（环境科学专业论文）污水处理过程中短程硝化的微生物生态调控技术研究.pdf

一 河北科技大学硕士学位论文 = = = = j i | l = t = = 目- _ _ 目= 目= = = = ；= = = ；目自z 自= = = = = = = = i 目日；= _ 自= = 目= 菌的生长，影响到污水的处理效果。在短程硝化过程中发挥作用的氨氧化菌虽然已 经被我们所认知，但是它在工艺中的作用机理我们还有待深入研究。 关键词 短程硝化；活性污泥；p l f a s ：1 6 sr d n a 克隆文库；细菌群落：a o b a b s t r a c t - _ - _ _ l _ _ l i - _ _ _ _ _ - _ i _ _ l _ - - _ _ - _ _ l _ l _ | = - l l - - l _ _ l _ i i - l _ _ l l _ _ _ l _ _ _ - _ _ _ l - - l _ a b s t r a c t w i t ht h ed e v e l o p m e n to fm o l e c u l a rb i o t e c h n o l o g y ，i ti sag r e a tp r o g r e s si nt h e r e s e a r c ho fn i t r o g e np o l l u t i o np r e v e n t i o na n dn i t r o g e nb i o g e o c h e m i c a lc y c l e t h er e m o v a l o fa m m o n i an i t r o g e ni nt h ea r t i f i c i a lw a s t e w a t e rt r e a t m e n ts y s t e mi ss t i l lt h ec o n c e r n e db y t h er e s e a r c h e r s c h e m o a u t o t r o p h i ca m m o n i ao x i d a t i o nb a c t e r i aa r er e s p o n s i b l ef o rt h e r e m o v a lo fa m m o n i an i t r o g e n w h i c ht u r n st h ea m m o n i an i t r o g e nt ot h en i t r i t e 吼s p r o c e s si s t h ei m p o r t a n tl i m i t i n gs t e pi nt h en i t r a t i o nr e a c t i o n o u rr e s e a r c hu s e sm a n y m o l e c u l a rb i o l o g i c a lm e t h o d s ，i n c l u d i n gp o l y m e r a s ec h a i nr e a c i o n ，t h ec o n s t r u c t i o no f m o l e c u l a rc l o n i n gl i b r a r y ，t h es e q u e n c eh o m o l o g ya n a l y s i so f16 s r d n a ，a n dp l f a s ，e t c ， t od ot h er e s e a r c ho ft h eb a c t e r i a ld i v e r s i t yo fa c t i v es l u d g ei np a r t i a ln i t r i f i c a t i o n w i t h c h a n g e so ft h er e l a t e dw a s t e w a t e rp a r a m e t e r s ，w e c a ni n f e ro p e r a t i o nc o n d i t i o n a n d t r e a t m e n te f f e c ti nt h i sp r o c e s s i nd i f f e r e n tp a r t i an i t r i f i c a t i o np r o c e s si nt h em i c r o b i a lc o m m u n i t yh a ds i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s ，a l lk i n d so fm i c r o b eg r o u p so fc o n t e n ta n ds p e c i e sa r en o tt h es a m e t h r o u g h t h ea n a l y s i so fp h o s p h o l i p i d sf a t t ya c i d sm a p ，t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ，b a c t e r i aa r e d o m i n a n ti nt h i sp r o c e s s ，a n da e r o b i cm i c r o o r g a n i s m sa r et h ed o m i n a n tb a c t e r i ai n c o m m u n i t i e s ，b u tt h em i c r o b i a lc o m m u n i t ys y s t e mw i t ht h ed i f f e r e n to p e r a t i o nc o n d i t i o n s c h a n g e da n dt h em i c r o b i a lc o m m u n i t ys y s t e mi ns p a c e s t r u c t u r ea r ed i f f e r e n t a tt h es a m e t i m e ，r e g a r d l e s so fs i z ea n dp r o p o r t i o no ff u n g i ，a e r o b i cb a c t e r i aa n df u n g ia l w a y se x i s t s i m u l t a n e o u s l y w h e n a i rt ow a t e rr a t i o ni s r e l a t i v e l y s m a l lo ri n f l u e n to r g a n i c c o n c e n t r a t i o ni sr e l a t i v e l yh i g h ，s r ba n do t h e ra n a e r o b i cb a c t e r i aw i l la p p e a r t h e s eh a v e s h o w nc o n s i s t e n tw i t ht h em e c h a n i s mo fa e r o b i cn i t r i f i c a t i o nl a w i no u rr e s e a r c h ，t h e16 sr d n ag e n ef r a g m e n to fb a c t e r i u mc l o n i n gl i b r a r yi sb y s e q u e n c eh o m o l o g ya n a l y s i s i ti se s t i m a t e dt h a tt h e r ea r ea tl e a s t2 6o t u s a f t e rt y p i n gb y r e s t r i c t i o ne n d o n u c l e a s e c l e a v i n g t h e b a c t e r i a lc o m m u n i t i e sa r ea sf o l l o w s ： p r o t e o b a c t e r i a ，c h l o r o b i ，n i t r o s p i r a ，b a c t e r o i d e t e s ，a c i d o b a c t e r i a , c a n d i d a t e d i v i s i o n t m 7 ，c h l o r o f l e x i ，p l a n c t o m y c e t e sa n df i r m i c u t e s c o m p a r e dw i t h op r o c e s s ，l o wd o p r o c e s sh a so b v i o u sd i f f e r e n c e ，t h e r ea r eg r e a tc h a n g e si ns t r u c t u r eo fb a c t e r i a c o m m u n i t i e s b u tt h em a i nc o m m u n i t yh a sn o tc h a n g e d t h el a r g e s tf r a c t i o nw a s b e t a p r o t e o b a c t e r i ai n p a r t i a ln i t r i f i c a t i o np r o c e s s a n a l y s i sb yc l o n i n gab a s ed e r i v e d f r o mt w od i f f e r e n tp a r t i a ln i t r i f i c a t i o np r o c e s ss h o w e das i m i l a r i t yw i t hc h l o r o f l e x i ， b a c t e r o i d e t e sa n dc h l o r o b i ，r