（农产品加工及贮藏工程专业论文）酶法及复合改性改善小麦面筋蛋白功能性质的研究.pdf

攒要 利展酶法及中性蛋鑫酶和琥璐歉纯相复合鲍方法对小麦蕊筋进行政性，旨在 改善小麦藿翁蛋白的各硬功能特性，包括游鳃性、羲他馒及乳纯稳定性、起泡性 及泡蛛稳定性。结果表明： ( 1 ) 列用中性蛋趣酶水解小麦霾簏蛋鑫，歇五个因素( 鼷液纥、酶浓度、p h 值、 温度鞠水解时间) 探讨了对面翁虽囊功能特性的影响，在正交试验的基础上，褥 到中性蛋白酶水解改性小麦面筋蛋白的最佳工艺条件为：网液比为1 ：1 0 ，酶浓发 为0 躺，p h 值为6 5 ，温度为4 0 c ，时间为3 h 。最佳条件处理后面筋蛋白的溶解 渡为6 5 1 5 ，乳化住为5 0 3 8 ，乳化稳定性为4 9 1 0 ，起治性为3 8 0 m l ，泡沫稳 定性为2 4 0 m l 。 ( 2 ) 中性蛋自酶有限水解小麦蛋白时，水解速率随水解度晨指数下降变化，同时， 酶活力也髓之薄低。这是出于酶的变性鞋及癀拐捐承解产物中存程抑制酶活成分 的原因。搬撼酶反虚动力学抟基本理论，出试验数据褥受；搂述串性蛋翻酶p 瞒5 和温度4 0 ( 2 条件下有限水解小麦蛋白的动力学方程如下： c x = 2 7 9 3l n 1 + 8 1 2 8 4 6 时趋于稳定；等电点时乳化性最差，偏离等电点尤 其在偏碱性条件下，乳化性明显增加；酶水解后，乳化性变化较大，水解度1 7 时，乳化性最佳。鲁晓翔等6 2 l 利用胰蛋白酶对玉米蛋白进行水解，得到了不同水 解度的玉米蛋白水解液，并对酶解蛋白液的溶解性、起泡性和乳化性等功能特性 进行了测定，结果表明酶改性可显著提高玉米蛋白的水溶性、起泡性和乳化性。 a k i ok a t o i ”】报道在p h 值为1 0 时，胰凝乳蛋白酶可进行去酰胺作用，使大豆分离 蛋白的乳化性和起泡性明显提高，其中约2 0 的天冬酞胺和谷氨酞胺脱去了酰胺 基。 基因工程法：通过重组植物蛋白的合成基因来改进蛋白质的功能特性。由于 该技术周期长，见效慢，目前仍处于实验室阶段，尚未在生产中应用m i 。 8 此外，融于食品加工多方面的要求，单一的蛋囱质改性技术往往不能达到目 的。近些年来，应用2 种或2 种以上的方法对撩白质改性的技术大量涌出，这就 是笺合法改秣1 6 5 | 。 鬓惑辨食是工终誊在檀物蛋鲁茏其是大豆分离凝鑫渡性方瑟基徽过大量研究 工作，饭有关谷朊粉( 小麦露筋蛋白) 改性的报道郯很少。w o o d a ：和s h o r t 旧q 用l 。0 m o l lh c i 溶液，7 5 处理3 0 分钟得到的去酰胺面筋蛋白仍有很好的溶解性和乳 化性以及起泡性，但酸去酰胺由予作用温度高，而鼠在酸的催化下难以控制肽键 永裤程魔，蛋白旗也部分变性。史新慧等嘲对用酸改往面筋蛋自进行了初步探索， 在盐酸浓度为0 3 m o l 1 ，7 0 睾爝3 0 分镑，溶解浚麸3 ，0 土升到5 4 8 ，乳纯缝有 明显提您。勰用减健促去黢胺改性压，对蛋皂艨中欺氨酸毒皴螺，毒理硬究表明 对小鼠肾有毒害作用i “”。酶法改性方面，齐军茹等1 6 8 i 采用蛋白酶水解小麦殛筋蛋 白，对酶解物的乳化性能进行了系统研究，实验表明，酶解质的小麦面筋摄白的 乳化能力大大提高。越冬袍口哪利用碱性蛋白酶对谷脱粉乳化性进行改良，研究了 酶浓度、p h 值、反应时间、爱应溢度对谷瓶精乳纯褴和乳纯稳定性的影响。为改 善食鼹蛋鑫鏖黪臻蕤魅震，h a m a d a ! 删袋耀皴牲蘩鑫酶对牛魏貉蛋鑫、大要球蛋鑫 靼小麦麦谷蛋白农a d l e r - n i s s e n 刨点数条l 牛t ( p h s t a t e ) 7 0 j 进荦亍改性，g 有效改善 食用蛋白质的功能性质。n b o m b a r a m c a n o n ”悃蛋白酶水解改性小麦面粉，研 究了水解过稳中水解度( d h ) 的变化，以及改性面粉的溶解性、乳化性和吸水性。 1 4 论文的主要内容及意义 利用中性蛋白酶水解小麦鼯筋摄自，从聂个因素( 固液比、懿浓度、蚶徨、 温度和水解时间) 探讨了对面筋蛋白功能特性的影响，缀过正交实验筛选出酶解 改性的最佳工艺条件；通过监控水解过程的水解度交化及酶失活情况，对中性蛋 白酶在p h 6 5 和温度4 0 条件傣亿水解小麦面筋强自的动力学机制迸彳亍系统研究， 觚焉建立描述孛魏蛋翻酶催纯农解，l 、麦蚤自豹动力学方稷：采霜渍璃酰纯稻中性 蛋是薅承艇摆结会抟方法慰小整夏荔蛋是进行复合改蛙，探雪哮酸能裁瘸曩、酸纯 温度、酶浓度及水解时间四个因素对改性霹笈蛋白的功能特性的影响，通过正交 实验筛选出复合改性的最佳工艺条件。 谷朊粉作为小麦淀粉生产的副产品，在食品及非食品( 工业) 领域的应用征逐步 爱到入们的青睐，僵蘸f 予谷朊粉功能特性的某些局限性，不能满怒食品加工及其 链工烃方覆静器求，极大蠡鏊隈制了铸黥粉翡应嗣。弱藏卷有静改瞧方法基本符合 加工业的要求，但仍或多或少褰在缺点，努力寻求更有馀蠖瓣改性方法垮是熬压 谷朊粉改性研究的重点和方向。