（农产品加工及贮藏工程专业论文）铁强化食品中NaFeEDTA快速检测试剂盒的研制.pdf

摘要 乙二胺四乙酸铁钠( n a f e e d t a ) 是一种新型的螫合铁营养强化剂。大量研究 证实，n a e e e d t a 不仅具有可靠的安全性，丽且其改善缺铁性贫血的效果优于传统 的铁强化剂。我国是缺铁性贫血的高发地区，食物强化是适合我国国情的预防和改 善缺铁性贫血较为可行的方法。1 9 9 9 年卫生部将n a f e e d t a 列为食品添加剂，批 准其作为铁营养强化剂使用，2 0 0 2 年批准n a f e e d t a 作为营养强化剂应用于酱油， n a f e e d t a 是目前唯允许在酱油中添加的铁强化剂。现在含有n a f e e d t a 的铁强 化酱油已成为我国酱油市场的重要产品，同时含有n a f e e d t a 的其它铁强化食品， 如铁强化面粉，也正逐步的被公众接受。 本试验针对目前对铁强化食品缺少有效的现场快速检测设备的现状，通过系统 研究铁强化食品中n a f e e d t a 的快速检测方法，结合酱油与面粉的特点，充分参考 了市场上其它试剂盒的设计特点，研制设计了铁强化食品快速检测分析仪与配套试 剂盒，并系统验证了试剂盒的检测效果。研究工作的主要成果如下： 1 在原有的铁强化酱油中n a f e e d l a 紫外分光光度检测法基础上，简化操作 步骤，重新考察影响显色反应的几个方面，确立了薪的检测条件。通过分析酱油与 面粉特性上的不同，针对酱油品牌间差异较大，面粉中水不溶性成分较多的特点， 使用甲醇沉淀法对酱油进行前处理，合适的水份配比提取面粉，优化了酱油与面粉 中n a f e e d t a 快速检测方法。方法的准确性、重现性、精密性均良好。 2 在建立的强化食品中n a f e e d t a 快速检测方法基础上，本着体积小、操作 简单、成本低的原则，在北京瑞利仪器公司大力的技术支持下，本实验设计了铁强 化剂快速分析仪与配套检测试剂盒。通过试验对快速分折仪的性能指标进行了考 察，结果表明快速分析仪的检测效果良好。 3 ，通过与高效液相色谱法及紫外分光光度法进行比对试验，验证了试剂盒对 铁强化食品检测的准确程度，同时考察了试剂盒法在缩短检测时间，节约检测成本 上的情况。结果表明，本研究设计的试剂盒能适用于铁强化食品现场快速检测。 关键词；乙二胺四乙酸铁钠；铁强化食品；试剂盒；快速检测；酱油：面粉 d e s i g no fr a p i dt e s tk i tf o rn a f e e d t ad e t e r m i n a t i o ni ni r o nf o r t i f i e df o o d x i el i b i n a d v i s o m h u oj u n s h e n g ，h u a n gj i a n ，c u it o n g a g r i - p r o d u c tp r o c e s s i n ga n ds t o r a g ee n g i n e e r i n g a b s n a c t s o d i u mi r o ne t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t a t e ( n a f e e d l a ) ，ac h e l a t ei r o nc o m p o u n di sa n e wt y p eo fi r o nf o r t i f i c a n t s s u 衔c i e n ts c i e n t i t l ed a t as h o wt h a tn a f e e d t ai ss a f e t yi n t e r m so ff o o da d d i t i v eo rf o o df o r t i f i c a n li na d d i t i o n , i th a sb e t t e re f f e c to nc o n t r o la n d p r e v e n t i o no fi t o nd e f i c i e n c ya n e m i a ( i d a ) t h a nt h a to fo t h c a t r a d i t i o n a li r o nf o r t i f i c a n t m i n i s t r yo fh e a l t h , c h i n ap r o v e da p p l i c a t i o no fn a f e e d t aa sf o r t i f i c a n ti n1 9 9 9a n d e n l a r g e di t sa p p l i c a t i o ni ns o ys a u c ei n2 0 0 2 n a f e e d t ai st h ee x c l u s i v ei r o nf o r t i f i c a n t p e r m i t t e di ns o ys a u c ef o r t i f i c a t i o ns of a ra