（农产品加工及贮藏工程专业论文）苹果渣固态混菌发酵产复合酶的研究.pdf

- 上 r 目录 符号说明8 1 1 固态发酵概述9 1 2 苹果渣的开发利用现状l o 1 2 1 固态发酵生产酶制剂l l 1 2 2 固态发酵生产蛋白饲料1 2 1 3 苹果渣的生物活性物质的作用1 3 1 3 1 降低胆固醇作用1 3 1 3 2 抗氧化作用1 3 1 3 3 降低能量，减少蛋白质的吸收作用1 4 1 4 纤维素酶1 4 1 4 1 纤维素酶的研究现状1 4 1 4 2 纤维素酶的分类、作用机理1 5 1 4 3 在食品中的应用1 6 1 4 4 饲料工业中的应用1 8 1 5 木聚糖酶l 8 1 5 1 木聚糖的结构1 8 1 5 2 木聚糖酶的分类1 9 1 5 3 木聚糖酶催化反应的机理2 0 1 5 4 木聚糖酶在食品工业中的应用2 0 1 5 5 木聚糖酶在饲料工业中的应用2 2 1 6 1 果胶酶的分类2 3 1 6 2 果胶酶催化反应机理2 3 1 6 3 果胶酶在食品中的应用2 4 1 6 4 果胶酶在饲料中的应用2 5 1 7 复合酶制剂2 5 1 7 1 复合酶制剂的研究进展2 6 1 7 2 复合酶制剂的分类2 6 1 7 3 复合酶制剂的功效及其作用机制2 7 1 7 4 影响复合酶作用效果的因素2 9 1 7 5 复合酶制剂在食品中的应用3 0 1 8 本研究的目的意义3 1 2 材料与方法3 2 2 1 材料、试剂及培养基3 2 2 1 1 菌种3 2 2 1 2 试剂。3 2 2 1 3 基础培养基3 3 2 2 测定方法3 3 2 2 1 纤维素酶活的测定方法3 3 2 2 2 木聚糖酶活的测定方法3 4 2 2 3 果胶酶活的测定方法3 6 3 结果与分析。3 8 3 1 苹果渣成分的分析3 8 3 2 三种酶活测定条件的优化3 8 3 2 1 三种酶活标准曲线3 8 3 2 2 测定波长的选择3 8 3 2 3 酶液稀释度对酶活力的影响4 1 3 。2 4 底物和酶液加量4 l 3 2 5 空白样的选择4 3 3 2 6 酶促反应最适p h 4 4 3 2 7 酶促反应时间4 5 3 3 复合酶学性质的研究4 6 3 3 1 温度对酶活的影响4 6 3 3 2 酶的热稳定性4 6 3 3 3 酶的最适p h 值4 7 3 3 4 酶的p h 稳定性4 8 3 4 固体发酵条件的确定4 9 3 4 1 发酵周期的确定4 9 3 4 2 含水量对酶活性的影响4 9 3 4 3 发酵培养基的确定5 2 3 5 混菌发酵5 8 3 5 1 单菌基本产酶能力的测定5 8 3 5 2 混菌组合筛选5 9 3 5 3 三种菌混合发酵条件的优化6 0 3 5 4 正交试验结果的分析6 6 4 讨论6 8 4 1 酶活测定条件中测定波长的确定6 8 4 2 酶液稀释倍数对于最终酶活结果的影响6 8 4 3 发酵过程中适时适量的补水6 9 5 结论7 0 参考文献7 2 攻读学位期间发表论文情况8 0 致 射81 山东农业大学硕士学位论文 摘要 我国是世界上苹果产量最大的国家之一，其中大约2 0 用于果汁加 工，可产苹果渣1 0 0 万吨左右。目前，苹果渣除少量被用于燃料、肥料和 深加工外，绝大部分被遗弃。不仅浪费了资源，还严重污染了环境。因此， 苹果渣的开发与利用研究，已成为饲料资源开发的重要课题。本文主要研 究了以苹果渣为原料经固态混菌发酵生产复合酶的可行性，并对发酵过程 中纤维素酶、木聚糖酶和果胶酶的酶活情况进行了分析，主要结果如下： 1 苹果渣的主要成分 果皮果肉占9 6 2 ，果籽占3 1 ，果梗占0 7 。苹果渣含无氮浸出 物6 1 5 ，总糖1 2 3 ，粗脂肪6 2 ，粗蛋白含量5 6 ，还原糖11 4 ， 果糖o 5 ，蔗糖o 5 ，总酸o 5 2 ，油酸3 1 8 ，亚油酸3 3 5 ，钠4 5 4 7 2 m g l ( g ，钾0 4 3 6 a 2 三种酶活测定条件的优化 对于果渣发酵产生的复合酶系中的纤维素酶，木聚糖酶，果胶酶三种 酶活测定方法进行探索，对三种酶活性最佳测定波长进行扫描，d n s 加 量，酶液底物添加量，反应时间，反应温度，煮沸时间进行单因素分析， 最终确定测定条件的各种参数：三种酶活的测定波长均选择4 8 0n i l l ，测 定温度4 0 。c ，p h5 0 ，底物和酶液加量各2 蚰，空白样选择终止空白。测 定纤维素酶底物浓度为1 0 l ，酶促反应时间1 0m i r a 木聚糖底物浓度是 1 0 1 ，反应时间1 5m i n i 果胶酶底物最佳浓度0 。8g 1 ，反应时间1 5r a i n 。 3 固态发酵培养基的确定 苹果渣固态混菌发酵产复合酶的研究 发酵周期确定为4 8h ：料水比确定为1 ：1 2 ；从发酵第二天开始，每 天补水1 0m l ，适时的补水对酶活提高有一定的作用。