值的有益作用的活菌制剂川双歧杆菌的主 要生理功能有同：维持肠道菌群平街，治疗肠道功能紊乱双歧杆菌可粘附于肠 黏膜上皮细胞，通过自身及产生代谢物捧斥致病菌双歧杆菌在体内发酵糖类，产 生大量乙酸和乳酸，降低肠道p h 和e h ，抑制致病菌生长；肠道内的酸性环境，可 以调节和促进肠蠕动，防止致病菌定植，还能防止便秘( 人体大肠部位的p h 通常 为弱碱性i 。】) 。双歧杆菌能产生胞外糖苷酶，可降解肠黏膜上皮细胞的复杂多糖，而 这些糖是致病菌和细菌毒素的受体，通过酶的作用可以阻止致病菌及其毒素在肠黏 膜上皮细胞的粘附和侵入。f u j i w a r as 等的研究表明”j ，由b 1 0 n g u m s b t 2 9 2 8 产生的 蛋白质b i f 的胞外组分p l o o v 抑制产肠毒素大肠杆菌( e t e c ) p b l 7 6 和在人体细胞 系h c t - 8 细胞上的糖脂受体g a l 结合双歧杆菌的发酵滤液中存在l o o b p 以下的 核酸片段，可能在双歧杆菌与机体的相互关系中起重要作用l i 川。双歧杆菌还能通过 产生细菌紊抑制病原菌的生长。抗肿瘤作用。双歧杆菌的存在及其生成的代谢产 物优化了肠道菌群组合，增强了免疫功能，抑制了肿瘤细胞增殖和致癌物质产生。 s a n g - m y e o n yl e e 等用b 1 0 n g u m h y 8 0 0 1 ( b i o 对氧化偶氮甲烷( a o m ) 导致的结肠肿瘤 发生前的损伤诸如异常的小囊病灶( a c f ) 形成的影响进行了研究i i “，结果表明，b i f 组中的a c f 总数比起只注射a o m 组的显著降低。完整肽聚糖( w h o l ep e p t i d o g l y c a n 。 w p g ) 是双歧杆菌细胞壁的主要成分，在体内具有抗肿瘤以及免疫赋活等多种功能。 目前认为w p g 的抑瘤途径主要是通过激活巨噬细胞，使之产生一定量的具有抑瘸 活性的l l 1 、i l - 6 ，i l 2 、t n f a 以及n o 等；另外，它亦能诱导肿瘤细胞的凋亡i j “。 激活免疫系统，提高人体免疫机能一些动物试验说明双歧杆菌能激话枫体吞噬 细胞的吞噬活性，促进特异性和非特异性i g a 抗体产生肚“”。营养作用双歧 杆菌产生的酸可促进对v b 、钙和铁离子的吸收。还有资料说明双歧杆菌可在肠道内 合成多种维生素，如、r b l 、v b 2 、v m 、，b 1 2 、v p 、泛酸和叶酸等控制内毒素的产 生双歧杆菌可抑制肠道中腐败菌繁殖，从而减少肠道中内毒素和尿素酶含量，使 血液中内毒素和氨含量下降降低自氧化作用，延缓机体衰老。双歧杆菌能使机 体中某些具有抗衰老作用的酶活性升高，使致衰老物质浓度下降。降低血清中胆 固醇含量l l 埘。k i k u c h i h a y a k a w ah 等用切除卵巢的叙利亚仓鼠作为绝经后妇女的脂 类代谢模型，研究了用b b r e v e 发酵的豆乳膳食对脂类代谢的影响【l “。结果显示，实 验组致动脉粥样化指数值和血浆甘油三酸醅水平低于对照组，肝的总胆圃醇含量显 著低于对照组提高宿主对放射线的耐受性”5 j 改蔷乳糖耐受等。双歧杆菌在 肠道中的作用研究复杂1 1 9 1 一是由于它们是一个复杂生态系统的一部分。二是由于 它们的体内研究遇到许多道德限制。w e dmj 等为了研究双歧杆菌的作用，在 耵蚴i s n e t l l c n 锄出) 研制出一些工具，包括双歧杆蘸的遗传修饰和体外肠道模型。 可以把益生菌在肠道健康方面的积极作用量化 3 双歧杆菌制品的种类 双歧杆菌是定植于人体内的生理性细菌。但是，随着年龄增长、饮食改变、环 境污染、抗生紊使用及放化疗等，双歧杆菌在体内的含量下降这将导致肠道微生 态失调引起菌群易位，诱发内源感染，造成机体病变删因此，人们一直在寻找 向肠道内补充双歧杆菌的方法从2 0 世纪7 0 年代以后，一些国家相继研制出双歧 杆菌制剂，用于治疗各种因素引起的菌群失调目前，国际上双歧杆菌制品的形式 2 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 主要有以下三种1 32 1 , 2 2 0 】：双歧杆菌活菌制品。包括双歧杆菌活菌制剂及其保健 食品，在保健食品中又以发酵乳制品居多。它能够对肠道直接快速补充双歧杆菌。 