n di sw i d e l yu s e di nf o r t i f i c a t i o no fo t h e r f o o d s s u c ha sw h e a tf l o u r t h et a r g e to ft h i ss t u d yi st r yt od e v e l o pn a f e e d t at e s tk i tt os a t i s f yt h er a p i d m e a s u r e m e n tr e q u i r e m e n tf o rb o t hq u a l i t yc o n t r o la n di n s p e c t i o nt h r o u 曲as e r i e so f r e s e a r c h e si n c l u d i n gr e n o v a t i o no fm e a s u r e m e n tm e t h o d so fn a f e e d t a ，d e s i g n i n go f t h et e s tk i tb a s e do nt h eo v e r v i e wo ft e c h n o l o g yo fd i f f e r e n tt y p e so fr a p i dt e s tk i t sa n d e v a l u a t i o no f n e w l yd e v e l o p e dn a f e e d t at e s tk i t t h em a i nr e s u l t so f t h er e s e a r c ha r e 1 r e n o v a f i o no nu l t r a v i o l e ts p e c t r o p h o t o m e t r i cm e t h o do fn a f e e d t ai ni r o n f o r t i f i e ds o ys a u c eh a sd e v e l o p e ds i m p l i f i e dm e a s u r e m e n tm e t h o db yas e r i e so f o b s e r v a t i o no nc o l o rr e a c t i o ns y s t e m t h e r ea r ed i f f e r e n c e sb e t w e e ns o ys a u c ea n dw h e a t f l o u rs u c ha sm o s ts u b s t a n c e si nw h e a tf l o u ri si n s o l u b l ea n dd i f f e r e n ts o r to fs o ys a u c e s c a nh a v ed i f f e r e n tc o m p o s i t i o n t h er e n o v a t e dm e t h o do p t i m i z e st h em e t h o dt h r o u 吐 c h a n g e ss u c ha su s i n gm e t h a n o lt op r e c i p i t a t es o ys a u c ea n dn e ww a t e rr a t i ot oe x t r a c t f l o u r t h em e t h o ds h o w e daf e a s i b l ea c c u r a c y , v e r a c i t ya n dp r e c i s e 2 b yt h es u p p o r to f b e i j i n gr u i l it e s t i n ge q u i p m e n tc o m p a n y , an a f e e d t a t e s tk i t w a sd e s i g n e da n de q u i p p e da c c o r d i n gt op r i n c i p a lo f r e n o v a t e dm e t h o da n dr e q u i r e m e n t o fs i l l a l lv o l u m e e a s yo p e r m i o na n di o wc o s t e v a l u a t i o no nt h ef u n c t i o n sa n dt e s t i n g p e r f o r m a n c eo f t h ek i ts u g g e s t e dt h a tt h ek i ti sa c c e p t a b l e 3 1 1 1 ec o m p a r i s o no fr e s u l t sa m o n gh p l cm e t h o d u l t r a v i o l e ts p e c t r o p h o t o m e t r i c