e s p e c t i v e l y n i t r o s p i r a eb a c t e r i u mw e r ea l s of o u n d ，w h i c h i i l 河北科技大学硕士学位论文 h a v ep l a y e di m p o r t a n tr o l e si no x i d a t i o no fa m m o n i aa n dn i t r i t ei nt h es y s t e m n i t r o s p i r a e b a c t e r i u ma c c o u n t e df o r8 2 i na op r o c e s sa n dl i t t l ea m o u n ti nl o wd op r o c e s s b e c a u s eo fi tg r o w si ns l o wd i s s o l v e do x y g e ni nl o wd op r o c e s sa n dl e s sn o b i nt h i s p r o c e s s s oi t w a sp r e s u m e dt h a tt h ep r o c e s so fl o wd ow a sm o r es u i t a b l et on i t r i t e a c c u m u l a t i o na n dt op a r t i a ln i t r i f i c a t i o np r o c e s s t h ea b u n d a n c eo fp l a n c t o m y c e t e s ，w i t h t h ea b i l i t ) o fa n a e r o b i co x i d a t i o no fa m m o n i a ，w a sh i g h e ri nt h ep r o c e s so fl o wd o ( 9 3 ) t h a nt h a ti nt h ep r o c e s so fa o ( 2 4 ) t h e r e f o r e ，i tw a sp r e s u m e dt h a tt h ep r o c e s so fl o w d ow a sm o r es u i t a b l et ot h ea n a e r o b i co x i d a t i o no fa m m o n i aa n dt op e r f o r mp a r t i a l n i t r i f i c a t i o n f i n a l l y , t h i sp a p e ra n a l y e sl o wd op a r t i a ln i t r i f i c a t i o ns y s t e mo fa m m o n i u m o x i d a t i o na m o ag e n es e g m e n t so ft h eb a c t e r i a w ef i n do u tm o s to ft h ea o bw h i c hi s s e q u e n c e db e l o n gt ot h en i t r o s o m o n a ss p o fb e t a p r o t e o b a c t e r i a t h eb a c t e r i am a ye x i s t h a l o p h i l u sc l u s t e ro fn i l r o s o c o c c u ss p w h i c hb e l o n g st og a m m a p r o t e o b a c t e r i a t h e s a m p l eh a sh i g hh o m o l o g yw i t hn i t r o s o p i r aa n dn i t r o s o c o c c u s c h a n g e so fd i f f e r e n tp r o c e s s i n gc o n d i t i o n s ，a r ed i r e c t l ya f f e c t e dp o p u l a t i o n si n a c t i v a t e ds l u d g e ，c o m m u n i t ys t r u c t u r ea n d a c t i v i t y , t h u sa f f e c t i n gt h en i t r i f i c a t i o np r o c e s s a m m o n i ao x i d i z i n gb a c t e r i ap l a yar o l ei nt h eg r o w t h ，i m p a c to ns e w a g et r e a t m e n te f f e c t a l t h o u g hw ea l r e a d yk n o wt