通过单因素试验和 正交试验，考察了不同氮源对苹果渣固态发酵的影响，并确定了固体发酵 苹果渣的培养基配方为：硫酸铵2 o ，磷酸氢二钾o 1 ，尿素2 5 ，果 渣：麸皮= 4 ：1 。 4 混合菌株的选择 以l o 株真菌为出发菌株，利用固体平板上的初筛和固态发酵产酶测 定的复筛，选出活性较高的几种菌。对筛选出的菌种，采用交叉划线的方 法，观察确定菌种之间是否有拮抗作用。对没有拮抗作用的菌种进行混菌 固态发酵，经过实验得到c 2 ，c 6 和a s p 1 混合菌为发酵的最佳菌株， 混合后三种酶活整体得到了提高，较单菌的某一酶活性较高的单一性，混 菌由于菌种之间的协同作用，达到了预期的混合效果。 5 对筛选出来的三种菌混菌发酵条件优化，得到最佳活性配比 采用正交试验对选出来的三菌株混合比例进行优化，发酵温度，装样 量，接种# 2 菌种时间，接种# 3 菌种时间，接种# 2 量，接种# 3 量。试验得 出结论：发酵温度3 0o c ；采用三角瓶容量2 5 0 m 1 ；选择菌种撑1 ，撑2 ，撑3 同时接种，接种撑1 体积1r n l ；接种撑2 体积2m l ；接种撑3 体积1 血。 6 对三种酶的酶活性质研究 酶的最适温度：纤维素酶的最适反应温度为7 0 0 c ，高于或低于这个 温度酶活力均下降。木聚糖酶的最适温度是5 5o c ，果胶酶的最适温度是 4 5o c 。 酶的热稳定性：纤维素酶的热稳定性比较高，在6 0o c 作用3 0r a i n 酶活仍保持在8 0 以上，再升高温度才看到明显的酶活下降；木聚糖酶 山东农业大学硕士学位论文 在4 0o c 条件下相对稳定，酶活没有损失，5 0o c 时酶活损失较小，残余 酶活为7 6 7 2 ，至6 0o c 时残余酶活只剩下1 7 3 5 ；果胶酶在5 0o c 时酶 的稳定性最好，在3 0 一6 0o c 之间酶活保持在7 0 以上。 酶的最适p h 值：纤维素酶最适p h 值4 6 ，木聚糖酶和果胶酶的最适p h 分别是4 4 和5 0 。在p h 4 2 5 4 范围内相对酶活在6 0 以上，说明实验室这 三种酶为酸性酶，在酸性条件下不容易失活。 酶的p h 稳定性：果胶酶在p h4 5 的条件下比较稳定，酶活力基本没 有损失，在p h3 - 6 范围内残存酶活在9 0 以上；木聚糖酶在p h 4 5 条件 下相对稳定，酶活力基本没有损失，在p h3 5 6 0 范围内残余酶活保持在 8 5 以上，超出这个范围，酶活力也没有较大损失。纤维素酶稳定性要比 木聚糖酶更好，p h3 0 - 8 0 都没有较大损失，残余酶活都在9 0 以上。 关键词：苹果渣；固态发酵；纤维素酶；木聚糖酶；果胶酶；复合酶；混 菌发酵；酶学性质 i st os a y ，t h eb e s td e t e r m i n a t i o no f e n z y m ea c t i v i t yo ft h r e ew a v e l e n g t hs c a n s ， d n sp l u s ，e n z y m es u b s t r a t e ，r e a c t i o nt i m e ，r e a c t i o n t e m p e r a t u r e ，b o i l i n gt i m e f o rt h es i n g l ef a c t o ra n a l y s i s ，t h ef i n a ld e t e r m i n a t i o no fc o n d i t i o n st o 4 山东农业大学硕士学位论文 d e t e 瑚i 1 1 et h ev a r i o u sp a r a m e t e r s ：w a v e l e n g t ho f t h r e ek i n d s o fa c t i v i t yi s4 8 0 眦m e a s u r i n gt e m p e r a t u r ei s4 0 。