（农产品加工及贮藏工程专业论文）双靶向阿尔茨海默病治疗药的分子设计及合成研究.pdf

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- t a r g e t - - d i r e c t e dl i g a n d sa s p o t e n t i a lt r e a t m e n tf o ra l z h e i m e r sd i s e a s e a b s t r a c t a l z h e i m e r sd i s e a s e ( a d )i sa ni r r e v e r s i b l en e u r o d e g e n e r a t i v ed i s e a s ew i t h t h ep a t h o l o g i c a lf e a t u r e sm a i n l yi nt h r e ea s p e c t s ：t h ee m e r g e n c eo fs e n i l ep l a q u e s i nt h ec e r e b r a lc o r t e xa n d h i p p o e a m p u s f o r m e db yt h ep - a m y l o i d ( a 1 3 ) ； n e u r o f i b r i l l a r yt a n g l e sf o r m e db yt a uh y p e r p h o s p h o r y i a t i o n ；n e u r o n a ld e g e n e r a t i o n a n df u n c t i o n a ll o s s a l t h o u g ht h ec o m p l e x i t yo ft h ec a u s e so fa dd e t e r m i n e st h e d i f f i c u l t y o fc u r i n gt h e d i s e a s e ，i t a l s or e m i n d st h ea dd r u g d e v e l o p m e n tt ot a k et h er o a do fm u l t i t a r g e t o nt h eb a s i so ft h ei d e ao fm u l t i t a r g e td r u gd e s i g n ，t h i sa r t i c l es e l e c t e dt w o k e yt a r g e t s a c e t y l c h o l i n e s t e r a s e ( a c h e ) a n da p ，n o to n l ye x p e c t e dt oa l l e v i a t e m e m o r yl o s so fa dp a t i e n t s ，b u ta l s ot o c o n t r o lt h es p e e do fd e g e n e r a t i o n p r o c e s s c o n s i d e r i n g t h a tt h ef o r m a lf d aa p p r o v e d d r u g s w e r e m o s t l y a c e t y l c h o l i n e s t e r a s ei n h i b i t o r s ( a c h e i ) ，a c h ew a sc h o s e na st h em a i nt a r g e t ，a p t h es e c o n d a r yo n e b a s e do nt h ea n a l y s i so fa c h e ia n da pi n h i b i t o r sp h a r m a c o p h o r e ，t h ea u t h o r d e s i g n e d9 8d u a l t a r g e t d i