（环境科学专业论文）构建新型电化学免疫传感器及其对多环芳烃的检测研究.pdfVIP

东华大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同 意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允 许论文被查阅或借阅。本人授权东华大学可以将本学位论文的全部或 部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 保密口，在年解密后适用本版权书。 不保密 学位论文作者签名：啤勰蛆 日期：y b 年f 月y 泪 指导撕签名：惭引k 日期：加，弓年1 月川汨 构建新型电化学免疫传感器及其对多环芳烃的检测研究 摘要 多环芳烃是一类具有致癌、致畸、致突变性的持久性有机污染物。 1 芘丁酸( p b a ) 是p a h s 的衍生物、葸( a n ) 是三环多环芳烃，对 人体和动植物均有毒性作用。因此，对p a h s 及衍生物的快速检测具 有重要意义。电化学免疫传感器作为一种有效的微量和痕量分析手 段，具有灵敏度高、分析速度快、选择性强、仪器简单等优点，近年 来被人们所广泛关注。文献调研表明，利用电化学免疫传感器来监测 环境中的多环芳烃及其衍生物的研究较少，对小分子物质p a h s 的电 化学免疫分析有待进一步探索。 本文以p b a 和a n 为检测对象，以石墨烯、壳聚糖、离子液体、 纳米金、二茂铁甲酸作为修饰电极材料，采用不同的复合物修饰玻碳 电极，构建了三种灵敏性高和特异性强的免疫传感器。以修饰的传感 界面为敏感元件，根据循环伏安、交流阻抗等电化学方法表征免疫传 感器的构建过程，通过示差脉冲伏安法和电化学交流阻抗谱测定抗原 抗体反应后传感器界面电子转移的变化来实现p b a 和a n 的定量分 析，并据此探索了利用电流型免疫传感器和阻抗型免疫传感器进行多 环芳烃快速检测的新方法。 以p b a 为研究对象，采用石墨烯壳聚糖复合膜修饰玻碳电极， 再将纳米金吸附其上，制备了一种无标记的电流型免疫传感器。该免 疫传感器利用成膜性极好的壳聚糖分散具有大比表面积和导电性极 好的石墨烯作为平台，利用生物兼容性极好的纳米金固定抗体，依据 不同浓度的抗原与抗体结合后，传感器界面的电流变化与免疫产物的 量成正比来测定p b a 分子的浓度。结果表明，在优化条件下，石墨 烯壳聚糖纳米金修饰电极对1 芘丁酸检测的灵敏度和稳定性比单一 的石墨烯壳聚糖复合膜修饰电极性能更优异，具有较宽的线性范围 和低检测限。p b a 浓度在0 0 0 1 1 0n g l 和1 0 2 0 0n g m l 范围内，峰 电流随p b a 浓度的增加而减小，且与峰电流值呈良好的线性关系， 回归方程分别是易，( 衅) = o 1 0 5 c e s a ( n g m l ) - 6 5 4 8 5 ，相关系数为 0 9 9 9 4 和锄( “a ) = 2 2 2 1 8 c p b a ( n g m l ) 一8 7 2 6 2 ，相关系数为0 9 9 ，检 出5 i 曼( s n = 3 ) 为0 0 0 1n g m l ，并且该传感器具有制作过程简单，检测 限低，稳定性好等优点。 以p b a 为研究对象，采用石墨烯离子液体壳聚糖复合物修饰玻 碳电极，构建了一种无标记的电流型免疫传感器用于p b a 的检测研 究。将1 丁基3 一甲基咪唑四氟硼酸盐( b m i m b f 4 ) 离子液体( 结 构式见图3 1 ) 掺杂进入一定比例的石墨烯一壳聚糖复合膜中，制备了 一种新型的电极修饰材料，利用透射电镜对其形态进行表征，用该复 合物修饰玻碳电极，采用循环伏安法和示差脉冲伏安法对修饰电极性 能进行表征。研究结果表明，在优化条件下，该方法制备的免疫传感 器对1 芘丁酸的检测同样具有较宽的线性范围和低检测限，p b a 浓 度在o 0 1 5n g l 和5 m 5 0n g m l 范围内，峰电流随p b a 浓度的增 加而减小，且与峰电流值呈良好的线性关系，回归方程分别是易，( “a ) = 1 6 4 8 2 c e b a ( n g m l ) 一8 9 6 0 6 ，相关系数为0 9 9 9 4 和锄( a ) = o 1 8 3 7 c e 8 4 ( n g m l ) - - 8 1 8 9 2 ，相关系数为0 9 9 7 6 ，检出限( s n = 3 ) 为 o 0 1n g m l 。 以a n 为检测对象，选择二茂铁衍生物二茂铁甲酸( f c c 0 0 h ) 、 离子液体1 丁基3 甲基咪唑四氟硼酸( i l s ) 、石墨烯和壳聚糖以及纳 米金为电极修饰材料，构建一种用于葸的检测研究的阻抗性电化学免 疫传感器。通过f c c o o h 、i l s 、g s 、c s 复合膜修饰玻碳电极提供 固定抗体的稳定且具有良好生物兼容性的界面，利用纳米金来固定抗 体，并且提高传感器的灵敏度。