h ea m m o n i ao x i d i z i n gb a c t e r i aw h i c hp l a yar o l ei ns h o r t c u t n i t r i f i c a t i o np r o c e s s ，t h er e s u l t sw i l lb et h eb a s eo ft h ef u r t h e rr e s e a r c hi n p r o c e s s m e c h a n i s mi nt h ef u t u e r k e yw o r d sp a r t i a ln i t r i f i c a t i o n ；a c t i v es l u d g e ；p l f a s ；16 sr d n ac l o n el i b r a r y ；b a c t e r i a l c o m m u n i t y ；a o b i v 第1 章绪论 第1 章绪论 1 1 研究背景 自然界中的氮元素以有机态氮和无机态氮的形式存在。动植物蛋白、有机化合 物中的有机态氮和硝酸根、亚硝酸根等无机物中的无机态氮在生物作用下，不断发 生物质转化，构成氮元素的生物地球化学循环。自工业革命以来，人类改造自然的 能力越来越强，但是大量不合理的人类活动同时对自然环境构成了严重的干扰。尤 其是大量含氮废水废渣废气的排放，严重影响了自然界的氮素循环。含氮废水来源 很多，如生活污水，农业灌溉废水，食品加工业废水，制肥厂、冶金废水，炼油厂 的某些废水及制药废水等都是主要的氮污染源【l 】。氨态氮和硝态氮是主要的氮素污染 物质。 氮磷元素超标是水体富营养化的主要污染因子【2 】。水体富营养化具有巨大的负面 影响，例如：藻类大量繁殖导致水体缺氧，微生物进行厌氧呼吸导致水体发臭：藻 类繁殖导致水体混浊，水体透明度下降，干扰了下层水生生物的繁殖代谢，释放有 毒有害物质，破坏了水生生态平衡：提高了饮用水的处理成本，对饮用水安全造成 潜在危害，对人类健康具有潜在威胁。水体富营养化对工农业生产同样具有危害， 大量的氮磷进入水体使水体铵态氮含量大大超标，而n h 3 和n h 4 + 对水生生物特别是 鱼类具有毒害作用。文献报道l p p m 的n h 3 即可对水体中大部分鱼类形成显著毒害【3 1 。 我国水环境中氮、磷污染十分严重，根据国家环保总局公布的“2 0 0 3 年中国环 境状况”1 4 j ，我国七大水系4 0 7 个重点监测断面中，有3 8 1 的断面满足地面水环 境质量标准的i i i i 类水质要求，3 2 2 的断面属、v 类水质，2 9 7 的断面属 劣v 类水质1 4 】。其中主要呈现为有机污染，主要的污染指标是石油类、氨氮、高锰酸 盐指数、生化需氧量和挥发酚等。我国的湖泊和大型水库也普遍的受到了氮、磷的 污染。根掘披露的权威统计结果，近年来我国的水体污染态势依旧严峻，污染状况 逐年加大。在对全国七大水系4 11 个监测点的数据进行统计分析表明：i u i 类水 体的断面占4 1 ，i v v 类占3 2 ，劣v 类水体占2 7 。其中，珠江和长江的水 质情况最好，其次是辽河、淮河、松花江和黄河，海河最差。在全国重点监控的湖 泊中，i i i i 类水质占2 8 ：水质1 1 ；v 类水质1 8 ；劣v 类水质的比例高达 4 3 。其中太湖、滇池和巢湖等几大湖泊的污染态势极为严重，水质均为劣v 类水体。 其中，七大水系的主要污染物是氨氮和k m n 0 4 指数等，湖泊和库塘的主要污染物是 总氮和总磷1 5 】。由此可见，污染水体的主要污染物仍为氮磷等物质。 氨氮进入天然水体后，在微生物和化学物质的复合作用下，与氧气反应形成亚 硝酸根和硝酸根。在这一反应过程中，需要消耗大量的氧气，导致水体的溶解氧浓 1 河北科技大学硕士学位论文 度大大降低。研究表明：l m g 的氨氮在自然条件下氧化，大约需要消耗4 6 r a g 的溶 解氧，在对二级污水处理的出水水体分析表明，氨氮需氧量在总需氧量中的比例超 过7 0 p j 。如果二级处理出水排放入自然水体，大量的氨氮氧化，需要消耗大量的溶 解氧，这会造成水体质量显著下降，严重破坏水生生态系统的平衡。 进入自然水体的氨氮被氧化为硝酸根和亚硝酸根，对人类健康具有潜在威胁。 研究表明：亚硝酸盐是一种对人类健康有害的物质，具有致畸致癌效应。亚硝酸根 可以引起高铁血红蛋白症，又称蓝婴症，可以导致婴儿窒息死亡。亚硝酸根还可以 通过一系列复杂的化学反应转化为亚硝胺。而亚硝胺同样具有致畸、致癌、致突变 的作用，危害人体健康 6 j 。而且相关的医学研究表明，大量的硝酸盐摄入会诱发胃癌。 环境污染的态势愈演愈烈，这促使越来越多的国家和地区制定更加严格的环境 保护措施，特别是对污水排放和市政污水处理厂的出水排放方面制定了详细的法律 法规。例如，我国早在1 9 9 6 年就制定了污水综合排放标准( g b 8 9 7 8 1 9 9 6 ) 1 7 1 。这 一标准规定了更加严格的氨氮一级排放不允许高于1 5 m g l ，也就是说，今后大多数 的市政污水和工业废水处理设施都必需重点考虑氨氮的处理。 