c ，p h5 0 ，a n de n z y m e s u b s t r a t ev o l u m ei s 2m l ，a n dc h o o s eb l a n ks a m p l et ot e r m i n a t e d e t e r m i n a t i o no f c e l l u l o s e s u b s 仃a t ec o n c e n t r a t i o ni s10g 1 ，e n z y m a t i cr e a c t i o nt i m ei s10m i n ；x y l a n s u b s 廿a t ec o n c e n t r a t i o ni s10g 1 ，r e a c t i o nt i m ei s 15m i n ；p e c t i n a s eo p t i m u m s u b s t ra _ t ec o n c e n t r a t i o ni s0 8g 1 ，a n dr e a c t i o nt i m ei s15r a i n 3 d e t e r m i n a t i o no fs o l i d s t a t ef e r m e n t a t i o nm e d i u m f e r m e n t a t i o np e r i o di s4 81 1 , t h er a t i oo f w a t e r a r ed e t e r m i n e dt ob e1 ：1 2 ， 丘o ms e c o l l dd a yo ft h ef e r m e n t a t i o no n ，d a i l yr e p l e n i s h m e n tw a t e ri s1 0m l ， t i m e l yr e p l e n i s h m e n to f t h ee n z y m ea c t i v i t yi n c r e a s e dt oa c e r t a i ne x t e n t s i n g l ef a c t o ra n do r t h o g o n a l t e s t sa r et od e t e r m i n ei n f l u e n c eo fd i f f e r e n t n i 仃o g e ns o u r c e s o ns o l i d s t a t ef e r m e n t a t i o no fa p p l ep o m a c e ，a n dt od e t e r m i n e m es o l i dm e d i 啪f o rf e r m e n t a t i o no fa p p l ep o m a c e ：2 o a m m o n i u m s u l f a t e ， p o t a s s i u mh y d r o g e np h o s p h a t e0 1 2 5 u r e a , m a r c b r a n 2 4 ：1 4 t h es e l e c t i o no fs p e c i e sc o m b i n a t i o n w ec a nu s es o l i df l a tc u l t u r em e d i u mt oc h o o s et h es p e c i e sw h i c h c a n d e v e l o pt h r i v i n g a n dw ec a n d e t e r m i n et h ea c t i v i t i e so ft h et h r e ee m 可m e st o c h o o s et h eh i g h e ra c t i v i t i e s f u n g iw h i c ha r ec h o s e d s h o u l db ev a l i d a t e d w h e a m e rt h e yc a ng r o w t hh a r m o n i o u sw i t he a c ho t h e rw i t h l i n eo nt h es o l i d n a tc u l t u r em e d i u m t h r o u g he x p e r i m e n t a t i o n ，w eg e tt h eb e s t c o m b i n a t i o n w h i c hi n c l u d i n gc - 2 ，c - 6 ，a s p 1 a f t e rf e r m e n t a t i o n w i t ht h em i x e ds p e c i e s ， 5 一 苹果渣固态混菌发酵产复合酶的研究 _ - _ 二_ 二二r _ = _ 一一 t h e r ee n z y m ea c t i v i t e sa r eh i g h e rt h a ns i n g l eo n e s m a y b et h es y n e r g ye f f e c ti s t h eb e s te x p l a n a t i o nf