应用电化学阻抗谱及循环伏安法测定 修饰电极在电解液中的电化学行为，对该传感器电极表面交流阻抗行 为的进行深入研究，实现了葸的快速检测。研究结果表明，在0 0 0 1 3 0 n g m l 范围内，a r e t 与p b a 的质量浓度对数呈现良好的线性关系， 回归方程为：a r e t = - 9 3 5 2 1 1 0 9 c + 3 9 3 2 3 ，相关系数r 2 = o 9 9 0 8 ，检测 下限为0 0 0 1n e d m l 。该免疫传感器具有良好的重现性和稳定性，制 备方法简单、快速、制备费用低，具有潜在应用价值。 关键词：多环芳烃；电化学免疫传感去；石墨烯；纳米金；离子液体 一 c o n s t r u c t i o no fn o v e l e l e c t r o c h e m i c a l i m m u n o s e n s o ra n dt h es t u d i e so nt h e d e t e r m i n a t i o no fp o l y c y c l i c a r o m a t i c h y d r o c a r b o n s a b s t r a c t p o l y c y c l i c a r o m a t i ch y d r o c a r b o n s p o l l u t a n t s ( p o p s ) w i d e l yp r e s e n ti nt h e ( p a h s ) a r eac l a s so fp e r s i s t e n to r g a n i c e n v i r o n m e n t ，m a n yw h i c ha r ec a r c i n o g e n i c ， t e r a t o g e n e s i sa n dm u t a g e n i c i t y 1 - p y r e n e b u t y r i ca c i d ( p b a ) ，o n eo fp a h sd e r i v a t i v e s a n da n t h r a c e n ea r eh a r m f u lf o rh u m a n b e i n ga n do t h e rf l o r aa n df a u n a t h e r e f o r e i ti s 叭n e c e s s a r yt od e v e l o pas e n s i t i v e ，r a p i da n dc o s t - e f f e c t i v em e t h o df o rp a h s d e t e c t i o n a sa ne f f i c i e n tt r a c e a n a l y s i sm e t h o d ，e l e c t r o c h e m i c a li m m u n o s e n s o r p o s s e s s e st h em e r i t so fh i g hs e n s i t i v i t y ，q u i c ka n a l y s i s ，s t r o n gs e l e c t i v i t ya n ds i m p l e s t r u c t u r e ， e t c h o w e v e r ,f e wr e s e a r c h e sh a v eb e e nc o n c e n t r a t e d o nu t i l i z i n 2 e i e c t r o c h e m i c a li m m u n o s e n s o rt om o n i t o rp a h sa n di t sd e r i v a t i v e su pt on o w f u r t h e r i n v e s t i g a t i o n ss h o u l db ec a r r i e do u tf o rt h ee l e c t r o c h e m i c a li m m u n o a s s a yf o rs m a l l m o l e c u l e so fp a h s 1 - p y r e n e b u t y r i ca c i d ( p b a ) a n da n t h r a c e n e ( a n ) w e r ec h o s e n a st h e e x a m l n a t i o no b j e c t si nt h i sp a p e r g r a p h e n e ( g s ) ，c h i t o s a n ( c s ) ，i o n i cl i q u i d ，n a n o a u a n df e r r o c e n e c a r b o x y l a t e ( f c - c o o h ) w e r ec h o s e na st h em o d i f i e dm a t e r i a l s t h r e e s e n s i t i v ea n ds p e c i f i ce l e c t r o c h e m i c a li m m u n o s e n s o rw e r ec o n s 蚋j c t e d t h em o d i f i e d s e n s o ri n t e r f a c ei st a k e na st h es e n s i t i v ee l e m e n t t h e nt h ec o n s t r u c t i o np r o c e s so f t h e 1 m m u n o s e n s o ri sd e s c r i b e db ye l e c t r o c h e m i c a lm e a n ss u c ha s c y c l i cv o l t a m m e t r y ( c a n de l e c t r o c h e m i c a l i m p e d a n c es p e c t r o s c o p y ( e i s ) ，e t c t h eq u a n t i t a t i v e a n a l y s i sf o rp b aa n da nw a sr e a l i z e da c c o r d i n gt ot h ev a r i a t i o no ft h ee l e c t r o n t 。a n s t e ra l t e rt h ei m m u n o r e a c t i o nb e t w e e n a n t i g e na n da n t i b o d yo nt h es e n s i n g i n t e r f a c ed e t e c t e db yd i f f e r e n t i a lp u l s ev o l t a m m e t r y ( d p v ) a n d e i s a c c o d i n gt ot h e o e s e a r c ho ft h et h e e l e c t r o c h e m i c a l a m p e r o m e t r i ci m m u n o s e n s o ra n dt h e 1 v e l e c t r o c h e m i c a li m p e n d e n c ei m m u n o s e n s o rw ee x p l o r en e wm e t h o d sf o rp o l y c y c l i c a r o m a t i ch y d r o c a r b o n sr a p i dd e t e c t i o n as i m p l e ，h i g h l y s e n s i t i v e ，a n dl a b e l - f r e ee l e c t r o c h e m i c a l a m p e r o m e t r i c i m m u n o s e n s o rw a s d e v e l o p e db a s e do ng r a p h e n e ( g s ) a n dc h i t o s a n ( c s ) c o m p o s i t e s a n dn a n o a um o d i f i e dg l a s s yc a r b o ne l e c t r o d e f o rt h ed e t e r m i n a t i o no fp b a t h e g r a p h e n ea n dc h i t o s a nc o m p o s i t ew h i c hh a sg o o de l e c t r o nt r a n s f e ra b i l i t ya n dl a r g e s p e c i f i cs u r f a c ea r e aw e r eu s e da sp l a t f o r m 。