（环境科学专业论文）油污染对小球藻与卤虫的毒性效应研究.pdf

r e s e a r c ho na c u t e t o x i c i t yo fs p i l l i n go i l st o c h l o r e u as p p a n da r t e m i a a b s t r a c t s t u d y i n gt h ea c u t et o x i c i t yo fo i li st h ei m p o r t a n tm e a s u r et oe v a l u a t eo i lp o l l u t i o n s d a m a g et om a r i n eb i o l o g y t h ep a p e rs e l e c t sg a s o l i n e ，n o 2 0f u e lo i l ，n o 0f u e lo i l ， n o 0m a r i t i m er u e lo i la n dm a r i t i m eh e a v yf u e lo i la so i l su s e di ne x p e r i m e n t s e l e c t s c h l o r e l l as p p ，a r t e m i aa n dp h o t o b a c t e r i u mp h o s p h o r e u mls p pa sb i o l o g yu s e di n e x p e r i m e n t t h er e s u l tp r o v e st h a t f i v eo i l sh a v es t i m u l a t e dc h l o r e t l as p p i nl o w c o n c e n t r a t i o n ，f o l l o w e da s o 5 ，1 5 ，3 5 ，4 9 4 ，a n d 6 5 m g l i tb r i n g st o x i c i t y t oc h l o r e l l as p p w h e nt h ec o n c e n t r a t i o ni si n c r e a s e d ，a n dt h eo r d e ro ff i v ew a f s t o x i c i t yi sg a s o l i n e n o 2 0f u e lo i l n o 0f u e lo i l n o 0m a r i t i m ef u e lo 丑 m a r i t i m e h e a v yf u e lo i l t h ep a p e ra l s of i n d st h a to i l sb a d l ye f f e c t sc h l o r o p h y l la n dp r o t e i no f c h l o r e u as p p ，a n dt h er a t eo fp h a e o p h y t i ni se n h a n c e di ns t u d y i n gt o x i c i t ym e c h a n i s m t h ee x p e r i m e n tt oa r t e m i ai sc o n t r o l l e di n4 8 h t h et o x i c i t yo fo i l st oa r t e m i aa t s h a p e ，t i m e so fs w i ma n dl e t h a l t h eo r d e ro ft o x i c i t yt oa r t e m i ai sg a s o l i n e n o 2 0 f u e lo i l n o 0f u e lo i l m a r i t i m eh e a v yf u e lo n n o 0m a r i t i m ef u e lo i l c o m p a r et o a r t e m i a ，c h l o r e u as p p i ss e n s i t i v et oo i lp o l l u t i o ne x c e p tt og a s o l i n ea t4 8 h t h e t o x i c i t yo fo i l st op h o t o b a c t e r i u mp h o s p h o r e u mzs p pm o s t l yi se f f e c t i n gt h er a t eo f l u m i n e s c e n c e t h eo r d e ro ft o x i c i t yi sn o 0m a r i t i m ef u e lo i l m a r i t i m eh e a v yf u e lo i l t h ep a p e ra l s od i s c u s s e st h et o x i c i t yo ft w oo i l s ；( n o 0m a r i t i m ef u e l o i la n d m a r i t i m eh e a v yf u e lo i l ) t om a r i n eb i o l o g ya f t e ru s i n gd i s p e r s a n tt ot h et w oo i l s 。