o rt h a t 5 t h r o u g ht h ef e r m e n t a t i o ns i t u a n t i o nc o n t r o lo ft h ec o m b i n a t i o ns p e c i e s ， w ec a ng e ts p e c i e sp r o p o r t i o nw i t ht h eh i g h e re n z y m e a c t i v i t y h w eu s eo r t h o g o n a le x p e r i m e n tt oo p t i m i z ee x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n ， i n c l u d i n gf e r m e n tt e m p e r a t u r e ，of l u x ，i n o c u l a t et i m ea n dv o l u m eo fs p e c i e s n o2a n dn 0 3 6 i n v e s t i g a t i o no fe n z y m ec h a r a t e r s t h eo p t i m u m t e m p e r a t u r eo fc e l l u l a s ei s7 0 。c ，t h eo p t i m u m t e m p e r a t u r e o f x y l a n a s ei s5 5 。c ，p e c t i n a s eo p t i m u mt e m p e r a t u r ei s4 5 。c t h ee n z y m eh o ts t a b i l i t y ：c e l l u l a s eh a sa g o o dh o ts t a b i l i t y ，w h i c hc a nb e r e s i d u e d8 0 e n z y m ea t6 0 。cf o r3 0 r a i n i f t e m p e r a t u r ei sh i g h e rt h a n 6 0 。c ， e n z y m ea c t i v i t yw o u l db ed i s t i n c t l yd e c r e a s e d x y l a n a s ei sl e s s e n e dal i t t l ea t 4 0 。c ，a n di tw o u l dr e s i d u e7 6 7 5 e n z y m ea c t i v i t ya t5 0 。c ，17 3 5 l e f ta t 6 0 。c t h eo p t i m u m t e m p e r a t u r eo fp e c t i n a s ei s7 0 。c ，p e c t i n a s ew o u l db e l e r7 0 f r o m3 0 o ct o6 0oc t h eo p t i m u mp ho f c e u u l a s ei s4 6 ，x y l a n a s ea n d p e c t i n a s e ni s4 4a n d5 0 r e s p e c t i v e l y r e l a t i v ee n z y m ea c t i v i t yi sa b o v e6 0 a tp h 4 2 5 4 ，s ot h r e e 参 e n z y m e sa r ea c i de n z y m e s ，a n dt h e yc a i lk e e pt h e i ra c t i v i t i e sf o ra l o n gt i m ea t a c i ds i t u a t i o n h t h ee n z y m ep hs t a b i l i t y ：p e c t i n a s eh a sag o o dh o ts t a b i l i t ya tp h 4 - 5 ，a n d i tw o u l dr e s i d u e9 0 e n z y m ea c t i v i t ya tp h 3 - 6 x y l a n a s ei ss t a b l er e l a t i v e l y 6 山东农业大学硕士学位论文 a tp h4 5 ，a n di tw o u l dr e s i d u ea b o v e8 5 e n z y m ea c t i v i t ya