m e t h o da n dt h ek i tm e t h o ds h o w e dt h ek i tm e t h o di sf e a s i b l e m e a n w h i l et h ek i tm e t h o d s h o w e df a s ta n dl o wc o s tf o ras a m p l ea n a l y s i s t h er e s u l to ft h i ss t u d ys u g g e s t e dt h a t n a f e e d t ak i ti ss u i t a b l em e t h o df o ra q u i c ka n dp i l o tm e a s u r e l l q e n to f n a f e e d t a k e y w o r d s ：s o d i u me t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t a t e ；i r o nf o r t i f i e df o o d ；t e s tk i t ； r a p i dm e a s u r e m e n t ；s o ys a u c e ；w h e a tf l o u r n a f e e d t a j e c f a a o a c t b a o h h p l c 缩略语表 a b b r e v i a t i o nu s e d 乙二胺四乙酸铁钠 f a o w h o 联合专家委员会 美国分析化学家学会 四丁基氢氧化铵 高效液相色谱法 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人 已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得塑些壅些盘鲎或其他教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：舡斌 签字日期 砷年舌月多日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解亟a 垦盎些盘堂有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅。本人授权塑i 垦盛些盘鲎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名 解互斌 签字日期：t 0 0 7 年6 月f 7 日 学位论文作者毕业后去向 工作单位： 通讯地址： 导师签名 签字嗍厕年6 月侈日 电话 邮编 铁强化食品中n a f e e d t a 快速检测试剂盒的研制 1 引言 1 1 铁营养强化及乙二胺四乙酸铁钠的应用现状 铁营养的缺乏是目前全球最严重的营养问题之一，它可以导致缺铁性贫血，是 尚待解决的营养问题。铁缺乏及贫血会严重影响儿童的体格、智力发育及其成年后 从事体力和脑力劳动的能力，对于育龄妇女则不仅危害其自身健康，更可能波及下 一代。我国是缺铁性贫血的高发地区，9 0 年代以来的各项调查数据表明我国农村育 龄妇女贫血率为4 1 2 ，城市为2 9 5 ，成年男子为1 2 t ”。导致缺铁性贫血的原 因是多样的，由于我国是植物性膳食结构，其中的铁源吸收率十分低下，因此被认 为是我国营养性缺铁的主要原因。经过多年的研究实践证明，食物强化铁是减少缺 铁性贫血的最有效途径之- - w 。 所谓食物强化就是指调整或添加食物中营养素，使之满足人类营养素需要的一 种食品深加工过程。其中所添加的营养素物质即为食品强化剂，而被强化的食品则 被看作强化载体，这种经过强化处理的食品，就被称为强化食品。因此选择适宜的 食物载体和选择适宜的营养强化剂成为食物强化的两个基本要素。有关专家和部门 经过多方调研并结合国际经验与我国国情，认为在我国酱油、面粉是比较理想的用 于铁营养强化的食物载体【3 1 4 ，2 2 】。根据g b l 4 8 8 0 9 4 的规定，硫酸亚铁、乳酸亚铁、 富马酸亚铁、柠檬酸铁等均可作为铁营养强化剂，但这些传统的铁强化剂不仅吸收 率低1 5 】，而且可造成食物载体口感及色泽方面的不良变化，影响食物的风味，给食 物中有效的强化铁带来困难。 乙二胺四乙酸铁钠( n a f e e d t a ) 是一种新型螯合铁营养强化剂，分子式为 c l o h i 2 f e n 2 n a o s ，3 i - 1 2 0 ，大量的试验和相关的报道都证实，n a f e e d t a 作为铁强化 剂在预防和改善缺铁性贫血方面的效果显裂”埔】。作为铁强化剂，n a f e e d t a 对食 物的感官性状，如风味、色泽等影响较小，且不易造成食物氧化【1 蚣0 1 。j e c f a ( t h ej o i n t f a o w h oe x p e r tc o m m i t t e eo nf o o d a d d i t i v e s ) 在1 9 9 3 年，对n a f e e d t a 的安全性 进行了评估，将n a f e e d t a 列为“一般承认安全”( g e n e r a lr e c o g n i z ea ss a f e ) ，并 推荐n a f e e d t a 为铁补充剂 2 q 。