1 2 研究现状 人们普遍认为：污水的脱氮工艺必须经历典型的硝化反硝化过程，使得n h 4 + 被 去除掉，只有这样才能保证污水中的氨氮的高效去除。这种工艺可以称之为全程( 或 完全) 硝化反硝化生物脱氮。然而，微生物在氨氧化过程的反应中，具有不同的功能。 根据功能的不同，可以分为两类细菌：硝化细菌和反硝化细菌。其中从氨转化成为 亚硝酸盐的过程是硝化过程的速度控制步骤，而对于反硝化菌而言，n 0 2 。、n 0 3 均 可以为最终受氢体。短程硝化反硝化是将传统的硝化反应控制在亚硝化的阶段，然 后进行反硝化。与传统的工艺相比，短程硝化反硝化的需氧量减少了2 5 ，碳源的需 求量减少了4 0 ，污泥的产量减少t 3 0 0 i s j 。在减少能耗。降低脱氮的成本( 尤其在 处理污泥消化液、垃圾渗滤液等高浓氨氮废水时) 等方面都具有十分重要的意义。 1 2 1 废水生物脱氮工艺 1 ) 硝化一反硝化工艺。 1 9 7 5 年v o e t l 9 1 等人在进行经n 0 2 途径处理高浓度氨氮废水的研究中，发现了硝 化过程中h n 0 2 。的积累现象。在对这一现象的深入研究过程中，提出了短程硝化反 硝化生物脱氮的概念( s h o r t c u tn i t r i f i c a t i o n a n dd e n i t r i f i c a t i o n ) ，发展了短程硝化反硝化 生物脱氮的工型引。 硝化过程，定义为有机或无机的还原性氮化合物，经过生物的作用，转变成为 较高氧化态物种的过程。 其生化反应式可以用如下方程式来表示，见( 1 1 ) 和( 1 2 ) ： 第1 章绪论 n h 4 十+ 2 0 2 一n 0 2 + 2 h 2 0 ( 18 5k j m o l 以n h 4 + ) ( 1 1 ) 2 n 0 2 。+ 0 2 2 n 0 3 。( 1 6 4k j t o o l 1n h 4 十) ( 1 2 ) 反硝化过程，是厌氧氨氧化细菌进行的氨氧化过程。污水中的硝化态氮和亚硝 态氮在无氧或低氧条件下，会被反硝化菌( 异养，自养微生物均有发现且种类很多) 还原转化成为氮气。在此过程中，有机物( 甲醇，乙酸，葡萄糖等) 作为电子供体被 氧化从而提供了能量。 其生化反应式可以用如下方程式来表示，见( 1 3 ) 和( 1 4 ) ： n h 4 + n 0 2 一n 2 + 2 h 2 0 ( 35 8k j m o l un h 4 + )( 1 3 ) 5 n h 4 + + 3 n 0 3 。一4 n 2 + 9 h 2 0 + 2 h 十( 2 9 7k j m o l n h 4 + )( 1 4 ) 硝化一反硝化工艺经过多年的科学研究，其理论和实践应用技术十分成熟，也是 目前应用最为广泛的污水脱氮技术之一。通常情况下，硝化反硝化工艺采用两个独 立的反应器或者利用同一反应器的不同隔间，分别进行硝化反应和反硝化反应。在 硝化过程中，化能自养型硝化菌将n h 4 + n 氧化成n 0 3 n ；而在反硝化过程中，化能 异养型反硝化菌将n 0 3 。- n 还原成n 2 ，逸出反应器，从而实现污水脱氮。 硝化工艺和反硝化工艺均具有各自的优缺点：硝化工艺可以把n 吖转化为 n 0 3 。，消除了n h 4 + 的不良影响，但是对于n 0 3 和n 0 2 的不良影响无能为力。此外， 反硝化工艺也具有一定缺陷，尽管可以大量去除水体中的氮素，但是这种反应是间 接的而不是直接的。因此，在污水处理过程申，硝化和反硝化这两种工艺通常联合 应用，以充分发挥各自的优势，高效地实现污水脱氮。 2 ) s h a r o n t 艺。 s h a r o n ( s i n g l er e a c t o rf o rh i g ha c t i v i t ya m m o n i ar e m o v a lo v e rn i t r i t e ) t 艺又称为 “短程硝化- 反硝化”工艺。这一工艺是近些年来d e l f t 工业大学( n e t h e r l a n d s ) 提出 并开发的一种新型污水脱氮工艺技术，并成功地应用于市政污水处理过程【1 0 以3 1 。这 一工艺的基本原理是：好氧氨氧化菌和亚硝酸氧化菌是脱氮工艺中主要的菌群。在 某些特定条件下，好氧氨氧化菌的生长速率远远高于亚硝酸氧化菌。因此可以通过 控制温度和水力停留时f 百j ( h y d r a u l i cr e t e n t i o nt i m e ，h r t ) 等反应条件，促进好氧氨氧 化菌的生长，使好氧氨氧化菌成为反应器中的优势菌群。进一步使其发挥好氧氨氧 化的功能，在充足氧气作用下将n h 4 + - n 转化为n 0 2 n 。然后通过改变反应器运行参 数，进行反硝化工艺。因此，只要采用好氧- 缺氧交替运行的处理模式，这一工艺即 可以实现在一个反应器内运行，实现污水脱氮。短程硝化反硝化工艺具有诸多优点， 例如，该工艺可以有效地减少曝气量，仅采用一个反应器即可实现污水脱氮，大量 节约了反应器建设成本和后期人力管理成本。 短程硝化反硝化工艺的实现可以通过控制多种工艺参数来实现。然而研究表明： p h 值、温度和d o 是最主要，也是最有效的工艺参数。亚硝酸氧化菌对p h 值比较 3 河北科技大学硕士学位论文 敏感，因此可以通过改变反应器的p h 值来启动短程硝化。