i t h a v eb e e nf o u n dr i s i n gt oc h l o r e l l as p p a n dd e c l i n i n gt oa r t e m i aa n dp h o t o b a c t e r i u m p h o s p h o r e u mes p p t h es t u d yp r o v e st h a tt h ea c u t et o x i c i t yo fo i l st om a r i n eb i o l o g yi si n c r e a s ew i t h t h ei n c r e a s eo ft i m e w h e nt h ec o n c e n t r a t i o ni ss t e a d y , t h e r e sq u a d r a t i ce q u a t i o n s b a s e do ni td o s e e f f e c ta n dt i m e - e f f e c tr e l a t i o n s h i p sw i l lb ef o u n d t h i sr e s u l tw i l ld o w e l lt oe v a l u a t et h et o x i c i t yd e g r e eo fo i l st om a r i n ea td i f f e r e n tt i m e k e yw o r d s ：o i lp o l l u t i o n ：d i s p e r s a n t a c u t et o x i c i t y 大连海事大学学位论文原创性声明和使用授权 原创性声明 本人郑重声明：本论文是在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果， 撰写成博士硕士学位论文 ：酒置鎏盟d ：监莲生直虫的壹：眭夔廑班基：。除论文 中已经注明引用的内容外，对论文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文 中以明确方式标明。本论文中不包含任何未加明确注明的其他个人或集体已经公 开发表或未公开发表的成果。 本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：1 痢p一辞j 月同 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者及指导教师完全了解“大连海事大学研究生学位论文提交、 版权使用管理办法”，同意大连海事大学保留并向国家有关部门或机构送交学位论 文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权大连海事大学可以将本 学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，也可采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编学位论文。 保密口，在年解密后适用本授权书。 本学位论文属于：保密口 不保密日( 请在以上方框内打“”) 论文作者签名：立。厕f导师签名：刍竺妥a 弓 日期：p 。( 年，月“同 第1 章绪论 1 1 研究背景 海洋占了地球表面积的7 1 ，孕育了地球上的原始生命，为人们提供了丰富的 生产、生活和空间资源，是全球生命支持系统的重要组成部分。随着海上运输业、 捕捞业的目益繁荣，海上溢油事故的发生也随之增多，使得海域中石油污染的面 积和程度都在不断扩大加深，这严重影响了海洋生态环境，破坏了海洋生物赖以 生长、存活和繁殖的栖息环境，同时也破坏了海洋生态系统的结构和功能。 长期的石油污染不仅影响海洋生物的生长、发育和繁殖，造成渔获量减产，而 且还可以在海洋生物体内蓄积不仅影响海产品的品质，重要的是可以通过食物 链影响人类的健康，曾经有报道指出，某些地区癌症的发病率高，就是食用石油 污染过的产品造成的。因此，石油污染对海洋生物的影响正日益引起人们的关注 和重视。研究石油污染对海洋生物的毒性作用及毒性机制，有助于人们理解石油 污染的严重性，并为制定防治海洋石油污染措施提供依据。 1 1 1 海洋中油污染的来源 海洋水体油污染是目前一种世界性的、严重的海洋污染，油污染来源于天然和 人为两个方面。天然因素主要有海底油藏的泄漏和河流从陆地含油沉积岩侵蚀下 来的油再搬运至海洋每年约为5 3 1 0 4 t ”。海洋水体油污染人为来源也很多，如 经河流或直接向海洋注入各种含油废水；海洋石油勘探开发中的泄漏和采油废水 排放；船舶压舱水、机舱水和洗舱水；船舶航行中因事故造成海上溢油，特别是 油轮溢油事故可造成特别严重的污染 2 1 。