r e c t e d n e wc h e m i c a le n t i t i e sw h i c hm a t c h e dt h e p h a r m a c o p h o r em o d e l w i t ht h eh e l po fm o l e c u l a rd o c k i n gv i r t u a ls c r e e n i n g ，15 c o m p o u n d s w i t hag o o dp r e d i c t e d b i o l o g i c a la c t i v i t y w e r eo b t a i n e d a f t e r a n a l y z i n gt h ep o t e n t i a lo fb e i n gd r u g ss u c ha st h ep h y s i c a la n dc h e m i c a lp r o p e r t i e s ， t h ed i f f i c u l t yo fs y n t h e s i s ，b r a i n t a r g e t i n go ft h ec o m p o u n d s ，c o m p o u n d38a n d3 9 w e r eu l t i m a t e l yi d e n t i f i e da st h et a r g e tc o m p o u n d s t a r g e tc o m p o u n d sw e r es y n t h e s i z e da n dc h a r a c t e r i z e db y 1h n m r ，m s t h ea c t i v i t yo fc o m p o u n d si nv i t r ow e r em e a s u r e d ，a n dt h er e s u l t sw e r ea s f o l l o w s ：t h ei c 5 0v a l u e so fc o m p o u n d38a n d3 9w i t ha c h ew e r e215n ma n d2 9 7 n m ；c o m p o u n d 3 8i n h i b i t e da b o v e5 0 o fa d l 4 0 ，a i 3 1 4 2a tac o n c e n t r a t i o no fm o r e t h a n10 m ，w h i l ec o m p o u n d39h a dr e l a t i v e l yl o w e ra f f i n i t y t h ec a l c u l a t i o na n de x p e r i m e n tr e s u l t sc o i n c i d e db a s i c a l l yw h i c hs u g g e s t e d t h em e t h o do fd u a l - t a r g e t - d i r e c t e dd r u gd e s i g na n dv i r t u a ls c r e e n i n gb a s e do n p h a r m a c o p h o r ew a sf e a s i b l e c o m p o u n d3 8 a n d3 9 ，h o l d i n gh i g ha f f i n i t yw i t h a c h ea n da p ，w e r ee x p e c t e dt ob e c o m en o v e ld u a l t a r g e t d i r e c t e dt r e a t m e n tf o r a 1 z h e i m e r 。