本课题以安徽省“十五”重点科技攻关项匿小 麦谷朊粉产业化关键技术研究及副产品深加工研究( 0 4 0 1 3 0 2 1 ) 为依托，通过改进 9 方法提高谷朊粉的功能特性以扩大谷朊粉在食品领域的应用范围，最终提高小麦 深加工的附加值，实现小麦粉的综合加工利用，进一步拓宽和加深小麦在食品工 业的应用。 1 0 第二章中性蛋白酶水解改性小麦面筋蛋白 2 1 材料姆仪器 2 1 1 原料 市售豁朊粉河南温县永大实业有限公司 孛瞧缀自酶广疆南宁纛落生物王稷有限公司，酶活力为2 0 万u g 。 大豆甑拉油上海福临门有限公司 2 。1 2 圭臻试裁 牛血清蛋臼( 生化试剂) 酪骚白( 生化试剂) 考马斯亮黻r 2 5 0 ( a r ) 三氯己 酸( a r ) c 。s 0 4 5 h 2 0 ( a r ) 氢氧化钠( a r ) 酒石酸钾钠( a r ) 2 1 3 主骚纹器设鬻 p h s - 2 5 b 型酸度计 t d l - 4 b 高速台式离心飘 半微鬣凯氏定氮仪 7 2 1 分必光度计 f k a 缀织搅碎枫 7 9 - 1 磁力加热搅拌器 毫熬蠖湿痰浴锻 电子天平 架盘天平 毫燕毽湿鼓戴予矮籍 冷冻高速离心机 玻璃仪器气流烘干器 2 ，2 实验方法 上海天达仪器有限公司 上海安簿羊萼学仪器厂 郑州长城科工贸有限公司 上海糖密科学仪器鸯壤公司 波苏金坛市金城国胜实验仪器厂 止海精密科学仪器有限公司 上海天平仪器厂 上海民桥精密科学仪器有限公词 永康市华邋衡器制造厂 主海获迸缀疗器藏厂 北京博医康实验仪器有限公司 郑州长城科工贸有限公司 2 2 1 水分测定 g b 5 4 7 8 5 实验步骤： ( 1 ) 样品的预处理：将样晶进行研磨、过筛，褥采用烘箱干燥测定水分。 ( 2 ) 襻蔟重量爨称囊援趣辏：撵晶蘩爨逯豢控铡其残饔耱必2 。毒竞；键震稼 爨皿的规格为：直径5 c m ，高度至少为2 c m ；直径加大时，高度至少3 c m 。称量三 次，结果取其平均值。 ( 3 ) 予爆条捧：烘箱嚣选麓静蘧度、压力及干爨薅阕，溺被测襻整静往霞及努 析目的不同而有所敬变。干燥濑度通常采用7 0 1 0 0 ，对热较稳定的食品，甚愿 可以采用1 2 0 1 4 0 。确定干燥辩闻的方法采耀干燥至僵耋瓣方法即于燎残整麴 重2 - 5 窥对，当连续两次承称重稠蒺不大子1 3 毫克。 2 2 2 获分的测定赢接灼烧获化法 2 。2 3 糨蛋白含量测定半微量凯氏定氮法f 嘲 准确称取样品o 5 0 2 o o g 予5 0 0 m l 豹凯戳烧瓶中，加入1 0 9 无水硫酸钾，o 5 9 硫酸铜和2 0 m l 浓硫酸。在通风橱中先以小火加热，待泡沫消必后，加大火力，消 化至透明无黑粒后，将凯式烧瓶摇动一下，使阑圈的黑粒溶予硫酸液中，继续加 热瀵纯3 0 r a i n 左杏，j 逡羹雪，群滚鏊绿色获态，傍壹溺往，冷帮。 取出凯氏烧瓶加入约2 0 0 m l 蒸馏水，连接定氮球及冷凝蒸馏装置，将馏出液 出口的冷凝管下端管口插入盛有5 0 m l 添加有指涿剂的硼酸吸收液的三角瓶中。在 凯氏烧艇溶液中加入玻璃珠数粒鬣徐徐加入8 0 m 1 5 0 氯氧他钠溶液，立靼接妊定 氮黥，捻查整个蒸镶装置是否漏气。强直接火灏麓热蒸馏，蒸至觐民浇麟内残液 减少到三分之一时，打开定氮球与凯式烧瓶的躲口处，停止加热，用水冲洗冷凝 管及馏出液管，用0 1 n 盐酸标准溶液滴定至灰级色为终点。同时做一空白宓验( 用 甲基鲤攥示裁漓定至红色瀵失帮麓终点) 。实验遴嚣三凌，绥祭取其平甥熬。 计算公式： 总氮爨( ) = 【n ( v 2 - v 3 o 0 1 4 w 】1 0 0 蛋白质( ) = 总氮量( ) k 式审；饕一糠罐黧羧滔滚静当豢浓度； v l 一空自滴定消耗标准激溶液的量； v r 一样液滴定消耗的标准酸溶液量i w 一样品爨爨； k 一换算鬈数，k = 5 。7 2 2 4 持水力的测定 ( 1 ) 称擞样品重量g ( 2 ) 髂爨褰心警耋鬃w l ( 3 ) 配5 0 m l ，4 蛋幽溶液调斑到7 倒入离心嚣 ( 4 ) 离心管放入恒温箱6 0 ，3 0 r a i n ，冷却3 0 m i n ( 5 ) 4 0 0 0 r r a i n 离心l0 r a i n 去上清波 ( 6 繇黧w 2 ( 7 ) 实验进行三次，结果取其平均饭。 重量差w = w 2 w i 一( 1 0 0 a ) 1 0 0 a 溶解发 1 2 撵品持农力( w h c ) 一竺二- “ 2 2 5 水解度测定p h - s t a t 法i 7 4 水解开始时，调节反应体系到遣宜p h 值，殷应过程中用o 1 m o l ln a o h 调节 醒使英保持恒定，并记录下瑟馒翅戆碱液的爨，按下式计葵窳簿度： d h = h h t o l 1 0 0 = 1 3 ( 醋b ) ( 1 a ) ( 1 i m p ) ( 1 h 。，) 1 0 0 其中：b 为n a o h 的体积( m l ) ：m b 为n a o h 的浓度( m o l l ) ；a 为水解系数； m p 为骚自质的质量( g ) ；h t 。