据统计日本沿岸海域油污染事故占海洋污 染事件总数的8 3 ；美国沿岸海域每年发生的l 万起污染事故中，约有3 4 是石 油污染，可见油类是当今海洋水体中最重要的污染物【3 1 。 1 9 9 6 2 0 0 4 年国内外重大溢油事件见附录1 1 4 】。 1 12 海洋中油的存在形式 油污染在海洋环境中有三种存在形式：( 1 ) 漂浮在海面的油膜；( 2 ) 溶解分散 态，包括溶解和乳化状态；( 3 ) 凝聚态的残余物，包括海面漂浮的焦油球以及在沉 积物中的残余物【5 1 。 油膜是石油输入海洋的初始状态，一般轻油油膜在海面的残留时间为1 0 天左 右，大规模事故性溢油( 特别是重油) 的油膜在海面停留的时间较长，它将严重 地影响海区的海空物质交换、热交换，使海水中氧含量、化学好氧量、比重、温 度等环境因素发生变化，并影响生物的光合作用及其生理生化功能。油膜严重破 坏了海洋环境地自然景观，降低了海洋环境使用质量。 溶解分散于水体的石油组分的含量起初取决于溶解分散、吸附和凝聚作用，然 后受控于沉积、光氧化、生物化学作用。分散态是石油对海洋生物产生直接危害 的形式，它的毒性也与组分的性质及其分散程度有关1 6 j 。 漂浮的颗粒态石油残余物焦油球是输入海洋石油的风化产物。焦油球不会对海 洋生物产生明显的影响，但它破坏了海洋环境的自然景观。 1 13 油污染对海洋生物的影响 油污染对海洋生物的影响包括其毒性所产生的影响及其窒息和缠裹作用的影 响。流入海洋环境中的石油，由于自然将解和微生物的分解，会消耗掉海水中大 量的溶解氧。氧化1 9 石油，大约需要3 4 m l 的氧气。1 l 石油被完全氧化，将要 消耗尽4 0 万升海水中的氧气，相当于面积l m 2 深4 0 0 m 水柱中的全部溶解氧量。 海水严重缺氧，所有生活在海洋中的生物从微小的浮游生物到庞大的海兽，都会 受到不同程度的影响1 7 j 。 石油污染海洋，首当其冲的受害者是浮游生物，包括浮游植物和浮游动物。浮 游生物一旦遇上漂浮在海面的粘糊糊的石油，就会被紧紧粘住，失去自由活动的 能力，最后随油块一起冲上海滩或沉入海底。其中单细胞藻类浮游植物是最易受 油污染的海洋初级生物。把马尾藻放在每升只含l m g 燃料油的海水中，5 m i n 后就 会出现发育迟缓 7 1 。据统计，浮游生物的生产力大约占整个海洋总生产力的9 5 。 浮游生物受到损害，就等于从根本上动摇了海洋生物“大厦”的基础。 鱼类大多对油污染很敏感，当局部海区受到石油污染时，鱼类就会很快逃脱或 回避。但是当油污染面积很大，或者大量石油突然倾泄入海，即使成鱼也很难逃 脱厄运。因为他们在逃离前腮就已经被粘糊糊的原油粘住了。呼吸变得困难，最 后窒息而死。在美国马萨诸塞州外海的一次溢油事故中，有大批鱼类死亡。3 天后 在这一海区捕到的鱼9 5 以上是死的。溶解在海水中的石油对鱼类的危害更大， 它可通过腮或体表进入鱼体，并在体内蓄积起来，损害各种组织和器官【7 】d 石油 对鱼卵和仔鱼的危害更加明显，仔鱼仔虾、卵以及仔鱼仔虾个体发育对石油污染 的毒性敏感程度要比成熟的鱼高1 0 0 倍吼 生活在海底的底栖动物，如海参、各种贝类、海星、海胆等，它们不仅受到海 水中石油的危害，而且还受到沉到海底的石油更大的危害。在一些石油污染比较 严重的海区采捕到的贝类、蛤、等煮熟后常常有一股浓烈的油臭味。 油污染的致死效应和对生境的破坏具有长期性生态影响。但是除某些种类的鸟 外，整个生物种群皆因此而濒于灭绝的现象则不多。 1 1 4 化学消油剂的使用及对海洋生物的影响 化学消油剂的应用迄今为止将近有4 0 年的历史了，从1 9 6 7 年t o r t e vc a n y o n 时的第一代产品到第三代产品。活性剂由阴离子儿发展至聚氧乙烯非离子，非离 子中又由醚型改换成酯型：溶剂由含大量低分子芳烃而演变成液态石蜡；现代某 些产品则用聚乙二酵为溶剂，同时消油剂产品也由溶剂型( 普通型) 而发展至浓 缩型。这一发展过程除了努力提高产品的乳化能力外，降低产品的毒性是个重要 追求目标，同时也注意到产品的生物可降解性1 9 1 。 化学消油剂中的主要成分是表面活性剂、溶剂和少量的助剂( 润湿剂、稳定荆 等) 。表面活性剂由亲油基团和亲水基团两部分组成，是消油剂中起主要作用的部 分。由于表面活性剂对油和水都产生亲合力，改变了油、水界面间的作用并极大 地降低了油膜的表面张力。消油剂通过亲油基团和亲水基团把油和水连接起来， 经机械搅拌混合和波浪的作用，使溢油分散成一个个水包油乳化粒子，随着水体 的自然运动扩散于水体之中，大大增加了油与水的接触面积，使油易于被微生物 降解，从而加速了溢油的自然净化【”】。普通型消油剂含活性剂1 0 4 0 ，浓缩型含 6 0 7 0 ，用时掺5 - 6 倍的海水后喷洒。但是化学消油剂并不是从根本上去除了油 的污染，它只是加速了溢油在水中的降解，从而使水表面的油膜迅速减少，减少 溢油对滨岸带及水鸟的影响【1 l 】。而且化学消油剂本身对海洋生物就有不同同程度 的毒害作用，目前消油剂毒性分级如表1 1 【1 2 1 。 