sd j s e a s e k e y w o r d s ：a l z h e i m e rd i s e a s e ；a c h e ；a p ；p h a r m a c o p h o r e ；m o l e c u l a rd o c k i n g 致谢 而逝，近三年的研究生求学生活即将结束，站在毕业的门槛上， 历过的所有酸甜苦辣都已成为美好的回忆，心中有着太多的不舍 多的是无尽的感激，因为在此期间，我得到了许多人的关怀与帮 论文完成之际，我谨向所有关心、帮助过我的人表示最诚挚的感 感谢我的导师潘见教授。近三年来，导师渊博扎实的专业知识， 认真严谨的治学态度，孜孜不倦的工作热情，精益求精的工作作风，诲人不倦 的高尚师德，豁达宽广的胸怀气度，幽默风趣的人格魅力，对我影响甚远，成 为我学习的楷模。虽仅历时三载，但导师以身作则，言传身教，令我终生受益 匪浅。我在求学阶段的每一点进步都离不开导师的教诲与指导，本论文的顺利 完成更是凝集了导师的大量心血。 感谢农产品生物化工教育部工程研究中心众位老师近三年来对我的鼓励和 关怀。感谢谢慧明教授、陈彦教授、袁传勋教授、甘昌胜教授、惠爱玲教授、 杨毅教授、张文成教授、曾庆梅教授、王莉老师、金日生老师在每周一次的学 术讨论会上对我的指导与帮助。感谢你们对我的研究提出了宝贵意见。 感谢实验室的袁媛师姐、吴泽宇师兄、杨俊杰师兄、周安师兄和王硕师弟、 邹英子师妹、周小健师弟、周琳师妹、苏娅师妹给予了积极的支持。感谢安徽 大学的王翠同学、王瑞君同学在实验中给予无私的帮助。感谢中国科技大学的 乔金平师兄、汪琛玮同学在实验中给予热心的帮助。 感谢在我的室友一直以来的理解与支持，关心与帮助。 感谢生物与食品工程学院学院2 0 0 8 级全体同学陪我一起走过这段人生难 忘的历程。 感谢初中高中大学阶段的老师们与同窗好友们对我一如既往的支持与关 岳 力乙。 感谢我的家人在生活和精神上一直给予我巨大的支持和鼓励。 最后感谢在百忙之中评审我硕士学位论文的各位专家和学者。 6 作者：苏慧 2 0 11 年3 月6 日 厂一 第一章绪论1 1 1 问题的提出：一1 1 2 课题来源1 1 3国内外研究现状2 1 3 1 a d 研究现状2 1 3 2双靶点药物研究现状3 1 3 3 天然药物与a d 治疗4 1 4 课题研究内容5 1 5 本章小结5 第二章分子设计及虚拟筛选6 2 1 化合物的分子设计一6 2 1 1 靶点分析6 2 1 2 药效团选择6 2 1 3 药效团整合9 2 ；1 4 类药性分析9 2 1 5候选药物初步设计结果1 0 2 2化合物与a c h e 的分子对接计算1 4 2 2 1 a c h e 蛋白的获得1 4 2 2 2 配体小分子的准备1 4 2 2 3分子对接方法的验证1 5 2 2 4 分子对接流程及参数设置1 5 2 2 5 结果与讨论1 6 2 3 化合物与a p 的分子对接计算2 0 2 3 1 a d 蛋白的获得2 0 2 3 2 配体小分子的准备2 0 2 3 3分子对接流程及参数设置2 l 2 3 4 结果与讨论2 1 2 4本章小结2 6 第三章典型化合物的合成与表征2 8 3 1 合成路线设计一2 8 3 2 化合物3 8 的合成与表征2 9 3 2 1 化合物3 8 的合成2 9 3 2 2 化合物3 8 的结构表征3 0 7 ：；1 ：i1 3 ：! ：；：； 3 4 3 4 3 4 与讨论3 6 3 8 3 8 4 2 2 a 1 3 1 4 0 阻聚活性测试结果与讨论4 0 4 3 a 3 1 4 2 阻聚活性测试4 3 4 3 1 a 1 3 l - 4 2 阻聚活性测试方法4 3 4 3 2 a 1 3 l - 4 2 阻聚活性测试结果与讨论4 4 4 4 本章小结4 7 第五章结论4 8 参考文献，4 9 8 图2 1 图2 2 图2 3 图2 4 图3 1 图3 2 图3 3 图3 - 4 图4 1 图4 2 图4 3 图4 4 图4 5 图4 6 插图清单 多奈哌齐的药效团模型7 多奈哌齐的结构7 化合物设计示意图1 4 对接空穴示意图1 6 化合物6 9 的合成路线图2 8 化合物3 8 和3 9 的合成路线图2 9 化合物3 8 的1 hn m r 谱图3l 化合物3 9 的1 hn m r 谱图3 3 a c h e 标准曲线3 6 化合物3 8 、3 9 、多奈哌齐与a c h e 结合方式比较3 8 a p l 4 0 标准曲线4 l 化合物3 8 、3 9 