然而，由于双歧杆菌具有对营养要求苛刻、专性厌氧、不耐酸等特殊生物学特性， 其工业化生产和活菌制品保藏极为困难。所以，目前只有少数技术和设备先进的工 厂有能力生产除此之外，外源双歧杆菌还难于通过宿主胃肠屏障并在肠道中定植， 因此，双歧杆菌活菌制品的活菌数有严格规定。据报导，为了防止有关疾病的发生， 只有摄入含有1 0 。c f u m l 或1 0 6 c f u g 以上的活性有益菌才能充分发挥其健康促进特 性双歧因子( b i f i d u sf a c t o r 。b f ) 制品b f 是一大类结构和性质各不相同的能 够促进双歧杆菌增殖的物质研究开发b f 不存在保持活菌数的技术难关。双歧因 子制品的生产、保藏、运输和销售等过程均无特殊严格要求，取材广泛，成本低廉， 但其应用效果必须在人体肠道中具有一定数量双歧杆菌的基础上才能表现出来。 双歧杆菌活菌和双歧因子结合的合生元( s y n b i o t i c s ) 制品。合生元集双歧杆菌的速 效性和b f 的刺激生长作用与一体。由于双歧杆菌制品的迅速发展，其研究也日趋 广泛和深入。 4 双歧杆菌的营养特性 双歧杆菌以有机碳源作为碳源和熊源。通常它们不能利用大分子碳水化合物， 可利用的碳源主要是葡萄糖等单糖和一些低聚糖。双歧杆菌的蛋白酶活性通常较弱， 甚至缺乏必要的蛋白酶，最适于它们的氮源是蛋白质水解产物：蛋白胨、肽类和氨 基酸等研究表明1 2 4 1 ，如果缺乏天冬氨酸，则双歧杆菌的活性降低5 0 ；如果缺少 食硫氨基酸，则活性完全丧失通常，铵盐可以作为氮源被双歧杆菌利用但是， 某些种如猪双歧杆菌、大双歧杆菌、小猪双歧杆菌和兔双歧杆菌等生长要求有机氮 e t o h 等的研究发现t 2 5 1 ，2 5 9 l 的硫酸铵可以和脱盐的天然摩擦乳清粉协同作用，促 进双歧杆菌生长。双歧杆菌要求矿物元素如磷、硫、钠、钾、钙、镁、锰、铁和锌 等刘兰等研究了稀土元素对两歧双歧杆菌生长的影响 2 6 1 ，结果显示，一定浓度的 稀土元素对两歧双歧杆菌生长并无促进作用n o v i kg i 等对在加工天然燧石粉时获 得的矿物质进行了研究1 2 7 j ，结果显示，这种矿物制剂添加到青春双歧杆菌9 4 - b i m 的培养基中，可以提高生长速率，降低代时，增加代谢物诸如乙酸、乳酸和乙醇的 积景及细胞外蛋白酶的水平此外，双歧杆菌还需要某些生长辅助因子：维生素， 嘌呤、嘧啶及其衍生物，b f 等闭由此可见，双歧杆菌对营养要求苛刻，这就促使 人们深入研究双歧杆菌的营养要求，并寻找b f l 2 】 5 双歧因子 5 1 双歧因子的化学本质 从目前b f 的研究结果分析【丑l ，b f 主要包括以下6 类物质：低聚糖类蛋 白质水解产物及一些蛋白质类物质多糖类天然植物及中草药提取物类 短链脂肪酸类其它类 3 菊芋对双歧杆菌生长影响的研究 5 1 1 低聚糖类b f 在b f 中，低聚糖类占主要部分，也是目前研究开发的重点。多数低聚糖不被 消化道吸收，直至大肠才被双歧杆菌及某些乳酸杆菌利用，因而具有独特的生理功 能目前主要有低聚果糖、低聚半乳糖、大豆低聚糖、菊糖低聚糖、低聚异麦芽糖、 低聚木糖、低聚龙胆糖、低聚葡萄糖( b 型) 、魔芋低聚糖、琼脂低聚糖、乳果糖、 甲壳质低聚糖、帕拉金糖等，共2 0 余种s a k a i 等发现，双歧杆菌在豆奶培养基中 生长时，水苏糖和蜜二糖优于蔗糖被消化吸收，而水苏糖和蜜二糖正是大豆低聚糖 的主要成分英国剑桥临床营养中心的研究发现，通过菊糖低聚糖的体外发酵能力 与一系列参考的碳水化合物如葡萄糖等的比较，以菊糖低聚糖为碳源对双歧杆菌生 长有明显的促进作用。 5 1 2 蛋白质水解产物及一些蛋自质类物质 已知有许多能促进双歧杆菌生长的蛋白质水解产物及一些蛋白质类物质，如乳 清蛋白、乳铁蛋白、胃黏膜蛋白水解物、酪蛋白水解物等。在商业上，较便宜的有 酵母提取液、牛肉浸液、大豆胰蛋白酶水解物等，其中酵母提取液最好1 2 q 。m e t w a l l y m m 等的研究发现8 w ，从甜乳清制备的糖多肽( g m p ) 能促进双歧杆菌生长无论 是哪种蛋白质水解物类b f ，它们均具有一个共同成分，即含硫的肽。如果它们的二 硫键被还原或烷基化则失去活性。