表1 1 消油剂对海洋生物的毒性分级 t a b l e1 1t h et o x i c i t y 、sc l a s s i f i c a t i o no fd i s p e r s a n t st om a r i n eb i o l o g y 1 2 研究现状 1 2 1 溢油污染对水生生物的毒性研究 急性毒性是指污染物高浓度下对生物体的毒性作用，是用来判断污染物毒性的 简便而快速的方法。 ( 1 ) 溢油污染对浮游生物的研究 目前国内外石油类产品对浮游植物毒性的研究已有报道，陈亚瞿和荣骊在 1 9 9 1 年研究2 0 燃料油对新月菱形藻的毒性报道1 4 4 h e c 5 0 值为4 6 1 3 _ + 1 0 1 m g l t l 3 】； 杨庆霄等报道原油对孔石莼有毒性影响，实验组中原油浓度越高，孔石莼叶绿素 含量也相对越低1 1 4 1 ；王修林等报道石油烃在0 5 m g l 以下对旋链角毛藻 ( c h a e t o c e r o sc u r v i s e t u s ) 生长有刺激作用，最大生长速率随着石油烃的增长而增 大，当石油烃浓度达到0 5 m e , a 。之后，最大生长速率达到最大，之后随浓度增加开 始减小【1 5 】。张蕾等对裸甲藻、中肋骨条藻等赤潮藻的研究也得出了相同的结论【1 6 1 。 西班牙j f a b r e g a s 的研究报道原油对t e t r a s e l m 括s u e c i c a 在低浓度时刺激生长，高 浓度( 2 0 0 m g l ) 时对其产生毒性影响【1 7 】，这与另一联合国海洋污染科学问题专家 组的一项调查相一致【”l 。另外，也有学者对石油内芳烃对海洋生物的毒性影响进 行研究，结果大致相似【1 9 , 2 0 。 浮游动物在水中的分布也相当广泛，对油类污染也很敏感，有研究报告，大庆 原油，直流柴油，蒸发汽油航空煤油对蒙古裸腹蚤( m o i n am o n g o l i c ad a d a y ) 4 8 h l c 5 0 值分别为9 8 9 、7 1 7 、3 5 2 、3 4 8 m g l ，其混合物的l c s o 值为7 0 2 m g l t 2 “。 浮游生物在食物链中处于最底层，在能量和物质的循环中处于很重要的位置， 因此浮游生物受到污染后很容易通过食物链影响其他的生物，例如有学者报道， 菲从藻到轮虫的营养传递中，无论是在油的水溶性成份还是在化学分散油中的影 响都是显著的，使轮虫对菲的吸收增加了两倍，也就是使轮虫对菲的暴露增加了 两倍【2 2 1 。 ( 2 ) 油污染对水产经济品种的研究 许多急性毒性实验都以重要的水产经济品种作为研究对象。在生物体整个生命 周期中以早期生命发育阶段对污染物最为敏感 2 3 , 2 7 ，因此利用鱼虾贝类的胚胎及 仔鱼、仔虾进行毒性实验，可以作为一种缩短的慢性实验，成为评价污染物最大 容许浓度很好的指标。吴彰宽等研究了2 3 种毒物对中国对虾的急性毒性，发现石 油烃和其产物的毒性大小顺序为：汽油 煤油 轻柴油 原油 润滑油【2 8 。胜利原油对 真鳃( p a g r a s o m u sm a j o r ) 、牙坪( p a r a l i c h t h y so l i v a c e u s ) 及黑嵋( s p a r u s m a e r o c e p h a l u s ) 仔鱼的4 8 hl c 5 0 值分别为6 4 、1 3 7 和1 0 7 m g l ，对牙醉仔鱼和暇虎 鱼9 6 hl c 5 0 值分别为1 6 ，6 6m g l t 2 9 1 。贾晓平和林钦测定了南海原油、o 。柴油和2 旷 柴油对斑节对虾( p 积口e “sm o n o d o n ) 、日本对虾( p e n a e u s j a p o n i c u s ) 、刀额新对虾 ( m e t a p e n a e u se n s i s ) 3 种仔虾和黄鳍鳃s p a r u sl a m s ) 、黑鳃( s p a r u sm a c r o c e p h a l i t s ) 、前鳞鲻( m u g i lo p h u y s e n i ) 和七星鲈( l a t e o l a b r a x j a p o n i c u s ) 4 种仔鱼的急性 毒性，发现油类对仔虾和仔鱼的毒性顺序均为：o 柴油 2 0 孝柴油，南海原油，而且油 类分散液的毒性大于其水溶性组分3 叭。贾晓平等在另一项研究中报道0 。柴油对四 种贝类的9 6 h l c 5 0 值在1 4 1 6 4 6 m 班之间，但是文蛤的l c 5 0 删3 2 m g l t 3 ”。 i s m a l lg u l e c 在两篇报道f 3 2 3 3 t 组分对三种水生生物的急往毒性，9 6 h e c s o 均超过 2 5 8 0 0 0 p p m ，所得结论和其他学者相差甚远，可能与浓度的表达方式有关。c a r m e l a 等总结前人研究成果表明，原油对各种r a i n b o wf i s h 的早期生命阶段的9 6 h l c 5 0 值从1 2 3 n 5 3 3 m g l 【州。田力杰等总结国内外学者对海洋生物的毒性研究结果见表 1 2 1 3 5 1 。 