然而通过改变p h 值的方 式的应用效果并不理想。研究表明，改变p h 值后的确可以快速启动短程硝化，然而 经过几周的处理之后p h 值的影响逐渐减弱，工艺逐渐类似予全程硝化。所以，仅靠 调节p h 值来实现短程硝化并不可靠。温度是该工艺运行的重要参数之一。好氧氨氧 化菌的生长速率在15 以上时，明显高于亚硝酸氧化菌。因此可以通过水体温度， 来实现短程硝化。在污水处理厂的实际运行中，水温控制在1 5 2 0 以上即可实现 该工艺。d o 是除p h 值和温度以外的另一重要反应参数。好氧氨氧化菌的0 2 的亲 和力显著高于亚硝酸氧化菌。因此可以利用该特点，控制反应器d o 值，抑制亚硝 酸氧化菌的生长繁殖，实现短程硝化工艺。 h e l l i n g a 等通过改变p h 值、温度和d o 等工艺参数，成功地研发了污水处理的 s h a r o n 工艺。他们首先构建了一个连续搅拌槽反应器( c o n t i n u o u ss t i r r e dt a n kr e a c t o r ， c s t r ) ，进而不断调节工艺运行参数，使其达到最优。a 控制温度在3 0 至4 0 之 间，p h7 到8 之间，促进好氧氨氧化菌的生长：b 应用较高的稀释率，即h r t = s r t ， 使反应器内无污泥停留，使亚硝酸氧化菌随水流出；c 好氧一缺氧交替运行( 1 d 好氧 和1 5 d 缺氧) ，在缺氧条件下进行反硝化去除n 0 2 。，并中和好氧氨氧化下降的p h 值。这一工艺取得了良好的处理效果，然而同时存在一定缺陷。反应器内活性污泥 的微生物活性很高，但是对污水氮素的作用较低，导致处理出水的氮浓度较高。因 此，该工艺还需进一步调节工艺参数，以获得更好的处理效果。例如：可以提高p h 值，延长水力停留时间等促进短程硝化；此外还可以提高曝气量和增加外加碳源等。 通过分子生物学方法对该反应器的活性污泥微生物群落结构进行解析，结果表 明至少有4 类细菌起重要作用1 1 4 l 引。其中，最主要的是n i t r o s o m o n a se u t r o p h a ，该种 细菌在活性污泥微生物群落中的比例高达6 9 ，是该工艺中的优势种群【1 6 】。文献报 道：n i t r o s o m o n a 属是一种典型的好氧氨氧化菌，能在高铵根离子和高亚硝酸根离子 。环境条件下生存，同时可以进行好氧氨氧化i l7 1 。 3 ) 厌氧氨氧化工艺( a n a e r o b i ca m m o n i u mo x i d a t i o n ，a n a m m o x ) 。 d e l f t 大学( n e t h e r l a n d s ) 的研究人员在充分认识和理解厌氧氨氧化的反应原理 的基础上，提出了一种称之为a n a m m o x 的新型生物脱氮工艺。该工艺的原理控制反 应器严格厌氧，微生物在绝氧条件下进行厌氧代谢，以亚硝酸根为电子受体，将铵 根离子直接氧化生成n 2 ，逸出反应器，从而实现水体脱氮。 其生化反应式如下，见( 1 - 5 ) ： n i - h 十+ n 0 2 n 2 + 2 h 2 0 ( 卜5 ) a n a m m o x 工艺对工艺运行参数要求较高：反应器必须完全隔绝氧气，严格厌氧； 反应器必须完全遮光，因为起主要作用的微生物菌群对光敏感；最适宜微生物的温 度为3 0 c ；p h 值7 8 5 【1 8 0 1 。s h a r o n 工艺是通过好氧缺氧交替运行来控制传统的 4 第1 章绪论 硝化反硝化过程，实现短程硝化。然而a n a m m o x 工艺则是一种全新的工艺，他是建 立在以亚硝酸根为电子受体，将铵根离子直接氧化的理论基础之上的，实现了生物 脱氮工艺的理论突破。 a n a m m o x 工艺的另一特点是对进水水质要求较高，即进水氨氮和亚硝态氮的比 例要接近1 ：1 。因此，这一工艺需要建立在厌氧氨氧化菌和其它的微生物的协同作用 的基础之上，或者必须在其它污水处理工艺的下游处理。 a n a m m o x 反应无需供氧、无需外加有机碳源来维持反硝化。此工艺适用于可生 化性较差的废水，不需要外加酸碱调节废水的p h 值，因此可以降低了能耗，节省了 药剂，减少了运行的费用。同时，还可以避免因外加药剂造成的二次污染等问题。 1 2 2 环境微生物技术 微生物是废水处理、城市生活垃圾的填埋或堆肥处理等系统中的主要功能生物， 来充分认识其中的微生物学原理能够为改进处理工艺、提高处理效率提供理论依据， 此外，污染环境的土著微生物也同样是污染自净的重要作用者，深入了解其存在的 状况可以为这些污染环境的恢复提供有力的微生物学理论根据。但是，目前研究环 境微生物群落的方法仍然是基于培养和分离纯化的传统技术上，因此已经无法满足 研究者对环境微生物进行的快速、准确的分析与鉴定的要求。利用基于1 6 s r r n a r d n a 序列分析的分子生态学技术的方法，研究者可以在不进行微生物分离培 养的情况下对微生物进行研究，甚至还可以利用原位核酸杂交和原位p c r ( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ) 技术对特定的环境中的微生物进行原位分析鉴定，并 且对微生物群落的结构和功能进行了研究，结果快速、准确。 