所以，这些物质对双歧杆菌的生长促进作用可能 与二硫键密切相关， 5 1 3 多糖类b p b f 中的多糖类物质有菊糖、云芝多糖、褐藻硫酸多糖p q 、胡萝i - 中的含氮多 糖等s h i nh s 等研究了两个商业双歧杆菌菌株( b f - 1 和b f - 2 ) 在含有低聚果糖、 低聚半乳糖和菊糖的复原脱脂乳中的生长 3 1 1 结果显示。当b f - ! 和b f - 2 在低聚果糖 存在时。生长促进和活性保存最大，其次是低聚半乳糖和菊糖。随着碳水化合物浓 度的增加，促进效果增加，在5 时最高。 5 1 4 天然植物及中草药提取物类 在人们研究过的天然植物及其提取物中，茶叶中的茶多酚、人参中的人参皂苷、 五加科植物的提取物、魔芋水解液嗍、螺旋藻哪、海带鲫等被证实有促进双歧杆菌 生长作用田碧文等( 1 9 9 6 ) 的试验证实，传统中药阿胶、五味子、刺五加、枸杞 能促进双歧杆菌生长剃一尘等报导，扶正固本类中草药如黄芪、党参等，除可增 强机体免疫功能夕 ，还可促进双歧秆菌生长i “。 5 1 5 短链脂肪酸类和其它类b f 短链脂肪酸类物质有费氏丙酸杆菌产生的丙酸盐( 脂) 等。其它的还有n - 7 酰 葡萄糖胺及其糖类、泛酰巯基乙胺等。 5 2 影响双歧因子促生长作用的因素 b f 的促生长作用与其浓度和菌种密切相关熊德鑫等的研究表明t 3 6 1 。低聚葡苷 糖对两歧双歧杆菌、青春双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、角双歧杆菌和短 双歧杆菌有促生长作用，一般以2 浓度最好。6 种双歧杆菌中对长双歧杆菌作用最 好乳果糖除了对婴儿双歧杆菌有促生长作用外，对其它5 种双歧杆菌无作用低 4 、 ， 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 聚异麦芽糖对婴儿双歧杆菌几乎无促生长作用，对其它5 种双歧杆菌有促生长作用。 张桂兰等的研究表明【3 0 l ，在褐藻硫酸多糖的浓度分别为o 5 、1 o 、1 5 、2 o 、 2 5 时，双歧杆菌活茵数随浓度增加而呈线性增加。在浓度增加到6 - - 8 时，双歧 杆菌活茵数无显著性提高，其原因可能是高浓度的褐藻硫酸多糖使培养基的渗透压 增高，反而不利于双歧杆菌生长王筱兰等的研究表明印j ，低聚半乳糖浓度在l s g l 内都能促进双歧杆菌生长，半乳糖三寡糖和半乳糖四寡糖浓度为5 9 l 时对双歧杆菌 生长的促进作用最大，当低聚半乳糖浓度大于s g l 时对双歧杆菌生长有一定抑制作 用张庆蕴等的研究表明1 3 s 】，高浓度的低聚糖对双歧杆菌生长有抑制作用，这可能 是高渗透压的低聚糖对细菌有脱水作用 5 3 双歧因子的作用机理 大量实验表明，双歧杆菌是通过分泌到细胞外各种酶来分解利用不同b f ，并促 进其生长繁殖【4 ”2 2 1 。目前，已分离纯化的双歧杆菌糖营酶有：a - 半乳糖苷酶、 1 3 d 半乳糖苷酶、1 3 呋哺果糖苷酶、n 木糖苷酶等生长迅速的双歧杆菌中发现 有较高的k 亮氨酸氨肽酶活力，此外，双歧杆菌还有磷蛋白磷酸酶、二肽酶、羧肽 酶等肽酶另有一些b f 是通过蛋白质类的粘附素来产生作用有报导粘附素可使 肠道上皮细胞与双歧杆菌连接在一起b f 与双歧杆菌间的空间相互作用关系也是目 前的一个研究方面低聚糖类b f 与双歧杆菌的空间作用机理与双歧杆菌优先利用 低聚糖促进其生长的内在机制密切相关通过核磁共振技术，确定糖苷键的性质及 位置进而可获得低聚糖的分子空间结构目前这方面的研究报导较少低聚糖不 仅仅只充当一种碳源或营养物质，其更熏要的作用是参与双歧杆菌的生长调节及粘 附等作用，这也是目前双歧杆菌制品应用中所面临的急待解决的理论问题之一 6 物美价廉的双歧杆菌培养基 双歧杆菌的高营养要求往往导致其生产原料昂贵目前。双歧杆菌制品生产中 基本上以脱脂奶粉、牛肉汤和牛肝浸汁等为培养活菌的主要原料这些原料是导致 双歧杆菌制品价格偏高的原因之一为了降低成本，且保证高的活菌数，利用天然 原料筛选复合培养基的研究报导也很多1 3 9 , “”j 这些复台培养基具有原料来源广泛、 价格低廉、对双歧杆菌促生长效果好等特点。