（环境科学专业论文）杀菌剂三唑酮对土壤动植物的生态毒性评价.pdf

e c o - t o x i c i t ye v a l u a t i o no t r i a d i m e f o nt os o i lf a u n aa n df l o r a a b s t r a c t 。 t r i a d i m e f o n ( t d m ) ，ak i n do ft r i a z o l ef u n g i c i d e sw h i c hc r e a t e di nt h e19 7 0 s ，i sw i d e l y u s e di nt e r m so f c o n t r o l l i n gd i s e a s ea n di m p r o v i n gp r o d u c t i o ni na g r i c u l t u r e ，a sw e l la sak i n d ofm e d i c i n ei nc l i n i c a la r e af o r a n t i d e p r e s s i o n o fn e r v o u ss y s t e m w i t ht h er a 【d i d d e v e l o p m e n to fe c o n o m ya n dt e c h n o l o g y , t h ea p p l i c a t i o nr a n g eo ft d m i nd i s e a s ec o n t r o l 3 - ： a d u a l l ye x t e n d e df r o ms i n g l yf o rw h e a tt ow i d e l yf o rf r u i t s ，v e g e t a b l e s ，h e r b sa n da l lk i n d s o fa g r i c u l t u r a lc u l t i v a t i o n i nr e c e n ty e a r s ，t h es t u d yi nt d mi s m o s t l yr o u e so nr e s i d u e d e t e c t i o na n dd e g r a d a t i o nm e c h a n i s m ，b u tl e s so nt o x i c i t y t h ec u r r e n tr e s e a r c h e sa r em a i n l y c o n c e r n e da b o u tt h ee f f e c to ft d mt oi n d i v i d u a l s b u ts e l d o mo nt h em o l e c u l a rl e v e l t h eo b j e c to ft h i sw o r ki st od e t e c tt h ei n h i b i t i o ne f f e c to ft d mt os e e dg e r m i n a t i o na n d r o o te l o n g a t i o no f6k i n d so fc r o p s ，t ot e s tt h ea c u t et o x i c i t ye f f e c tt oe i s e n i af o e t i d a ，a n dt o i d e n t i f yt h eg e n o t o x i ce f f e c tb yu s i n gm i c r o n u c l e u st e s to nw h e a tr o o tt i pc e l l sa n dt h ec o m e t a s s a yo nc e l l so fe i s e n i af o e t i d a ，t h r o u g ht h e s ea s s a y st h ee c o t o x i c i t yo ft d mt ot h es o i l e c o s y s t e mh a sb e e ne v a l u a t e d t h em a i nc o n c l u s i o n sa r ea sf o l l o w s ： 1 t h es e n s i t i v i t yo ft h eg e r m i n a t i o nr a t eo fd i f f e r e n tc r o p st ot d mi sd i f f e r e n t ，a n di t w a ss h o w e dt h a tt h es e n s i t i v i t yo ff i b r o u sr o o ts y s t e mc r o p sw e r es t r o n g e rt h a nt h et a pr o o t s y s t e mc r o p s