表1 2 石油对各类群海洋生物的危害浓度 t a b l e1 2t h eh a r mc o n c e n t r a t i o no fo i lt om a r i n eb i o l o g y 5 ( 3 ) 溢油污染对水生生物的慢性毒性作用 慢性毒性试验是用来判断污染物在较低浓度或较长时间内对海洋生物的影响， 目前对石油及其产品对海洋生物的慢性毒性研究主要集中在对海洋植物的光合海 洋生物的孵化、生长和发育的研究、对海洋生物细胞和组织病变的研究等。 石油组分中可能刺激也可能抑制藻类的细胞分裂速度和光合作用。在溶解石油 组分的浓度相对较低( 0 0 1 0 5 r a g l ) 时，藻类的光合作用速率有所提高，这是 因为石油是一种多组分的物质，即含有毒物又含有生物活性组分，后者包括石油 增长因子( p e t r o l e u mg r o w t hf a c t o r ) ，已证实它对海洋单细胞藻类有刺激作用。若 提高石油的浓度或增加接触时间，刺激作用将转变为抑制作用，特别是在强烈的 刺激作用之后，光合作用的强度迅速下降【3 6 】。杨庆霄等也发现石油对孔石莼的叶 绿素含量有抑制作用【1 3 】。 石油污染对水生生物的生长发育和繁殖有明显的影响。生物早期生命发育阶段 的胚胎和仔鱼，是整个生命周期中对各种污染物最为敏感的阶段。许多学者对鱼 类受精卵发育及胚胎孵化进行研究发现石油污染降低了胚胎的孵化，畸形率增加， 受精卵发育迟缓，生殖量下降等【2 8 】【3 7 - 3 8 1 。魏玉银等对海湾扇贝( a r g o p e c t e n i r r a d i a n s ) 进行研究发现，当海水中石油浓度在0 1 6 m g l 以上时，扇贝的行为和生 长受到一定的影响，在试验范围内，水中的油浓度越高扇贝的生长越缓慢，体内 油的蓄积量也越高 3 9 】。 石油污染对生物体的结构和功能都有影响，并进一步造成细胞和组织的病理性 变化致使生物体免疫力下降，导致疾病的产生。 沈弦等研究报道，当石油浓度为0 0 5 m g l 时，就已经对非洲鲫鱼多种血清蛋白 产生影响i 帅1 ，石油浓度为o 2 4 m g l 时就能显著降低非洲鲫鱼血清胆固醇含量，说 明低浓度石油污染对鱼体已产生了慢性毒害作用【4 1 。孙风等人也发现梭鱼在石油 浓度为0 1 3 o 1 6 m g l 的海水中，肝脏芳烃羟化酶活性显著升高【4 2 】。黄鲈f & ，c a f l a v e s c e n s ) 暴露于被含油砂( 沥青) 污染的水体中3 和1 0 个月，鳍严熏腐烂，并发现有 由过滤性病毒引起的肿瘤，同时鳃还有氯细胞、上皮细胞增生和动脉瘤形成等病 理变化【“。 慢性毒性研究还包括石油烃通过食物链在不同生物间的累积，以及同种生物世 代间的累积作用，c a r m e l a 报道说暴露在石油污染中的第二代c r i m s o n s p o t t e d r a i n b o 哪妇的幼虫耐受性又明显增强，但是随着父代暴露浓度的增加，第二代幼 体的9 6 h 致死浓度没有明显的规律【4 4 】。 1 ，2 2 消油剂对水生生物急性毒性影响的研究 国内外已有不少关于消油剂对生物的毒性研究，杨波等报道说，双象i 号， g a m l e n 、奥妙能、碧浪宁8 6 8 、n a l f l e e t9 - 0 1 0 车n c o r r e x i t9 5 2 7 六种常用消油剂对菲 律宾蛤仔，阿匍赧虎鱼，中华哲水蚤及中肋骨条藻都有毒性影响，且毒性差异较 大【4 5 1 。杨庆霄对孔石莼的生长研究表明，双象1 。消油剂以及消油剂原油的混合物 在3 m l 以上的浓度时，皆能观察到该藻体叶绿素a 含量的下降，在同一条件、浓 度下，混合物溶液对该种海洋浮游植物生长的影响比单一溶液要大【1 3 】。国外有学 者也证明化学消油剂的加入增加了w a f 对水生生物的毒性【崛4 7 1 。g u l e ee ta 1 研究表 明原油水溶性组分对海洋生物a m p h i p o d a l l o r c h e s t e s c o m p r e s s a 9 6 h 的半致死浓度为 3 1 10 0 0 m g l 总石油烃，而原油添；b n c o r e x i t9 5 2 7 后的水溶性成份的半致死浓度降 至1 6 2 m e l 总石油烃 4 7j 。 相反的，另外的研究指出加分散剂后分散液( d i s p e r s e d w a t e r a c c o m m o d a t e d f r a c t i o n ，d i s w a f ) 的毒性比单纯油分散液( w a t e r a c c o m m o d a t e df r a c t i o n ， w a f ) 的毒性小的多。s a r a m 等证明原油的d i s w a f 和w a f 对o p a l l i d u s 卵的 4 8 h l c 5 0 分别为1 8 和0 3 9m g m ，他说造成这种结果的原因可能和溢油的化学组成的 变化有关，而总石油烃的增加对生物的毒性影n 很d , t 4 8 1 。相似的，f u c i k 等发现尽 管由于分散剂的加入使总石油烃的浓度增加了，d i s w a f 的对各种海洋生物的毒 性水平仍然小于石油w a f 的毒性【4 9 1 。