、多奈哌齐、硫磺素t 对a b l 4 0 的抑制率4 2 a p l - 4 2 标准曲线4 5 化合物3 8 、3 9 、多奈哌齐、硫磺素t 对a p l - 4 2 的抑制率4 6 9 表2 1待选药效团结构8 表2 2化合物1 1 6 0 的结构1 1 表2 3化合物6 1 9 8 的结构1 3 表2 4对接方法验证结果1 6 表2 5化合物与a c h e 的分子对接结果1 8 表2 - 6化合物与a 3 1 4 0 的对接结果一2 1 表2 7化合物与a 3 l - 4 2 的对接结果2 4 表4 1a c h e 抑制活性实验的试剂与药品3 4 表4 2a c h e 试剂盒标准品的o d 值( x 士s d ) 3 6 表4 3化合物3 8 、3 9 和多奈哌齐的a c h e 抑制实验结果( x ：t ：s d ) 3 6 表4 4不同浓度的化合物3 8 、3 9 和多奈哌齐对应的a c h e 浓度( x + s d ) ：；7 表4 表4 表4 表4 化合物3 8 、3 9 和多奈哌齐对a c h e 的抑制率( 一x + s d ) 3 7 a b l 4 0 抑制活性实验的试剂与药品3 9 a p l 4 0 试剂盒标准品的o d 值( 一x + s d ) 4 0 化合物3 8 、3 9 、多奈哌齐、硫磺素t 的a b l 4 0 抑制实验结果( x + s d ) 4 l 表4 - 9 不同浓度的化合物3 8 、3 9 、多奈哌齐和硫磺素t 对应的a 3 1 4 0 浓 度( x + s d ) 4 l 表4 1 0 化合物3 8 、3 9 、多奈哌齐、硫磺素t 对a p l 砌的抑制率( x + s d ) z i 二! 表4 1 1a p l - 4 2 抑制活性实验的试剂与药品4 3 表4 1 2a b l - 4 2 试剂盒标准品的o d 值( x + s d ) 4 4 表4 1 3化合物3 8 、3 9 、多奈哌齐、硫磺素t 的a s l 4 2 抑制实验结果( 一x 士s d ) 4 5 表4 1 4 不同浓度的化合物3 8 、3 9 、多奈哌齐和硫磺素t 对应的a p l 4 2 浓 度( x 士s d ) 4 6 表4 1 5化合物3 8 、3 9 、多奈哌齐、硫磺素t 对a 3 i - 4 2 的抑制率( x + s d ) 4 6 1 0 第一章绪论 1 1问题的提出 阿尔茨海默病( a l z h e i m e r sd i s e a s e ，a d ) 又称老年痴呆症，现已成为继心血 管疾病、恶性肿瘤、脑卒中之后老年人的第四大杀手。该病是一种原发性退行 性脑病，发生在老年期及老年前期，且随年龄增长而成倍增加，年过6 0 岁，患 病率为4 - - - 8 ，6 5 岁后增加到1 0 ，8 0 岁后会超过3 0 。中国老年人口已经 增至1 6 9 亿，现正以年均近1 0 0 0 万的增幅“跑步前进”，老年痴呆的患者数也 呈显著上升趋势。据国际老年痴呆病协会公布的数据显示，目前中国a d 患者 总数有6 0 0 多万，居世界首位，即全球a d 患者中大约1 4 在中国【l j 。 近年来治疗a d 的药物研究发展快速，全世界已经分别上市2 0 多种临床药 物，不同时期的临床研究药物近百种。a d 的主要临床症状是记忆力减退和认 知功能障碍，所以药物治疗的主要目标是改善认知和行为障碍，延缓病情的进 展。乙酰胆碱酯酶抑制剂( a c e t y l c h o l i n e s t e r a s ei n h i b i t o r ，a c h e i ) 因其疗效确切成 为最早获美国f d a 批准用于治疗轻至中度a d 的一类药物。迄今得到美国f d a 认可并已在多国上市的a c h e i 类药物包括他克林( t a c r i n e ，c o g n e x ) 、多奈哌齐 ( d o n e p e z i l ，a r i c e p t ) 、利伐斯替明( r i v a s t i g m i n e ，e x e l o n ) 和加兰他敏 ( g a l a n t h a m i e ，r e m i n y l ) 等。