t h ed o s e r e s p o n s er e l a t i o n s h i po fg e r m i n a t i o ni n d e xo fd i f f e r e n tc r o p st o t d mi si nt h es a m em a n n e r , w h e nt h ec o n c e n t r a t i o ni si n c r e a s i n g ，t h ei n h i b i t i o ne f f e c ti s i n c r e a s i n g 2 t h em e d i u ml e t h a lc o n c e n t r a t i o n ( e c s 0 ) o ft d mt or o o te l o n g a t i o nw a sa sf o l l o w s ： c u c u m i ss a t i v u s ，61 6m g l 。；b r a s s i c ac h i n e n s i s ，8 8 7m g 。l 1 ；m u n gb e a n ，211 7m g l 。； p a d d yr i c h ，3 9 5m g l _ ；w h e a t ，6 2 5m g 。l ；s o r g h u m ，9 5 7m g l i tw a ss h o w e dt h a tt h e s e n s i t i v i t yo fr o o te l o n g a t i o nt ot d mi nf i b r o u sr o o ts y s t e mc r o p sw e r es t r o n g e rt h a nt h a ti n t h et a pr o o ts y s t e mc r o p s ，a n dt d mi se a s yt oe x e r tt o x i cd a m a g eo nf i b r o u sr o o ts y s t e m c r o p s 3 m i c r o n u c l e u sw a sa p p e a r e di nac e r t a i nr a n g eo ft d mc o n c e n t r a t i o n ；h i g h c o n c e n t r a t i o no ft d m i n d u c e dm e t a b o l i t e sr e t e n t a t ei n c r e a s i n gi nc e l l s t h e r ew a sn oc l e a r l y t o x i ce f f e c to ft d ma tc o n c e n t r a t i o no f2 0 m g l t oe i s e n i a f o e t i d a l c s 0o ft d mt oe i s e n i a f o e t i d aw a s16 7 6 ，5 4 9a n d3 7 5m g l a t2 4 ，4 8a n d7 2 h ，r e s p e c t i v e l y 4 w i t ht h er i s i n go ft d mc o n c e n t r a t i o n ，t h er a t eo ft a i l i n gc e l l sa n dt h el e n g t h e so f c o m e tt a i l so fc e l l sh a v eao b v i o u s l yi n c r e a s e d ，p r e s e n t i n gar e l a t i o n s h i pb e t w e e nd e g r e eo f d a m a g ea n d c o n c e n t r a t i o n t h ec o n c e n t r a t i o no ft d mi np r a c t i c a la p p l i c a t i o n si s2 0 0 m g l 1s u g g e s t e db yt h e 1 1 r n a n u f a c t u r e r , f o r mo u re x p e r i m e n t a lr e s u l t s ，t h i sc o n c e n t r a t i o nw a sn o to n l yl a r g e rt h a nt h e l c 5 0o ft d mo nt h eg e r m i n a t i o na n dg r o w t ho fc r o p ss e e d s ，b u ta l s ot h a nt h a to nt h eg r o w t h a n dg e n e t i ci n t e g r i t yo fs o i la n i m a l s t h u s ，t d mw i l