1 9 9 9 年我国卫生部将n a f e e d t a 列为食品添加剂， 批准其作为铁营养强化剂使用【2 3 1 。2 0 0 2 年批准n a f e e d t a 作为营养强化剂应用于 铁强化酱油。目前n a f e e d t a 是我国睢一允许在酱油中添加的铁强化剂【2 3 1 。现在含 有n a f e e d t a 的铁强化酱油已经成为我国酱油市场的重要产品。目前市场上 也有多种品牌的使用“7 + 1 ”营养强化配方的营养强化面粉，其中的铁剂就是 以n a f e e d t a 形式添加，由于n a f e e d t a 相对于其它形式铁剂而言，在面粉 贮藏加工过程中化学形式最为稳定1 2 4 2 6 l ，今后以n a f e e d t a 为强化剂的铁强 化面粉必将有很好的市场潜力【2 7 4 。 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 1 2 强化食品中n a f e e d t a 的检测方法现状 测定食物铁的分析方法主要有原子吸收分光光度法、铁盐检测法、络合滴定法 等。其中原子吸收分光光度法是国家标准中规定的食品中铁的检测方法【刈，但它只 能检测食品中总铁的含量，需要有未经强化的食品做空白对照，才能将食品营养强 化所添加的铁强化剂与食品中本身含有的铁进行区分，而且此法需要昂贵的专用分 析设备。n a f e e d t a 的检测方法有毛细管区带电泳法【3 l 】和高效液相色谱法【3 2 1 ，这两 种方法不需要未强化食品做空白对照，均能比较准确的对强化食品中的n a f e e d t a 进行检测，但是这两种方法也对检测设备有较高的要求，只能适用于实验室盼应用， 不能满足现场快速检测的要求。 直接用紫外吸收分光光度法扣除本底测定酱油的方法【3 3 1 ，不需要很昂贵的检测 设备，但酱油中的防腐剂、氨基酸类、核酸类、色素及其它有机酸类物质在紫外光 区都有较强的吸收，需要强化前的空白酱油做比较，由于市场监钡4 时强化前空白酱 油较难获得，造成了此法的局限性。黄建等建立的硫氰酸铵比色法1 3 4 j 是目前比较快 速实用的检测铁强化食品中n a f e e d t a 的方法，该方法利用游离三价铁离子( f e 3 + ) 与显色剂硫氰酸铵( n h 4 s c n ) 在酸性溶液中( p h i 0 5 ) 反应生成红色络合物的特 点，利用紫外可见分光光度法测出吸光度值，进而得到含铁量。硫氰酸铵比色法对 酱油底色进行了扣除，不需要空白酱油做比较，增强了方法的有效性，已被卫生部 作为2 0 0 4 年国家健康相关产品抽检推荐方法，但该方法主要针对铁强化酱油等液 态样品中n a f e e d t a 的检测，使得该方法适用范围受到限制，单样检测时需要测定 四个吸光度值，步骤仍略显繁杂，且需要紫外分光光度计，不能完全满足现场检测 的要求。 s p o t t e s t 法【3 5 】是目前国际上广泛用于现场快速检测铁强化面粉中强化铁量的方 法，此法将f e 3 + 离子在酸性条件与硫氰酸钾反应生成的红色络合物斑点作为判定依 据，根据红色斑点的多少与密度来判断铁强化面粉中的铁强化量，这种方法虽然简 单快速，但属于半定量检测，仍不能完全有效的对铁强化面粉进行现场快速检测。 k o m p a n y z a r e h f 3 6 1 使用手动扫描仪结合电脑，通过扫描分析s p o t t e s t 方法中亮度、 单位面积斑点数等参数获得定量数据。国内也有类似的研究【37 l 使用清华紫光a 8 0 0 扫描仪结合r q s i 0 系统软件对铁强化面粉中n a f e e d t a 进行检测，测得回收率为 9 8 0 1 0 8 3 。但此类型方法必须借助电脑分析，且对分析软件的要求较高，会大 大增加检测成本，短期内还难以有效应用于现场检测。 因此目前还没有发现一种有效的能用于各种铁强化食品现场快速检测的方法 或试剂盒，由于目前我国开展的国家营养干预项目多使用n a f e e d t a 为铁营养强化 剂，同时n a f e e d t a 也在其它各类食物强化中广泛应用，因此研究一套铁强化食品 中n a f e e d t a 快速检测方法并设计开发相应的检测试剂盒对于铁强化食品的质量 控制和铁强化食品的推广普及都有着重要的意义。 2 铁强化食品中n a f e e d t a 快速检测试剂盒的研制 1 3 食品快速检测技术发展现状 1 3 1 食品快速检测方法概述 所谓快速检测方法，首要的是能缩短检测时间，以及在样品制备、实验准备、 操作过程和自动化上简化操作，主要体现为下面三个方面：一是实验准备过程简化， 使用的试剂较少；二是样品经简单前处理后即可进行测试，或采用高效快速的样品 处理方式；三是简单、快速和准确的分析方法，能对处理好的样品在很短的时间内 测试出结烈”】。从广义上来讲，能将原有的检测方法时间缩短的都可以称为快速检 测方法，但从严格意义上讲，快速检测方法与常规方法相比，除应具有准确性外， 还应具有明显的简捷性、经济性与便携性。 