朱俊晨等利用胡萝h 汁作主要原料， 辅以番茄汁、豆芽汁、葡萄糖、氯化钠等筛选出胡萝h 汁复合培养基，双歧杆菌在 其中生长良好，发酵液可直接罐装制备价廉物美的功能性食品m a h a l a k s h m ir 等 为两歧双歧杆菌a t c c l l 8 6 3 开发了一种以乳清为基础的培养基乳酪乳清补充以 n - 乙酰葡萄糖胺( i m g m l ) 、酵母提取物( 1 0 m g m l ) 和巯基乙酸钠( 0 i ) ，在 p u 6 8 ，3 7 ，两歧双歧杆菌生长良好崔萤林等研制的保蒲培养基较番茄原汁培养 基可使双歧杆菌的产量提高3 0 6 - 5 3 6 倍 7 双歧杆菌的厌氧培养方法和选择性培养基 随着双歧杆菌基础研究和开发应用的迅速发展，双歧杆蔼活菌计数方法越发显 得重要选择营养丰富的培养基和满足厌氧要求是双歧杆菌纯菌计数需要的两个基 5 垄苎塾翌些堑堕生篓整堕竺堕! l 本条件。大量研究表明，由于双歧杆菌对营养成分要求较高，不同培养基对检测结 果有显著影响p 。迄今为止，m r s 对双歧杆菌的检出率最高。与其它蛋白胨相比， 胰蛋白胨由于富含双歧杆菌生长所需的鸟氨酸、瓜氨酸、谷氨酸、天冬酰胺等，能 明显提高双歧杆菌的活菌检出率。 7 1 双歧杆菌的厌氧培养方法 现有的厌氧培养方法有厌氧罐、厌氧袋、厌氧箱和亨盖特( h u n g a t e ) 厌氧培养 技术等8 “3 1 与后者相比，厌氧罐和厌氧袋的结果不太令人满意，厌氧箱的设备费 用又高。相比而言，亨盖特厌氧培养技术是一种目前令人满意厌氧培养方法它的 主要优点是，在预还原培养基制备好后可随时进行实验 任何时间观察和检查试管 内的菌都不干扰厌氧条件。与其它技术比较，这套技术需要一段训练过程，但不足 之处是可以弥补和克服的探索更为简便易行的方法的研究也在不断进行马向前 等根据高层半固体培养基具有良好厌氧性能的原理，提出了一种适用于双歧杆菌和 其它乳酸菌等不产气厌氧菌的简便快速的活菌计数方法州j 。该方法集稀释( 凝固前) 和计数( 凝固后) 于同一试管，使活菌计数只需3 步。而不是传统计数方法的5 步。 汤丹剑等提出了双层半固体培养方法h 2 i ，进一步提高了双歧杆菌的活菌检出率，其 主要缺陷是在计数过程中由于试管圆弧面的存在，容易给计数造成一定的困难和误 差 7 2 选择性双歧杆菌培养基 近年来，国内外围绕双歧杆菌的选择性计数也进行了许多研究m j 。内容主要集 中在培养基的设计上，即利用选择性培养基。选择性培养基中除含有满足双歧杆菌 良好生长的营养基质外，还添加不同含量的抗生素或其它抑菌剂。如硫酸卡那霉素、 硫酸新霉素、硫酸巴龙霉素、萘啶酸、氯化锂、丙酸钠、山梨酸等，这些成分主要 是抑制大肠杆菌的生长t e r a g u c h i 等将新霉素巴龙霉素- 萘啶酮酸- 氯化锂培养基 ( - 聊、i i ) 用于双歧杆菌的选择计数( 1 9 7 8 ) ，该培养基在后来双歧杆菌计数培养基 中一直作为一种参考培养基随后，t a p i e r r e 等设计的氯化锂- 丙酸钠培养基( l p ) 及l i m 等研制的葡萄糖血肝- 牛胆汁- 庆大霉素培养基( g b l - o g ) 在发酵乳制品中 选择性计数双歧杆菌时也得到较好的效果c h e v a l i e r 等研究的在半乳糖基质中同时 计数牛奶中的双歧杆菌及其它乳酸菌的方法也较好( 1 9 9 1 ) n e b r ay ：等研制出一种 无抗生素的双歧杆菌选择性培养基l 拍j 。它以乳果糖为主要碳源，美蓝、丙酸和氯化 锂作为一些相关细菌的抑制剂且前已提出的培养基似乎尚无一种是完全有选择性 的。它们也不能使双歧杆菌所有的种在其上生长能让大多数已知的双歧杆菌类型 生长良好的基质是目前较好的选择它们中的大多数有复杂的成分，包括使用抗生 素作为生长抑制剂；需要长的培养时间或显示低的细菌显现水平深入研究双歧杆 菌的生理生化特性，有助于设计出更为理想的双歧杆菌的选择性培养基除了利用 选择性培养基外，沈永才等初步探索了利用荧光定量p c r 定量测定双歧杆菌【7 j ，结 果表明，此法可正确定量样品中的双歧杆菌数量a m ym a e 等使用若焦扫描激光 显微术结合l i v e d e a db a c l i g h t 活性染色，评价了在复原脱脂乳中的双歧杆菌菌株 u c c 3 5 6 1 2 的活性阳。结果证明了显微方法对于益生制品的快速活性检测的价值， 6 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 其最低检测线为1 0 8 个细菌m l ( 相当于大约1 0 c f u m l ) 。 8 耐氧双歧杆菌的研究 双歧杆菌对氧气的敏感性不仅为厂家在技术管理上带来烦恼，而且要长时间维 持制品中双歧杆菌的活菌数也十分困难因此，很早以前就有人开始进行耐氧双歧 杆菌的研究h ”。