tp h3 5 6 0 ，a n d i ti sa l s oa p p l i e da to t h e rp h c e l l u l a s ei sm o r es t a b i l i t yt h a nx y l a n s e ，a n d c e l l u l a s ei sl i t t l el o s e na tp h3 0 - 8 0 ，w h i c hi sr e s i d u e dm o r et h a n9 0 k e yw o r d s ：a p p l ep o m a e e ；c o t t o n s e e dm e a l ；s o l i d s t a t ef e r m e n t a t i o n ； x y l a n a s e ；c e l l u l a s e ；p - m a n n a n a s e ；e n z y m e c h a r a c t e r i s t i c s 7 苹果渣固态混菌发酵产复合酶的研究 二二二二二二- 一一一 缩写 a n i g e r s s f s m f c d d f c b d t d x b d p e 符号说明 英文名称 a s p e r g i l l u sn i g e ， s o l i ds t a t ef e r m e n t a t i o n 中文名称 黑曲霉 固态发酵 s u b m e r g e df e r m e n t a t i o n液体深层发酵 c a t a l y t i cd o m a i n d i e t a r yf i b r e c e l l u l o s e b i n d i n gd o m a i n 催化区 膳食纤维 纤维素结合区 t h e r m o s t a b i l i s i n gd o m a i n热稳定结构 x y l a n - b i n d i n gd o m a i n p e c t i n e s t e r a s e p m g p o l y m e t h y l g a l a c t u r o n a s e 木聚糖结合区 果胶酯酶 聚甲基半乳糖醛酸 酶 p g p o l y g a l a c t u r o n a s e聚半乳糖醛酸酶 p m g l p o l y m e t h y l g a l a c t u r o n a t e l y a s e 聚甲基半乳糖醛酸 裂解酶 p g l p o l y g a l a c t u r o n a s e l y a s e 聚半乳糖醛酸裂解 酶 n s p s n o n - s t a r c hp o l y s a c c h a r i d e s 非淀粉多糖 8 山东农业大学硕士学位论文 1 引言 1 1 固态发酵概述 固态发酵( s o l i ds t a t ef e r m e n t a t i o n ，s s f ) 是指培养基呈固态，没有 或几乎没有自由流动水，利用自然底物作为碳源和能源，或利用惰性底物 作为支持物的任何发酵过程，其体系含水率低，处理工农业残渣、固体废 弃物等具有能耗低，技术简单，处理量大成本低，产率高，处理彻底，环 境污染少等优点，可以达到净化环境与收获有益产品并举的目的( 李林辉， 徐春，2 0 0 6 ) 。 固态发酵培养基既可以提供微生物生长所需碳源、氮源、无机盐、水 及其他营养物，还是微生物生长的场所( 徐福建，2 0 0 2 ) 。固态发酵是人类 利用微生物生产产品历史最悠久的技术之一。公元前3 0 0 0 年我国发明了 酱油曲，公元前1 0 0 0 年中国酱油曲生产技术传到日本及东南亚等地。 表1 固态发酵的历史和发展 t 曲l elt h eh i s t o r ya n dd e v e l o p m e n to fs o l i d - s t a t ef e r m e n t a t i o n 公元3 0 0 0 年中国人发明酱油 公元2 6 0 0 年 公元2 5 0 0 年 公元2 5 0 0 年 7 世纪 1 8 世纪 1 8 6 0 - 1 9 0 0 1 9 0 0 1 9 2 0 1 9 2 0 1 9 4 0 1 9 4 0 - 1 9 5 0 1 9 5 0 1 9 6 0 1 9 6 0 1 9 8 0 1 9 8 0 一现在 埃及人制造面包 用糖，淀粉盐等发酵贮藏鱼 麸曲发酵过程产生 麸曲发酵被佛教传到日本 鞣酸用于制革，印染等 污水的处理 真菌酶，曲霉发酵提取 真菌酶，葡萄糖酸，柠檬酸发酵提取，转鼓式 反应器 大规模工业发酵出现，用s s f 和s m f 生产虾青 素 用真菌转化生产甾族化合物，类固醇 生产真菌酶素，蛋白饲料 生产其他产品，如乙醇，赤霉素 但现代发酵技术的首要条件是纯种培养，不允许自然界的其他微生 物进入，造成杂菌污染，加上现代工业对大规模集约化生产的要求，使固 态发酵的生产应用处于停滞状态，几乎被排斥到现代工业之外。