lh a v es t r o n gn e g a t i v ep o t e n t i a le f f e c t s t h a ti n d u c i n gc h r o m o s o m ea b e r r a t i o na n dd a m a g eo fd n au n d e rh i g h c o n c e n t r a t i o n 7 f h e r e f o r e ，w es h o u l dt a k et h em e t h o do fa p p l y i n gm o r et i m e s a tl o wc o n c e n t r a t i o nt o d e c r e a s et h eh a r mo ft d mo nt h es o i le c o s y s t e ma n dt h ee n v i r o n m e n t ，r e d u c et h et h r e a tt o 1 u m a nh e a l t h k e y w o r d s ：t r i a d i m e f o n ；e c o l o g i c a lt o x i c i t y ；m i c r o n u c l e u st e s t ；c o m e ta s s a y i i i 辽宁师范大学硕士学位论文 第1 章绪论 1 1 三唑酮概述 三唑酮( t r i a d i m e f o n ，t d m ) ，又称百理通或粉锈宁，是一种高效、持效期长、内吸 性强的三唑类杀菌剂，属低等毒性，适于防治麦类、玉米、高梁、果树、蔬菜等作物锈 病和白粉病，广泛用于水果、蔬菜、中草药以及农产品种植1 1 。随着t d m 的广泛使用， 其毒性日趋暴露，加之不合理的施用，在一定程度上加重了对人类的内分泌干扰作用。 因此，评价三唑酮对土壤生态系统的生态毒性，可以为生态环境的保护提供依据，指导 农户在生产实践上合理使用农药方面具有重要意义。 1 1 1 结构 t d m 的分子式是c 1 4 h 1 6 c 1 n 3 0 2 ，分子量：2 9 3 7 ，c a sn o 号是4 3 1 2 1 4 3 3 ，化 学结构式见图1 1 。 c t 卜卜彳h k 图1 1 三唑酮的化学结构式 f i g 1 1 t h ec h e m i c a ls t r u c t u r a lf o r m u l ao ft r i a d i m e f o n 1 1 2 理化性质 t d m 为无色结晶，熔点8 2 3 ，有特殊芳香味，相对密度d 2 0 为1 2 2 ，蒸汽压 小白菜 黄瓜，须根系作物g i 由高 到低依次为高粱 小麦 水稻，且黄瓜要比高粱的发芽指数要高出1 4 ，表明须根系作 物的发芽指数对t d m 的敏感性也要大于直根系作物。从总体来看，t d m 浓度越大， ：六种作物的发芽率和发芽指数受抑制程度越强，因此表现出明显的剂量效应关系。 辽宁师范大学硕士学位论文 。 表2 1 不同浓度t d m 处理对作物种子发芽和发芽指数的影响 t a b l e2 1e f f e c to ft d mw i t hd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so ns e e dg e r m i n a t i o na n dg e r m i n a t i o ni n d e x e so f c r o p s 种子萌发实验是评价环境中化学物质生态毒性的主要方法之一，在有机污染物的生 态毒性评价中有广泛应用 6 2 。6 3 。总体看，不同作物的发芽率对于t d m 的敏感性是不同 的，且明显表现出须根系作物的敏感性大于直根系作物；不同作物的发芽指数具有相同 的浓度梯度效应，即随着t d m 浓度的升高，受抑制作用越强。 在实际应用中，一方面，t d m 的使用量为5 0 m l 兑水5 0 k g ，即2 0 0 m g l ，并根据 病情喷施l 一2 次，其使用量远远超过对作物种子的半抑制浓度；另一方面，t d m 主要 用于防治麦类、玉米、高粱等敏感性较强的须根系作物的锈病和白粉病，使作物受到较 强的抑制作用。近年来，使用三唑酮拌种来提高作物产量逐渐成为一种普遍的趋势。李 增义等人【删和陈企村等人【6 5 的研究表明，使用三唑酮拌种可以增加小麦千粒重和穗粒 数，达到小麦增产的效果，同时还可以有效防止病害，但也能使作物的发芽和出苗速度 变慢，出苗期推迟，基本苗减少 6 6 。6 7j 。随着药量的增加，抑制作用更加明显。在不合理 使用t d m 的前提下，会降低作物种子的发芽率和发芽指数，不但不能提高作物产量， 反而会减少基本苗造成作物产量降低等不良影响。因此，严格控制三唑酮的施用浓度具 有极为重要的作用。 杀菌剂三唑酮对土壤动植物的生态毒性评价 坐3 2 三唑酮对作物种子根伸长的抑制作用 从t d m 对六种作物种子生长发育的抑制关系曲线中可以看出，t d m 工作液浓度越 ：大，对作物种子根伸长抑制率越大，这种抑制作用对六种作物表现出一致性。