他克林是第一个被美国f d a 批准上市的能减轻a d 症状的a c h e i 类型药物，但它对肝脏有极大的损害。多奈哌齐是目前最常用的 药物，其具有高度选择性，不良反应轻微、短暂，未发现有肝脏毒性，一般患 者对该药有良好的耐受性。但多奈哌齐对不足半数的早老性痴呆症患者有帮助， 而且治疗有效期仅几个月，最长不超过2 年1 2 j 。 a c h e i 能改善记忆衰退症状，使乙酰胆碱( a c e t y l c h o l i n e ，a c h ) 在突触维持 一定水平，但不能逆转减缓a d 的基本病理过程，因而临床使用表现出明显的 局限性。例如：其对轻度到中度a d 患者有效，对晚期患者没有疗效或者是疗 效甚微：长期临床疗效并不理想，且有研究表明5 5 患者因不能耐受其副作用 而不能长期用药；只能促进和增强未受损的或者受损不太严重的神经元的功能， 不能减轻神经细胞的退化。 尽管关于a d 的病因、病理、分子生物学的基础研究以及新药的研发均很 活跃，但从根本上治疗a d 至今仍无良策。 考虑到a d 病理的复杂性，单靶点药物的局限性，众多研究者不得不走双 靶点乃至多靶点药物开发之路。 1 2课题来源 本课题是中国科技大学、解放军总医院、合肥工业大学和合肥拓峰生物工 程有限公司a d 治疗新药联合开发的前期研究工作之一部分。 马出现老年斑( s e n i l e p l a q u e s ，s p ) ，其由p - 淀粉样蛋白( 1 b - a m y l o i dp r o t e i n ，a 1 3 ) 聚集形成；t a u 蛋白过度 磷酸化形成神经纤维缠结( n e u r o f i b r i l l a r yt a n g l e s ，n f t ) ；神经细胞功能退化及缺 失。 a d 的治疗靶点包括：乙酰胆碱酯酶( a c e t y l c h o l i n e s t e r a s e ，a c h e ) ：a p ； t a u 蛋白：离子通道等。目前，人们尚不清楚a d 的确切发病机理，但研究 人员根据a d 与各种可能的发病因素之间的关系，对a d 的病理机制研究已取 得了一定进展，并提出了多种学说，包括a t 3 沉积学说、t a u 蛋白过度磷酸化学 说、基因学说、炎症反应学说、胆碱能损害学说、神经细胞凋亡学说等【3 】。本 文介绍两种主流学说：a p 沉积学说和胆碱能损害学说。 ( 1 ) a d 沉积学说 随着对a d 病理生理学机制探讨的日益深入，现代研究普遍认为，a d 患 者脑中a b 的异常增加与沉积是启动神经元退行性病变的核心事件 4 1 。1 9 9 2 年， h a r d y 等人提出了a p 的级联假说”1 ，认为脑内异常增多的a b 和其他危险因素 共同作用，启动了a d 的发病过程，并在其发生、发展中起关键作用。 a p 在a d 的发生、发展中起主导作用是因为它不仅自身具有相当的毒性， 并且a d 病程中的其他因素也通常与a p 蛋白的产生和清除之间的不平衡有关。 a p 的神经毒性涉及到复杂的分子机制主要包括破坏细胞内的c a 2 + 稳态，促进 自由基的形成，降低k + 通道的功能，增强致炎细胞因子引起的炎症反应等f 6 1 。 a d 是由其前体蛋白( p - a m y l o i dp r e c u r s o rp r o t e i n ，a p p ) 酶切产生的，一 般含3 9 - - - 4 2 个氨基酸，其中与a d 关联最大的是a p l 4 0 和a p l _ 4 2 。在脑内存在 的a p 具有多种形态和分子结构，且不同形态和分子结构的a p 神经毒性有明显 差异。不溶性a p 纤维对神经元具有毒性，a p 寡聚体的毒性则比a p 纤维的毒 性还大得多，可以快速引起大量的神经细胞死亡【7 】。 以a p 为靶点的阻止老年斑形成的药物可在多个途径起作用：减少a d 前体蛋白a p p 的合成以减少a s 生成；调节脑组织内a 、p 、7 分泌酶的活性 以减少a b 生成。d 分泌酶调节剂m y r i a dg e n e t i c s 、f 1 u r i z a n t a r o n f l u r b i l 已经进 入i i i 期临床研究。