t h en a n o a uw h i c hh a sp r o m i n e n t b i o c o m p a t i b i l i t ya n dp r i m a r i l ye x c e l l e n ta d s o r p t i o nw e r eu s e dt oi m m o b i l i z ep a h s a n t i b o d y ( a n t i - p a h s ) u n d e ro p t i m i z e dc o n d i t i o n s ，t h ea m o u n to fi m m o b i l i z a t i o no f a n t i b o d yw a ss i g n i f i c a n t l yi m p r o v e do nt h em o d i f i e d e l e c t r o d e ，r e s u l t i n g i n a m p l i f i c a t i o no ft h ee l e c t r o c h e m i c a ls i g n a lf o rp b ad e t e c t i o n b e c a u s eo ft h ep o o r c o n d u c t i v i t yo ft h ea n t i b o d y - a n t i g e ni m m u n o c o m p l e x ，t h ec u r r e n tr e s p o n s eo ft h e p r o p o s e di m m u n o s e n s o rd e c r e a s e dl i n e a r l yw i t hi n c r e a s i n gc o n c e n t r a t i o no fp b a t h el i n e a rr e s p o n s eo ft h ei m m u n o s e n s o rf o rp b ad e t e c t i o nw a sa tt w or a n g e so f c o n c e n t r a t i o n sf r o m0 0 01t o10a n df r o m10t o2 0 0n g m lw i t had e t e c t i o nl i m i to f 0 0 01n g m l t h er e g r e s s i o ne q u a t i o nw a s ，( a ) = 0 10 5 c p b a ( n g m l ) - 6 5 4 8 5w i t h ac o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n to f0 9 9 9 4a n d 妇( 衅) = 2 2 218 c e , e w ( n g m l ) - 8 7 2 6 2w i t ha c o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n to f0 9 9 ，r e s p e c t i v e l y m o r e o v e r , t h ep r o p o s e di m m u n o s e n s o r h a de x c e l l e n ts e l e c t i v i t ya n dr e p r o d u c i b i l i t y a h i g h l ys e n s i t i v e ，s t a b l ea n dl a b e l f r e ee l e c t r o c h e m i c a li m m u n o s e n s o rf o rt h e d e t e c t i o no f1 - p y r e n e b u t y r i ca c i d ( p b a ) w h i c hw a sb a s e do ng r a p h e n e ( g s ) ，c h i t o s a n ( c s ) a n di o n i cl i q u i d s ( 1 - b u t y l - 3 m e t h y l i m i d a z o l i u mt e t r a f l u o r o b o r a t e ，【b m i m b f 4 ， 1 l s ) c o m p o s i t e sm o d i f i e dg l a s s yc a r b o ne l e c t r o d ef g s c s i l g c e ) t h em o r p h o l o g y o ft h eg s c s - i l sc o m p o s i t e sf i l mw a sc h a r a c t e r i z e db yt h et r a n s m i s s i o ne l e c t r o n m i c r o s