t d m 对 其中的五种作物黄瓜、小白菜、水稻、小麦、高梁根部生长发育的敏感性较强，其 关系曲线均符合二级动力学方程，抑制作用表现为前期急剧增大，之后增幅减缓；而 t d m 对绿豆的关系曲线表现出一次函数关系，抑制作用幅度随t d m 浓度的波动呈现出 一定的稳定性。 装 槲 妊 最 姒 哥 踞 摹 槲 。= a 啦 嚣 亟 喜 葱 浓度m g l 。 o 5 01 0 01 5 0 浓度m g l _ 1 2 0 0 加 的 加 加 o 辽宁师范大学硕十学位论文 装 斟 = ， 啦 暴 出 哥 违 0 七一 7 0 6 0 5 0 4 0 3 0 2 0 1 0 o 7 0 6 0 5 0 4 0 3 0 2 0 1 0 o 7 0 6 0 5 0 4 0 3 0 2 0 1 0 0 o5 01 0 01 5 02 0 02 5 03 0 0 浓度m g - u 1 o 2 04 06 08 01 0 01 2 01 4 0 浓度m g l 。1 02 04 0 6 08 01 0 01 2 0 1 4 0 浓度m g l 。1 1 5 装斟器罪半孽罂 装斟罐器半晕罂 杀菌剂三唑酮对土壤动植物的生态毒性评价 装 槲 啦 罪 业 壬 型 * 05 01 0 01 5 02 0 02 5 0 浓度r a g l 1 图2 1 不同浓度t d m 作物根伸长抑制作用 f i g 2 1 i n h i b i t i o ne f f e c to f t d mw i t hd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so nt h er o o te l o n g a t i o no f r o o tc r o p s t d m 对六种作物r e i 的动力学方程见表2 2 。 表2 2t d m 对作物根伸长抑制作用的动力学方程和相关系数 t a b l e2 2 r e g r e s s i o ne q u a t i o n s ，c o r r e l r t i o nc o e f f i c i e n t so fi n h i b i t i o ne f f e c to ft d mt or o o te l o n g a t i o n 运用e x c e l 软件进行数据统计，计算得到t d m 对作物种子根伸长半抑制浓度 ( e c 5 0 值) 分别为：黄瓜，6 1 6 m g l ；小白菜，8 8 7 m g l - 1 ；绿豆，2 1 1 7 m g l ? 1 ；水稻， 3 9 5 m g l ；小麦，6 2 5 m g l ；高粱，9 5 7 r a g l 。与t d m 对发芽率和发芽指数的抑制 作用趋势相同，t d m 对各实验种子根伸长的半抑制浓度的数据结果同样显示出对须根 系作物根伸长的敏感性较大。 2 0 t d m 乳油的推荐施药浓度为2 0 0m g l ，对比上述六种作物种子的半致死：浓度 值，其中只有绿豆种子半致死浓度略超出推荐使用浓度，分别是黄瓜、小白菜、水稻、 阳的如加m o 辽宁师范大学硕士学位论文 小麦、高粱种子半致死浓度的3 2 5 倍、2 2 5 倍、5 0 6 倍、3 2 倍、2 0 9 倍，严重抑制了 作物种子的萌发以及种子根的生长，直接导致作物的发育不良甚至减产情况的产生。 从对t d m 可以增强生物有机体抗氧化性和抗胁迫性中，发现如果让t d m 发挥延 缓衰老和增强作物的抗胁迫性，必须要严格控制t d m 的施用浓度。t d m 的推荐使用浓 度是2 0 0 m g l ，大大超过了6 种作物种子的半致死浓度，不但不能对作物形成较强抵 御力的同时，还会对作物造成严重的损害。 对作物施用农药作用在于防治病虫害，确保作物达到高产、高效。2 0 t d m 乳油 的推荐使用浓度已远远超过作物种子正常生长发育所能承受的限度，因此在施用t d m 时，有必要降低其施用浓度。对不同作物施用相应合理的浓度，达到有效防治病虫害的 同时，不阻碍作物的正常生长发育。 2 4 本章小结 本章通过种子萌发实验和根伸长抑制试验检测出，t d m 对作物种子根伸长半抑制 浓度( e c 5 0 值) 分别为：黄瓜，6 1 6 r a g l ；小白菜，8 8 7 m g l ；绿豆，2 1 1 7 m g 。l ； 水稻，3 9 5 m g l ；小麦，6 2 5 m g l ；高粱，9 5 7 m g l ，t d m 实际应用推荐剂量2 0 0m g l 。 大大超过了作物根伸长的半抑制浓度。t d m 浓度为1 2 0m g l 。时黄瓜、水稻和小麦的 发芽指数分别为3 9 6 、3 0 8 和3 1 9 ，已经对发芽率和根伸长造成一定程度的影响， 可以想象浓度增至2 0 0m g l 。1 对作物造成的后果将是十分严重的。通过数据可以表明 t d m 浓度的严格控制对植物的生长发育以及农作物的产量具有极其重要的现实意义。 杀菌剂三唑酮对土壤动植物的生态毒性评价 第3 章从个体水平对三唑酮生态毒性的评价 本章采用t d m 对赤子爱胜蚓的急性毒性实验，从个体水平的角度对t d m 进行生 态毒性评价。