拮抗a s 参与的炎症反应以降低a p 毒性、保护神经元； 抑制a p 聚集和形成纤丝以阻止老年斑的形成；增加a p 降解或清除。 在这些途径中，最关键的两个环节是减少过量的a p 聚集以及增加a b 的清 除，可归纳为a b 的“阻聚 和“解聚”。本文主要研究a p 的阻聚，以a d 单 体为研究对象。 ( 2 ) 胆碱能损害学说 2 、记忆及认知活动密切相关，基底前脑胆碱 的通路是学习记忆功能的重要结构基础。研 著减退是a d 早期出现的主要病理变化，并 且持续整个病程。 a c h e 是a c h 的水解酶，a c h e i 可通过抑制a c h e 的活力使突触间隙a c h 的作用时间延长，增强了中枢胆碱能系统的功能，限制了a d 患者的认知功能 下降速度瞪】。因此，a c h e i 在a d 的治疗方面发挥了重要的作用，已广泛应用 于临床中。 在a d 的发病机制及治疗对策中，a s 和a c h e 都有重要的作用，并且两者 之间存在一定联系。首先a c h e 除水解a c h 外还有其他非经典功能，其中包括 了促进a p 沉积例。研究显示，a c h e 促进a p 的聚集有三个因素：离子作用、 疏水作用及结构构象的影响【lo 】，而该作用主要与a c h e 外周阴离子位点有关。 用抗a c h e 外周阴离子位点的单抗【1 1 】和外周阴离子位点的抑制剂【1 2 1 可以阻止 a c h e 对a p 聚集的促进作用。其次在老年斑中及其周围a c h e 的升高是a b 毒 性作用于细胞表达的结果【1 3 】。 i 3 2双靶点药物研究现状 多靶点药物有利于提高药物疗效，降低副作用【1 4 】，减少剂量，提高药物制 剂的生物利用度，弥补了单靶点药物的缺陷。针对a d 发病的复杂性，多靶点 治疗a d 的方案也逐渐被认可。 第一种多靶点药物设计思路主要着眼于充分挖掘a c h e 的非经典功能。 a c h e 水解a c h 以外的功能被称为非经典功能，包括促进a 1 3 沉淀、激活多巴 胺神经元、参与突触形成、促进轴突生长、参与细胞相互作用、参与红细胞的 成熟【1 5 1 ，这些非经典功能均与a c h e 的外周位点作用相关。对a c h e i 的药效团 模型研究发现，仅作用于中心活性位点或仅作用于外周位点的化合物活性远低 于与两个部位同时结合的化合物【l6 。，并且当化合物同时与a c h e 的中心活性位 点和外周位点作用时，不仅显著提高了与a c h e 的亲和力，增加了对a c h e 的 选择性，还可以干扰a b 聚合、a p p 的加工。 自从1 9 9 6 年p a n g 1 7 j 等成功设计出高活性双作用点分子b i s ( 7 ) t a e r i n e 以来，他克林一直是研究者们热衷的设计对象。而目前基于他克林的二联体或 杂合体主要设计思想即为通过与a c h e 的中心活性位点和外周位点同时结合提 高抑制a c h e 的活性和选择性，并且开发药物的多靶点作用。m a r t i n e z 等设计 合成了他克林吲哚系列杂化体，其中最优化合物对a c h e 的抑制活性达到了 p m 级【l 引。s h a o 等将多奈哌齐与他克林组合成异二联体，在活性比他克林高出 3 7 倍，在选择性上比他克林高出31 倍【”】。c a r l i e r 等将石杉碱甲a 与他克林连 接，结果发现新化合物对a c h e 的抑制活性分别是石杉碱甲a 和他克林的1 3 。m e l c h i o r r e 小组利用多胺骨架设计了 不仅有较高的a c h e 抑制活性而且是目 2 1 1 o 另一种多靶点设计思路在于将a c h e i 与其他生物活性分子相结合，使其具 有多种功效，以达到更好的治疗a d 的目的。r o d r i g u e z f r a n e o 2 2 】等通过将褪黑 激素与他克林连接，得到的分子不仅具有a c h e 抑制活性，而且有褪黑激素的抗 氧化特性，从而能双重作用治疗a d 。a b 和a c h e 分别针对a d 的成因和表现， 因此，我们有理由相信若能对a c h e 和a b 同时起作用，则有可能达到标本兼 治的效果。 1 3 3天然药物与a d 治疗 以天然化合物为先导，通过结构修饰发现高效低毒的新化学实体是新药研 发的重要途径之一。