当液态发 酵与固态发酵有相同经济性能时，液态发酵的许多特征使其成为较优选的 方法。更重要的是，液态发酵的传质、传热均匀有较大程度的可行性。固 苹果渣固态混菌发酵产复合酶的研究 态发酵含有不溶于水的固体、少量的水分及空气，微生物生成的热导致水 分蒸发，使发酵体系具有气液固不均匀的三相，存在严重的浓度梯度及传 质、传热困难，这样很难控制p i - i 、水活度、最佳温度等，使产量大大下 降。然而近几年，由于能源危机与环境问题的日益严重，固态发酵技术再 次引起人们的兴趣。 表2 固态发酵的优缺点 t a b l e2a d v a n t a g e sa n dd i s a d v a n t a g e so f s o l i d s t a t ef e r m e n t a t i o n 优点缺点 培养基组成简单，多为便宜的天然物质 几乎无废水排放 对氧的需求可由气体扩散或间歇通风完成 产物的产率较高 能源消耗低 能够在一定程度上解除产物的抑制 工艺主要限于耐低a 霄的微生物 大规模操作时，产生的代谢热可能造成问题 难于准确的测定含水量，菌体量和二氧化碳等工 艺参数，在线监测难 生化反应器设计不完善 产品少，工艺操作难度大 微生物生长速度缓慢，发酵最终获得较高产量的 次级产物 汪：引目( 谢玉文等，2 0 0 1 ) 1 2 苹果渣的开发利用现状 鲜渣中主要含有的成份是：水分( 7 5 左右) 、粗纤维、果胶物质、蛋 白质和少量脂肪，其中蛋白质含量较低，粗纤维含量较高，豁度较大，不 适宜于牲畜大量饲喂。新鲜的果渣具有苹果特有的香气，p h 值约4 6 ，酸 甜适口。 苹果加工下脚料果皮、果渣传统意义上讲是废物，但从循环经济以及 可持续发展的角度讲，苹果渣的营养价值较高。据分析，风干的苹果渣粉 含粗蛋白质4 4 ，粗脂肪4 8 ，可溶性糖分6 2 8 ，此外还含有微量元 素。苹果渣的赖氨酸含量是玉米粉的1 5 倍，精氨酸是玉米粉的2 7 5 倍。 2 始苹果渣粉相当于1 蚝玉米粉的营养价值。从营养结构分析，利用苹 果下脚料不仅可生产膳食纤维，还可制作苹果皮渣饮料和果醋，可提取果 胶和苹果皮色素和苹果多酚等。因此，综合利用苹果皮、渣开发高附加值 产品，是加快苹果产业化实现可持续发展的必然趋势。 据调查，这些果渣除1 5 2 0 用作燃料，约1 0 作饲料外，7 0 被 废弃。若能对果渣资源进行开发利用，提高果品的综合利用水平，不仅可 山东农业大学硕士学位论文 以减少环境污染，而且又增加了果品的附加值。因此，对果渣资源的开发 利用，具有一定的生态效益、经济效益和社会效益( 王丽嫒，仇农学，2 0 0 9 ) 。 废弃的果渣不仅对环境造成污染，而且造成了资源的极大浪费，在一 定程度上也阻碍了果业的可持续发展。随着人们环保意识的增强，加上饲 料等资源的匾乏，世界各国对果渣开发利用也越来越重视。随着果蔬加工 业的发展和加工能力的提高，果渣的综合利用问题和矛盾越来越突出。为 此，政府部门设立专项研究基金，各高校和科研单位、果品加工企业积极 探索，力求寻找一条经济合理的综合利用之路，如中国农业大学食品学院 和山东省微生物所利用生物技术，研究了果渣发酵生产蛋白饲料的工艺， 取得了成功的经验。其主要原理是通过微生物发酵果渣( i n 苹果渣、柑橘 渣) 生产蛋白饲料。如美国利用废弃的柑橘果渣榨取3 2 的食用油及制取 4 4 的蛋白质；利用葡萄渣提取葡萄红色素；从橘子皮、苹果渣中提取和 纯化果胶质或发酵成柠檬酸和商业酒精，己形成规模化生产，取得了良好 的经济效益。日本己从苹果渣中提取了香精、低聚糖等产品( k e r i n e d y ， 1 9 9 4 ) 。 1 2 1 固态发酵生产酶制剂 酶在食品中的应用有悠久的历史，尤其是固定化酶技术发展，对提高 生产效率，降低成本，改善产品质量具有重要的作用。从果渣中生产酶的 研究，己取得了一定进展，生产工艺大多为固态发酵。b e r o v i e m 和 o s t r o v e r s n i k ( 1 9 9 7 ) 应用黑曲霉( a s p e r g i l l u sn i g e r ) 通过固态发酵苹果渣制 取果胶酶，他在发酵基质中混合于适量的豆粉、麸皮、无机盐，调配至发 酵适宜水分，酶最大得率为2 0 0m g l ( g 培养基。