通过研究t d m 对土壤动物蚯蚓的半致死浓度，初步评估t d m 的生态毒 性，并研究t d m 在生物有机体内的转运和转化特征。 ：3 1 实验材料 ：j 1 1 主要仪器与试剂 主要仪器： 7 8 1 型磁力加热搅拌器、d h p 9 2 7 2 电热恒温培养箱、培养皿、镊子、烧杯、量筒 滤纸等。 主要试剂及配置： t d m ( 2 0 孚l 油) ，购自江苏化工厂，取1 0 m l t d m 乳油溶解于1 0 m l 无水乙醇中，配 制成t d m 母液；在电子天平上称取2 0 9 吐温，转移至容量瓶中，加入9 8 0 m l 蒸馏水配 制成0 2 的吐温水溶液。实验时取不同量的t d m 母液分别加入到5 0 m l 吐温水溶液中， 使用磁力加热搅拌器搅拌均匀，配制成不同浓度的t d m 实验浓度。 ：3 1 2 实验动物 赤子爱胜蚓，购白沈阳尊龙生物技术有限公司。均选取体重均匀的蚯蚓。 ：3 2 实验方法 ：j 2 1 蚯蚓处理 实验蚯蚓在实验室( 2 5 - 4 - 1 ) 室温条件下，喷洒一定量的蒸馏水，使土壤保持一定 的湿度培养一星期，蚯蚓总体呈现出良好的生长发育趋势。在培养皿中加入一定量的蒸 馏水，使培养皿内的滤纸充分润湿，选取体重为3 0 0 m g 左右的蚯蚓若干，每5 条放入一 个培养皿内，然后放入2 1 + 1 的恒温培养箱内1 2 h ，进行清肠处理。 ：j 2 2 实验试剂浓度的确定 选择体重3 0 0m g 左右的健康赤子爱胜蚓，实验前一天在放入湿润滤纸的培养皿内 进行1 2 h 清肠处理的培养。按表3 1 中的浓度梯度分组，其中阴性对照组为o 2 的吐温 ；水溶液，每组设置两个培养皿，分别注入3 m l t d m 溶液，每个培养皿内加入5 条经过 i 2 h 清肠处理后的蚯蚓，无光照培养2 4 、4 8 和7 2h ，实验重复5 次，数据取用5 次实验 平均值。预实验结果见表3 1 。 辽宁师范大学硕士学位论文 表3 1 预实验蚯蚓存活数量 t a b l e3 1s u r v i v a ln u m b e ro fe i s e n i a f o e t i d ai np r e e x p e r i n m e n t o 1 0 m g l 1 2 0m g l 1 3 0m g l l 4 0m g l + 1 5 0 m g l - 1 6 0 m g l 1 7 0 m g l 1 8 0 m g l - 1 9 0m g l - 1 1 0 0m g l 。1 1 2 0m g l 1 1 5 0m g l 1 2 0 0m g l 1 根据预试验结果确定2 4 ht d m 浓度梯度为0 、4 0 、8 0 、1 2 0 、1 6 0 、2 0 0 m g l ，4 8 h t d m 浓度梯度为0 、3 0 、4 0 、6 0 、8 0 、1 2 0 ，7 2 h t d m 浓度梯度为0 、1 0 、2 0 、3 0 、4 0 、6 0 m g l 一。 3 2 3 实验步骤 选取体重3 0 0m g 左右的健康赤子爱胜蚓，实验前一天，将蚯蚓放入铺有湿润滤纸 的培养皿，进行1 2 h 清肠处理的培养。清肠处理后，按照已确定的浓度梯度，分别取不 同量的t d m 母液移入5 0 m l 吐温水溶液中，配制成浓度为0 、1 0 、2 0 、3 0 、4 0 、6 0 、8 0 、 1 2 0 、1 6 0 、2 0 0m g l 。的t d m 工作液，按照2 4 h 、4 8 h 和7 2 h 对以上浓度进行分组，每 组5 个实验浓度组和阴性对照组。每组设置两个培养皿，分别注入3 m l t d m 溶液，每 个培养皿内加入5 条经过1 2 h 清肠处理后的蚯蚓，无光照培养2 4 、4 8 和7 2 h ，每个实验 组和阴性对照组设置5 组重复试验。 3 2 4 数据处理 赤子爱胜蚓死亡率( d r ) ，即某一浓度实验组中蚯蚓死亡数占该浓度实验组实验总数 的百分比。 d 厂：一n 10 0 n 加m m 8 4 0 o 0 0 一 一 一 一 - 一 一 k k k 9 7 5 5 4 2 0 0 0 0 o k k k k 9 9 9 8 8 6 7 7 5 3 杀菌剂三唑酮对土壤动植物的生态毒性评价 其中， d r 死亡率； n 某一浓度实验组中蚯蚓死亡数： n 该浓度实验组实验总数。 运用e x c e l 软件拟合不同剂量t d m 分别在2 4 、4 8 和7 2 h 与赤子爱胜蚓死亡率的 曲线方程，并根据动力学方程计算得出2 4 、4 8 和7 2 h 赤子爱胜蚓的半致死浓度( l 1 3 5 0 ) 。 3 3 结果与讨论 从各组蚯蚓死亡率曲线关系可以看出，t d m 浓度的增加，蚯蚓的死亡率相应的增 ：大。由于浓度横轴数值存在一定的差异，在趋势线相似的情况下，浓度刻度越小表明变 化趋势越剧烈。在2 4 h 实验组中，蚯蚓死亡率增长较为缓慢，各实验组蚯蚓表现出一定 的敏感性，用镊子轻轻触碰能使蚯蚓挣扎扭曲，发生剧烈蜷动，高剂量实验组中蚯蚓有 ：黄色体腔液渗出，死亡率较低。