我国在a d 治疗的天然药物开发中也取得长足进步，例如 银杏内酯、石杉碱甲、姜黄素、川芎嗪等。 石杉碱甲( h u pa ) 是我国科学家首先从石杉科植物千层塔中提取的一种新 生物碱，是一种可逆性a c h e i 2 3 。由于它的治疗指数高且作用时间长，在国际 上已被列为第二代a c h e i 之一。与f d a 批准的其他a c h e i 相比，石杉碱甲化 学结构较独特，具有极高的选择性抑制脑内a c h e 和增强脑内胆碱能神经元的 功能，此外还有易透过血脑屏障、作用时间长、口服生物利用度高以及不良反 应少等多种优点，疗效优于多奈哌齐、加兰他敏【2 4 1 。石杉碱甲具有多靶点作用， 除具有抑制a c h e 活性外【2 孓2 引，还能通过抗氧化应激和抗细胞凋亡途径保护神 经元，对多种实验性记忆损害均有改善作用 2 7 1 。不仅如此，从蛇足石杉中分离 出的其结构类似物也同样有a c h e 抑制作用。h u p a 还能够保护神经元细胞对 抗a b 产生的毒性，抑制神经细胞凋亡1 2 8 】。 近年来的研究显示，从天然药物姜黄中分离纯化出的活性成分姜黄素在体 外和体内 2 9 】都具有抗a p 的特性，能够抑制a p 的聚集和生成，有望开发成治 疗a d 的新型药物。查耳酮具有和姜黄素相似的结构单元，和a b 有很好的结 合力且脑穿透力很强【3 0 1 。芪类化合物和苯并呋喃衍生物具有适当的脂溶性，与 a p 有很好的结合力1 3 。银杏叶提取物能明显抑制a p i - 4 2 中p 折叠的形成，并使 a d l - 4 2 侧链基团发生化学修饰，从而对a p 聚集和纤维生成有很强的抑制作用 【3 2 】。黄酮类化合物【3 3 】、杨梅黄酮、槲皮素、桑黄素、儿茶素、表儿茶素等通过 选择性地结合a p 纤维发挥抑制a p 聚集的作用m 】。 研究发现，小檗碱在无细胞毒性的正常剂量范围内，能调节人神经胶质瘤 细胞中a p p 的形成，减少a d 的产生【3 5 1 ，还可作为a c h e i ，有望成为治疗a d 的药物1 3 6 】。三七总皂苷能减轻细胞对a p 的毒性反应并促进细胞突起生长【3 7 1 ， 还可提高海马内a c h 、去甲肾上腺素、多巴胺、5 羟色胺含量【3 引，改善痴呆模 4 型大鼠的学习记忆能力。栀子苷元能有效抑制a p 的神经毒性【3 9 1 。红景天能够 减少超氧化物歧化酶氧化蛋白的含量，抑制a p p 转基因小鼠血清及大脑的氧化 应激反应水平，对抗a 1 3 的神经毒性【4 0 1 。 深入解析这些天然药物药效团，对开发a d 治疗药物颇有裨益。 1 4 课题研究内容 本研究拟采用多靶点药物设计思路，着眼于a d 的两大靶点a c h e 与 a d ，尝试开发既能缓解a d 患者记忆力减退症状，又能控制其病程发展的新药。 本研究主要内容包括： ( 1 ) 在药效团解析的基础上，设计双靶点新化学实体，利用分子对接方法预 测化合物和靶点蛋白的结合能力，筛选出有潜力的候选药物； ( 2 ) 选择有代表性的化合物合成及表征； ( 3 ) 通过体外活性测试，验证新药分子设计的合理性。 1 s 本章小结 a d 是退行性中枢神经系统变性病。全国a d 患者数超过6 0 0 万。a d 以渐 进性记忆障碍、认知功能障碍、人格改变以及语言障碍等神经精神症状为特征。 现有临床一线药物大多为a c h e i 。a c h e i 能改善a d 患者的认知和行为障 碍，延缓病情的进展，对于轻度到中度的a d 病人有良好疗效，但不能逆转a d 的病理过程，对a d 晚期病人疗效不佳，且不适合长期用药。 a p 沉积、胆碱能损害、t a u 蛋白过度磷酸化是a d 病理机制的主流学说。 新的a d 药物设计应走多靶点治疗之路。 本研究拟以a c h e 和a p 为靶点，借助计算化学方法，以临床效果确切的 合成和天然药物药效团为主要基元，设计双靶点新化学实体。同步抑制a c h e 活性和阻止a p 聚集，从而缓解a d 患者记忆力减退并控制a d 病程。 