h a n g y d 等( 1 9 9 5 ) 分别使 用臭曲霉( a s p e r g i l l u s f o e 打d u s ) 、黑曲霉( a s p e r g i l l u sn i g e r ) 和米曲酶 ( a s p e r g i l l u so r g z a e ) 在3 0o c 下发酵果渣9 6h 生产吠喃果聚糖酶，分析 发现a s p e r g i l l u s f o e t i d u s 发酵得到的酶活性最强，产率最高( 9 0 0u k g 果渣) ，在p h3 4 6 o 之间具有较高的稳定性，并采用超滤和凝胶过滤措 施对酶进行了纯化，纯化后酶p h 为4 6 。h a n g y d 等( 1 9 9 5 ) 还以 a s p e r g i l l u sf o e t i d u sn r l 3 3 7 为发酵菌时活力最高种，通过固态发酵，从果 渣中制备出了胞外果糖普转移( e x t r a c e c l u t a rf r a c t o s y l t r a n s f e r a s e ) ，发酵 温度为3 0 0 c ，经过1 2 0h 的发酵后，酶活力可超过l1 4 0u ，所得酶作用的 苹果渣固态混菌发酵产复合酶的研究 适宜温度和p h 值分别为4 0 4 5 和5 0 6 0 ，这种酶可以实现将蔗糖转化为 含有5 0 以上蔗果三糖的糖浆。w i a c e k z y c h i l i n s k a a 等( 1 9 9 5 ) 研究人员 仍以固态发酵方式，分别接入毛霉和黑曲霉生产木聚糖酶( x y l a n a s e s ) ， 培养基配方为鼓皮7 5 ，苹果渣5 ，甜菜废粕2 0 ，在一定条件下发酵， 分别得到酶产率为1 7 5u m l 和2 4u i i l l 。以黑曲霉系列n r r i ，2 2 7 0 、 n r r i ，2 0 0 1 、n r r l 5 9 9 、n r r l 3 7 8 、n r r l 5 6 7 为发酵菌种，苹果渣为发 酵基质，制备聚半乳糖醛酸酶，其中黑曲霉m r l l 5 9 9 在3 0 0 c 下培养7 2h ， 可得到具有最高活性的聚半乳糖醛酸酶，酶的最佳作用条件为4 0 0 c 温度 下，p h 值为4 5 ( h a n g 和w o o d a m s ，1 9 9 4 ) 。 c a s t i l h o 等( 2 0 0 0 ) 研究了豆渣等固态发酵产生果胶酶的最优条件， 结果表明水分含量4 0 ，p h4 4 ，3 5o c 培养2 2h 效果最佳。杨辉等在前 人研究基础上对以苹果渣为主要原料固态发酵生产果胶酶的工艺进行了 优化，使果胶酶酶活力可达1 7 4 5 4u m l ；田林茂等( 2 0 0 4 ) 以黑曲霉h g 1 为生产菌种对苹果渣进行固态发酵。实验结果证明最适培养基为苹果渣 1 0g ，棉粕1 0g ，( n 】瞰) 2s 0 40 2g ，k 2 h p 0 40 0 6g ，初始水分含量6 0 ； 最适发酵条件为：装料量为2 0g 干料2 5 0m l 三角瓶，3 0 0 c 恒温培养4 8 h ，果胶酶酶活力可达2 22 4 8u g 。酶活值不仅远高于其它同类报道，也高 于以麸皮为主要原料时的酶活力。 1 2 2 固态发酵生产蛋白饲料 2 0 0 3 年起，我国的研究人员在固态发酵菌种的选育及发酵条件优化 的研究上取得很大进展。徐抗震等( 2 0 0 3 ) 利用激光选育出菌种，进行混合 菌种发酵苹果渣，通过单因素试验获得了适宜的发酵工艺条件即：接种比 4 5 ：3 ：l ，接种量1 0 ，发酵温度3 0 3 4 0 c ，自然p h 值，发酵时间9 6h ， 尿素与无机盐分两次添加，不灭菌。陈五岭等( 2 0 0 3 ) 从山东- 孚lt h 、莱阳， 陕西合阳、乾县和渭南等地长期堆放苹果渣的区域中分离得到菌体蛋白含 量4 0 以上的菌株，经鉴定为黑曲霉和产朊假丝酵母，该菌株适合应用于 大生产。李巨秀等( 2 0 0 5 ) p a 根霉、白地霉、啤酒酵母的混合菌种为发酵剂， 研究了发酵果渣生产菌体蛋白饲料的影响条件，初步确定了果渣固态发酵 的适宜条件，即发酵温度3 2 0 c ，物料质量比果渣：麸皮为8 5 ：1 5 ( 水分 山东农业大学硕士学位论文 含量在6 6 0g k g ) ，发酵料投放量为1 5 0g ，采用自然p h 值，发酵周期为 7 2h 左右。 目前，果渣作饲料主要有三个方向：直接饲喂( 鲜渣或干燥的果渣) 、 鲜渣青贮、利用微生物发酵生产菌体蛋白饲料。由于鲜渣具有水果特有的 香气，可口性好，牲畜喜采食，但其蛋白质含量较低，酸度大，粗纤维含 量高，只能作日粮配合添n ( b a e 等，1 9 9 5 ) 。 