m i t c h e l lf m 等报道，原油w a f 和原油d i s w a f 对淡水生物i n v e r t e b r a t eh y d r av i r i d i s s i m a 9 6 h l c 5 0 值分别为0 7 和9 0m g 几总石油烃 5 0 l 。s i n g e r 等对l a r v a lt o p s m e l t l 拘研究结果为，w a f 和d i s - - w a f 9 6 hl c s o 值分别为 ( 1 6 3 4 4 0 2 0 ) 和( 2 8 6 0 7 4 7 3 ) 【5 l l 。 上述研究报道中，石油加消油剂前后的毒性比较有很大的差异，可能的原因有 两种，一是油浓度的表示方法不同导致结果不同【5 2 1 ；二是所研究的生物不同，不 同生物种和门之间差异非常明显，对石油及其产品的耐受性也明显不同口引。另外， m i t c h e l l f m 等的研究结果表明，导致原油急性毒性的成份是低分子量的烃即单环芳 烃而不是多环芳烃【5 0 1 ，此观点被s a r a 等的研究所支持，s a r a 等在研究消油剂的加入 对原油毒性影响的研究中发现，气象色谱所能检测出的的毒性大的，低分子量的 烃浓度没有增加，而加入c o r e x i t 9 5 2 7j 昕引起的只是低分子量烃浓度的相对减小， 因此加入c o r e x i t 9 5 2 7 不能增加原油对口a i l i d u s 幼虫的毒性增加【矧。 作者在总结石油污染对各种生物的毒性研究中发现，无论是对油品w 址还是对 d i s w a f 的研究，其半致死浓度的差异都很大，分析其原因可能是由于试验条件 的不同、受试生物的不同和实验液制备方法和浓度测定方法的不同造成的，因此 其可比性也非常小，有必要建立一套比较合理、适用的石油毒性检验方法。 1 3 研究目的、内容和意义 1 3 1 课题来源及研究目的 课题来源：国家自然科学基金项目( 4 0 4 7 6 0 4 6 d 0 6 0 8 ) “g i s 支持下的突发性 海洋污染事故生物资源损害评估研究”。 目前，溢油污染问题已被联合国和我国列入“2 1 世纪重大议程”。根据国际和 国内有关法规和“谁污染谁治理，谁损害谁赔偿”的原则，污染事故的受损方有 权要求有关责任方对其损失给予及时赔偿或恢复。对于突发性海上溢油事故所造 成的渔业和生物资源损害程度进行定量评估是海事仲裁和经济索赔的重要内容。 目前我国尚缺乏有效的损害评估模式，常采用的专家调查等评估方法属于半定量 化估算，存在手段不统一和主观性较大等缺陷。因此定量化、准确的评估石油及 其成品对海洋渔业及海洋生物资源的损失量就显得非常重要，此项目将基于数值 模拟方法建立海洋污染事故生物资源损害定量化评估模式。 石油污染对海洋生物的急性毒性研究开始发展和深入，但是大多数研究都集中 在经济品种鱼类和虾类，而对浮游植物和低级甲壳类生物的研究很少，即使有也 限于对其生长发育情况的观察，而定量的毒性研究少见报道。因此本研究的目的 就是探讨和建立石油、成品油及消油剂的使用对浮游植物和低级甲壳类动物的毒 性研究方法，在试验基础上获得石油、成品油及消油剂对单细胞藻类和甲壳类生 物的急性毒性数值，为定量化评估溢油对海洋生物及海洋生态的损失量提供基础 实验室数据。 1 3 2 本文研究内容 本文选用普通小球藻为主要受试生物，以卤虫和明亮发光杆菌作为辅助研究生 - 8 物。三种所选生物分别处于海洋食物链低级和中级层次，有一定的代表性。 ( 1 ) 技术路线 油分散 小球藻 性试验 消油剂 油分散 小球藻 性试验 油分散液的制 及浓度测定 小球藻急性 性研究 油小球藻的 复培养 性机理的探讨 消油剂后石油 散液的制各及 度测定 小球藻急 毒性研究 油小球藻 恢复培养 性机理的探讨 油分散液 卤虫的急 毒性试验 剂量一效应关 的分析与讨论 时间一效应关 的分析与讨论 消油剂前后! 毒性效应比较 油分散涮 发娄菌目 性毒性蚓匾季孺 ( 2 ) 具体实施 a 急性毒性试验部分 几种常用石油成品油分散液对三种受试生物的急性毒性研究； 石油成品油添加化学消油剂后分散液对三种受试生物的急性毒性研究； 石油成品油应用消油剂前后分散液对受试水生生物急性毒性的变化与比较。 b 石油对受试生物致毒机理的探讨 对受油污染胁迫的小球藻从叶绿素a 、脱镁叶绿素a 、蛋白质含量三方面的变 化来分析其毒性作用位置，探讨其毒性机理； 对石油w a f 和d i s w a f 中的化学成分进行分析，从前后化学成分的变化中找 到使用消油剂前后毒性差异的原因。 c 抑制率与时间关系的探讨 目前国外已有此方面的研究，但是每个固家根据其不同的国情和生物品种的不 同，研究结果的应用有不同的要求和使用条件，因此，为了更好的适应我国国情， 定量化评估溢油污染对渔业和生物资源的损害程度，本文将根据试验结果进行初 步探讨。 1 33 本文研究意义 1 ) 生物毒性监测中物种的选择通常从生态学意义来考虑，如浮游生物、生物 的早期发育阶段、受污染环境的主导物种等。但是我国海洋石油污染排放监测物 种的筛选工作相对滞后，文献少有报道【5 4 1 。因此本文对小球藻、卤虫及发光菌等 常用受试生物进行试验研究，可以为石油污染敏感生物的选择提供依据。 