2 1 1靶点分析 1 9 9 1 年，以色列科学家s u s s m n a 等用单晶x 一光衍射法测定了加州电鳐 a c h e 的三维结构，证实a c h e 是一个含5 3 7 个氨基酸的蛋白，存在两个活性 部位，通向酶活性中心的是一个细长、下端扩展的通道，其中5 0 的腔壁由1 4 个含芳香环氨基酸组成，因此称为“芳香峡谷”。谷底部有活性中心，由g l u 3 2 7 、 h i s 4 4 0 和s e r 2 0 0 构成的催化三联体负责底物a c h 的水解，阴离子亚位点识别 底物的四价季铵基团。在通道的外周边缘，还存在外周结合部位，主要是 t r p 2 7 9 4 1 1 。 对a c h e i 的药效团模型【l 6 j 研究发现，仅作用于催化部位( 如他克林，i c 5 0 = 3 3 3n m ) 和外周部位( 如石杉碘甲，i c 5 0 = 2 6 0n m ) 的化合物活性远低于与两个部 位同时结合的化合物( 如多奈哌齐，i c 5 0 = 2 2n m ) 。为了提高化合物与a c h e 的结合能力，希望化合物同时与a c h e 的中心位点及外周活性位点作用，故设 计的双靶向化合物应同时具有与a c h e 中心位点结合的药效团以及与外周位点 结合的药效团。 a p 是a d 病理特征中老年斑的主要成分，该肽一般由3 9 - - 一4 3 个氨基酸组 成，其中主要是含4 0 个氨基酸的a p l 4 0 和含4 2 个氨基酸的a 1 3 1 4 2 。a p 的神经 毒性与a p 的分子构型关系密切，其中a p 寡聚体的神经毒性最大，其次是不溶 性的a d 纤维【4 2 1 。h i ) 自身具有高度聚集性，易从单体聚集成寡聚体，再形成不 溶性纤维，直至沉积在脑中形成老年斑。因此，h i ) 由可溶状态到不溶状态的转 变是a d 发病机制中的关键环节，在此聚集过程中，a p 的二级结构发生很大变 化，一部分a 一螺旋和不规则卷曲转变成更易叠加的p 折叠【4 3 1 。但a p l - 4 0 和a p l 4 2 这两种单体的聚集性质有所不同，由a p ! - 4 0 a p l - 4 2 混合物的聚集实验表明， a p l 4 2 更像是聚集的“种子”，而a 1 3 1 4 0 则是聚集的“砖块”i 州。 a p 两种单体a 1 3 1 4 0 和a p l 4 2 对于a p 的聚集都有贡献，两者在结构上仅相 差两个氨基酸，故阻聚a 1 3 1 4 0 和a p l 4 2 的药效团结构差别不大，在本研究中统 称a d 阻聚剂药效团。 由于a p 单体结构较为简单，分子量也较小，并无多个活性位点，故双靶 向化合物应包含能与a d 结合良好的药效团。 2 1 2药效团选择 本研究在药效团选择时充分考虑了已有化药和天然药物包含的药效团，从 中选择满足双靶向候选药物要求的药效团，再整合成新化学实体。 ( 1 )已有化药的药效团 6 c h e i ，而a d 阻聚剂尚未在临床使用，故从 多奈哌齐自身就是一个双作用点a c h e i ，能 点同时结合，其与a c h e 的作用模式对新化 合物的药效团选择有参考性。 为进一步明确多奈哌齐的药效团，作者运用药效团模型构建软件 l i g a n d s c o u t ，以多奈哌齐a c h e 复合晶体结构( p d bi d ：1 e v e ) 为对象， 分析了多奈哌齐与a c h e 氨基酸残基作用的药效团模型。 ，： ； 酾i 反j ：- 一 i l e 4 4 4 a 、 一一 米一一一 柴一一一 f 鸦_ _ - 一 黪一一 ( a ) 多奈哌齐药效团 ( b ) l i g a n d s e o u n t 图例( c ) 药效团作用方式 图2 - 1多奈哌齐的药效团模型 f i g 2 - 1d o n e p e z i l sp h a r m a c o p h o r em o d e l 由图2 一l 可知多奈哌齐上的苯环主要与t r p8 4 、l i e4 4 4 等芳香性氨基酸残 基形成7 【呱堆积作用，与p h e3 3 0 、t y r3 3 4 形成疏水作用。而质子化的氮原子 p h e3 3 0 、t r p8 4 、t y r3 3 4 形成阳离子兀作用。该模型中，苯环和氮原子这两个 药效团对配体分子和受体蛋白的结合起到关键作用。 多