为繇克原料蛋白质中肽键的爨摩尔数，对予小麦面 荔蛋自，癌取蓬g 。3 8 。 2 2 6 小麦面筋蛋自功能特性的测定 2 2 6 1 溶解度的测定 7 5 1 懿潮1 袈薛滚，3 0 0 0 d m i n 瓷3 0 m i n ，载上清夜1 0 m l 予试警中，热入1 o v a l 水，混匀后加入双缩脲试剂4 m l ，震荡摇匀，予5 4 0 n m 处进行比色测定。以牛血 清蛋白为标准曲线，分别吸取0 、0 4 、0 8 、1 2 、1 6 、2 0 、2 4 m l 于试管中，用蒸 馏农於怒裂2 0 m l ，务燕入4 m l 双缀艨试刘，滋匀螽予5 4 0 n m 处进行毙锻溅定， 以孛盘满蛋自台量( u g m l ) 为横嫩标，班光嗷渡值为缀坐标，绘出标准籁线( 冕 图1 ) ，作为定量依据，得标准曲线方程为：y ；o 1 3 1 7 x + 0 0 1 1 8 。将待测小麦面筋 蛋白的吸光度值( e ) 代入标凇艟线方程，则得到该鬣岛的溶解度( ) = a x k n i w x1 0 ”1 0 0 。a 建撂避鞠线奎褥襻晶蔽走凄镶对应翡蛋盘凄含耄 ( u g ) ；n 为用于显色的样品体积( m l ，本实验巾n = i 0 ) ；w 、m 为原样品薰爨( m g ) 及稀释尉体积( m l ) 。 。4 凳0 3 度0 2 。| 0 爨囊浓度u g f m l 图1 牛墩清蛋白溶解艘曲线 f i g1 s o l u b i l i t yc u r v eo fb o v i n es e r u ma l b u m i n 1 3 2 2 。6 。2 乳化度及魏他稳定牲豹测定1 7 雌 醺涮1 永解液，调节到一定的髑篷，取l o o m l 该溶液鞫1 0 0 m l 大豆包拉涵， 在f k - a 商速组织捣碎机中以1 0 0 0 0 r m i n 的速度搅打i m i n ，然质取4 5 m l 移入5 0 m l 离心管中，在t d l - 4 b 岗速离心机中以1 5 0 0 r m i n 离心5 m i n 。搬掘乳化层高度计算 嚣诬性，实验送行三次，鳝采取箕乎臻蓬。 乳化性( ) = 乳化层高度总离度1 0 0 将混合液在5 0 水浴3 0 m i n ，再用自来水冷却至室温，然后再次测擞乳化层 的高度计算霉k 化稳定憔： 嚣德稳定蝗 = 巍铯器毫度惑裹凄i o 藩 2 2 6 3 超泡性及泡沫稳定性的测定 7 7 , 7 8 精确称取2 9 小麦水解蛋白，加入l o o m l 水鬣予装料杯中，在高速组织搅碎机 中援蠢i m i n ，逐速掰入5 0 0 m l 爨篱牵，记录淹沫体积，表示怒泡桎，翳鬣l o m i n 后，再次测量泡沫体积，记为起泡稳定性。实验谶行三次，缩果取其平均值。 2 2 7 中性蛋白酶水解小麦面筋蛋岛 2 。2 。? 。i 夺麦嚣簸蛋巍瓣蛋鑫藩承簇工艺 按一定的固液比凇确称取谷脱粉，在磁力搅拌下使底物均匀溶解于蒸馏水中 并加热到所需温度，同时用l m o l l n a o h 溶液调节酸碱度至实验设定的p h 。在磁 力搅搏下麴入逶量中魏瀑叁酶，鬟予瞧漫瘩滏蠛冷送行汞薅，虢0 。l m o l ln a o h 溶液滴寇，使p h 稳定不变。反应捌预定时闯，迅速在沸水浴中加热5 m i n 钝化蛋 白酶。记录水解过程消耗的n a o h 的毫升数，并以此来计算水解度d h 。改性谷朊 粉在喷雾干燥机中干燥后保存。 2 。2 7 。2 酶解俸趸豹基本条释 影响踯促水解速度的因素很多，本实验主要研究了固夜比、酶浓度、p h 值、 温度和反废时闻对中性蛋白酶水解小麦面筋蛋自的影嘀，分别避霉亍单因素实验， 酶解条穆蕊薹本参数凳袭3 。 表3 中性蛋囱酶水解条件的罄本参数 t a b 3 p a r a m e t e ro fe n z y m a t i ch y d r o l y s i s 2 2 7 3 派交试验的设计 壤攒罄嚣素实验续莱确定五嚣素霆承乎乙。( 5 ) 歪交试验，曩三交试验袭头设诗 1 4 凳表4 。对试验结果避蠢综合评分，慧分中溶解度占4 潞，乳纯性释起泡性各3 0 。 表4 五因素四水平l m ( 4 蔽交试验设计 t a b 4 d e s i g no fl ”( 矿) o r t h o g o n a le x p e r i m e n t 2 3 结果与讨论 2 3 1 原始貉朊粉理化指标的测定 原始谷朊粉理化指标觅表5 。 表5 餐器静理纯攒标 t a b l e5t h ep h y s i c sa n dc h e m i s t r yi n d e xo f v i t a lw h e a tg l u t e n 2 。3 。2 酶解条律慰小麦嚣整蛋鑫改镁熬影蟾 蛋囱酶水解嚣戆鬃盎的过程十分复杂，中性蛋爨酶的活力、黪浓发、疯物懿 性质与浓度、水解过稷的p h 值与离子强度、酶水鳃的温度与时间，都会影响水 解度d h 的大小以及水解蛋臼液的性质。 2 3 2 1 酶浓度对改健效栗的影响 取酾个不同中性蛋白酶浓度梯度0 4 、0 6 、0 8 、1 o ，其它反应条件固 定海：滋度4 0 。