2 ) 本文研究石油w a f 及d i s w a f 对普通小球藻、卤虫和发光菌的急性毒性， 通过急性毒性试验获得石油产品对小球藻2 4 1 4 4 h 半数抑制浓度数据，卤虫的 2 4 4 8 h 和发光菌的1 5 r a i n 及更短时间的半数致死浓度( l i 5 0 ) 或半数抑制浓度 ( e c 5 。) 数据。这些急性毒性数据可以作为石油污染损害评估的参考依据。 3 ) 本文还就石油污染物对三种生物的制毒机理做了一定的探讨，从多个方面 和角度对石油的生物毒性进行分析，为我国海洋石油污染的生物研究提供一条可 供参考的途径。 4 ) 结合我国研究现状和实际情况，对现有的溢油生物损害程度与时间的关系 进行进一步探讨，使其更加适应我国溢油损害评估的需要，为定量的评价溢油对 海洋渔业及海洋生态的损失，以及在海事仲裁和污染事故赔偿索赔方面提供一个 可参考的数据。 第2 章急性毒性试验材料和方法 生物急性毒性试验是指在短时间内( 通常是2 4 9 6 h ) 接触高浓度毒物时，被 测试化学物质能引起试验生物群体产生一特定百分数有害影响的试验。由于死亡 容易观察，而且是最明显而又最严重的有害影响，因此，进行水生生物试验时， 常用死亡作为急性中毒的观察指标，一般用实验生物在4 8 9 6 h 死亡5 0 的浓度来 度量化学物质的急性毒性1 ：5 5 1 。 2 1 试验油品的确定 石油是一种成分十分复杂的天然混合物。在精炼过程中可分馏出汽油、煤油、 柴油、润滑油、裂变原料油、渣油等产品。研究表明各种分馏物的毒性是不一样 的，本文选取海域船舶主要运输、使用的成品油如汽油、2 柴油、0 8 轻柴油、船 用o 。柴油和船用燃料油作为试验油种，其中汽油，酽柴油、2 舻柴油均购自大连市 汽车加油站，o 船用柴油及矿船用燃料油均来自海上航船。 2 2 受试生物的选择 生物毒性监测中物种的选择通常从生态学意义来考虑，国内外学者通过大量研 究，提出了一些选择试验生物的原则，概述如下：在水生食物链及最终传递到人 的食物链上有一定重要性( 有一定生态学、经济学价值) ；分布广泛，来源丰富、取 材方便；能在实验室条件下饲养、易于操作；最好能在实验室内完成接个生活周期 ( 其生活周期最好短于一年1 其成体尽量小等 5 6 ) 。 普通小球藻( c h l o r e l l as p p ) 属于单细胞藻类( u n i c e l l u l a ra l g a e ) ，因为藻体小， 又称微藻( m i c r o - a l g a e ) 。小球藻具有利用太阳能效率高，营养丰富，生长繁殖迅 速等重要特征，而且对各种污染侵害比较敏感，因而受到重视，许多学者都将小 球藻作为受试生物【1 9 , 2 0 1 5 饥。在海洋环境中作为初级生产者，它们光合作用放出大 量氧气，是地球上生物圈中的氧气循环的关键环节，并且吸收水中的富营养化成 分作为碳源，是水体自净的重要保障，在海洋环境中的地位尤其重要。又因为本 研究所选用的藻种是饵料藻，它作为海洋食物链的低层基石，有一定的科研价值。 卤虫( a r t e m i as a l i n a ) 又名盐水丰年虫，为节肢动物门甲壳纲生物，主要以单 细胞藻类为食。我国卤虫资源极为丰富，是饲养虾、蟹、鱼类的蛋白质等丰富的 食料，而且卤虫卵易于长期保存，凼为卤虫卵孵化前胚胎几乎完全停止代谢，处 于休眠状态，当有适宜条件即可孵育出二至三期无节幼体。应用卤虫进行急性毒 性试验已经经过国际会议确定并标准化，目前也是我国船舶散装运输液体化学品 危害评价的标准受试生物，湛波等探讨了卤虫在海洋油田生产水中生物毒性监测 的应用，认为卤虫是海洋石油污染物毒性监测的适宜物神【5 4 j 。另外卤虫在大连、 塘沽、青岛等地附近的盐田产量很大。 明亮发光杆菌( p h o t o b a c t e r i u m p h o s p h o r e u mzs p p ) 作为评价毒性水平的指示生 物，具有时间短、方便、灵敏和经济等优点，发光菌1 5 r a i n 或2 0 r a i n 的e c 5 0 值和鱼 类9 6 h l c 5 0 值有很好的相关性，因此在某些情况下可以替代鱼类的急性毒性研究。 因此本研究选取大连海湾常见的普通小球藻作为主要受试生物，卤虫和明亮发 光菌作为辅助研究。其中小球藻来自本实验室藻种：卤虫选用的是天津英伟公司 提供的卤虫休眠卵；明亮发光杆菌购自南京土壤研究所i 2 3 试验材料 2 3 1 试验仪器 1 ) u v - 7 2 1 分光光度计上海市第三分析仪器厂； 2 ) j a s c o - - 5 5 0 紫外可见分光光度仪； 3 ) 红外测油仪； 4 ) 气相色谱惠普5 8 9 0 ； 5 ) 其他：超声清洗器；显微镜( 1 0 4 ) ；血球计数板( o 1 m m 3 ) ；照度计； 温度计；p h 计：日光灯架；2 5 0 m l 三角烧瓶；5 0 m l 小烧杯；5 0 m l 玻璃具 塞比色管；量筒：移液管；玻璃棒；分液漏斗；胶头滴管；盐度计等。 2 3 2 试验药品 1 ) 分光纯石油醚； 2 ) 分光纯四氯化碳； 3 ) 其他：无水硫酸钠；盐酸；浓硫酸；碳酸铜；无水乙醇；氢氧化钾；丙酮 碳酸镁；0 4 跏i n 玻璃纤维滤膜等。 