伴随快速检测出现的是“仪器革命”，传统的检测过程中，检测仪器昂贵，步 骤复杂，对操作人员的要求比较高，而便携型或易用型设备操作简单易于掌握，且 对操作人员专业知识和技术的要求不高。这些便携型设备的出现使快速检测技术能 够更适应现场检测的要求，为快速检测的普及提供了保障，特别是为基层检验人员 提供了方便。 1 3 2 常用快速检测技术及应用 1 3 2 1 化学比色分析法 化学比色分析法可分为利用普通化学原理与利用生物化学原理显色两大类。化 学比色分析法的优点是操作相对简便，结果显示直观，检测灵敏度高。因此市场上 已有很多试剂盒是利用比色法，表1 中列出了部分使用比色法的速测实例。比色分 析法的不足之处是此类分析法会破坏食品，不能实现无损检测，只能用于抽样检测， 无法对每一个样品都实行检测；此外，此类方法对化学反应自身条件依赖性较强， 因此在检测过程中受到的干扰因素比较多。 1 3 2 2 近红外和傅里叶变换红外光谱法 此类方法常用于生产的在线控制，优点是检测成本低，分析速度快；不需前处 理，免去了化学反应中的诸多影响因素，也避免了对环境的污染；实现了样品的无 损检测，并且能够对样品的多个组分同时检测，表2 列出了此方法在快速在线检测 方面的一些应用。此类方法的缺点是不适于痕量分析，灵敏度较比色法低，且需要 建立相关的模型数据库，需要大量的前期工作。 3 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 表2 近红外速测实例 t a b l e2 e x a m p l e so f n e a r - i n f r a r e dr a p i dm e t h o d 被测项细节说明被测食品参考文献 过氧化值 碘值 根据三苯磷( 1 1 p p ) 与过氧化物定量作用生成三苯氧化膦 ( t p p o ) 的光谱数据铡定。 将熔化后的食用油脂恒温在7 5 以保持液态，在玻璃测试瓶 中扫描。 将鱼油置于1m l 玻璃瓶，恒温在4 0 ( 2 扫描。 油脂 油脂 鱼油 l ir 6 4 e n d 0 1 6 5 虫害感染通过检测面粉中虫类的残留肢体数量预测被感染程度。小麦耪p c r 既- m 朗d o 一6 6 7 9 9 ；在制粉过程中，连续的在线检测原料小麦和小麦粉，并能把受原料小麦q 硼e c k 一4 3 蛋白质等检小麦的情况替换成同点、及时采集试样的实验室测定值。小麦粉 4 铁强化食品中n a f e e d t a 快速检测试剂盒的研制 1 3 2 3 免疫学分析法 免疫学分析法的检测原理是基于免疫学中的血清学检测方法，利用抗原与抗体 的高度专一性特异反应来进行检测。抗原抗体的反应是一种特异性吸附反应，即通 常情况下，抗原只和它自己诱导产生的抗体发生反应。在实际工作中应用最多的有 两种方法，一种叫酶联免疫法( e l i s a ) ，它是将酶标记在抗体抗原分子上，形成 酶标抗体酶标抗原，也称为酶结合物，将抗体抗原反应信号放大，提高检测灵敏度， 之后该酶结合物的酶作用于能呈现出颜色的底物，通过仪器或肉眼进行辨别。另一 种方法是试纸条法，它是将特异的抗体交联到试纸条上和有颜色的物质上，当纸上 抗体和特异抗原结合后，再和带有颜色的特异抗原进行反应时，就形成了带有颜色 的三明治机构，并且固定在试纸条上，如没有抗原，则没有颜色。 免疫学分析法常用于快速检测有害微生物、农药残留、兽药残留及转基因食品， 它的优点是特异性和灵敏度都比较高，对于现场初筛有较好应用前景。不足是由于 抗原抗体的反应专一性，针对每种待测物都要建立专门的检测试剂和方法，为此类 方法的普及带来难度，如果食品在加工过程中抗原被破坏，则检测结果的准确性将 受到影响。 表3 免疫学分析法速测寰倒 t a b l e3e x a m p l e so f i m m u n o l o g i c a lr a p i dm e t h o d 5 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 1 3 2 4 生物传感器技术 生物传感器是由生物感应元件和与之紧密连接或组合的传感器所组成。传感器 能将生物学事件转变成可以被后续处理的响应信号。生物传感器具有选择性好、响 应快、样品需要量少、可微型化的优点。不足之处是一些识别元件的长期稳定性、 可靠性、一致性方面存在问题，目前多数处于研制阶段，离批量生产尚有距离。生 物传感技术目前在食品快速检测方面的应用实例还不是很多，其中主要原因是由于 过去在食品工业中对生物传感技术缺乏了解，而生物传感技术的研究人员又对食品 分析的要求和条件缺乏认识。 裹4 生物传感器技术逢测实例 t a b l e4 e x a m p l e so f r a p i dm e t h o dw i t hb i o s e n s o r 1 3 2 5 生物芯片检测法 所谓生物芯片技术是相对于计算机芯片而言的，计算机芯片处理电子信息，而 生物芯片则处理生物分子所携带的信息。生物芯片法的优点是自动化程度高，能够 实现同时检测多种目标分子的目的，而且检测效率高，检测周期短。不足之处在于 前期需要大量已测知的d n a 片段信息。检测费用仍偏高。目前按照检测对象分类， 可以分为基因芯片、蛋白芯片等。