c ，p h 馕7 0 ，霞滚毙1 ：1 0 ，求解薅鬻2 ，l 、霹，分鄹溯定个梯皮下静 样品的水解度、溶解度、起泡性、起泡稳是性攀b 化憾和乳化稳定性。 从圈2 可以糖出，随着酶浓度的增大，水解度不断提高，当达到某一极限值 后，水解度随酶浓度的增加而降低。这主簧是豳为酶浓度过大，发生自水解现象， 导数对藏浆零解俸震减弱。 当中性蛋白酶用量不断增加，小麦面筋蛋白溶解度依次增加( 见图3 ) ，可 能是由于酶解后一部分蛋自质被彻底水解成氨基酸，而更多的被降解为分子量更 夺静蛋鑫覆或多歉类，麸焉使其溶解发逐渐增翔。 2 4 避2 0 熬 蕤 1 2 04 06 0 8 1012 酶旅度( * ) 燧2 酶浓度对拳勰度躲影响 f i g 2e f f e c to fe n z y m ec o n c e n t r a t i o n o nd e g r e e so fh y d r o l y s i s 1 ，j j _ i ：么：二一 04060e0 酶浓艘( 篙) 墅3 酶浓度瓣溶解度懿影嘀 f i g 3e f f e c to fe n z y m ec o n c e n t r a t i o n o ns o l u b i i i t y 瓢蘑4 霹戳看出，德着孛经蛋白酶浓度熬增热，小麦面翁蛋密藐纯性帮乳纯 稳定依次增加，这是出于酶浓度较低时，中性蛋白酶大辍水织蛋酝分予，使套艨 粉分子断裂成较雾亲水性较强的小肽，分子内部疏水基闭暴露，相对增加了蛋白 质的疏水部分，有乖j 子胶荣的形成，形成水包油结构，促使乳化住及乳化稳定性 鬟裹。毽当薅浓发增褥太大时，其承鼹崮静夺获更短，辍桎瑟夺，形藏了涵包求 结构，警l 化性按水包油来计算，所以下蜂迅速。 图5 所示，中性龋白酶浓度的增加，导致小麦面筋骚自起泡性和趣泡稳定性 先增掘骺减小。在酶鞠萤邻近0 6 对，越泡健最好。这是因为，在适当的酶浓度 下，蛋白质分子拔大爨痰簿，分子量一定程度减小，爨豢蛋巍震浓度提毫，起泡 性和泡沫稳定性增加。当酶解进步进行，由于蛋白质分子的疏水性交小，向界 面移动越小，起泡能力降低。由此可见，酶浓度过离或过低都不利于发泡和泡沫 稳定。 孽 丑 氍 篷 一 ： 1 0 j 。一。， | l o 。一一7 l 一 0 4n 80 81o 辩浓度穗) 图4 酶浓度对乳化能力的影响 f i g 4e f f e c to fe n z y m ec o n c e n t r a t i o n o ne m u l s i f y i n ga b i l i t y 鼍 v 辎 数 1 6 定性 0 40 60 81 0 酶浓度( ) 圈5 酶浓度对起泡能力的影响 f i g 5e f f e c to fe n z y m ec o n c e n t r a ti o n o nf o a m a b i l i t y 骼 磷 轴 拈 霉魁齄滩 2 3 2 2 固液比对改性效果的影响 取l ：5 1 ：3 0 六个不同固液比梯度，其它反应条件固定为：温度4 0 ，p h 值 7 0 ，酶浓度0 8 ，水解时间2 小时，分别测定个梯度下的样品的水解度、溶解 度、起泡性、起泡稳定性、乳化性和乳化稳定性。 由图6 可以看出，当固液比低于1 ：2 0 时，水解度随着固液比的增大呈上升趋 势，而当固液比高于1 ：2 0 时，水解度则开始降低，继续加大固液比到1 ：3 0 ，水 解度持续降低，说明固液比过大，导致底物浓度过低，酶促反应速率下降，水解 度下降。 a 20 重 。16 世 琏 * 1 2 151 ：101 ：1 51 ：2 01 ：2 51 ：3 0 回液比 图6 固液比对水解度的影响 f i g 6e f f e c to fs o l i d l i q u i dr a t i oo i l d e g r e e so fh y d r o l y s i s 1。、 ，、5 6 1。- 暮5 2 1 罄1 8 1 ：51 ：1 01 ：1 51 ：2 01 ：2 5 1 ：3 0 固液比 图7 固液比对溶解度的影响 f i g 7e f f e c to fs o l i d 1 i q u i dr a t i o o ns o l u b i l i t y 由图7 可知，随着固液比的增大，小麦面筋蛋白的溶解度也不断增大，在固液 比1 ：2 0 达到最大溶解度，固液比继续增加，溶解度则开始降低。这与水解度变化 趋势一致。固液比过大，底物浓度低，水解率下降，溶解度也降低。此外，除了 固液比对溶解度的影响，还应考虑到生产成本及产物的浓缩等问题。 1 5 毒1 0 丑 氍 擐5 o 同液比 图8 固液比对乳化能力的影响 f i g 8e f f e c to fs o li d 1i q u i dr a t i o o ne m u s i f y i n ga b i l i t y 同液比 图9 固液比对起泡能力的影响 f i g 9e f f e c to fs o l i d l i q u i d r a t i oo i lf o a m a b i l i t y 性 稳定性 出灏8 可以看出，髓着固渡眈戆增大，小麦骚鑫的乳化 篷秘霉纯稳定瞧帮穗应 降低。