c o p y ( t e m ) t h ee l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o ro ft h em o d i f i e de l e c t r o d ea n dt h e e l e c t r o c h e m i c a lp r o p e r t i e so ft h ei m m u n o s e n s o rw e r es t u d i e db yc y c l i cv o l t a m m e t r y ( c v ) a n dd i f f e r e n t i a lp u l s ev o l t a m m e t r y ( d p v ) i nd e t a i l u n d e ro p t i m i z e dc o n d i t i o n s ， t h ei m m u n o s e n s o rs h o w e daw i d el i n e a r r a n g ea n dl o wd e t e c t i o nl i m i t t h e a m p e r o m e t r i cr e s p o n s ed e c r e a s e dw i t hi n c r e a s eo ft h ep b ac o n c e n t r a t i o na n dw a s p r o p o r t i o n a lt ot h ep b ai nt h er a n g eo f0 01 t o5n g m la n d5t o15 0n g m l r e s p e c t i v e l y t h er e g r e s s i o ne q u a t i o nw a s 易( r t a ) = 1 6 4 8 2c p b a ( n g m l ) - - 8 9 6 0 6 w i t hac o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n to f0 9 9 9 4a n d ，( 嶂) = 0 18 3 7c p b a ( n g m l ) - - 8 1 8 9 2 w i t hac o r r e l a t i o n c o e f f i c i e n to f0 9 9 7 6 ，r e s p e c t i v e l y t h ed e t e c t i o nli m i tw a s e s t i m a t e dt ob e0 , 01n g m lb a s e do nas i g n a lt on o i s er a t i oo f3 a ne l e c t r o c h e m i c a l i m p e d a n c es p e c t r o s c o p y ( e i s ) i m m u n o s e n s o rf o rt h e v d e t e c t i o no fa nw a sd e v e l o p e db yi m m o b i l i z i n ga n t i b o d yt h r o u g hn a n o a u 。g r a p h e n e ( g s ) ，c h i t o s a n ( c s ) ，i o n i cl i q u i d ( i l s ) a n df e r r o c e n e c a r b o x y l a t e ( f c c o o h ) w e r e c o m b i n e dt o g e t h e rt op r e p a r ean e wt y p eo fc o m p o s i t ef o r t h em o d i f i c a t i o no fg l a s s y c a r b o ne l e v t r o d e t h ec o n s t r u c t i o np r o c e s so ft h ei m m u n o s e n s o ri s d e s c r i b e db y e l e c t r o c h e m i c a lm e a n ss u c ha sc y c l i cv o l t a m m e t r y ( c v ) a n d e l e c t r o c h e m i c a l i m p e d a n c es p e c t r o s c o p y ( e i s ) ，e t c t h er e s u l t s s h o w st h a tt h ep l o to fi n c r e a s