4 8 h 实验组与2 4 h 实验组相比，死亡率的增长表现出较 为剧烈的趋势，1 2 0 m g l 1 时蚯蚓死亡率达到1 0 0 ，中高剂量实验组中蚯蚓有黄色体腔 液渗出，环带肿大，蚯体变软、伸长。7 2 h 实验组中，浓度在2 0 m g l 。1 以下的实验组中 ! 蚯蚓均没有出现死亡的情况，6 0 m g l 1 时蚯蚓死亡率达到1 0 0 ，3 0 、4 0 、6 0 m g i 。1 实 验组中蚯蚓均出现黄色体腔液，环带肿大，蚯体糜烂等现象。 斟 u u 晦h 05 01 0 01 5 0 2 0 02 5 0 浓度m g l - 1 加 的 蚰 加 加 0 辽宁师范大学硕士学位论文 逻 料 u 碌 透 槲 u 碌 1 2 0 1 0 0 8 0 6 0 4 0 2 0 0 1 2 0 1 0 0 8 0 6 0 4 0 2 0 0 4 06 08 010 01 2 0 1 4 0 浓度m g l 1 2 04 0 浓度m g l 1 图3 1 不同浓度t d m 对赤子爱胜蚓的致死率 f i g 3 1 e f f e c to f t d mw i t hd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so f o nt h em o r t a l i t yr a t e so f e i s e n i a f e t i d a 2 1 杀菌剂三唑酮对土壤动植物的生态毒性评价 t d m 对赤子爱胜蚓的毒性效应均符合二级动力学方程，如表3 2 。 表3 2t d m 对作物根伸长抑制作用的动力学方程和相关系数 t a b l e3 2 r e g r e s s i o ne q u a t i o n s c o r r e l r t i o nc o e f f i c i e n t so f i n h i b i t i o ne f f e c to f t d m t or o o te l o n g a t i o n 运用e x c e l 软件进行数据统计，计算得到t d m 对赤子爱胜蚓在2 4 h 、4 8 h 和7 2 h 的半致死浓度依次为1 6 1 3 m g l 、5 6 m g l j 和3 7 2 m g l ，可见随着时间的推移t d m 毒性逐渐增大，在t d m 中暴露的时间长短成为评价毒性大小的因素之一。根据之前的 研究【6 9 】，t d m 对体型较小动物毒性较大。本研究中t d m 对赤子爱胜蚓2 4 h 的半致死 浓度为1 6 1 3 m g l ，与鸭、雌鸡和大鼠( 经口) 睇j 的l d 5 0 分别为4 0 0 0 m g k g 、5 0 0 0m g k g _ 和1 0 0 0 1 5 0 0m g k g 。1 相比，显然对体型较小的动物有较强的急性毒性，符合t d m 对体 型较小动物毒性较大的理论，证实本章实验具有较高的可信度。 急性毒性实验可以初步确定农药的毒性大小【7 0 - 7 1 。与西维因【7 2 j 相比，2 4 ht d m 和 西维因l c 5 0 浓度分别为1 6 1 3 m g l 。和3 2 4 2 m g l ，4 8 ht d m 和西维因的l c s c l 浓度分 别为5 6 m g l 。1 和1 5 8 m g l ，可见2 4 h 时t d m 毒性要大于西维因，但4 8 h 时t d m 毒性 却要比西维因小，充分说明了t d m 对土壤微生物具有短期的抑制作用。类似的研究的 研究也证实了这一点，f a n gh 等人【73 j 在第一次施用t d m3 天后，检测出s h a n n o n w i e n e r 指数没有表现出明显的抑制作用，然而s i m p s o n 指数和m c i n t o s h 指数却显著降低了， 然后逐渐恢复、超过对照组土壤的水平，第二次和第三次施用三唑酮表现出相似的趋势， 但s i m p s o n 指数和m c i n t o s h 指数恢复所需要的时间减少，恢复率有所加快。 根据前人对大鼠急性行为影响的研究，表明t d m 能够诱导神经传导物质多巴胺受 体无法正常运行，进一步影响中枢神经系统。并且相关研究也证实了t d m 可以产生类 似一种精神运动方面兴奋剂的作用，进而引发生物有机体的多动综合症。这些研究很恰 当的解释了2 4 h 各实验组蚯蚓表现出较强的敏感性，用镊子轻轻触碰就可能对蚯蚂l 各环 节神经产生较为剧烈的影响，因此出现挣扎扭曲、剧烈蜷动的现象。2 4 h 高剂量实验组 以及4 8 h 、7 2 h 各实验组中，由于浓度或时间因素的增加，导致t d m 在蚯蚓体内产生较 强的毒性作用，扰乱了细胞中酶和激素的动态平衡，破坏新陈代谢的过程，使蚯蚂i 细胞 遭到严重破坏，出现蚯体环带肿大、变软、伸长以及糜烂等现象。 因此，合理控制t d m 的施药浓度，不仅可以促进农作物生长发育和保障生态环境 的安全，对土壤动物的生长同样具有重要的现实意义。 辽宁师范大学硕士学位论文 3 4 本章小结 本章对赤子爱胜蚓的急性毒性试验测定t d m 对赤子爱胜蚓在2 4 h 、4 8 h 和7 2 h 的半 弧死浓度依次为1 6 7 6 m g l 、5 4 9 m g l j 和3 7 5 m g l 。