近年来，不少专利报导了厌氧菌的耐氧驯化h o j 驯化方法有连续传 代法、与好气性真蔼共同培养的生物夺氧及交替培养法等。侯红漫等利用深层牛奶 培养基( 液深2 0 c m ) 和浅层牛奶培养基( 液深1 0 c m ) 1 5 1 , 经长期耐氧驯化，将一 株厌氧生长的长双歧杆菌驯化成有氧良好生长的菌株，其凝乳时间由7 2 h 缩短到 2 4 h ，加入适量b f 后，凝乳时间缩短到1 2 h 傅晓超等的研究表明p “，出发菌株和 驯化得的耐氧型菌株在生化特性上基本保持一致，没有发生变异反应驯化得的双 歧杆菌耐氧菌株是否发生变异，并因而改变了其特有的生物学功能以及在人体肠道 的定植能力，还需要对耐氧菌株进行形态学、生理学和临床效果分析鉴定特别是 菌株耐氧的分子生物学机理，都有待深入研究根据双歧杆菌的厌氧机理，利用基 因工程手段，对双歧杆菌的厌氧特性进行改造，目前在国内外已经开展了这方面的 研究其研究框架如下：筛选适合于添加在食品中并可转化的双歧杆菌；过氧 化氢酶( c a t a l a s e ，c a t ) 和超氧化物歧化酶( s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ，s o d ) 基因的 分离及其克隆；双歧杆菌质粒的分离及食品级大肠埃希氏菌- 双歧杆菌穿梭表达载 体的构建：载体与目的基因的连接；把连接有目的基因的载体转化到双歧杆菌 中并使其高效表达i ，q 9 耐酸双歧杆菌的研究 双歧杆菌对低p h 抵抗力差，使它难以通过胃酸环境( 通常p h 为3 左右) ，这 也是其制品活性保持较困难的原因之- - i ”l 。一些研究者正致力于耐酸菌株的筛选或 基因改造，以获得耐酸的双歧杆菌菌株。但目前最多的是采用微胶囊技术对它进行 保护将双歧杆菌采用肠溶性壁材进行微胶囊化后，就能防止低p h 破坏s u l t a n ak 等研究了双歧杆菌的藻酸钙包埋”同自由培养物相比，包埋的细菌产酸速率较低； 在酸奶中，双歧杆菌的包埋提高了存活率。总的来说，此项技术尚不太完善，一些 问题如颗粒大小、口感、微胶囊的控制释放、临床效果以及实现工业化生产的工艺 和设备等尚需进一步研究。 双歧杆菌胆盐耐受性的研究 人体小肠中胆盐含量以o 0 3 - 0 3 波动着，胆盐对双歧杆菌也存在不利影响， 尤其使十二指肠的高胆盐状态m 1 g r i l lj e 等的研究发现印l ，甘氨脱氧胆酸，而不 是牛磺脱氧腰酸，对双歧杆菌存在致死效应这种现象在低p h 下增加，而且更适 合于缺乏联合胆盐水解酶活性( c b s h ) 的菌株p e r r i ns 等的研究表明p q ，能代谢 的碳源的存在可以减轻胆盐的毒性作用；同其单节成分( 葡萄糖和果糖) 相比，新 糖( n e o s u g a r s ，一种低聚果糖) 的存在导致对胆盐的杀菌作用的抵抗力增加。 7 菊芋对双歧杆菌生长影响的研究 1 1 双歧杆菌对抗生素的敏感性研究 在临床上普遍使用的抗菌素必然会影响机体肠道的双歧杆菌及双歧杆菌制品的 应用。因此，双歧杆菌对抗生素的敏感性也是双歧杆菌研究的一个重要领域。”。 m a t t e u z z i ( 1 9 8 3 ) 试验了4 5 9 菌株( 代表1 5 个种的双歧杆菌) 对1 6 种抗菌素的敏 感性结果表明大多数菌株抗多粘菌素b 、卡那霉素、庆大霉素、链霉素和新霉素。 对青霉素g 、万古霉素、氯林肯霉素、红霉素和杆菌肽高度敏感，它们对9 0 菌株 的抑制少于1 6pg m l 所有菌株都对氯霉素敏感( m i c g o - - 2 0 - 5 8pg m l ) 。对林肯 霉素也敏感( m i c ，o = 0 6 扣1 5ug n 【l l ) ，对四环素的敏感性变化幅度大。凌代文等 ( 1 9 9 6 ) 也曾进行过有关试验，结果显示，所有菌株高度抗多粘菌素b 、链霉素和 新霉素。大多数菌株抗卡那霉素和庆大霉素所有菌株都对红霉素、万古霉素和氯 霉素敏感。对四环素和青霉素的敏感性则有较大变化陈峥宏等的研究表明，双歧 杆菌可通过发生耐药性变异或细胞壁缺陷变异等机制逃避抗生素的杀伤作用，临床 常用剂量的抗生素短时期使用不会对肠道内双歧杆菌的生存产生显著影响；在检查 肠道菌群时，应当考虑到细菌l 型的存在形式双歧杆菌的耐药性机理和耐药性质 粒的监控是目前双歧杆菌的一个重要研究内容。 