这是由于在低浓度下承的表面张力随乳纯熟表面浓度增加丽迅速减少( 被 改性的铸朊粉视为乳化荆) 。当蛋囱质浓度较高时，每5 0 一2 0 0 个蛋白质分子彼此 靠近形成聚集团，称胶柬( 或液晶) 1 7 9 1 ，可增加界面膜的厚腱，从而提高膜的强 度，罐艇蛋叁覆戆霉l 像戆力，镬襞纯瑟交褥矍熬稳定。 圈9 所示，当鞠液眈逐渐增大，起泡性和泡沫稳定性均髓之降低。由此可见， 当底物浓度过低时，不利于发泡和泡沫稳定，原因是蛋白质浓度高时扩散速度快， 迅速拉伸形成新表谶，而浓度较低瓣，泡沫粗化，稳定性降低。 2 3 2 3p 珏僮对改彀效采静影响 取洲值分别为5 5 、6 0 、6 + 5 、7 0 、7 5 、8 0 ，其它威应条件固定为：温度 4 0 ，酶浓度0 8 ，飚液比l ：1 0 ，水解时间2 小时，分别测定个梯度下的群晶的 溶缨蒗、超淹毪、怒涤稳定瞧、巍绽经秘襞纯稳霆经。 4 茎3 e 趟2 琏 * 5 s6 06 5707 ，58 o d h 德 图l op h 值对水解度的影响 f i g 。1 0e f f e c to f 埔o nd e g r e e s o fh y d r o l y s i s 7 0 窑8 5 蘧6 0 缝 5 5 5 56 o657 0758 0 p h 值 强l lp 珏毽瓣滚壤痊豹影嗡 f i g 1 1e f f e c to f 蹲o i ls o l u b i l i t y 酶作为一种特殊的骚自质分子，其酶催化反威的能力与环境p h 密切相燕，环 壤翊会影响酶分子静梅蒙和酶分子及底耱分子敕磐离状态，鼓嚣影昀酶侄爱斑速 度。如鬻l o 所示，髓者p 拜值的舞瀚，承解度垒升高趋势，毽p h 值过高会导致小 麦面筋蛋囱的氨基酸损失，以及其露功能性质指标降低。当p h 值临近6 5 时，为 中性蛋自酶的适宜p h 值。 港缝凌疆臻豹交稼趋势觅霆l l 。蠲趋近6 。0 鬟孛，滚薅凌不凝提高，这爨等 电点范围时( 6 0 - 7 0 ) ，蛋白质闯相互作用达到缀高，缔结和收缩的面筋鬣白呈 现最低的水化程度。p h 达到7 o 以艏，酶活性降低，但小麦骚白受碱水解影响， 蛋自质变性，亚基结梭丈分子分裂鹚较低分子煮的蛋叁质分予，溶解度仍然继续 升高。 出图1 2 可以看出，乳化性在p h 僮为5 5 8 o 的范围内是先增后减，在p h 值6 5 时乳化性和乳化稳定性最好。这是因为当p h 值增大时，由于o h 一作用使c o o 一增多， 从而增加了分子问的静电斥力，使离散双电层增加，溶液界面膜增厚，同时有利于 胶柬的形成，提高了乳化性：另一方面酶活力受p h 值影响，p h 值的适当增加可使酶 活力加大，反应速率加快，其水解程度也相应提高，同样提高了其乳化性。随p h 值 继续增大，酶水解的质子化和去质子化受p h 值影响较大，从而影响酶对谷朊粉的水 解，乳化性下降。 1 6 1 2 弓 墓e 蛙 4 5 56 065707 58 0 p h 值 图1 2p h 值对乳化能力的影响 f i g 1 2e f f e c to f d ho n e m u l s i f y i n ga b i l i t y 5 560657 07 58 0 p h 值 图1 3p h 值对起泡能力的影响 f i g 1 3e f f e c to fp ho n f o a m a b i l i t y 性 稳定性 p h 值与起泡能力的关系如图1 3 所示，随着p h 值的增大，起泡性和泡沫稳定性 先增大后减小，在p h 值为6 5 时起泡性与泡沫稳定性最好。起泡性能与蛋白质的溶 解性密切相关，面筋蛋白中的麦谷蛋白能溶于稀酸，所以在p h 低于6 5 的酸性区域 内，起泡性随着p h 值降低有升高的趋势。在p h 值高于6 5 时，起泡性和稳定性都显 著降低。 2 3 2 4 水解温度对改性效果的影响 取反应温度分别为3 5 、4 0 、4 5 、5 0 、5 5 ，其它反应条件固定为：p h 值7 0 ， 酶浓度0 8 ，固液比1 ：l o ，水解时间2 小时，分别测定各个梯度下的样品的溶解度、 起泡性、起泡稳定性、乳化性和乳化稳定性。 温度对酶促反应的影响有两个方面，一方面温度提高可以使反应速度加快， 另一方面随着温度的提高，酶失活速度也开始加快，这两方面的综合影响导致酶 促反应存在着最适温度，偏离最适值会降低水解效果。在其最适反应温度区，温度 提高可加快反应速率，即在较短的时间内提高水解度。如图1 4 所示，在4 5 附近面 1 9 = 。 、一 、薹 化化 一 乳乳 、，一 一一、贰、 一 一 镰 = 冀 蕊 一 荔， 一 薹 筋蛋白的水解度最高。 