按照制备技术标准又可分为点阵型芯片与实验室 芯片。d n a 探针技术就属于点阵型基因芯片，它是在玻璃或塑料、硅基片上制备 6 铁强化食品中n a f e e d t a 快速检测试剂盒的研制 的已知碱基对序列的单链d n a 分子。d n a 探针技术目前已经有对食品中致病菌检 验及转基因食品快速检测的应用。 表5 生物芯片检测法速测实倒 t a b l e5e x a m p l e so f r a p i dm e t h o dw i t ha u t o m a t i cc h i p 1 3 2 6 生物学发光检测法 利用细菌细胞裂解时会释放出a t p ，a t p 自细菌细胞放出来后，使用荧光虫素 和荧光虫素酶可使之释放出能量，这些能量产生磷光，光的强度就代表a t p 的量， 从而推断出菌落总数。美国c h a r ms c i e n c ei n e 有一系列通过检测细菌的a t p 量来 控制不同食品卫生安全的产品，如检验食物表面的p o c t e t s w a bp l u s 、检测水产品表 面的w a t e r g i e i l e o m 、检测生肉的c h a r mc h e f 等，操作方法都是使用专用药签刮抹 待测部位，然后将药签装入笔形管内，插入便携检测仪读数即可。 1 3 2 7 物理性质检测法 王林等4 2 1 发明的便携式酒醇含量速测仪外表类似于折光仪，由镜筒、检 测棱镜、盖板、取光筒、视度调节圈、且镜及含量刻度划分板组成。它的检 测原理是随着水中乙醇浓度的增加其折光率也有规律地上升，当甲醇存在时， 折光率会随着甲醇浓度的增加而降低。检测时，只要将待测液涂抹于检测棱 镜上，通过目镜即可直接读取乙醇含量。当酒中甲醇浓度超过1 时此设备即 可适用。 1 3 3 食品快速检测技术发展现状 目前在国外，快速检测技术发展很快，各种商业化试剂盒和速测设备层出不穷， 且具有三个明显的发展趋势，一是创新性，很多试剂盒已不再是原有检测方法的小 型化，而是在检测技术上有了质的转变，使得检测过程不再对检测人员有很高的专 7 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 业要求。二是精确化，很多速测技术已能达到原有的经典检测方法的准确性，a o a c 就将很多试剂盒作为其官方推荐方法。三是平民化，快速检测不再只是专业检测部 门专用的工具，国外一些公司生产的速测工具非常便宜，使得快速检测技术的大范 围普及成为了可能。如w e bs c i e n t i f i c 公司出品的s p o t c h e c k t m 药签就利用几乎8 5 的食品中存在葡萄糖，通过用药签头部刮抹检测部位后，挤出尾部葡萄糖显色液， 观察显色情况来判断葡萄糖情况，借此推断依赖葡萄糖生长的有害微生物是否存 在，它每支成本仅1 美元。而国内的快速检测技术发展则相对滞后，目前国内市场 上常见的试剂盒多为国外进口，特别是在食品生化检测领域。国内具有自主产权的 试剂盒在检测精确度与简便性上也往往不如进口试剂盒。 1 4 本研究的工作目的与意义 随着社会的进步，生活水平的提高，人们对自身的健康更加关注，对饮食的营 养意识越来越强，对于受传统膳食结构影响的微量营养素缺乏也有了较为清醒的认 识。营养强化食品必将受到人们的欢迎。鉴于我国缺铁性贫血的高发，铁强化食品 也会有很好的发展前景。目前国际国内尚未发现有效的用于铁强化食品现场检测的 手段。在铁强化食品推广过程中，如果有可靠快速的检测方法对铁强化食品的质量 迅速做出认定，无疑会有利于监管部门及时做出反应，进而使得铁强化食品市场能 得到有效的监管，同时也能迎合企业内部生产的质量控制需要，这将对我国铁强化 食品的推广发展有着重要意义，而本研究的立项目的正在于此。 1 5 本研究试验思路 1 5 1n a f e e d t a 检测试剂盒的研制 基于前文所述，由于铁强化食品对于营养改善的特殊功效，铁强化食品已经越 来越多的得到社会的认可和重视，且正在我国非常迅速的发展，然而现在对铁强化 食品的质量控制检测还多停留于实验室，需要专业分析设备的辅助，这些专业设备 无法用于现场检测，且检测周期长，成本高，这种状况一定程度上制约着铁强化食 品的发展。因此研制成本低廉，能适用于铁强化食品现场准确快速初筛的分析仪与 试剂盒成为市场发展的必然要求。目前市场上尚没有发现用于铁强化食品快速检测 的分析仪与试剂盒。本研究拟在这种情况下，充分参考市场上各种成熟的快速检测 技术以及各种试剂盒设计上的长处，本着盒体体积小，操作快速简单，配套用品易 得成本低，试剂毒害性小的原则，设计铁强化食品中n a f e e d t a 快速检测分析仪并 配套专用试剂盒。 1 5 2n a f e e d t a 硫氰酸铵比色法的改进 8 为达到上一步的目的，则要确立一种用于铁强化食品中n a f e e d t a 快速检测的 铁强化食品中n a f e e d t a 快速检测试剂盒的研制 方法，此方法应操作简单，结果准确、稳定，使用试剂种类少，用量小，试剂价格 相对便宜，试剂的稳定性比较好。