e d e l e c t r o nt r a n s f e rr e s i s t a n c e s ( r e t s ) a g a i n s tt h el o g a r i t h mo fp b ac o n c e n t r a t i o ni s l i n e a ro v e rt h er a n g ef r o m0 0 0 1t o3 0n g m lw i t had e t e c t i o nl i m i to f0 0 0 1n g m l t h er e g r e s s i o ne q u a t i o nw a s r e t = 9 3 5 2 1 i o g c + 3 9 3 2 3 w i t hac o r r e l a t i o n c o e f f i c i e n to f0 9 9 0 8 t h es e l e c t i v i t ya n da c c u r a c yo ft h ep r o p o s e de i si m m u n o s e n s o r w e r ee v a l u a t e dw i t hs a t i s f a c t o r yr e s u l t s k e yw o r d s ：p o l y c y c l i ca r o m a t i ch y d r o c a r b o n s ；e l e c t r o c h e m i c a li m m u n o s e n o r ；g r a p h e n e ； n a n o a u ；i o n i cl i q u i d s x us h u a n g j i e ( e n v i r o n m e n t a ls c i e n c e ) s u p e r v i s e db yl i uj i a n s h e v i 构建新型电化学免疫传感器及其对多环芳烃的检测研究东华大学硕士学位论文 目录 摘要i a b s t r a c t i v 1 绪论1 1 1 电化学免疫传感器1 1 1 1 电化学免疫传感器原理1 1 。1 2 电化学免疫传感器分类2 1 1 3 电化学免疫传感器中免疫传感界面的构建方法6 1 1 4 电化学免疫传感器发展趋势8 1 2 石墨烯在电化学免疫传感器中的应用8 1 2 1 石墨烯概述8 1 2 2 石墨烯及其复合材料在电化学免疫传感器中的应用1 0 1 3 多环芳烃及其衍生物l1 1 3 1 多环芳烃及其衍生物概述1l 1 3 2 国内外多环芳烃及其衍生物的检测现状1 2 1 4 本论文研究内容和方法1 3 2 基于石墨烯一壳聚糖一纳米金修饰玻碳电极的电流型免疫传感器对卜芘丁酸的 检测研究1 4 2 1 引言14 2 2 实验部分15 2 3 结果与讨论1 8 2 3 1 金纳米粒子( n a n o a u ) 的形态表征1 8 2 3 2 石墨烯一壳聚糖复合膜的表征1 8 2 3 3 石墨烯一壳聚糖一纳米金修饰电极的电化学表征1 9 2 3 4 电极在修饰过程li 的电化学表征2 l 2 3 5 实验条件的优化2 2 2 3 6 免疫传感器对卜芘丁酸的d p v 检测一2 5 2 3 7 免疫传感器的特异性、稳定性和重现性2 7 2 3 8 实际样品测定2 8 2 4 本章小结2 9 构建新型电化学免疫传感器及其对多环芳烃的检测研究东华大学硕士学位论文 3 基于石墨烯一壳聚糖一离子液体修饰玻碳电极的电流型免疫传感器对l 一芘丁酸 的检测研究一3 0 3 1 引言3 0 3 2 实验部分3 l 3 3 结果与讨论3 3 3 3 1 石墨烯一壳聚糖一离子液体复合物的形态表征3 3 3 3 2 石墨烯一壳聚糖一离子液体复合物修饰电极的电化学表征3 4 3 3 3 电极在修饰过程中的电化学表征3 5 3 3 4 实验条件的优化3 7 3 3 5 免疫传感器对1 一芘丁酸的d p v 检测4 0 3 3 6 免疫传感器的特异性、稳定性和重现性4 0 3 3 7 实际样品测定4 1 3 4 本章小结4 2 4 基于纳米金石墨烯一离子液体一二茂铁修饰玻碳电极的阻抗性免疫传感器对葸 检测研究一4 3 4 。1 引言4 3 4 2 实验部分4 4 4 3 结果与讨论4 7 4 3 1 金纳米粒子( n o n a a u ) 的形态表征4 7 4 3 2 电极在修饰过程中的循环伏安特性4 7 4 3 3 电极在修饰过程中的界面行为4 8 4 3 4 实验条件的优化5 0 4 3 5 阻抗数据拟合电路的选择5 3 4 3 6 免疫传感器对葸的e i s 检测5 5 4 3 7 免疫传感器的稳定性和重现性5 7 4 3 8 实际样品测定5 7 4 4 本章小结5 8 5 结论5 9 参考文献6 0 攻读硕士期间论文发表情况一6 9 致谢7 0 构建新型电化学免疫传感器及其对多环芳烃的检测研究 东华大学硕士学位论文 1 绪论 免疫分析方法是一种将特异性免疫反应与现代检测手段相结合建立的超微 量测定技术，以抗原抗体之间高特异性的反应( 即免疫反应) 为基础，对化合物、 蛋白质或酶等进行定性和定量分析的方法l l 】。