2 1 盆18 墨 0 能15 堪 苌 1 2 3 54 04 55 05 5 温度( ) 图1 4 温度对水解度的影响 f i g 1 4e f f e c to ft e m p e r a t u r eo n d e g r e e so fh y d r o l y s i s 5 8 5 6 邑5 4 趟 琏5 2 靛 5 0 3 54 04 55 05 5 温度( ) 图1 5 温度对溶解度的影响 f i g 1 5e f f e c to ft e m p e r a t u r e o ns o l u b i l i t y 温度对溶解度的影响见图1 5 。在蛋白酶的最适温度范围内，温度高有利于胶 原蛋白的水解，因此，在4 5 c 附近蛋白质的溶解度较大。温度高于4 5 时，开始 偏离最适温度，酶活力下降较大，因此，溶解度开始减小。反应温度升高到5 5 c ， 蛋白酶逐渐失活，溶解度迅速降低。 水 、一 丑 醛 垃 3 54 04 55 05 5 温度( ) 图1 6 温度对乳化能力的影响 f i g 1 6e f f e c to ft e m e r a t u r eo n e m u l s i f y i n ga b i l i t y 3 54 04 5 5 05 5 温度( ) 图1 7 温度对起泡能力的影响 f i g 1 7e f f e c to ft e m p e r a t u r e o nf o a m a b i l i t y 定性 反应温度与乳化能力的关系如图1 6 所示，温度达到4 0 左右乳化性与乳化稳 定性最大，在温度范围内，先增后减，5 0 后基本保持不变。由此可见，适当的增 加反应温度，会使面筋蛋白的乳化能力提高，但是温度过高会使蛋白质的天然性 质丧失过多，乳化能力反而下降。 从图1 7 可以看出，随着温度的升高，起泡性和泡沫稳定性均逐渐降低，在4 0 到4 5 之间趋于稳定，这是由于达到了酶解反应的适宜温度范围，酶解液疏水性 增强，表面张力减弱，蛋白质分子肽链展开，在液面上形成一层稳定的液膜。 2 0 泡沫 一 起泡 一 一 ) ： 鞴 一 誓 ) = f 心漆 一 鋈 2 3 2 5 水解时间对改饿效聚的影响 震中瞧蘩鑫酶对夸麦叛麓蛋鑫分别承麟o 。5 、l 、2 、3 、4 小时，箕它爱应效 孛 霹定为：溢发4 0 ，因液院为l ：1 0 ，酶用j o 潞，努别测定个梯壤下鼹稃磊静溶 解度、超淑幢、起稳稳怒睦、巍纯往辩巍讫稳定饿。 l 錾图1 8 掰熨瘩麟度髓反盛对翔泡筵长瑟增大。般来说，要达到嚣群趣水解 发，承蕻懿阍秘酶浓度蠢关，酶溪量犬，零薅彗雩翊丽缝鎏。强群酶浓度下，辩鬻 越长，永解度越高，但粼一定时间后上升趋势减缓。另外，综合考虑到能耗、生 产周期及防止水解液变成等因素，水向掣时间不离过长。 懿l 鲁掰忝，蘧羞审槛蚤鑫酶窳解辩溺的增翔，枣麦委翁蛋智溶辩瘦逐渐漤 黯，这是赢予簿鳃秘魏酶灌力较豢，承释魔不睽交大，蛋叁囊被蹲解隽分子爨燮 小的蛋囊质或多肽类，从瓶使其溶解发逐渐增加，随着时间延长，酶活力降低， 水解度趋向恒定，溶解廉增加趋势减缓。 葶 e 螂 饕 精 2 。5 0123 4 对阕h ) 豳1 8 薅阕辩求辩度戆黪穗 f i g 。1 8e f f e c to ft i m eo n d e g r e e so fh y d r o l y s i s 5 6 求 越5 2 琏 涟 4 8 01234 时闽( b ) 鬻i 簿阊对海解蕉蕊影媾 f i g 1 9e f f e c to ft i m e o ns o l u b i l i t y 麸鞠2 0 冒戳看爨，隧着中性强骞辩水辫对阕的增翱，小麦繇筋蛋自乳化性翘 嚣张豫定程依次洚骶，谯i - i 5 夺辩之黼交往鑫袭。这主要是溺为藏着承麓时阍 延长，蛋国旗赢秘逐渐减少，酶解速度降低，丽鼠永勰产物的秘豢爱过来对簿奉 赛按判；其次，端基数鞭壤魍到一定程度，亲家性 妊增裂一定瑕凄，吸黪濑麴然力 洚繇；努努，毽裹东濑滚表嚣静黢越来越枣，镬澹瀵镶护层越来越薄，疆终导致魏 化活性和乳优稳定性的下降。 酶解时间对起泡能力的影响见图2 1 。随着水解时间的延长，小麦面筋蛋白起 泡褴帮超泡稳定性先增蕊篮减，j 、，在2 小时左右逸鳓越泡挂和溆沫稳定程的最佳 效莱。在酶解歼始除段，臻鸯蒺努予逐渗被零鬃梵小胶，交迭气渔表嚣藜蛋寅蕨 浓痰提糍，形成渡媵，晦低了渡鞠的袭嚣张力。本解进行较长慰趣蜃，蛋爨墩蛉 疏水性变小，起泡性也酶低。 2 l 3 0 琶2 0 釜 器 蛰1 0 鞋耀( h ) 鬻2 0 辩褥辩巍纯麓力秘嚣螭 f i g 1 9e f f e c to ft i m eo n e m u l s i f y i n ga b i l i t y 2 。3 。3 最辕反应条转鹣磺定 2 3 3 1 豫交试验结浆 2 0 0 6 0 2 0 8 0 熬箍能 j j l ：二二：二二：二= = = = = ： 对翊( h 礴2 l 对祠对超混髓力豹彩嫡 f i g 2 le f f e c to ft i m e o nf o a m a b i i i t v 袭6 芷交实验鳍暴 t a b 6r e s u l to fo r t l 目a g o n a l e x p e r i l e n t 1_-_-_“_”_h_*t-wm_*，_w 实验号 水解度( 9 6 )溶榔度( )乳化性( ) 乳化稳磁性( )起泡憾( m 1 )泡沫稳感性( 珂1 ) l0 。