鉴于在现有的用于食品中n a f e e d t a 检测的方法 中，黄建等建立的硫氰酸铵比色法是相对比较简单的，检测结果也是准确的，本研 究拟在此方法基础上本着简化检测步骤，以减少单样检测过程吸光度值测定次数的 目的，从影响显色反应的酸度、显色剂、显色介质等几个方面通过试验来重新考察 显色条件，以建立适用于快速检测试剂盒的专用检测方法。 1 5 3n a f e e d t a 检测试剂盒的检测技术研究 在优化了显色体系后，还应根据不同食品的特点研究简化样品前处理过程的方 法，使得样品的前处理过程步骤简单，快速，处理过程所借助的器械工具也应较为 简单易得。由于目前我国市场强化食品以酱油、面粉为主，酱油的特点是不同品种 酱油成分组成差异大，面粉的特点是自身水不溶性成分较多。本研究应在充分研究 了解酱油性质差异与面粉水溶特性的基础上优化其前处理过程。 1 5 4n a f e e d t a 检测试剂盒在食品中的应用 在完成快速分析仪与试剂盒的研制设计工作后，使用试剂盒对市售铁强化食品 进行检测，并与其它检测方法进行检测结果的比较，验证试剂盒的有效性。同时， 在检测时间与检测成本方面与其它检测方法比较，全面考察试剂盒的市场适用性。 9 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 2 铁强化食品中n a f e e d t a 硫氰酸铵比色法的改进 2 1 试验目的 黄建等建立的硫氰酸铵比色法的检测过程具体为先检测加盐酸的试剂空白吸 光度a # 目与不加盐酸的试剂空白吸光度a ”。o ，两者相减求出盐酸在显色条件下的 吸光度aw n ，然后检测酱油在加酸条件下的吸光度a # s 与不加酸条件下的吸光度 a 样g o ，两者相减扣除了酱油本底的影响，求出显色条件下盐酸与n a f e e d t a 显色 的吸光度a # b ，最后用a 样日一ah * 得到样品中n a f e e d t a 显色吸光度，从而 计算出n a f e e d t a 含量。该方法充分考虑了在硫氰酸铵显色测定过程中影响结果准 确性的各种因素，此法结果虽然准确，但需要通过4 次吸光度值测定才能得到最终 结果，而且最终显色体系体积为5 0m l ，试剂的用量比较大。 本章节的试验目的是摸索n a f e e d t a 硫氰酸铵比色法在降低取样量、试剂用量 方面的可行性，探讨优化显色体系的途径。 2 2 材料与方法 2 2 1 试验材料 2 2 1 1 主要仪器 7 5 6 c r t 紫外可见分光光度计( 上海精密科学仪器有限公司) ； m e t f l e ra e l 0 0 电子天平( 瑞士梅特勒托利多公司) 。 2 2 1 2 试剂 n a f e e d t a 标准品( 6 5 可通过1 6 0 目筛，纯度9 9 o ) ，从美国s i g m a 公司 购买。硫氰酸铵、过硫酸铵、氯胺t 、浓盐酸、甲醇、丙酮均为分析纯，均购自北 京化学试剂公司。试验用水为去离子水。 显色剂的配制：称取硫氰酸铵1 5 0 岛，置5 0 0m l 容量瓶中，加水2 5 0m l 溶解， 加丙酮7 5m l ，加水稀释至刻度，摇匀【3 4 】。 5 0 盐酸的配制：取浓盐酸5 0 0m l ，加水稀释至1 0 0m l ，摇匀。 1 盐酸的配制：取浓盐酸1 0m l ，加水稀释至1 0 0m l 。 5 0 丙酮溶液的配制：取丙酮5 0 0m l ，加水稀释至1 0 0 0m l ，称过硫酸铵1 0 0 0g 溶解于丙酮溶液中。 l o 铁强化食品中n a f e e d t a 快速检测试剂盒的研制 各种品牌普通酱油、果汁，面粉均从当地( 北京) 超市购买。 2 2 2 试验方法 2 2 2 1 检验条件的优化与改进 将n a f e e d t a 标准品配成浓度为1 3 0i t g m l 的溶液，吸取1 0 0m l 此溶液置于 1 0m l 比色管中，加入5 0 0m l 丙酮溶液，加入显色剂1 0 0m l ，加入盐酸1 0 0m l ， 用丙酮溶液稀释至刻度，充分振荡，以相应试剂空白为校正，在九= 4 8 0n l n 测定吸 光度。此过程中分别改变加入的1 0 0 m l 盐酸浓度( 依次为5 、1 5 、3 0 、5 0 、 7 0 、8 0 、1 0 0 ) ，1 0 0m l 显色剂浓度( 依次为5 、1 0 、1 5 、2 0 、2 5 、 3 0 、3 5 、4 0 ) ，丙酮水溶液中的过硫酸铵浓度( 依次为0 5m g m l 、1 0 m g m l 、 1 5 m g m l 、2 0 m g ，m l 、2 5 m g m l ) ，丙酮水溶液中丙酮的浓度，以此重新考察确 定加入的各试剂的适宜浓度。吸光度值的测定均经过6 次重复。 2 2 2 2n a f e e d t a 标准曲线的制备 精密称取n a f e e d t a 标准品2 0 0m g ，置于10 0m l 棕色容量瓶中，加水溶解并 定容至刻度，摇匀，制成浓度为2 0 0 0 t g m l 的n a f e e d t a 标准储备溶液，备用。 精密吸取n a f e e d t a 标准储备溶液0 0 、0 2 、0 4 、0 6 、0 , 8 、1 0m l 分别置于 1 0m l 容量瓶中，用水定容，摇匀。