1 3 苹果渣的生物活性物质的作用 1 3 1 降低胆固醇作用 m a r i a 等( 2 0 0 1 ) 通过试验证明苹果渣具有使脂质降解的特性，以1 0 的干苹果渣加0 3 的胆固醇饲喂w i s t a r d 雄鼠4 0d ，结果明显阻止了原生 质脂质的升高( p o 0 5 ) ，使原生质胆固醇总量降低了2 0 ，h d l 胆固 醇降低了3 2 6 ，并降低了总磷酸脂的浓度。未加胆固醇组果渣的喂饲对 以上指标无显著影响，对脂类过氧化物的含量无作用。用于食用胆固醇的 白鼠时，这一特性更加突出，他推测苹果渣中起这种作用的有效成份含于 渣的水溶性物质之中。s l y 等( 1 9 8 9 ) 对猩猩的喂养试验和e g a s h i ms a n a d a 在小白鼠上的研究表明苹果渣具有降低胆固醇的作用。b o b e k 等( 1 9 9 8 ) 用 高胆固醇血症的白鼠试验，给刚断奶后的白鼠以0 3 的胆固醇饮食1 0w ， 将其作为对照后，给其中几组在对照组饮食基础上添加5 的纤维素，其 余的喂饲干燥的苹果渣细粉，果渣的加入并未改变血清中胆固醇水平，却 使肝脏中的胆固醇降低l l ，心脏部位的胆固醇含量降低1 8 - 2 1 。 1 3 2 抗氧化作用 李志西等( 2 0 0 5 ) 研究了苹果渣多酚提取物对羟自由基的清除能力与 脂质过氧化的抑制作用，发现苹果渣多酚提取物对清除羟自由基和抑制脂 质过氧化均有较强的作用，清除率和抑制率分别达到9 1 1 和9 3 4 。任 静，黄漫青亦对其抗氧化活性进行了研究。s h i n 等( 2 0 0 1 ) 以1 0 的苹果渣 粉和苹果渣的乙酸乙酯提取物取代纤维素饲喂p r a g u e d a w l e y 鼠6w ，再 以溴苯熏蒸，杀死，取出肝脏化验，脂类过氧化值在乙酸乙酯提取物组较 为对照组低，谷胱甘肽在果渣组和乙酸乙酯提取物组均高于对照组，而谷 胱甘肽转移酶的活性在各组一样高，2 种处理组的肝损伤程度比对照组轻， 证实了苹果渣的乙酸乙酯提取物具有保护肝受到溴苯伤害的作用。l u 等 苹果渣固态混菌发酵产复合酶的研究 ( 2 0 0 0 ) 对苹果渣中的绿原酸、根皮苷等物质进行了消除自由基和猝灭超氧 化物活性实验。得出其活性分别高于v c 和v e 的2 3 倍和1 0 3 0 倍。为苹 果多酚作为抗氧化剂应用于食品等行业提供了理论依据。 1 3 3 降低能量，减少蛋白质的吸收作用 f e k e t e 等( 2 0 0 1 ) 研究发现在猫的食料中加入一定比例的苹果渣能够降 低热量值，适于作为肥胖猫的食谱，实际应用时应根据蛋白质的需求量和 添加料对蛋白质的稀释比例来准确计算纤维质配料的加入比例。另外， z h e n g ( 2 0 0 0 ) 证明苹果渣作为培养基有促进种子发芽和幼苗生长的作用。 1 4 纤维素酶 纤维素酶是一类能够将纤维素降解为葡萄糖的多组分酶系的总称，它 们协同作用，分解纤维素产生寡糖和纤维二糖，最终水解为葡萄糖( 顾方 媛等，2 0 0 8 ) 。纤维素酶系可分为完全酶系和不完全酶系，其中能够降解无 定性纤维素和结晶纤维素的酶系称为完全酶系或全值酶系，仅能降解无定 性纤维素的酶系称为不完全酶系或低值酶系，不同种类的微生物所形成的 纤维素酶系之间在组分的种类和性质上均有很大差异。 1 4 1 纤维素酶的研究现状 s e i l l i e e r ( 1 9 0 6 ) 在蜗牛的消化液中发现了纤维素酶，它能够分解天然纤 维素并产生葡萄糖，这是人类首次发现纤维素酶。1 9 3 3 年g r a s s m a n 等研 究了一种真菌的纤维素酶系，分辨出两个组分。4 0 5 0 年代，以美国陆军 n a t i k c 研究发展中心为代表的世界许多研究机构开始从不同方面对此进 行了艰苦而卓有成效的探索，对产生纤维素酶的微生物进行了大量分离筛 选工作，建立起较为完整的分离筛选方法。 r e e s e 等( 1 9 5 0 ) 提出纤维素酶作用方式的c 1 c x 假说以后，开始转入纤 维素酶的基础研究，包括纤维素酶的性质、作用方式、培养条件和活力测 定方法等( s m i h t ，1 9 7 7 ) 。6 0 年代以后，由于分离技术的发展，推动了纤维 素酶的分离纯化工作，对纤维素酶的组分、作用方式以及诱导作用等方面 的研究比较快，并且实现了纤维素酶制剂的工业生产。目前已有许多国家 在进行纤维素酶的研究( 以纤维素转化成糖为主要目标) ，其中美国、日 本和德国等国发展得较快，纤维素酶制剂的产量亦逐年增加。 山东农业大学硕士学位论文 从上世纪8 0 年代开始，随着分子生物学和基因工程的发展，人们开 始利用基因工程的方法对纤维素酶基因进行克隆和一级结构的测定，利用 遗传工程从分子生物学水平对纤维素酶生产菌株进行诱变育种，对纤维素 酶