与其它农药相比，t d m 对土壤 动物的短期抑制效应明显。在时间较短的条件下，高剂量的t d m 同样可以引发蚯蚓的 一系列病症与死亡，因此应严格控制t d m 在实际生产中的施用浓度，可以采用小剂量 多次喷洒的方法。 杀菌剂三唑酮对土壤动植物的生态毒性评价 第4 章。从分子水平对三唑酮遗传毒性的评价 本章采用小麦微核试验和赤子爱胜蚓彗星实验，从分子水平上t d m 遗传毒惶：进行 评价。微核试验能够测定不同浓度t d m 使小麦生成的微核率，检测t d m 对小麦细胞 染色体的损伤程度，通过分析t d m 毒性作用机理来评价t d m 对植物的遗传毒性作用。 蚯蚓彗星实验通过测定不同浓度t d m 造成的彗星细胞拖尾率和彗尾长度，能够对细胞 中d n a 的损伤程度进行定量分析，以此评价t d m 对动物的遗传毒性作用。 4 1 三唑酮对小麦种子的遗传毒性研究 微核是在1 9 世纪末被h o w e l l 和j o l l y 7 4 发现的。经过大量的实验和研究，在2 0 世 纪7 0 年代中期创建了微核试验 7 5 。7 6 】，这种方法在敏感性、特异性和准确性方面，与经 ：典的染色体畸变分析方法基本相当【7 7 】，但更加经济、快速、简单，直观有效可行，得到 了极其广泛的应用。微核的产生是由于染色体断裂或纺锤丝受影响而在有丝分裂后期滞 留在细胞核外，形成染色体畸变，在一定程度上，微核率的大小直接反映染色体的损伤 程度一圳。目前许多国家和国际组织，己将其规定为新药、食品添加剂、农药、化妆品等 毒理安全性评价的必做实验【7 9 - 8 2 。 4 1 1 材料与方法 主要仪器： 7 8 1 型磁力加热搅拌器、d h p 9 2 7 2 电热恒温培养箱、b y - 1 1 7 光学显微镜、手术刀 片、直尺、载玻片、盖玻片、镊子等。 主要试剂及配置： t d m ( 2 0 $ l 油) ，购自江苏化工厂，取1 0 m l t d m 乳油溶解于1 0 m l 无水乙醇中，配 制成t d m 母液；在电子天平上称取2 0 9 吐温，转移至容量瓶中，加入9 8 0 m l 蒸馏水配 制成0 2 的吐温水溶液。实验时取不同量的t d m 母液加入到5 0 m l 吐温水溶液中，使 用磁力加热搅拌器搅拌均匀，配制成不同浓度的t d m 实验浓度。 固定液为甲醇和冰乙酸按照3 ：1 的比例配制而成，使用时固定液用量是实验样本 体积的2 0 倍以上。 水解分离液为9 5 的甲醇与盐酸按照1 ：l 的比例配制而成。 改良苯酚品红染液染色是用电子天平称取3 6 9 山梨酸，放入1 8 0 m 1 4 5 的乙酸中， 搅拌均匀后加入2 0 的苯酚品红染液5 0 m l 配制而成。 实验种子： 须根系作物种子小麦，购自大连种子公司。 小麦种子处理 辽宁师范大学硕士学位论文 在培养皿中滴加一定量的蒸馏水，使滤纸充分润湿，并保持一定的水量，选取颗粒 饱满的小麦种子若干，浸泡在培养皿中，放入温度为2 1 土1 的恒温箱内培养1 2 小时。 实验试剂浓度的确定 根据本研究第2 章实验数据结果，得n d , 麦e c 5 0 浓度为6 2 5m g l ，取浓度7 0 m g l 。 为半抑制实验浓度组，阴性对照组为双蒸水，在阴性对照组与半抑制浓度取4 0 m g l 。1 为低剂量实验组，取1 0 0 m g l 。1 为高剂量实验组，选取1 0m g l 。1 环磷酰胺溶液为阳性对 照组。 实验步骤 参照k a n a y a 等8 3 1 的方法，选取颗粒饱满的小麦种子，移入铺有滤纸的培养皿，置 于2 5 土1 恒温箱内进行避光培养1 2h 。 染毒当幼根长到1 o 一1 5c m 时，选取形态以及幼根长度相近的种子各1 0 粒分 别移入含5 组浓度试样的培养皿中置于2 5 士1 恒温箱内，进行2 4 h 的避光培养。 恢复染毒2 4h 后取出，用双蒸水冲洗2 次，再换用双蒸水恢复培养2 4h 。 固定恢复2 4 h 后，取出种子，用手术刀片将种子根尖切下，长度为3 - 5 m m 左 右，室温下用固定液把切下的根尖固定2 4 h 。 水解固定2 4 h 后取出根尖移入2m l 水解分离液中处理3 0m i n ，再换用2m l 固定液处理1 0m i n 。 染色将水解后的根尖伸长区切去，将根尖分生区置于载玻片上，采用十字压片 法覆盖载玻片，用力下压使细胞分离。分离载玻片，在3 5 * c 温度下用染液染色4 0m i n ， 染色后进行常规压片制片。 观察将染色的载玻片放到光学显微镜上进行观察，每个处理根尖观察1 0 0 0 左 右细胞。计算微核细胞所占的比例以千分率( f m n o ) 表示。 数据处理 观察每个根尖中约1 0 0 0 个细胞，每组浓度进行5 次实验，取5 组微核数量的平均 值，并运用e x c e l 软件对5 组微核数量进行标准差的计算，微核率的计算采用平均数士 标准差的形式表现出来。 4 1 2 三唑酮对小麦种子遗传毒性结果与讨论 实验结果表明，五个实验组中，形成的整体的微核率还是相对较少的。