精密吸取稀释后的不同浓度标准品溶液1 0 0m l 分别置于1 0m l 比色管中，加显色剂1 0 0m l ，加稀盐酸1 o om l ，用丙酮溶液稀 释至刻度，充分振荡，以试剂空白为校正，在k = 4 8 0n l l l 处分别测定其吸光度，得 到n a f e e d t a 标准品浓度为4 - 一2 0p g m l 的显色体系。 2 2 2 3 铁强化酱油样品的制备与处理 精密称取1 0 0 - - 3 0 0m gn a f e e d t a 标准品用未强化的市售普通酱油将其溶解， 转移至1 0 0m l 容量瓶中用酱油定容，得到不同浓度铁强化酱油样品。 吸取铁强化酱油样品o 6 0 m l 置于1 0 m l 容量瓶中，用7 5 ( v ) 的甲醇溶 液定容，摇匀。静置lm i n 后，使用针头过滤器吸取此溶液，用1 2t , t m 有机相微 孔滤膜过滤，分别吸取滤液1 0 0m l 两份，置于两支1 0m l 比色管中，备用。每个 样品检测进行6 次重复。 2 2 2 4 铁强化果汁样品的制备与处理 精密称取5 - 一2 0m g n a f e e d t a 标准品用市售“统鲜橙多”果汁溶解，转移至 1 0 0m l 容量瓶中用果汁定容，分别得到浓度为5 啦2 0 0r t g m l 的铁强化果汁样品， 分别吸取铁强化果汁样品1 0 0 m l ，置于两支1 0 m l 比色管中，备用。每个样品检 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 测进行6 次重复。 2 2 2 5 铁强化面粉样品的制备与处理 对铁强化面粉的制备，采用逐级放大混合方法，将n a f e e d t a 标准品研细后， 先与少量普通面粉混合均匀，再将混合好的面粉与剩余面粉混合，制成n a f e e d t a 含量为2 0 0 , - 4 0 0i t g g 的铁强化面粉样品。 称取强化面粉样品1 5 0g 于试管中，加1 0m l 水，反复振荡2m i n ，使水与面 粉充分接触混匀，静置5r a i n ，待不溶部分大部沉降后，取上部水层部分，过0 6 5l a m 水系滤膜，分别取滤液2 0 0m l 两份，置于两支1 0m l 比色管中，备用。每个样品 检测进行6 次重复。 2 2 2 6 铁强化食品样品比色法显色体系分析条件 向盛有经过前处理样品溶液的1 0 m l 比色管中的一个加5 0 丙酮溶液5 0 0 m l ， 加显色剂1 0 0m l ，加1 ( v v ) 稀盐酸1 0 0m l ，以5 0 丙酮溶液定容，摇匀后 在a - - 4 8 0n e f f 测定吸光度舢。另一个比色管中加5 0 丙酮溶液5 0 0m l ，加显色剂 1 0 0m l ，加5 0 盐酸1 0 0m l ，以5 0 丙酮溶液定容，摇匀后在x 爿8 0n l n 处测定 吸光度a 1 。计算a a = a 1 a o ，以吸光度标准曲线法定量。 2 3 结果与讨论 2 3 i 检测原理及操作方法的选择 由于比色法具有直观、快速的特点，因此本研究以黄建等建立的硫氰酸铵比色 法原理为基础，采用三价铁离子( f e 3 + ) 与显色剂硫氰酸铵( n h 。s c n ) 在酸性溶 液中( p h i 0 5 ) 反应生成红色络合物作为检测的方法依据。此显色反应是f e 3 + 与 s c n 之间的可逆的络合反应，平衡体系会受到酸度、显色剂浓度、显色介质与温度 的影响。 由于该检测方法是后期设计快速检测试剂盒的基础，试剂盒检测的要求是操作 步骤应简单，试剂用量应较少，因此本试验控制加入盐酸、显色剂的量都为1 0 0m l ， 最后的显色体系体积为1 0 0m l 。 2 3 2 测定波长的选择 将n a f e e d t a 标准品配成浓度为1 3 0i _ t g m l 的溶液，吸取1 0 0m l 此溶液至于 1 0m l 比色管中，显色后，得到n a f e e d t a 标准品浓度为1 3r t g m l 的显色体系， 同时以试剂为空白，在4 0 0 - - , 5 7 0n n l 波长范围内扫描，如图1 所示，该红色络合物 的显色体系在 甜8 0n l n 处有最大吸收。 铁强化食品中n a f e e d t a 快速检测试剂盒的研制 ： ii 、j： i ! ， 。 ：、o 己一 ， 、 ：7 7j y ： ： 、： - ： & _ 一 固in a f e e d t a 显色后红色络台物的紫外可见扫描图 f i g1 u v - v i sa b s o r b a n c es p e c t r o g r a mo f t e di r o nc h e l a t e 2 3 3 酸度对红色铁络合物吸光度的影响 由于n a f e e d t a 是不很稳定的酸式螯合物( f e e d t a 螯合物在不同p h 值溶液 中存在形式见图6 ) ，n a f e e d t a 只有在一定酸度下才能完全将f e 3 十解离出来，本试 验采用1 0 0 m l 不同浓度的盐酸来考察酸度对吸光度的影响，结果见图2 o1 53 04 56 07 59 0 盐酸浓度( ) 图2 酸度对红色铁络合物吸光度的影响 f i g2i n f l u e n c eo f a c i dc o n c