免疫分析法具有特异性强、灵敏度 高、检测快速、成本低、分析容量大、操作简单等优点，已被广泛地应用于临床 分析、毒物分析、药物分析、环境分析和食品分析中【2 。j 。 免疫传感器是一种新型生物传感器1 6 ，它将高选择性的免疫分析方法与高灵 敏性的传感技术相结合，不仅减少了分析时间、提高了灵敏度和测试精度，也使 得测定过程变得简单，易于实现自动化，有着广泛地应用前景。免疫传感器的检 测原理与免疫分析方法的检测原理相似，属于固相免疫分析法，既把抗体( 或抗 原) 固定在固相支持物表面，固定化的抗体( 或抗原) 识别与其对应的抗原( 或 抗体) 并形成稳定的复合体，不同点是免疫传感器能都对整个免疫反应过程的动 态变化进行实时监测，通过传感器将免疫反应产生的物理、化学、光学或电学上 的变化转变成可检测的信号来测定环境中待测分子的浓度f _ 川。根据换能器的不 同可以将免疫传感器分为：电化学免疫传感器、压电免疫传感器、光学免疫传感 器、场效应晶体管免疫传感器和热敏电阻免疫传感器等。 电化学免疫传感器是将电化学分析方法与免疫技术相结合而构建的一类生 物传感器，利用固定各种各样的抗原抗体到电极表面，通过固定化的分子识别 物质和分析物或标记物之问的免疫反应，把抗原抗体结合的信息转变为可检测的 屯化学信号。除具有生物传感器快速、灵敏、选择性高、操作简便等特点外，与 其他免疫传感器相比，电化学免疫传感器还具有仪器操作简便，控制敏感电极方 法灵活，易于实现集成化、微型化和在线检测的优势。因此，电化学免疫传感器 得到人们的广泛关注，在免疫传感器的研究中，有越来越重要的地位。 1 1 电化学免疫传感器 i i 1 电化学免疫传感器原理 电化学免疫传感器由分子识别元件和换能器组成，以抗原或抗体为分子识别 元件，通过电极式传感元件把免疫反应引起的化学物质浓度变化信号转变为相应 的电信号，原理图见1 1 。通常采用碳质电极( 石墨电极、玻碳电极、碳糊电极 等) 、铂电极、金电极及其他修饰电极作为基体电极。采用各种电分析技术，如 循环伏安法、脉冲伏安法、溶出伏安法、电化学交流阻抗谱等，大大提高了免疫 塑堡塑型电化学免瘦传感器及其对多环芳烽的检测研究 东华人学硕士学化论立 分析的灵敏度。 样 u 信号传输童喧广型 图i - i 电化学免疫传感器原理示意图 f i g 1 - is c h e m eo f t h ep r i n c i p l eo f e l e c t r o c h e m i c a li m m u n o s e n s o r 2 电化学免疫传感器分类 电化学免疫传感器根据是否需要标记物可分为直接电化学免疫传感器和间 接电化学免疫传感器。 直接电化学免疫传感器是指不使用任何标记物的传感器。其工作原理是：蛋 白质分子抗原或抗体携带大量的电荷，当两者发生免疫反应时，产生免疫复合物， 会发生若干电化学变化或电学变化，涉及参数包括电导率、介电常数、阻抗等， 检测这些参数中的一种的改变即可直接测得抗体与其相应抗原的识别免疫反应， 见图1 2 a 。 震+ 冀一朦丛 丫抗体苗冬抗原：爵麟标抗原 图i - 2 直接型和问接性电化学免疫传感器原理示意圈( 标记物以酶为倒) f i g i - 2s c h e m eo f t h ep r i n c i p l eo f t h ed i r e c ta n d i n d i r e c t e l e c t r o c h e m i c a l i m m u n o s e n s o r 间接电化学免疫传感器足指利用标记物将免疫反应的信号放人后间接地测 定抗原或抗体的浓度的传感器，见图l 一2 一b 。其中标记物一般为酶( h r p 酶、a t p 掏建新型电化学免疫传感器及其埘多环芳烃的检测研究东华人学硕士学位论立酶等) 、电活性物质( 石墨烯、碳纳米管、纳米会等) 、荧光物质( 量子点等) 、放射性同位素等。目前研究最成熟、应用最广泛的简洁点电化学免疫传感器足电化学酶联免疫传感 ： ( e l i s a ) ，它将抗体和抗原的特异性免疫反应和酶的高效催化作用相结合。整个电化学酶联免疫分析包括两部分：一是免疫反应学过程包括抗原、抗体、酶标记物之间的反应；是酶和底物反应过程，对酶催化反应的产物进行电化学定量分析。根据测定原理一般分为竞争法、间接法和双抗体夹心法。竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，待测抗原与酶标抗原共唰竞争固定的抗体，由于酶标抗原浓度已知待测抗原浓度越高，与抗体结合的酶标抗原就越少，因此，检测到的标记物信号人小与待测抗原的量成反比关系见图1 3 。