在自然生长 状态下，小麦根尖细胞存在一定的微核数量，低剂量组微核率约是阴性对照组的1 5 倍， 半抑制组约是4 5 倍，高剂量组约是8 9 倍，相对于阳性对照组的2 2 4 倍来说，t d m 暴 露处理所产生的微核率相对较少，并且小麦微核率与t d m 能够呈现出一定的剂量 效应相关关系。t d m 能够诱发小麦根尖细胞微核的生成，具有微核的细胞中绝大多数 具有一个微核。 杀菌剂三唑酮对土壤动植物的生态毒性评价 表4 1t d m 对小麦根尖细胞微核率的影响 t a b l e4 1m i e r o n u c l e u sr e s u l t so fr o o tt i pc e l la f f e c t e db y f d mi nw h e a t 图4 1 中显示，在阴性对照组中，小麦根尖细胞中没有出现微核细胞，细胞质内无 明显的代谢滞留物；低剂量t d m 实验组出现一定的微核，细胞内滞留物质不明显；t d m 浓度为7 0 r a g l 。1 时，即约为小麦e c 5 0 浓度时，细胞内出现微核较为明显；高剂量t d m 实验组可使细胞核内微核数量增加，并且滞留物质明显增多；阳性对照组中细胞核内聚 集大量的滞留物质。 专錾签0 。i 。 辽宁师范大学硕士学位论文 4 0 m g l 。1 t d m 浓度组 7 0 m g l 1 t d m 浓度组 1 0 0 m g - l 。t d m 浓度组 2 7 杀菌剂三唑酮对土壤动植物的生态毒性评价 阳性对照 图4 1t d m 对小麦种子幼根细胞的致微核试验 f i g 4 1 t d mi n d u c e dm i e r o n u c l e u st e s to fr a d i c l ec e l l so fw h e a ts e e d s 实验结果表明细胞中的微核数量与t d m 浓度具有一定的浓度效应关系。一定浓度 的t d m 可以导致细胞染色体丢失或断裂，从而诱发了细胞内微核的产生，使细胞内染 色体发生畸变，造成染色体或有丝分裂器的损伤，使小麦根尖细胞产生遗传毒性作用。 从t d m 毒性作用机理角度来看，b a i r dt d 和d e l o r e n z om e 9 2 检测t d m 对绿藻的影响， 通过对渗透调节功能和脂质结构的研究揭示了t d m 的毒性机制，研究证实了三唑酮对 固醇的抑制作用是通过干扰细胞膜内麦角固醇的生物合成来实现的，经过t d m 处理可 以改变细胞膜的结构以及阻碍了细胞膜的流动性。b e r gd 和d r a b e rw 等人【6 8 在酵母菌 和真菌中对t d m 的作用机理进行研究，发现t d m 参与麦角固醇合成过程中的脱甲基 化反应，从而减少了甲羟戊酸的产生，形成对麦角固醇合成具有较强的抑制作用。图4 1 中高剂量t d m 实验组和阳性对照组的细胞质中出现大量的滞留物质，这是由于t d m j 秀发了生物有机体内酶含量的增高，导致细胞新陈代谢过程的加速，产生了大量的排泄 物质，同时t d m 改变了细胞结构并阻碍了细胞膜的流动性，导致这些大量的排泄物质 无法及时排除，拥堵在细胞内，形成细胞内滞留物质的畸变，对小麦细胞产生了十分严 ：重的毒性作用，给小麦种子的萌发、根部的生长发育造成一定程度的不良影响。 在实际生产应用中，合理控制t d m 施药浓度具有极其重要的意义。本研究结果表 明小麦e c s o 浓度为6 2 5 m g l - 1 ，黄瓜e c 5 0 浓度为6 1 6 m g l 一，两种作物种子对t d m 的 敏感性十分相近。根据张涛等人 5 7 】对黄瓜的研究，在施药量方面，推荐2 0 t d m 乳油 1 3 3 3 倍( 即1 5 0m g l 。1 ) ，有效施药量为2 2 5 9 h m ，即4 5 0 m l 的2 0 t d m 乳油加入1 5 0 0 l 的水，喷洒在1 公顷的土地上。但从本章研究结果来看，t d m 的施用浓度过大，已经 超过黄瓜种子e c 5 0 的2 倍，对作物的生长发育已经产生了比较严重的负面影响。在保 辽宁师范大学硕士学位论文 证有效施药量2 2 5 9 h m 。2 的前提下，通过增加兑水量来降低t d m 浓度，在确保达到防治 病害的同时，最大程度减小对植物生长和发育的危害。在施药次数和采摘间隔方面，一 般来说t d m 对植株的降解半衰期在1 0 天之内，对于土壤的降解半衰期虽差距较大，但 都在3 0 天之内【5 1 巧4 | 。第一次喷药和第二次喷药无论间隔3 天还是1 5 天，7 d 后检测黄瓜 和白芍植株上的残留均超标，但3 0 d 后检测其残留符合标准。本研究第3 章中表明t d m 在短期内的抑制作用较强，因此，喷药的间隔时间不比过长，且最后一次施药与收获时 间的最佳采摘间隔应定为3 0 d 。 4 2 三唑酮对赤子爱胜蚓的遗传毒性研究 彗星实验是一种通过检测d n a 损伤辨别遗传毒性的技术。1 9 7 6 年，c o o k 等人【8 4 1 发明了一种研究d n a 损伤的方法。1 9 7 8 年，r y d b e r g 等人 85 在此基础上第一次在单细 胞水平上定量检测了d n a 损伤程度。