6 53 9 5 7 3 7 3 43 6 1 22 4 51 6 0 2l 。铤鳓赞 3 ，3 5鹅+ o 巷3 2 8 5 31 i 36 2 2 71 5 3 l 1 03 3 03 0 0 44 0 67 6 1 7 3 ，2 32 。9 6 3 0 02 1 0 51 。8 86 6 。8 5 4 2 7 74 l 。4 84 0 0 2 9 0 s0 ，8 3 6 7 ，2 7i 3 ，8 i 2 3 8 3 髓3 0 0 7 2 1 77 1 5 22 4 0 8 2 3 。6 42 0 07 5 82 2 5 7 2 8 06 6 36 0 6 3 0 52 1 5 i 。0 5酶。裙2 。7 0l 。8 6 3 5 52 8 0 1 02 ，3 7 s 8 0 31 2 6 61 1 0 2 4 01 3 0 l l 2 ，0 75 4 3 81 1 5 4 1 0 5 23 5 03 1 0 1 2 2 。6 l6 3 0 48 + 3 3 7 3 63 2 52 0 0 l s3 稻鞠。i s9 + 辨 8 托l 鼯鳓 1 42 ，8 28 2 。1 9 1 2 1 31 1 0 3 1 8 07 0 1 5 0 6 35 1 2 49 8 88 。1 7 3 6 53 0 5 1 6 l + 6 55 2 媳 1 6 妪1 4 。83 1 5 2 5 0 薯v 器晕 表7 正交实验结果分析 t a b 7h n a l y s i 8o fo r t h o g o n a le x p e r i m e n t 实验号a 圃液比 b 辫浓度( )cp h 值d 温度( )e 时间( h )综合评分 ll ( 1 ：5 )l o 4 )l ( 6 0 ) “3 5 )1 ( 0 5 ) 9 1 1 2 l2 ( 0 8 )2 6 。静2 ( 4 0 )2 q ) 1 2 4 0 7 i 3 e 。8 )3 ( 7 。0 ) 3 ( 4 5 ) 3 ( 2 ) 1 0 4 4 14 ( 1 0 ) 4 ( 7 5 ) 4 ( 5 0 ) 4 ( 3 ) 1 0 1 。6 0 2 ( 1 ：1 0 )l23 4 1 3 6 8 9 22l431 0 7 7 2 23 4121 0 0 5 6 2432 l 1 0 2 1 3 3 ( i ：1 5 ) 13429 2 4 4 3 2 43 18 6 。5 4 33l 249 7 1 2 342l39 8 3 0 4 ( 1 ：2 0 ) i4239 9 2 6 423l49 7 4 3 4 324l9 5 ，3 4 44l3 29 4 4 3 1 0 5 3 2 1 0 4 9 39 7 6 09 6 8 59 3 7 8 1 1 1 8 31 0 3 9 41 1 3 6 51 0 5 6 51 0 2 8 8 9 3 。6 09 9 3 8 9 9 1 31 0 5 5 9i 0 2 4 4t = 4 0 7 3 7 9 6 。6 29 9 1 29 6 9 9 9 9 2 81 0 8 2 6 1 8 2 35 8 l1 6 。8 68 。8 01 4 。4 8 本实验选择爨渡沈、瓣浓攫、球篷、瀑度帮本解雾重瓣遴行玉霹素疆承平爱交 试验，试验按l 。( 4 6 ) 菠交表设计，蘸交试验结果与分析熙表6 和袭7 。 从表6 中可以看出，正交试验对谷朊粉功能性质的提高更加屉著。水解改性 后谷朊粉的溶解度最简达到9 0 1 6 ，乳化性最高为4 2 7 7 ，起泡性最好达到4 0 0 m l 。 芷交试验的结果分析觅表7 。将改佼谷胝粉的各项功能特性通过评分方式封 列 蹶摩，黯燕交表进行极差分析。觚表7 哥疆看斑各鼹索豹极差分弱为：器液院1 8 2 3 ， 薅浓度5 + 8 l ，翊1 8 6 6 ，滠度8 + 8 0 ，本媾时阙1 4 ，4 8 ，鼹霹撂墩孵泼性对答嚣粉珐 能性质提离的五个因繁重要性大小顺序为；囤渡比、p h 馕、水解时间、湿度、酶 浓度。通过正交表可以得到最佳改性条件a ：b 。c 出。e 。：固液t b = l ：1 0 ，酶浓度= o 4 ， 2 3 4 5 6 7 8 g姆u舱插h据掩配弛r p h 值= 6 5 ，温度= 4 5 ，时间= 3 h ；通过正交分析得蒯计算出的最佳搭配凡b 。c t d z e 。： 固液醴：= 1 ：i o ，酶浓度= o 辅，p h 值= 6 5 ，温度= 4 0 。c ，时间= 3 h 。 2 3 3 2 试验结采的验证 由于优化的反应组合a ：b 。c 。d e 甄在正交方案中没有出现过，所以必须通过实验 检验，验证缩栗与原始谷朊粉的对比列于表8 。检验结采表明，屯b ，c 。d 。e 。确为使小 麦霆翁蛋自各静功能性璇均熊达戮较努翁优纯凝应条件。困既，最佳酶辩条件为： 固波比1 ：1 0 ，熊浓度0 4 ，蚶馕6 。