随着生命科学的迅速发展，双歧杆菌各种功能的机理研究方兴未艾，并进一步 促进了双歧杆菌的开发应用伦永志等的研究发现州j ，灭活的双歧杆菌及其耗尽培 养上清液( s c s ) 对小鼠肠道生理菌群具有一定调节作用。张振玲等将8 种不同的 经热处理杀死的双歧杆菌分别与培养的r a w 2 6 4 7 细胞温育1 1 j ，所有双歧杆菌均能 诱导i n f - a 及i l - 6 产生，且产生量与双歧杆菌剂量和诱导时间有关这些研究为研 制新的双歧杆菌制品提供了新思路 8 1 前言 1 1 本研究的目的意义 双歧杆菌是一种人体肠道中重要的生理性细菌。大量科学研究证明，双歧杆菌 对人体有多种生理调节作用。虽然双歧杆菌属于原籍菌群，但是，随着年龄增长、 饮食改变、环境污染、抗生素使用及放化疗等，双歧杆菌在体内的含量下降这将 导致肠道微生态失调。引起菌群易位，诱发内源感染，造成机体病变。从2 0 世纪 7 0 年代起，一些国家相继研制出双歧杆菌制剂，用于治疗各种因素引起的菌群失调。 随着抗生素的广泛应用给人类带来的忧虑日益明显，以双歧杆菌为代表的益生菌制 剂更受到医学界重视。对于一些由抗生素引起的顽症和副作用，人们试图求助于生 物防治方法，以菌制菌，重新建立起肠道正常菌群平衡，保证机体正常生理功能。 在这种背景下，双歧杆菌制品在市场上更受欢迎。目前，国内外有7 0 多种双歧杆菌 制品【6 2 1 ，包括酸奶、乳酪、乳粉、胶囊、液体制剂等尤其是在日本，其双歧杆菌 酸奶占酸奶市场的l 3 。 菊芋( j e m s 蜘矾j c h o k e ) ，俗名洋姜，菊科，向日葵属，多年生草本植物即。 菊芋分布广，在我国南北各地均有栽培；适应性强，耐贫瘠，耐寒，耐早；种植简 易，一次播种多次收获；产量极高。据测定，鲜菊芋块茎中含水7 9 8 ，碳水化 合物1 6 6 ，蛋白质1 0 ，粗纤维0 6 ，灰分2 8 ( 其中每1 0 0 9 鲜菊芋块茎含 c a ：4 9 m g 、p ：1 1 9 m g 、f e ：8 4 r a g 等) 及一定量的维生索( 其中每1 0 0 9 鲜菊芋块 茎含v b l o 1 3 m g 、v b 2 ：0 0 6 m g 、v p ：0 6 r a g 、v c ：6 r a g 等) 其中碳水化合物的 7 8 为菊糖。研究表明唧、“硎菊糖有许多生理功能，特别是能选择性促进双歧杆 菌、乳杆菌和醋酸杆菌的生长，调整肠道内微生物区系的组成和功能；作为一种膳 食纤维复合物，也已被正式认可由此可见。菊芋是一种极具开发潜力的半野生资 源 功能性食品将是2 1 世纪的食品。我国已把满足不同人群需要的特殊营养品作为 2 l 世纪食品工业的发展重点，而双歧杆菌和菊芋丰富的功能性恰好适合这一趋势。 此外，我国已正式加入w t o ，主要农产品将面临更加严峻的挑战，菊芋作为一种半 野生资源，对调整农业种植结构，提高农村经济效益，也有重要的现实意义因此， 本文就菊芋对双歧杆菌生长的影响开展研究，以期为双歧杆菌活菌制品的生产提供 一种物美价廉的原料；另一方面，可以为研制以菊芋为原料的功能性食品提供理论 依据。 9 1 2 本研究当前的国内外现状和存在的问题 菊糖作为一种功能性食品配料，已在食品工业中广泛使用。7 “7 “。利用菊芋作 为食品配料也有一些报导”2 】，主要有菊芋粉和菊芋汁两种形式。菊芋粉可在乳品、 焙烤制品、涂抹食品、汤、调味品和甜点等食品中广泛使用。同菊芋粉一样，菊芋 汁一般也不直接食用，而是添加在啤酒、果汁等一些饮料中然而，关于利用菊芋 作为一种促进双歧杆菌生长的物质的研究报导，迄今为止还很少p ”。以菊芋为主要 原料筛选优化物美价廉的双歧杆菌培养基的研究目前几乎还无人开展a 迄今为止，我国对菊芋的开发还不能令人满意。在初级加工方面，菊芋基本上 只是用于腌制成菜【7 4 】；在深加工方面，自二十世纪九十年代以来，有不少人进行了 用菊芋生产高果糖浆和低聚果糖的研究”。“”但是，充分利用菊芋中菊糖成分的 双歧因子功能，以菊芋为主要原料的功能性食品的研究开发很少报导。菊芋中除了 含有菊糖，还含有许多其它成分，所以不能简单地等同于菊糖利用。由鉴于此。菊 芋在体内和体外对双歧杆菌生长的影响研究殛待开展，以期为进一步开发菊芋资源 提供理论依据。 1 3 本研究的主要内容和预期成果 本课题研究的内容主要包括以下4 个方面： ( 1 ) 菊芋在体外对双歧杆菌生长的影响。 ( 2 ) 以菊芋为主要原料，筛选优化双歧杆菌培养基。 ( 3 ) 菊芋在体内对双歧杆菌生长的影响。 ( 4 ) 菊芋对双歧杆菌胆盐耐受性的影响 通过研究菊芋在体内外对双歧杆菌生长的影响，为将菊芋作为一种促进双歧生 长物质添加到其它基质中和开发菊芋类双歧因子制品提供理论依据。以菊芋为主要 原料的双歧杆菌培养基将可以大大降低双歧杆菌活菌制品的生产成本。菊芋对双歧 杆菌胆盐耐受性的影响研究，将为改善双歧杆菌在同胆盐接触中的存活，从而提高 双歧杆菌的益生效果提供新的思路 1 0 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 2 材料和方法 2 1 试验材料 2 1 1 菌种 长双歧杆菌：b l m 、b l r , 两歧双歧杆菌：b b m ，短双歧杆菌：b b b ，嘈酸乳杆菌 ( l a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u s ) ：l a l 、l a 2 和大肠杆菌( e o c h e r i c h i a c o l i ) 均由河北农 业大学食品科技学院生物工程系提供。 2 1 2 菊芋 采自保定市郊区，1 1 月下旬采收，- 2 0 c 保存备用。 ( 1 ) 菊芋汁( j e r u s a l e ma r t i c h o k ej u i c e , j a j ) 的制各 菊芋一清洗一称重一灭酶( 1 0 0 c ，5 m l n ) 一打碎一加8 0 ( 2 水适量一双层1 0 0 目滤布过滤一滤渣加8 0 c 水适量一重复压榨一合并滤液一加水定容至1 0 0 9 菊芋出 1 0 0 m l 汁( 将其定义为1 0 0 菊芋汁) ( 嬲霄芋粉( j e r u s a l e ma r t i c h o k ep o w d e r j a p ) 的制各 菊芋一清洗一切片一干燥( 5 5 c ) 一粉碎一过筛( 1 0 0 目) 一菊芋粉 2 1 3 实验动物 初生普通级昆明系雄性小白鼠，体重2 0 9 左右，从河j e 医科大学实验动物房购 得普通鼠饲料同时由此处购得。 2 1 4 培养基 ( 1 ) 改良g r s 培养基( a | c s ) 准确称量各种成分，将除半胱氨酸盐酸盐以外的其它成分加水后煮沸溶解，补 充水至原来体积；然后加入半胱氨酸盐酸盐，搅拌溶解；用饱和n a o h 溶液调整p h 至6 8 - - 7 0 。分装厌氧管，1 1 5 ( 2 灭菌1 5 m i n 在液体c m r s 中加入琼脂( 1 8 屹) ， 即为固体c m r s 用于双歧杆菌的菌种活化和纯菌活萄计数。 菊芋对双歧杆菌生长影响的研究 ( 2 ) 基础培养基 牛肉青3 9 氯化钠 5 9 蛋白胨1 0 9半胱氨酸盐酸盐o 4 9 葡萄糖1 0 9 蒸馏水 1 0 0 0 m l p h 6 8 - 7 0 ，分装厌氧管1 1 5 灭菌1 5 m l n 。 用于菊芋汁和菊糖对双歧杆菌的体外促进生长试验。 ( 3 ) 双歧杆菌选择性培养基 营养基质与c m r s 的成分大致相同，另外添加三种抑菌物质：氯化锂，丙酸 和美蓝；p h ：5 5 。将其称为p l m 培养基分装厌氧管，1 1 5 c 灭菌1 s t a i n 。 用于动物体内实验中双歧杆菌的选择性计数。 “) 蛋白胨水培养基 蛋白胨 1 0 9 无水碳酸钠 o 2 5 9 氯化钠 5 9 蒸馏水1 0 0 0 m l d h ：7 2 7 4 1 2 1 灭菌2 0 r a i n 。 用于菊芋汁对大肠杆菌的体外促进生长试验。 牛肉膏蛋白胨培养基 用于大肠杆菌的菌种活化和纯菌计数。 ( 6 ) 伊红美蓝琼脂( e m b ) 用于动物实验中大肠杆菌的选择性计数。 a 脱脂乳培养基 脱脂牛奶粉( 内蒙古伊利) 加蒸馏水复原，浓度为1 4 。分装厌氧管，1 1 0 c 灭 菌1 0 m i n 用于菊芋粉促进双歧杆菌凝乳试验 1 2 2 1 5 稀释液 ( 1 ) 稀释液 磷酸二氢钾 磷酸氢二钠 半胱氨酸盐酸盐 4 5 9 6 9 0 5 9 分装厌氧管，1 2 1 灭菌2 0 m i n 。 用于动物实验中粪便样品的稀释。 ( 2 ) 稀释液 蛋白胨 l g 氯化钠 5 9 分装厌氧管1 2 1 灭菌2 0 r a i n 用于胆盐实验中样品的稀释 ( 3 ) 稀释液 0 8 5 生理盐水 吐温8 0 蒸馏水 琼脂 半胱氨酸盐酸盐o 5 9 蒸馏水 1 0 0 0 m l 分装厌氧管或普通试管，1 2 1 灭菌2 0 r a i n 。 用于本研究中除动物实验和胆盐实验之外的其它稀释 2 1 6 主要试剂 ( 1 ) 半胱氨酸盐酸盐( c y s - h c i ) 生化试剂，上海康达氨基酸厂 ( 2 ) 菊糖：化学纯，上海生化试剂厂 ( 3 ) 去氧胆酸钠盐( d c a - n a ) ：分析纯，上海行知化工厂进口分装 ( 4 ) 玉米浆：生化试剂，河北康欣制药有限公司 ( 5 ) 大豆蛋白胨：生化试剂，北京双旋微生物培养基制品厂 ( 6 ) 酵母膏：生化试剂，北京双旋微生物培养基制品厂 ( 7 ) 葡萄糖：分析纯，天津市化学试剂三厂 ( 8 ) 伊红美蓝琼脂：生物试剂。杭州天和微生物试剂有限公司 1 3 止 眦 嗡 m 培 塑芏婴些堑堕生篓整堕竺堡塞 其它试剂皆为分析纯或生化试剂。 2 1 7 主要仪器设备 ( 1 ) s w c g i b 超净台：苏挣集团 ( 2 ) y x q g 0 2 型电热式蒸汽消毒器：山东新华医疗器械厂 ( 3 ) l r h - 2 5 0 - a 生化培养箱：广东省医疗器械厂 ( 4 ) f a l 0 0 4 电子天平：上海天平仪器厂 ( 5 ) h u n g a t e 厌氧设备：首都师范大学 ( 6 ) 医用注射器、针头：上海医疗器械工业集团公司 ( 7 ) 电子恒温水浴锅：北京市光明医疗仪器厂 ( 8 ) 7 2 1 b 型分光光度计：上海第三分析仪器厂 ( 9 ) p h s 3 c 型酸度计：萧山市鑫龙医疗器械有限公司 o l y m p u s 照相显微镜：日本日立公司 2 2 主要试验方法 2 2 1 活菌计数 ( 】) 双歧杆菌活菌计数 采用h u n g a t e 厌氧培养技术h ”，3 7 c ，培养4 8 h 。 ( 2 ) 大肠杆菌活菌计数 采用稀释平板活菌计数法，3 7 c ，培养2 4 h 2 2 2p h 值铡定 采用p h s - 3 c 型酸度计直接测定 2 2 3 发酵酸度测定 采用滴定法【，用吉尔涅尔度( 吁) 表示 2 2 4 动物实验 ( 1 ) 小鼠饲喂 将购得的小鼠称重，记录，用鼠饲料和清水预饲1 周，之后随机分为两组，每 1 4 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 组5 只。菊芋组喂食鼠饲料和菊芋汁( 每日提供l o o m l 新鲜菊芋汁，让小鼠自由摄 取，与对照组清水饲喂相同) ，对照组喂食鼠饲料和清水。 ( 2 ) 小鼠粪便中的微生物检测 于第0 ( 预饲结束后) 、1 、2 、3 、4 周，分别无菌采取小鼠粪便( 每只o 1 9 左 右) 将其尽快加入到已称重的内装玻璃珠的稀释管中，再次称重，计算出小鼠粪便 的重量用旋涡振荡器打碎粪便，系列稀释。选择适宜稀释度，分别接种在各培养 基中，按要求进行培养。 2 2 5 双歧杆菌厌氧试验 随机抽取培养4 8 h 的小鼠粪便样品的双歧杆菌培养管，随机挑取菌落，点接于 p l m 平板上，3 7 ( 2 ，好氧培养4 8 h ，观察是否有菌落长出 2 2 6 吸光度测定 使用7 2 1 型分光光度计于 = 6 0 0 r t m 处测定 2 2 7 试验数据处理 采用q s t a t 软件进行方差分析。 3 结果与分析 3 1 菊芋在体外对双歧杆菌生长的影响 3 1 1 菊芋汁在基础培养基中对双歧杆菌生长的影响 ( 1 ) 在基础培养基中添加菊芋汁对双歧杆菌生长的影响一量效关系 将b l m 、b b m 活化后，以o 1 的接种量接种到含不同浓度菊芋汁( j a j ) 的基 础培养基中，3 7 c 恒温培养，每隔8 h 取样1 次，进行活菌数测定。结果如图1 、图 2 所示。 081 62 43 2 培养时间( h ) + 基础培养基 + 基础培养基+ 2 0 j j 十基础培养基+ 4 0 j a j + 基础培养基+ 6 0 j a j * 一基础培养基+ 8 0 j m 圈1 不同浓度j a j 在基础培养基中对b i m 生长的影响 f i 9 1 e f f e c to f j a j o f d i f f e r e n t n c e n b l 酊o no i lt h eg r