电极间接法相抗原即可双抗体的测定，见卷匿兰立嘲喀；逸撼电极5图 构建新型i n 化学免j 盘转感器及其对多叫、芳烃的检测研究东华人学硕士学位论立 电化学免疫传感器根据测量信号的不j 刊可分为：电流型免疫传感器、电位 型免疫传感器、电容性免疫传感器和阻抗性免疫传感器等几种形式，下面重点介 绍电流型免疫传感器和阻抗性免疫传感器。 ( 1 ) 电流型免疫传感器 电流型免疫传感器是测定恒定电位下通过电极的电流信号来检测抗体或抗 原的免疫传感器，待测物通过氧化还原反应在传感电极上产生的电流与电极表面 的待测物浓度成正比。该类传感器有高度的敏感性，与浓度线性相关、重现性好， 非特异性影响性等优点，是日前应用最广泛、研究最成熟的电化学免疫传感器。 南于抗原，抗体生物分子本身不具各电活性，电流型免疫传感器一般需要标记的 抗原或抗体，标记物一般有屯活性物质和酶两种。常用的电活性标记物包括金属 离子、二茂铁、 f e ( c n ) e 1 4 ，。等，常用的标记酶有辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化 酶、碱性磷酸酶等i i t - 1 5 。 目前对标记型电流免疫传感器的研究较为广泛，但是其操作方法复杂、耗 时较长，近年来，随着电化学分析技术的提高和仪器设备的进步无试剂电流型 免疫传感器越来越引起人们的亲睐1 1 叫”。无试剂是指不需要标记生物分子，光需 添加标记物的反应底物直接待测抗原或抗体免疫反应前后引起的电信号变化进 行分析检测的方法，如可将电子媒介体琉堇、甲苯胺蓝、二茂铁等固定在电极表 面作为探测免疫反应的矩阵媒介。李贺等，利用水溶性石墨烯普鲁士蓝- 壳聚糖 纳米金复合物修饰电极，制备了一种无标记电流型免疫传感器用来检测 那霉 素。普鲁士蓝作为电子媒介，石墨烯增加导电性，纳米金用以固定抗体，其传感 器制备过程见图i - 6 【i s l 。本文也致力于简易的无标记电流型免疫传感器的研究。 n h ? 曼 图1 - 6 免疫传感器制备原理示意图 f i g 1 - 6s c h e m a t i cr e p r e s e n t i o no f t h ei m m u n o s e n s o r ( 2 ) 阻抗性免疫传感器 阻抗型免疫传感器的工作原理：抗体抗原间的结合降低了电活性探针分子l 刊 蜘建新型b 化学免瘦转感器及其对多“艿烯的捡洲研究尔华人学硕士学似论土 电极之f i j 的电子转移速率、从而增加了f 乜子转移叭抗，通过测挝免疫介前l 前后电 子转移阻抗之差，再由阻抗谱显不，来问接测量这种修饰物，此类检测方法也可 以实现高灵敏的检测。 杨萍等i 】以多环芳烃衍生物1 芘j 酸为研究对象，采刚不同的固定化技术 将多环芳烃抗体有敬固定在电极表而，构建灵敏和特异性的传感界而，研制r 基 于n a n o - a u n a f i o n 复合膜等i 种不同的阻抗性免疫传感器，见图1 7 。图i 7 中 a 为n y q u i s t 周和对应的等效电路图。n y q u i s t 由段半圆部分和段直线部分组 成，分别出现在高频区和低频区两种极限情况。半圆部分的反应受电子转移速率 控制，直线部分反应受扩散控制。依据r a n d l e 和e r s h l e r 理论将该反应的氧化还 原过程，模拟出如图a 中所不的等效电路，该等效回路包括一个溶液电阻r s ， 代表电解液电阻；一个w a r b u r g 阻抗z 。，代表离子从溶液到电极表面【刮j 7 散产 生的阻抗；一个烈电层电容c d l ，是电极电解质界面础电层的电容；以及一个电 子转移阻抗r e t ，代表氧化还原对的电子传递电阻。其中r s 和z 。分别由电解液 的性质和氧化还原探针在溶液i - 扩散的性质决定，不受电极表面电化学反应的影 响。c d l 和r e t 的大小则由电极，电解质界面介电性质和绝缘性质决定。r e t 控制 着氧化还原探针在电极表面电子转移速率。表面被修饰后，当电极这层修饰物会 促进或阻碍电子在屯极表面的传递，使得屯子转移阻抗发生变化( 减小或增加) 。 图b 即为标准曲线。 n z f n 构建新型i u 化学免班传感器及其对多耶芳烃的捡删研究 东华人学硕士学化论文 c = z y n 图1 7 拟合阻抗曲线( ) 和标准曲线( b ) f i g 1 7f i t t e d ( c a l c ) a n de x p e r i m e n t a l ( m s d ) n y q u i s tp l o t s o f i m p e d a n c es p e c t r a ( a ) a n di m p e d a n c es p e c t r ao f t h ep r o p o s e di m m u n o s e n s