23 3 油分散液的制备 过滤海水：取自大连市星海湾，经沉淀过滤后用于实验。温度为( 2 4 2 ) o c ，盐 度为3 1 3 5 ，电导率为4 7 3 ，p h 值为8 1 3 。 油w a f 的制备：将受试油品与过滤海水按体积比l ：9 混合，置于超声波清 洗器中连续恒温振荡3 h ，静置3 h 后分离水相低温( 4 6 。c ) 保存。用紫外分光光 度法测定其浓度【5 8 1 。 油d i s - - w a f 的制备：采用油和水1 ：9 的比例混合，在此基础上以消油剂和 油1 ：3 0 的比例迅速加入消油剂，再用超声波清洗仪混合振荡3 h ，后静置3 h 分液， 取水相作为实验储备液。 2 3 4 试验液浓度的测定 测定海洋环境中的石油烃，目前已有多种规范的分析方法。常用的方法主要有 重量法、紫外分光光度法、荧光分光光度法、红外法、气象色谱法和色质谱法等， 这些方法各有自己的优缺点和适用范围，根据他们各自的特点，本文采用紫外分 光光度法和三波长红外分光光度法测定试验液的浓度，采用气象色谱法测定水中 油的组分。 ( 1 ) 紫外可见一分光光度法 原理：紫外一可见分光光度法是跟据分子对光的选择性吸收特征和吸收强度， 进行定性和定量的分析方法。原油及其产品在紫外区有特征吸收。带有苯环的芳 香族化合物，主要吸收波长为2 5 0 2 6 0 n m ，带有共轭双键的化合物主要吸收波长 为2 1 5 2 3 0 n m ，一般原油的两个吸收波长为2 2 5 n m 、2 5 4 r t m 。所以采用紫外分光 光度计测定2 2 5n m 和2 5 4n m 波长下的吸光度，即可计算原油及其产品在水中的 浓度。 测定方法：测定时，先对所测定的溶液进行全程扫描，确定最大吸收峰位置， 找出测定波长。然后配置标准系列，在测定波长下测量标准系列的吸光度，绘制 标准曲线。 步骤： a 分光纯石油醚质量鉴定：以医用蒸馏水作参比，分光纯石油醚在紫外分光光 度计上于2 5 6 n m 处测定，透光率应不小于9 0 。 b 标准曲线得绘制：准确称取0 1 克标准油，用分光纯石油醚溶解，并定容于 5 0 m l 容量瓶种，摇匀，吸取2 5 m l ，再定容至5 0 m l ，此液为1 0 0 # g m l 。吸取标 准原液0 5 ，1 0 ，2 0 ，3 0 ，4 0 ，5 0 m l 于1 0 m l 比色管中，定容，摇匀，此 标准液分别为：5 ，1 0 ，2 0 ，3 0 ，4 0 ，s o s g m l 。分别测吸光度( 吸光度控制在o 1 1 之间，如果超过此范围，重新设定标准液的浓度) ，绘标准曲线。 c 样品的提取与测定：取1 0 0 m l 水样于分液漏斗中，加l m l l ：3 硫酸，加盖 摇匀，加1 0 m l 分光纯石油醚，摇匀( 注意放气) ，静置1 0 r a i n 分层，将水相收集。 将石油醚提取液经1 0 9 无水硫酸钠，过滤于2 5 m l 比色管中，再将水层移回分液漏 斗，用1 0 m l 石油醚重复萃取一次同上操作。然后用5 m l 石油醚洗涤漏斗，其洗 涤液均收集于同一比色管中，并用石油醚定容至刻度，摇匀。 d 取与水样相同体积的水，与水样同样的操作。 e 在选定的波长处，用l c m 石英比色皿，以萃取水样的石油醚做参比溶液， 测量其吸光度( 如果吸光度较大，可以将萃取液稀释后再重新测定) 。 计算： 油( m w e ) = ( m 8 1 0 0 0 ) v ( 2 1 ) 试中：m 从校准曲线中查出相应油的量( m 曲；v _ 水样体积( m l ) 。 o 。柴油测定实例 图2 1 扩柴油紫外可见光扫描图 f i g + 2 1t h eu v s t a l l sd i a g r a mo f n o 0d i e s e l 图2 1 是0 ”柴油以分光纯石油醚做溶剂，用紫外可见光分光光度计进行全波段 扫描图像。由图可见酽柴油在2 2 5 n m 左右有特征吸收峰，因此，用紫外可见光分 光光度计测定时可采用2 2 5 n m 波长。标准曲线的配置方法如前所述，测定结果见 表2 1 。 表2 1o “柴油浓度和对应的紫外吸光度值 t a b l e2 1t h er e l a t i o no fn o 0d i e s e ld e n s i t ya n da b s o r b e n c yo fu v 对表2 1 的数据进行线性回归分析，得到吸光度和浓度之间的回归方程： y = 4 3 0 1 3 x ，相关系数r 2 为o 9 9 4 8 。按前文所述萃取和测定方法测定0 8 柴油的浓度， 测前要估测萃取液中油的浓度大致在标准曲线的范围内，最后测定此溶液的浓度 为1 3 1 8 5 m - j l 。 油的浓度测定与试验室的温度、试剂及操作人员都有一定的关系，因此不能一 直采用一条标准曲线，本试验中每种油品每月制作一条新的标准曲线。 ( 2 ) 三波长红外分光光度法 原理： 用三氯三佛乙烷( t t e 或四氯化碳) 萃取水体中的油类物质，而后将萃取液通 过一特定活性的硅酸镁吸附柱，脱除动植物油等极性化合物，得到纯的石油烃； 水中石油类物质的量可以用石油烃在波数为2 9 3 0 c m ，2 9 6 0 c m 1 及3 0 3 0 c m d 处吸 光度来计算，