微生物群落多样性由于其具有重要的理论和应用价值，一直是微生物生态学、 水处理工艺学和环境科学相关研究领域的研究热点。a 微生物的群落多样性可以反 应其生态功能；b 微生物群落多样性的变化可以反应环境的变化；c 微生物群落多 样性的稳定对于生态稳定和平衡至关重要，也是有效地行使其生态功能的前提；c 微 生物群落多样性的研究可以对发现新型的微生物资源起指导作用。因此，研究环境 微生物多样性和种群结构，可以为环境污染的治理、维持生态平衡和可持续发展、 评价微生物的生态功能等方面提供理论依据。 1 ) 环境样品总d n a 的提取。 环境样品总d n a 的提取技术是现代微生物分子生态学研究中的一项最重要的 实验技术，高质量的d n a 提取是进行后续实验的基础。由于环境样品种类多、组成 成份复杂、物理化学性质的多变，使得传统的对纯培养微生物的提取d n a 的方法很 难直接运用到环境样品的研究中，因为纯培养出来的细胞通常比环境中的原始存在 的细胞更容易裂解。随着现代微生物分子生态学的发展，各种提取环境样品d n a 的 方法被陆续的建立了起来，但是对于多种环境样品而言，没有一种方法能够适用于 5 河北科技大学硕士学位论文 所有的环境样品，每一种环境样品根据其特有的理化特性和生物学特性，都需要优 化出一种特有的提取d n a 的方法。随着现代分子生物学的发展，基于总d n a 提取 的分子生态学方法已经被应用于活性污泥微生物研究中【2 。由于不同活性污泥的 d n a 序列差异很大，因此必须建立高效、可靠的总d n a 提取方法【2 2 1 。 2 ) 聚合酶链反应技术。 聚合酶链反应( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，p c r ) 是8 0 年代中期发展起来的体外 核酸扩增技术。它具有特异性、敏感性、产率高、快速性、简便性、重复性好、易 自动化等突出的优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一d n a 片段在数 小时内扩增至十万乃至百万倍，使得肉眼能直接观察和判断。 ( 1 ) p c r r f l p 方法 限制性内切核酸酶( r e s t r i c t i o ne n d o n u c l e a s e ) 可以特异性地识别某一d n a 序列， 并且可以在特定的位点特异性地切割双链d n a 2 3 】。因此，利用限制性内切酶这一特 点，根据采用酶切分型产生的特定的限制性酶谱图可以对环境样品中的微生物加以 识别。p c r r f l p ( p c r r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m s ) 方法的原理是将上 下游引物或其中一条用荧光标记，经过p c r 反应后，选择合适的内切酶进行酶切反 应、通过毛细管电泳分析，根据酶切片断大小和种类分析微生物群落多样性【2 4 1 。该 技术在土壤微生物多样性的研究中应用较多【2 5 之8 1 ，在活性污泥微生物种群结构中也 有研究报道。 ( 2 ) p c i 卜一d g g e 方法 p c r _ 一变性梯度凝胶电泳( p c r d e n a t u r i n gg r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i s p c r _ 一 d g g e ) 最早应用于d n a 突变检测的相关研究中【2 9 】，上世纪9 0 年代引入微生物生 态学的研究领域【3 。近些年来，该技术已被广泛应用于微生物种群结构和动态变化 的研究中，在环境科学和生态学研究中具有重要的应用【2 9 ，3 1 羽】d g g e 技术的原理 是：以聚丙烯凝胶电泳为基础，加入以尿素和甲酰胺为主的变性剂，通过特定装置 灌制变性梯度胶【2 9 ，3 5 1 。环境样品p c r 产物由于序列不同因而具有不同的t m 值，在 变性梯度和电场的作用下，逐渐分离形成d g g e 图谱。该方法在原生动物多样性和 微生物多样性的研究中应用较多【36 1 。 3 ) 克隆文库分析法。 克隆文库( c l o n el i b r a r y ) 分析方法的原理是：首先通过特定引物进行p c r 反应， 扩增环境样品d n a ，进一步将其克隆连接进入合适的载体( e g p g e m te a s y ) 中， 转化e c o l i 细胞。然后对分离的克隆子进行p c r r f l p 分型进一步测序，获得其序 列。通过与g e n e b a n k 数据库中的微生物序列对比，鉴定其分类地位1 3 7 】。通过分析克 隆子的类型和出现频率，通过统计运算，进而可以获得微生物群落的多样性【3 8 】。 克隆文库分析法应用较为广泛，然而他也存在这样那样的缺陷。例如：克隆数 6 第1 章绪论 目必须足够多，只有这样才能比较完整地认识该种群组成的情况；p c r 偏好性的存 在使d n a 序列无法反映真实情况：成本高，工作量大，分析时间长，不适合对大量 样品中的微生物群落结构进行研究。 