5 ，瀑度4 0 ，农鼹时趣3 h ，霹褥姥旋牲质 良好的小麦水解蛋白。 表8 验避遮骏结襞与愿誊车静慰鞋： t a b 11c o n t r a s to fe x p e r i m e n tr e s u l ta n dr a wm a t e r i a l 2 4 小结 利用中性蛋白酶水解小麦蕊筋蛋白，从五个因豢( 阂液比、酶浓度、p 珏傻、 温度和水解时间) 探讨了对面筋蛋白功能特性的影响，在正交试验的基础上，碍 到中性鬻自酶水解改性小发面筋蛋白的最佳工艺条件为：固液比为1 ：1 0 ，酶浓度 为0 酶，p h 值为6 5 ，温度为4 0 ，时间为3 h 。最佳条件处理后面筋蛋白的溶解 度梵6 5 1 溅，毳纯瞧为5 0 3 8 ，巍纯稳定谯为4 9 1 筛，起游往为3 8 0 m l ，泡沫稳 定燃为2 4 0 m l 。 第三章中性蛋白浆永解嚣筋缀自动力学的研究 3 1 材辩与纹器 3 1 1 原料 帮攥谷骶粉澎怒遗县永大炙烂寿隈公司 中健鬣自酶广西南宁庞搏蹩：物工程有限公司，酶活力为2 0 万u g 。 3 1 - 2 擞簧试剂 牛立瀵凝自( 生纯试褰l ) 酪蛋幺( 生像试裁) 考马簸蹇蘸r 2 5 0 ( a r ) 三氯乙 酸( a 鼗) 氢氧仡镳( a r ) 营爨酸( a r ) 撩辕酚试裁( a r )盐酸 a r )氨 水( a r ) 3 1 3 患要仪器设备 鞭s 一2 5 b 型酸度计 t d l 一4 b 高速台式离心机 7 2 1 分光光度计 7 9 一l 磁力热熬揽搏嚣 电热恒温水浴锅 电予天平 架擞天平 毫煞恒温鼓燕子澡籍 冷冻商速离心机 玻璃仪器气流烘干器 3 2 安骏方法 上海天逸仪器有限公司 上海安婷科学仪器厂 上海精密科学仪器有照公司 主海精褰耪学便器毒黻公司 上海天平仪器厂 上海民桥精密科学仪器有限公司 索康市牮逶簿器制造厂 上海疑滋医疗器藏厂 北京博暇康实验仪器裔限公司 郑州长城科工贸有限公司 3 2 1 水解度测定p h - s t a t 法 7 4 】 测定方法同2 2 5 。 3 。2 。2 枣麦嚣蕊蛋爵的蛋鑫酶瘩辫忑艺 水解工艺如2 2 7 1 。 3 2 3 中性蛋白酶水懈面筋蛋自动力学的探讨 秀了缝够更充分燧了解酶法窳解霹菸蛋自茨癍俸系静零溪，掌握秘按髑酶求 解反应的进程，建立反应水解过程规律的动力学凝系十分重要。 本实验对中性蛋囱酶在p h 6 5 和温度4 0 * ( 2 条件催化水解灏筋蛋白的动力学机 毒l 进行寨绕匏研究，麸霞建立搓述审侄蛋叁骛镶纯窳瓣，、麦甏然蛋鑫豹动力学方 程。 在恒定的溢度4 0 c 和p h 值6 5 的条件下，考察不同初始酶浓度和底物浓度下， 中性蛋鑫酶催纯永繇，j 、麦覆筋蛋鑫酌情况， 云泵下随着时闻延长永解度d h 的交 化及酶活力魄变化；剥鬟o r i g i n 较锋诗冀爨露荔蛋皇酶水瓣豹动力学参数，根据 酶反应动力学的基本理论，得到温度4 0 c 釉p h 值6 5 下有限水解小麦西簏蛋照的 动力学方程。 3 3 结果与讨论 3 3 1 酶解反应过程中水解度变化 在恒定的温度4 0 c 和州值6 。5 的条件下，考察不同初始酶浓度和底物浓度下， 中性蛋臼酶催化水解小麦面筋蛋白的情况，试骏结槊如液g 所示。 由表9 可知，在不同的底物浓度和酶浓度条件下，水解度随着反应时间的增加 蔼罐高，稳永解速率随对闯增加而降低，在反疲时黼6 0 r a i n 内永解魔增加较为明 显，隧嚣衣瓣速率隧反应黠闻豹缮龆蔫降低，反应2 h 看农解发交纯趋予稳定。承 鳃速率随时闻延长蔗下降的暇因霹能毒以下几方瑟：1 ) 经蛋白黪幸筝鬟压瘸甥孛易 被水解的肽键数目减少；2 ) 酶的变性失活；3 ) 水鳃产物中可能食有对酶有抑制 作用的成分；4 ) 底物对酶有抑制作用，尤其是高底物浓度会大大降低酶的催化效 率。 表9 中性蛋鑫酶承解，j 、麦簧鑫游数据 t a h 。9d a t a so ft h ep r o c e s so fe n z y m a t i ch y d r o l y s i s 底物浓度s o ( g l ) 6 2 。5 09 0 。9 l1 6 6 6 7 酶浓度b ( g l ) 0 3 6 30 5 4 50 7 2 70 3 6 30 5 4 50 。7 2 70 。3 6 30 5 4 50 7 2 7 水解度x ( ) x 1) ( 2 x ix 2x 3x lx 2 00 0 0o 0 0o 0 00 o o0 0 0 0 o o0 0 00 0 0 o 0 0 52 3 42 6 73 0 01 3 4 2 0 0 2 2 3o 8 21 1 11 2 2 1 94 3 45 0 l5 3 42 6 73 + 3 43 酾i 5 41 9 02 1 1 式 1 5 5 。6 78 。s 87 0 l3 5 84 2 l4 9 02 1 82 5 72 7 8 躺 2 06 6 88 o l 8 3 44 o l5 。1 25 。7 9 2 。6 4 3 + 0 9 3 。3 4 时2 57