4 ) p l f a 谱图分析法。 磷脂脂肪酸( p h o s p h o rl i p i df a t t ya c i d ，p l f a ) 谱图分析方法在微生物生态学的研 究中应用广泛。这一方法具有诸多优点：a 特定的脂肪酸可以进行应用于微生物分 类的研究b 适合微生物群落的动态监测，因为磷脂是构成活细胞细胞膜的主要组分， 细胞死亡，磷月w 日- - 月日w - - , 肪酸迅速降解。其方法原理是：b l i g h 和d y e r 法提取【3 9 1 ，气相色 谱分析，获得磷脂脂肪酸图谱，进一步监测微生物的结构变化【4 0 1 。磷脂脂肪酸方法 适合研究微生物群落变化，因为该方法能够快速提取出大部分环境样品的脂肪酸。 1 3 本课题研究的目的与意义 为了了解不同氨氮浓度下，微生物群落结构多样性的差异，本课题研究的目的 就是用微生物学原理进行硝化污泥中氨氧化菌的鉴定、选育；建立有效的微生物群 落的结构解析方法：解析不同工艺条件下微生物群落结构和氨氧化功能基因的特征。 旨在通过不同工况条件下的氨氧化菌的微观分析，以此来找到氨氧化菌最佳反应的 工艺，并且指导短程硝化工艺的改良。 7 河北科技大学硕士学位论文 = 昌昔譬罱= 昌昌墨皇冒昌= ；昌昌昌宣昌畜= = 昌昌皇= 兰= 岩暑宣墨昌皇= = 昌昌昌_ _ 昌昌啊昌= = 置一昌= | 皇昌昌- 1 4 本课题研究的技术路线 图l 1 试验研究技术路线图 f i g i - 1r o u t ed i a g r a mo ft h ee x p e r i m e n t 8 第2 章短程硝化运行工艺 第2 章短程硝化运行工艺 2 1 短程硝化工艺的发展 1 9 7 5 年w o e t 9 等人在进行经n 0 2 途径处理高浓度氨氮废水的研究中，发现了硝 化过程中h n 0 2 。的积累现象。在对这一现象的深入研究过程中，提出了短程硝化反 硝化生物脱氮的概念( s h o r t c u tn i t r i f i c a t i o na n dd e n i t r i f i c a t i o n ) ，发展了短程硝化反硝化 生物脱氮的工艺1 9 j 。 硝化过程，定义为有机或无机的还原性氮化合物经过生物的作用，转变为较高 氧化态物种的过程。 其生化反应式可用如下方程式来表示，见( 2 1 ) 和( 2 2 ) ： n i - 1 4 + + 2 0 2 - - n 0 2 + 2 h 2 0 ( 18 5k j m o l 叫n h 4 十)( 2 1 ) 2 n 0 2 。+ 0 2 2 n 0 3 ( 1 6 4k j m o l 叫n l - h + ) ( 2 2 ) 反硝化过程，是厌氧氨氧化细菌进行的氨氧化过程。污水中的硝化态氮和亚硝 态氮在无氧或低氧条件下，会被反硝化菌( 异养，自养微生物均有发现且种类很多) 还原转化成为氮气。在此过程中，有机物( 甲醇，乙酸，葡萄糖等) 作为电子供体被 氧化从而提供能量。 其生化反应式可用如下方程式来表示，见( 2 3 ) 和( 2 4 ) ： n i - h + + n 0 2 。n 2 + 2 h 2 0 ( 3 5 8k j m o l 叫n h 4 + )( 2 3 ) 5 n i - 1 4 + + 3 n 0 3 。 - 4 n 2 + 9 h 2 0 + 2 h + ( 2 9 7k j m o l 叫n l - h + )( 2 4 ) 硝化反硝化工艺经过多年的科学研究，其理论和实践应用技术十分成熟，也是 目前应用最为广泛的污水脱氮技术之一。通常情况下，硝化反硝化工艺采用两个独 立的反应器或者利用同一反应器的不同隔间，分别进行硝化反应和反硝化反应。在 硝化过程中，化能自养型硝化菌将n h 4 十- n 氧化成n 0 3 n ；而在反硝化过程中，化能 异养型反硝化菌将n 0 3 - n 还原成n 2 ，逸出反应器，从而实现污水脱氮。 将氨氦氧化过程控制在亚硝酸根阶段是短程硝化反硝化实现的关键。到目前为 止的报道中，将硝化反应有效的控制在亚硝化阶段之中的实际运行工艺并不是很多 见。主要原因有以下两点：( 1 ) 、影响亚硝酸根积累的控制因素( 如p h 、溶解氧d o 、 温度、水力负荷、游离氨f a 以及游离羟胺f h 、污泥泥龄和有害物质等) 都比较复 杂：( 2 ) 、常温条件下石肖酸菌的生长速率要大于亚硝酸菌，所以硝酸菌可以快速的地 将亚硝态氮转化为硝态氮：所以实际中将氨态氮的氧化成功地控制在亚硝态氮状态 是很困难的过程。目前，荷兰d e l f t 理工大学开发的s h a r o n ( s i n g l er e a c t o rf o rh i g h a c t i v i t ya m m o n i ar e m o v a lo v e rn i t r i t e ) - v 艺是比较有代表性的新型脱氮工艺。 s h a r o ns e 艺是荷兰d e l f t 工业大学提出的新型生物脱氮工艺，又叫短程硝化一反 9 河北科技大学硕士学位论文 硝化工艺 1 0 - 1 3 】。其基本原理是：在高温条件下，亚硝酸氧化菌的生长速率要明显低 于好氧氨氧化菌的生长速